CELLULÁRIS SZÍV- ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK Dr. Virág László
Intracelluláris mikroelektród technika Voltage clamp technika Patch clamp technika
Membrane potentials and excitation of impaled single muscle fibers. J. Graham, R. W. Gerard. J Cell Physiol. 1946 Aug;28(1):99-117. J Cell Physiol. 1949 Dec;34(3):383-96.
J. Physiol. (I95I) 115, 74-94. Coraboeuf, E. & Weidmann, S. (1949a). C.R. Soc. Biol., Paris, 143, 1329. Coraboeuf, E. & Weidmann, S. (1949b). C.R. Soc. Biol., Paris, 143, 1360.
Intracelluláris mikroelektród technika
Ag/AgCl 3 M KCl R e ~ 10-40 MOhm 0.1-0.2 µm
erősítő számítógép ingerlő d e r A/D P Detektált jel szervfürdő 0mV d: ingerlő elektróda e: mikroelektróda r: referens elektróda P: preparátum 50 mv 100 ms
0 mv APA 50% 100 ms 20 mv V max 90% RP APD 50 előinkubáció APD 90 anyag kimosás 60 perc 20-60 perc 60 perc
Voltage clamp technika Cole KS (1949) Dynamic Electrical Characteristics of the Squid Axon Membrane. Arch. Sci. Physiol. 3:253 258
Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál makroszkópikus nátrium-áram
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (1981) Improved Patch-Clamp Techniques for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-Free Membrane Patches. Pflügers Arch. 391: 85 100.
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (1) Szívjunk be egy kis membrán darabot a mikropipetta hegyének belsejébe (átmérő ~ 1 µm) Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (2) Gigaohm-seal R > 1 GOhm Sejt
M. Sokabe and E Sachs, The Journal of Cell Biology, Volume 111, 599-606, 1990.
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete zárt nyitott (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. + + Sejt
Patch clamp: a voltage clamp egy speciális esete zárt nyitott zárt (3) Kapcsoljuk a kívánt potenciálra az elektróda belsejét és tartsuk konstans értéken a voltage clamp módszert használva. Sejt
Nátrium csatornák tulajdonságai parancsjel (voltage command) 10 msec
Két mikroelektródás voltage clamp teszt potenciál parancsjel (voltage command) holding potenciál makroszkópikus nátrium-áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. makroszkópikus nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik makroszkópikus nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 300 felvétel szummája makroszkópikus nátrium áram
Nátrium csatornák tulajdonságai 1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus nátrium áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák inaktivációja miatt a másodszori nyitás nagyon ritka 300 felvétel szummája makroszkópikus nátrium áram
1. A csatornák vagy nyitott vagy zárt állapotban vannak. 2. A csatornanyitások csak rövid rövid események a makroszkopikus áramhoz viszonyítva. 3. A csatornanyitások időtartama és latenciája nagyon változó és előfordul, hogy a csatorna ki se nyílik 4. A csatornák nyitási valószínűsége hasonló a makroszkópikus áramhoz 5. A csatornák többször is kinyílhatnak, ha nincs inaktiváció Slowly inactivating K current channel (Ram & Dagan, 1987)
Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Cell-Attached
Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Insideout patch
Patch clamp technika konfigurációi On- Cell Whole Cell
Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell
Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell outsideout patch
Whole cell konfiguráció
Whole cell konfiguráció
Whole cell konfiguráció R s R c C m C m R s
A whole cell konfiguráció Intracelluláris oldat Mikropipetta Patch-clamp erősítő Extracelluláris oldat + _ + + + + + + + Sejt _ + + IBM PC -20 mv... +50 mv -40 mv 10 ms... 5000 ms
Run-down jelenség ATP-függő kálium áram
Run-down jelenség L típusú kalcium áram
Patch clamp technika konfigurációi Whole Cell Whole Cell, perforated patch - amphotericin-b - nystatin
Run-down jelenség L típusú kalcium áram
Sejtizoláció - Ca 2+ - mentes perfúzió - emésztés (kollagenáz...) - mechanikai agitáció
L típusú kalcium áram 400 ms 0 mv -40 mv 100 ms 200 pa
L típusú kalcium áram -40 mv -35 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -30 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -25 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -20 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -15 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv -10 mv I Ca amplítúdó (pa) 0-400 -800-1200 -40-20 0 20 40 60 Potenciál (mv)
L típusú kalcium áram -40 mv 55 mv I Ca amplítúdó (pa) 0 Áram-feszültség (I-V) karakterisztika -400-800 -1200-40 -20 0 20 40 60 Potenciál (mv) előinkubáció anyag kimosás 5-10 perc 5-10 perc 10-15 perc