NANOTECHNOLOGIA 6. előadás A plazmid: Ha meg akarjuk ismerni egy fehérje működését, akkor sokat kell belőle előállítanunk. Ezt akár úgy is megtehetjük, hogy a kívánt géndarabot egy baktérumba ültetjük és az megfelelő szabalyzók mellett sokszorositja. (A baktériumban inkluziós testek képződnek., melyek könnyen kivalszthatók a baktériumból.) A baktériumba bejuttathatjuk a gént: - Hordozó eszköz segítségével
- Sóoldattal vagy elekromos-stimulációval. Hodozó eszköznek tekitjük a plazmidot például. A plazmid természetes genetikai eleme a baktériumnak. Szerepe, olyan fehérje kódolása, mely adott antibiotikummal szemben rezisztensé teszi a baktériumot. Ha a baktérium ezen szakaszát felnyitjuk a megfelelő hasitó enzimmel, és oda beillesztjük azt a génszakaszt, amit szokszorosítani szeretnénk, akkor a baktérium a saját ellenanyaga mellett a mi génállományunkat is sokszorosítani fogja. Mesterséges plazmid: úgy módosítjak a szekvenciát, hogy szakítóhelyet építanek be. Ezek akár kétféle rezisztencia szekvenciát is tartalmazhatnak. Egyszerűen ki tudom szelektálni azokat, amik nem kellenek nekem. DNS könyvtár: Azért van szükség a DNS könyvtárra, mert ha keresek egy fehérjét, pontosan nem tuodm megmondani, hogy miben található meg.
DNS-könyvtár készítése: Fogom a teljes genont. Restrikciós endonukleázzal fedarabolom. Veszek egy alkalmas plazmidot, amit ugyanezzel az enzimmel darbolok fel. A két oldatot osszekeverem az egyik pazmidba az egyik szakasz a masikba a másik szakasz fog kerülni.
(Ezt többféle enzimmel meg tudom csinláni.) Kitenyésztem őket. Telepek képződnek benne, amelyek azonos plazmidokat tartalmaznak, és ezzel készen van a könyvtár. Keresés a könyvtárban:ha van egy génünk, aminek például csak a végét ismerjük, meg tudjuk keresni, hogy melyik telepen van. Veszünk egy replikát az adott telepről. Melegíteni kezdjük, majd elbomlik a sejt. A DNS kettéválik. A keresett gént a komplemeterével mosom és ehhez a komplementerhez hozzátapadnak a keresett részek.
Nem csak a plazmid jó a gének klónozásához, hanem a bakteriofágok is alkalmasak erre a feladatra. A bakteriofág nem más mint egy vírus szerűség, kívül fehérje belül DNS, ami a vírust építő fehérjéket kódolja. A géneket hasítjuk, majd a részeket összeforrasztjuk és a vírusra hagyjuk a sokszorosítást. A vírus magatól összeáll és mintha a saját génje lenne úgy fogja a beépített génünket sokszorosítani. Így egyszerűbb bejuttatni a fehérjénket. Vektor: amivel be tudok juttatni DNS-t. Irányított mutagenezis: Valamilyen módosítást hajtunk végre a fehérjén. Ilyen például a pont mutácio ami egyetlen helyen végrehajtott változtatást jelent a fehérjén. - A plazmid konstrukcio az eredeti fehérjét tartalmazza - felmelegítjük a telepből kivett részt és felbomlik benne a sejt. - Szintetizáltatok egy olyan oligonukleitodot, mely a megváltoztatandó helyen más. - Ezt elegyítem a komplementerével. Mindenütt összetapad csak azon a helyen nem, ahol a cserét végrehajtottuk. Így csak néhány nukleotidot lehet kicserélni. Ha ezt célzottan jól csinálom, akkor meg tudom változtatni a specificitását. Olyat is lehet, hogy egy nagyob darabot betoldok, vagy kivágok (hasitással es ragadós végekkel). Következmény képpen bármit meg lehet csinalni, példaul úgy módosítható egy aminósav szekvencia, ahogy akarjuk. A távoli kölcsönhatások miatt drasztikus változások nem lehetségesek. Design vs. Directed evolution: Az elöbbi módszerrel nem tudok teljesen más fehérjét előállítani. Viszont vannak tudatos módszerek, melyekkel nem tudom, hogy hogyan idézem elő, de gyökeresen új fehérjét tudunk előállítani. Ezek közül a számunkra jókat kiválogatjuk vagy a rosszakat szűrjük ki. Utanozzuk az evolúciót. Directed evolution: Nagy számú variánst készítünk. Eőállítuk nagyonsok módosulatot, aminek egy része rossz. Kell egy szelekciós módszer, amivel ki tudjuk szűrni a jókat. Példaul: Az immoglobulin variálja a két végét és így biztosan megköt valamilyen idegen anyagot. Ez aktiválja a sejtet, ami szaporodni kezd és megsemmisíti az idegen anyagot. Phage Display:
A fágok felületén való bemutatás. A mi fehejénket a fág burkán lévő fehérjéhez kötjük. Amikor a vírus ezt a burokfehérjét termeli, akkor termeli a miénket is. Keresünk olyan fehérjét, ami felismeri a miénket és kiválogatjuk. Ezáltal nekünk tetsző kötő tulajdonságú fehérjét állítottunk elő. Ezt kb. 10 8 db molekulával tehetem meg. Ribosoma Display: Csinálunk sok RNS módosulatot. Az RNS másolat: hozzákötünk egy csoportot, ami a fehérjét a riboszomához köti, aztán halászunk nekünk megfellő fehérjéket. (kihasználhatjuk, hogy az RNS kémcsőben összeáll)
a,)ribosoma Display b,)mrna Display mrna Display: Ne a riboszomához kössük, hanem a hírvivő RNS-hez legyen kapcsolva és ezek közül válogatunk.
DNS Számítógép: Példa: Az utazó ügynök probléma (vagy N város probléma): Probléma: van egy házaló ügynökünk akinek Ndb varost kell bejárnia. Minden városba csak egyszer mehet. Svárosból indul es F-be kell érkeznie. Keressük utat az ügynöknek!
Megoldás: - generáljuk véletlenszerűen az útvonalakat - kiválogatjuk az S-ből (kiinduló állomás) induló és az F-ben (végállomás) végződőket - csak azokat tartjuk meg, melyek pontosan N db várost érintenek - kiválogatjuk azokat melyekben minden város benne van - a megmaradt útvonalak a megoldás. Útvonalak generálása: - minden város kap egy 8 tagú oligonukleotid nevet (melyek nem nagyon hasonlítanak egymásra) - az útvonalat két város között: az induló város utolsó 4 betűjének komplementere és a végállomás első 4 betűjének koplemetere alkotja. - Ezek kiegészítő bázis párosodással összekötődnek, megalkotva az útvonalakat. Ez hatalmas mennyiségű útvonal. 1 ml mintaból ->10 18 db nukleotid.
S és az F kiválasztása: - a felső kiegészítő szálon egy primert csinálunk - a másikon a végállomas komplementerét jelöljük ki - PCR-rel ez a szakasz felerősíthető - legenerálható a jó helyen kezdődő és végződő útvonal. Úthossz-szelekció: Gélelektroforézis: N*8 db méretszelekció: gélben megfuttatjuk az anyagot, és megkapjuk a csíkokat, melyekben az azonos részek vannak. Ebből már tudjuk, hogy hol vannak a számunkra jó utak. Ezeket ki tudjuk oldani a gélből. Város-ellenőrzés: Kihalászás mágneses mikrogömbökkel N-lépésben: (Mikrogömböket a boltban veszünk.) A gömbökhöz kapcsoljuk hozzá például a 3. város komplementer darabkáját. Sok ilyen gömb van és más-más darabkák lógnak rajtuk. A gélből kivett oldatba belekeverem a mikrogömböket Hibridizációval kijönnek azok az útvonalak, melyekben benne vannak a megfelelő városok. Ezt ismétlem minden városra. Ha megcsinlátuk, akkor megkapjuk a végeredményt, amit DNS-szekvenálással olvashatunk ki.
Ez azért jobb, mint a számítógépes procedura, mert a probléma a városok számával lineárisan bonyolodik. DNS-számítógéppel néhany perc alatt elvégezhető egy-egy lépés.