A KRÓNIKUS B ÉS C VÍRUSHEPATITISEK ANTIVIRÁLIS TERÁPIÁJÁT BEFOLYÁSOLÓ MOLEKULÁRIS DIAGNOSZTIKA DR. GERVAIN JUDIT PhD Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium rium és s IV. Belgyógy gyászat Fejér r Megyei Szent György KórhK rház Székesfeh kesfehérvár
Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium rium SZÉKESFEH KESFEHÉRVÁR 1992.
MOLEKULÁRIS DIAGNOSZTIKA HEPATOLÓGIA FORRADALMA
VÍRUSOK DIAGNOSZTIKA ÉS S A VÍRUSOKV HBV AuAg DIAGNOSZTIKA HDV HIV HCV 1965 1977 1984 1989 1953 1986 1992 2000 DNS PCR Real Time PCR DNS Chip A vírusok felfedezését, pathomechanizmusuk és szerkezetük megismerését a molekuláris diagnosztikai módszerek tették lehetıvé.
AKUT Hepatitis A vírus Hepatitis B vírus Hepatitis C vírus Hepatitis Delta (vírus) Hepatitis E vírus HGV csoport Egyéb hepatotrop vírusok: VÍRUSHEPATITISEK CMV, EBV, HIV, stb. KRÓNIKUS (6 hónapon túl) -----------------------?
MIÉRT KELL KEZELNI A KRÓNIKUS VÍRUSHEPATITISES BETEGET? 20-30 év alatt májcirrhosis cirrhosisos betegek közül 3-4%/év HCC MI A TERÁPIA CÉLJA: C vírus eliminálás vírus szaporodás gátlása (ahol nincs vírusszaporodás, nincs májsejt pusztulás nem alakul ki cirrhosis)
VÍRUSOK JELLEMZİI - szerkezetük: nukleinsav (DNS vagy RNS) fehérjék (külsı burok, core, enzimek) - önálló szaporodásra képtelenek (hiányos az enzimrendszerük és nincs riboszómájuk)
VÍRUSFERTİZÉS LÉNYEGE - élı, gazdaspecifikus sejtekben szaporodnak a saját nukleinsavukban lévı genetikai kód alapján, - ettıl kezdve a fertızött sejt (hepatocyta) a vírus folyamatos újratermelését végzi = vírushepatitis - az aktív vírusfertızés kimutatásának legbiztosabb módja a vírus nukleinsav direkt vizsgálata
HCV szerkezete RNA genome Nucleocapsid (core) protein burok
HBV-DNS HCV-RNS
HEPATITIS DIAGNOSZTIKA. KÉMIAI VIZSGÁLATOK (SGPT/ALT) SZEROLÓGIA (anti HCV anti HBs, HBsAg anti HBc) MÁJBIOPSIA MOLEKULÁRIS DG.
MOLEKULÁRIS DIAGNOSZTIKA Lényege: nukleinsavak DNS, RNS vizsgálata (genetikai informáci ció)
GYÓGYSZEREK GYSZEREK interferonok: standard pegilált ribavirin nukleozid analógok A jövı: enzim gátlg tlók
DIAGNOSZTIKA FÜGGF GGİ TERÁPIA
ANTIVIRÁLIS TERÁPIÁT BEFOLYÁSOLÓ FAKTOROK TERÁPIA ELİTTI VÍRUSSZÁM VÍRUS GENOTÍPUSA TERÁPIA ALATTI VÍRUSSZINT CSÖKKENÉS =VÍRUS KINETIKA stop-szabály NUKLEOTID SZERKEZET ANALÍZISE
KRÓNIKUS C VÍRUSHEPATITISV
HCV-RNS VÍRUSSZV RUSSZÁM 400.000-800.000 IU/ml alatt szignifikáns összefüggés van a tartós virológiai válasszal
HCV-RNS (RT-PCR) TÍPUSAI MINİSÉGI VIZSGÁLAT (szőrés): pozitív vagy negatív MENNYISÉGI VIZSGÁLAT: MIKOR VÉGEZZÜK? Terápia alatt: vírusszám: 10-100.000.000 IU/ml 0 4-12 24 (48?) hét utánkövetés 24. hetében TERÁPI PIÁS STOP SZABÁLY LY
HCV GENOTÍPUS 2b 1b 1a 1b 3a 1a1b 1b 1b 2a 2b 1a 1b 3a 1-2 4 3 7-9 10 6a 1b2b 2a 5 3a
VÍRUS GENOTÍPUS TERÁPIA 1; 4 2; 3 (1a 1b) - epidemiológiai jelentısége van BEFOLYÁSOLJÁK : - a betegség súlyosságát - az antivirális terápiára mutatott gyógyulási hajlamot 1b = 48%-52% tartós virológiai válasz (SVR)
HCV GENOTÍPUS Legfontosabb basalis prediktor 1. genotípus: 41%-52% SVR 2.;3. genotípus: 76-84% SVR 4. genotípus 65-72% 5.;6. genotípus: ua. mint 1. Fried MW et all. N Engl J Med 2002;347:975-982 Hadziyannis SJ et all. Ann Intern Med 2004;140:346-355 Shiffman N Engl J Med 2007;357:124-134 Khuroo MS et all. Aliment Pharmacol Ther 2004;20:931-938
45 1 1 9 2 6 29 48 1a 1b 1a+1b 1a+2 1a+4 1b+2 1a+1b+2 3 kevert 860 Magyarországi betegek (2054) 92% HCV 1b genotípusú
HCV GENOM SZERKEZETE (NS5A) ISDR-ben található mutációk száma befolyásolja a terápiás sikert Enomoto N et al. N Engl J Med 96;334:77-81 Sarrazin C et al. J Hepatol 1999;30:1400-1413 Pascu M et al. Gut 2004;53:1345-1351
HEPATITIS C VÍRUS V GENOM SZERKEZETE (NS5A) 5 core E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5A NS5B 3 aa. 1973 NS5A aa. 2419 aa. 2209 PKR-BR aa. 2274 aa. 2209 aa. 2248 ISDR PKR-BR: RNS-függı protein kináz kötı régió ISDR: interferon sensitivity determining region
SZEKVENCIA ANALÍZIS VIZSGÁLATA (bázisok)
VÍRUSKINETIKA A terápia alatti vírusszint csökkenés a kezelés eredményességét elıre jelzi meghatározza a kezelés idıtartamát (24-72 hét) Jensen et al. Hepatology 2006;43:954-960 Dalgard et al. Hepatology 2008;47:35-42 Fried et al. J Hepatol 2008;48(Suppl.2):5A Neumann AU et al. Science 1998;282:103-107 Zeuzem S et al. Hepatology 1996;23:366-371
TERÁPIA ALATTI VÍRUS KINETIKA
VÍRUSKINETIKA 1. genotípusú hepatitisben a várható tartós vírus válasz (SVR) valószínősége: KEZELÉS IDEJE SVR 4. hét 91% 12. hét 70% 24. Hét 45% P.Marcellin: J.HEPATOLOGY47.2007.580-597 48 óra 100%
Végpontos és real-time detektálás Real-time módszer (valós idejő mérés) Log cél DNS Végpontos mérésm ciklusszám
14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 MÉRÉSI EREDMÉNYEINK K.Á. D.ZS. V.J. N.T. G.GY. D.L. H.Z. D.F. K.J. J.T. B-né T-né N-né P.G. P.E. P-né N.L. M.Z. T.I. O.R. B.M-né V.A. B.S. G.Sz. G.K. O.T. M.L. COBAS TaqMan COBAS Amplicor
KVANTITAT ANTITATÍV PCR TESZTEK SuperQuant 100 kópia/ml~30iu/ml 100 million kópia/ml~1.470.000iu/ml COBAS AmpliPrep/ TaqMan HCV Teszt, Roche 15 IU/mL 100 million IU/mL Roche COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Teszt, v2.0 600 IU/mL 700 000 IU/mL Roche AMPLICOR HCV MONITOR Teszt, v2.0 600 IU/mL 850 000 IU/mL Bayer bdna 3.0 615 IU/mL 7.7 millió IU/mL
KRÓNIKUS B HEPATITIS
KIINDULÁSI PREDIKTOROK - HBV-DNS szint - HBV genotípus - Gyógyszer rezisztens mutánsok Perrillo RP et all. N Engl J Med 1990;323:295-301 Brook MG Hepatology 1989;10:761-763 Thomas HC J Hepatol 1991;13(Suppl.1):S4-S7
HBV-DNS (PCR) < 2.000 IU/ml vírustiter nem tekintendı fertızınek 2.000 és 20.000 IU/ml a terápiát igénylı kiindulási vírusszám (HBeAg függı) HBV GENOTÍPUS: A-H Magyarországon: A és D
HBV genotípus megoszlás s Magyarországon gon (n=210) A (44.0%) B (1.5%) C (2.0%) D (45.0%) A+D (4.7%) mixed (2.8%)
GYÓGYSZER GYSZER REZISZTENS MUTÁNSOK Nukleozid analógok (bázis+cukor) LAMIVUDIN ENTECAVIR Nukleotid analógok (bázis+cukor+foszforsav) ADEFOVIR TENOFOVIR EMTRICITABIN*
(Lamivudin) (Adefovir) (Entecavir)
Antivirális terápia alatti rezisztens mutánsok szaporodása Terápia Wild-type virus Természetes vírus variánsok Drug-rezisztens mutáns virus HBV szaporodás HBV-DNS Idı Fung SK, et al. Antivir Ther. 2004;9:1013-1026. Locarnini S, et al. Antivir Ther. 2004;9:679-693.
HBV rezisztencia kumulatív incidenciája ADV rezisztencia [1] LAM rezisztencia [2] ETV rezisztencia LAM-refrakter pts [3] Incidence of Resistance (%) 80 60 40 20 0 71% LAM 16% ETV ADV Year 1 Year 2 Year 3 Year 4 Year 5 29% 1. Qi YL, et al. EASL. 2005. Abstract 57. 2. Borroto-Esoda K. EASL 2006. Abstract 483. 3. Colonno RJ. ISVHLD 2006.
HBV gyógyszer-rezisztens mutánsai Terminal protein Spacer Pol/RT RNaseH GVGLSPFLLA YMDD 845 a.a. I(G) II(F) LAM rezisztencia ADV rezisztencia A B C D E rtl80v/i rtv173l rtl180m rta181t/v rtm204v/i/s ETV rezisztencia rtl180m rtt184s/a/i/l rtm204v/i rts202g/c LdT rezisztencia rtl80v/i rtl180m rtm204i TDF rezisztencia rta194t rtm204v rtl180m rtn236t rtl233v? Allen MI, et al. Hepatology. 1998;27:1670-1677. Qi X, et al. J Hepatol. 2004;40(suppl 1):20-21. Tenney D, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2004;48:3498-3507. Tyzeka [package insert]. Lai CL, et al. Gastroenterology. 2005;129:528-536. Schildgen O, et al. N Engl J Med. 2006;354:1807-1812. Locarnini S. 2006 IDRW. Abstract P2. rtm250i/v
DE AZÉRT NEM MINDEN ILYEN SZÉP! DIAGNOSZTIKA FINANSZÍROZ ROZÁSA!? DIAGNOSZTIKAI VÁRÓLISTA! V
KÖSZÖNÖM MEGTISZTELİ FIGYELMÜKET!