Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Vörösvértestmembránokra ható vegyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata Ágner Gabriella Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola 6. sz. program: Ionizáló és nemionizáló sugárzások biológiai hatásai Témavezető: Dr. Blaskó Katalin Programvezető: Dr. Rontó Györgyi 2001
Összefoglalás A Pseudomonas syringae pv. syringae növényi kórokozó baktérium által termelt ciklikus lipodepszipeptidek (CLP), a syringomycin E (SRE) és a syringopeptin 22A (SP22A) fungicid hatást gyakorolnak különböző gombafajokra. A vegyületek hatásának fő támadáspontja a sejtmembrán. A CLP-ek vagy származékaik a szisztémás gombás betegségek terápiájában is felhasználásra kerülhetnek, ezért fontos, hogy megismerjük a vörösvértestekre kifejtett hatásukat. A CLP-ek emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatását radioizotópos transzportkinetikai módszerekkel vizsgáltuk. A SRE 2 x 10 6 molekula/sejt-nél nagyobb koncentráció esetén a sejtek egy részén igen gyors és irreverzibilis hemolízist hoz létre és a lízis mértéke a mérés során változatlan marad. A SP22A által okozott lassú és a sejtek duzzadásával járó hemolízis a kolloid ozmotikus mechanizmus eredményeként jön létre. 2 x 10 6 molekula/sejt-nél nagyobb koncentrációban alkalmazott SRE hatására megnőtt a lízist túlélő vörösvértestek membránjának ionáteresztőképessége, a SP22A pedig már a lízisküszöb alatti koncentrációban is megnövelte a membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitását. A permeabilitás-növekedés oka, hogy a CLP-ek a vörösvértestmembránban pórusokat képeznek és az ionok ezeken keresztül szabad diffúzióval áramlanak. A SP22A hatására a membrán 86 Rb + -permeabilitása átlagosan négyszerese az azonos koncentrációjú SRE hatására létrejött 86 Rb + -permeabilitásnak. Meghatároztuk a két CLP megoszlási hányadosát a vörösvértestmembrán és az extracelluláris tér között és megállapítottuk, hogy a SRE megoszlási hányadosa négyszerese a SP22A-ének. Ebből arra következtettünk, hogy a két vegyület hatására létrejövő különböző mértékű permeabilitás növekedés oka a SP22A nagyobb pórusképző aktivitása, és nem az eltérő lipofilitás miatt a membránban létrejött különböző hatóanyag koncentráció. A SRE-pórusok meghatározott élettartammal rendelkeznek, majd időben inaktiválódnak. A csatorna-inaktiválódás sebessége nagymértékben függ a hőmérséklettől. A SRE-pórusok 37 C-on már 15 20 perc alatt inaktiválódnak, 20 Con csak 40 50 perc alatt, míg 6 C-on, a vörösvértestmembrán fő lipidjeinek fázisátalakulási hőmérséklete alatt nem lép fel inaktiváció. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a SRE-pórus inaktivációs mechanizmusában fontos szerepük van a membránt 1
alkotó lipideknek. A SP22A-pórusok a vizsgált időtartamban, 90 perc alatt még testhőmérsékleten sem inaktiválódnak. Az emberi vörösvértestmembrán lipidösszetételét megváltoztatva megvizsgáltuk az egyes szterolok SRE-pórusképzésre gyakorolt hatását. Megállapítottuk, hogy a membrán koleszterintartalmának csökkentése ill. ergoszterinre történő részleges szubsztitúciója megnöveli a pórusképző aktivitását. A koleszterinnek az SREpórusképződést gátló hatása fontos lehet a SRE szisztémás alkalmazása szempontjából. Summary The cyclic lipodepsipeptides (CLPs) syringomycin E (SRE) and syringopeptin 22A (SP22A) produced by the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. syringae have fungicidal activity on different fungi. The primary site of their action is the plasma membrane. The molecules or their derivatives may also be perspective drugs in the therapy of systemic opportunistic mycoses so it seems to be important to know their effect on red blood cells. Transport kinetic methods were used to study the action of CLPs on human red blood cells (RBCs). SRE above the concentration of 2 x 10 6 molecules/cells lyses a fraction of cells in a fast and irreversible way, then the extent of lysis remains constant. The SP22A induced relatively slow hemolysis accompanied by the swelling of cells is based on the colloid osmotic mechanism. Above the concentration of 2 x 10 6 molecules/cells SRE increases the ion permeability of the lysis survived cells, while SP22A has that effect already below the lytic threshold concentration. The permeability increase was explained by the formation of CLP-pores in RBC membranes and the free diffusion of ions through these pores. The SP22A-induced 86 Rb + -permeability is about 4 times of that induced by SRE at the same concentration. The partition coefficients of both CLPs between the RBC membrane and the extracellular space were determined. It was found that the partition coefficient of SRE is 4 times higher than that of SP22A. It was concluded that the different permeability increases induced by the 2 CLPs is the result of the higher pore-forming activity of SP22A as compared to that of SRE and not that of the different CLP concentration in the membrane due to the different lipophilic character of the molecules. SRE forms pores with well defined life times then they inactivate in time. The 2
speed of pore inactivation depends strongly on temperature. The SRE pores are inactivated at 37 C in 15 20 min, at 20 C only in 40 50 min, while at 6 C, below the phase temperature of the major lipid components of the human RBCs there is no pore inactivation. This result indicates that the lipids are involved in the mechanism of the SRE pore inactivation. With SP22A no pore inactivation was observed during the measurement (in 90 min after the addition of SP22A) even at 37 C. The influence of sterols on the SRE-pore formation was studied after altering the membrane sterol composition of the human red blood cells. Partial depletion of cholesterol or partial substitution by ergosterol increased the pore-forming activity of SRE compared to membranes with unaltered sterol composition. The protective role of cholesterol in the pore-forming activity of SRE may be an important factor in the perspective therapeutic use. I. Bevezetés és célkitűzések A Pseudomonas syringae pv. syringae növényi kórokozó baktérium által termelt lipodepszipeptidek, a syringomycin E (SRE) és a syringopeptin 22A (SP22A) fungicid hatást gyakorolnak különböző gombafajokra. A vegyületek hatásának fő támadáspontja a sejtmembrán. A molekulák vagy származékaik a terápiában is felhasználást nyerhetnek, ezért a vörösvértestekre kifejtett hatásuknak, mint potenciális szisztémás gombaellenes szerek hatásának ismerete fontos lehet. A vörösvértestmembrán, mint egyszerű, ugyanakkor természetes biológiai membrán, modellként szolgál különböző membránra ható gyógyszermolekulák, elsősorban ionofór antibiotikumok által előidézett iontranszport-folyamatok kinetikai vizsgálatáran is. Ilyen meggondolások alapján vizsgáltuk a SRE és a SP22A emberi vörösvértestekre gyakorolt hatásait transzportkinetikai módszerekkel. Munkánk célja volt, hogy a két lipodepszipeptidnek az emberi vörösvértestmembránon keresztül a transzportfolyamatokra gyakorolt befolyását tanulmányozzuk, és megvizsgáljuk az iontranszport-növelő hatás mechanizmusait. Különös érdeklődéssel vizsgáltuk a szterolok esetleges jelentőségét a SRE-nek az emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásában, mivel korábbi adatok szerint ezek a lipidek játszanak szerepet a SRE gombaellenes hatásában. 3
II. Módszerek Az általunk alkalmazott legfontosabb vizsgálati módszerek közül megemlítem a radioizotópos transzportkinetikai módszert, a vér különböző paramétereinek (hematokrit érték, vörösvértestszám, méreteloszlás) meghatározását COBAS-MICROS hematológiai automatával, hemoglobin koncentráció mérését spektrofotometriásan, ciánmethemoglobinná történő átalakítás után, a vörösvértestek membránpotenciáljának meghatározását fluorimetriás módszerrel, a sejtmembrán koleszterin és ergoszterintartalmának mérését spektrofotometriásan. A vörösvértestek szterolösszetételét liposzómás előkezeléssel változtattuk meg. III. Eredmények és megbeszélés A SRE hemolízist okozó és pórusképző hatása emberi vörösvértestmembránon 2 x 10 6 molekula/sejt koncentráció alatt a SRE nem okoz mérhető hemolízist. Ennél nagyobb koncentrációk esetén a SRE hatására az emberi vörösvértestek egy része igen gyorsan (2 percen belül) hemolízist szenved és ezután a lízis mértéke nem növekszik tovább 50 percen át. Viszonylag széles koncentrációtartományban ((2 12) x 10 6 molekula/sejt) a lízis mértéke közel lineáris függvénye a SRE koncentrációnak. A sejtek átlagos mérete SRE hatására nem változik. Mindezek arra engednek következtetni, hogy a SRE a sejtekben véletlenszerű eloszlást követ, a sejtek egy része elegendően sok SRE molekulát köt meg ahhoz, hogy igen gyorsan lízist szenvedjen, ami irreverzibilis szerkezeti változás következménye. Az épen maradt sejtek ionpermeabilitása megnövekszik, ennek következtében a 86 Rb + gyors kiáramlását követhetjük nyomon. Az iontranszport a SRE által a vörösvértestekben képződött pórusokon keresztül zajlik. 37 C-on a K + Na + -ATP-áz enzim aktivitása a vörösvértestmembránban nagy, azonban mivel a K + Na + -pumpát gátló ouabain jelenléte a SRE hatására kialakult 86 Rb efflux kinetikáját nem befolyásolja, ezért az aktív transzport szerepét kizártuk. A 86 Rb + efflux kinetikája a SRE hozzáadása után igen jellegzetes: a gyorsan 4
meginduló transzport néhány perc alatt telítésbe megy. A telítési érték azonban kisebb, mint a sejtek intra- és extracelluláris tere közötti egyensúlyi ioneloszlásnak megfelelő érték (N ) volna. A 86 Rb + efflux kinetikáját kétféleképpen magyarázhatjuk: 1, vagy azt feltételezzük, hogy a diffúzió valamennyi lízist túlélő sejten keresztül kialakult SREpórusokon keresztül folyik, majd 5 6 perccel a SRE hozzáadása után az összes pórus egyszerre inaktiválódik, 2, vagy azt feltételezzük, hogy a SRE hatására a vörösvértestekben háromféle populáció jön létre: 1, lizált sejtek, 2, módosított sejtek, 3, módosítatlan sejtek. A transzport csak a módosított sejtekben levő SRE-pórusokon keresztül jön létre, a módosítatlan sejtekben vagy nincsenek SRE-pórusok, vagy nem zajlik rajtuk transzport. A kérdés megválaszolásához előrevisz az a tapasztalat, hogy a lízist nem szenvedett sejtekből mind a 86 Rb +, mind a hemoglobin kiáramlását ki tudtuk mutatni. Dalla Serra és mtsai szerint a pórusok mérete függ a SRE koncentrációtól. Az általunk alkalmazott SRE koncentráció esetén a pórusok átmérőjét 3,3 3,4 nm-nek becsültük. A monomer hemoglobin átmérője gömb alakú molekulát feltételezve körülbelül 3 nm. A hemoglobin disszociációs állandói (tetramer/dimer K d = 4 x 10-6 mol/l, dimer/monomer K d = 3 x 10-9 mol/l) alapján a vörösvértestekben a monomer hemoglobin koncentrációja 10-6 mol/l. Mindezek alapján úgy véljük, hogy a hemoglobin a sejtekből monomer formában jut ki a SRE-pórusokon keresztül. A hemoglobin efflux kinetikáját két exponenciális függvény eredőjeként tudtuk jellemezni. Eredményeink szerint a transzport sebessége a SRE adagolás után 15 20 perccel csökken, de egy óra múlva sem fejeződik be teljesen. Ez a tapasztalat ellentmond a 86 Rb + transzportkinetika olyan értelmezésének, ami szerint valamennyi sejtben kialakulnak SRE-pórusok, amik rövidesen inaktiválódnának. Ekkor ugyanis a 86 Rb + -nál nagyobb méretű hemoglobin transzportnak is le kellene állnia. Ezért úgy véljük, hogy a transzport a módosított sejtek membránján keresztül zajlik, a módosítatlan sejtek izotóptartalma nem vesz részt a egyensúlyi ioneloszlásban. Így a telítési N t érték megegyezik a módosított sejtek intracelluláris tere és az extracelluláris tér közötti egyensúlyi ioneloszlásnak megfelelő értékkel (N (mód)). A 5
kisméretű 86 Rb + tehát igen gyorsan áramlik ki a módosított sejtekből, néhány perc alatt kialakul az egyensúlyi ioneloszlás a sejtek intracelluláris tere és az extracelluláris tér között, ekkor a 86 Rb + transzport leáll. A nagyobb méretű hemoglobin molekula transzportsebessége kisebb, a 86 Rb + -ra ill. a hemoglobinra vonatkozó permeabilitási állandók aránya (p Rb /p Hb 7 1) megfelel a hemoglobin és a hidratált Rb + méretarányának, vagyis mindkét ion szabad diffúzióval áramlik a SRE-pórusokon keresztül. A hemoglobin transzport sebességének későbbi megváltozása, a membrán hemoglobinra vonatkozó permeabilitásának csökkenése arra utal, hogy a SRE-pórusok meghatározott élettartammal rendelkeznek, ez 15 20 perc, majd inaktiválódnak. Eredményeink összhangban állnak Kaulin és mtsai BLM-en nyert eredményeivel is. Single channel vezetőképesség-méréseik szerint a SRE a lipid bilayer membránon kis és nagy pórusokat képez, ez utóbbiak hat kis pórusból álló clusterek. A nagy pórusok vezetőképessége hatszor nagyobb a kicsikénél. A mi vörösvértestmembránon nyert eredményeinkből ugyancsak kis és nagy pórusok létrejöttére következtethetünk. A SREvel kezelt vörösvértestmembránban a módosított sejtekben nagy pórusok képződnek, míg a módosítatlan sejtek csak kis méretű pórusokat tartalmaznak. A rajtuk keresztül végbemenő transzport sebessége elhanyagolhatóan kicsi a nagy pórusokon keresztül létrejövő transzport mértékéhez képest. BLM-en végzett kísérletek alapján a SRE-csatornák gyenge anionszelektivitást mutatnak, a csatorna tulajdonságai függnek a membrán két oldala közé kapcsolt feszültségtől. Megvizsgáltuk a vörösvértestmembránban a SRE által képzett csatornák érzékenységét a membránpotenciál nagyságára és polaritására. Emberi vörösvértesteken a SRE pórusképző aktivitása gyakorlatilag független a vörösvértestek külső és belső tere között kialakított membránpotenciáltól. A SRE-pórusok inaktivációja SRE-rezisztens mutáns S. cerevisiae törzseken nyert eredmények arra utaltak, hogy a SRE fungicid hatásában a lipideknek szerepük van. A SRE lipopeptid szerkezetéből adódóan kölcsönhatásba léphet a vörösvértestmembrán lipidjeivel is, ami előmozdíthatja a SRE penetrációját a membránba. Tapasztalataink szerint a hemoglobin transzportsebessége 37 C-on a SRE hozzáadása után 15 20 perccel csökken, amit 6
pórus-inaktivációval értelmezünk. Ebben a folyamatban a lipidek ugyancsak szerepet játszhatnak. Mivel a lipidek mozgékonyságát a hőmérséklet döntően befolyásolja, ezért megvizsgáltuk a hőmérséklet hatását a SRE pórusképző aktivitására, pontosabban a pórusok jelenlétét jellemző 86 Rb + transzportra. A testhőmérsékleten (37 C), szobahőmérsékleten (20 C), valamint 6 C-on mért 86 Rb + -efflux kinetikája alapján megállapítottuk, hogy a vizsgált hőmérsékleteken azonos koncentrációjú SRE hatására létrejött 86 Rb + transzport kinetikája hasonló a módosított sejtekben. Mindhárom hőmérsékleten a transzport egyetlen exponenciális függvénnyel jellemezhető. A lizált valamint a módosított sejtek arányában sincs szignifikáns különbség. Mindez arra mutat, hogy a hőmérséklet nem befolyásolja a SRE penetrációját. A 37 C-on, 20 C-on ill. 6 C-on mért hemoglobin efflux kinetikája különböző. Testhőmérsékleten és szobahőmérsékleten a kinetika két különböző kitevőjű exponenciális függvénnyel jellemezhető, a kitevők változását 37 C-on a SRE hozzáadás után 15 20 perccel tapasztaltuk. Szobahőmérsékleten a transzportsebesség megváltozása a 37 C-hoz képest 20 30 perccel később jelenik meg, míg 6 C-on a transzport sebessége 90 perc alatt sem változott. E tapasztalatot a csatornák inaktivációjával magyarázzuk, ami a hőmérséklettől függ. Az értelmezéshez tekintetbe kell venni azt a tényt, hogy a SRE által okozott gyors 86 Rb + efflux 37 ill. 20 C-on még a csatornák inaktivációja előtt eléri az egyensúlyi eloszlásnak (N (mód)) megfelelő értéket, ezért a 86 Rb + transzport mindegyik hőmérsékleten egyetlen exponenciális függvénnyel írható le. A hemoglobin transzporkinetika azt tükrözi, hogy a transzport sebessége kisebb, mint a rubídiumé, és időben is változik. A nagyobb méretű hemoglobin molekula lassabban vándorol kifelé, és az időben jelentkező csatornainaktiváció tovább csökkenti a transzport-sebességet. A 6 C-on végzett mérések a vörösvértestmembrán lipidjeinek fázisátalakulási hőmérséklete alatt történtek, ezen a hőmérsékleten mind a 86 Rb +, mind a hemoglobin transzport sebessége változatlan. A fázisátalakulási hőmérséklet alatt a lipidek mozgása a membránban gátolt, feltételezhető, hogy a membrán-lipidek szerepet játszhatnak a SRE pórusok inaktivációjában is. BLM-en a SRE-clusterek syringomycinből és foszfolipidekből felépülő komplexek. Úgy véljük, hogy a komplexeken belül magasabb hőmérsékleten a lipidek és a SRE molekulák egymás közti elmozdulása lehetséges, és 7
ez konformáció-változáshoz, azaz a csatorna inaktivációjához vezethet. Minél magasabb a hőmérséklet, és ennek következtében minél nagyobb a membrán fluiditása, annál kifejezettebb lehet a SRE lipid komplex mozgása, ezért 37 C-on gyorsabban kialakulhat az inaktiváció, mint 20 C-on. Fázisátalakulási hőmérséklet alatt viszont a lipidek mozgása gátolt, valószínűleg ezért nem észlelhető 6 C-on pórus-inaktiváció. DOPS/DOPE-ből (1/1) készített BLM-en végzett vezetőképesség-mérések alapján a SRE-pórusok inaktivációja modell lipid membránokon is függ a hőmérséklettől. 17 C-on a SRE-vel kezelt membrán integrált vezetőképessége időben nem változik, 23 C-on azonban a SRE hatására megnövekedett vezetőképesség 15 20 perccel a SRE adagolás után folyamatosan csökken. Ennek oka lehet vagy a nyitott pórusok számának csökkenése, vagy a pórusok tulajdonságainak (élettartam, vezetőképesség) megváltozása. Single channel kísérletekkel bizonyítottuk, hogy az egyes pórusok vezetőképessége és élettartama időben nem változik, így az inaktivációt a nyitott pórusok számának csökkenése okozza. A SRE-pórusok számának csökkenése testhőmérsékleten fontos élettani jelentőséggel rendelkezhet. A clusterképződés BLM-en a SRE és a lipidek kölcsönhatásának következménye. Eredményeink alapján úgy véljük, hogy a vörösvértestmembránban is hasonló kölcsönhatás játszódik le: a SRE-pórus képzésében nagyszámú lipidmolekula vesz részt, ez a membrán szerkezeti integritását megzavarja. A pórus-inaktiváció a membránszerkezet visszaállítása érdekében egy védekező mechanizmus lehet. Ez a védekező mechanizmus fiziológiás oldatban szuszpendált vörösvértestmembránon, testhőmérsékleten viszonylag gyorsan (15 20 perc alatt) lezajlik, így a SRE relatív kis toxicitásának a fizikai hátterét jelentheti. Ma még nem ismert az, hogy hasonló inaktivációs folyamat gombasejteken is létrejön-e. Ha nem jön létre, akkor az emberi vörösvértesteken kialakuló inaktiváció alapja lehet a SRE gombasejtekre gyakorolt szelektív terápiás hatásának. A vörösvértestmembrán szterolösszetételének hatása a SRE pórusképző aktivitására A gomba ergoszterin szintéziséért felelős gén, a SYR 1 hiányzik bizonyos SRErezisztens S cerevisiae fajokból, Feigin és mtsai szerint pedig a szterolok befolyásolják a SRE-nek a modellmembránokra gyakorolt hatását. Mi humán vörösvértesteken azt 8
tanulmányoztuk, hogy a membrán szterolösszetétele mennyiben módosítja a molekula hatását. Összehasonlítottuk az azonos koncentrációjú SRE által három különböző szterol-összetételű vörösvértestmembránon létrehozott 86 Rb + efflux kinetikáját. Ezek rendre: koleszterin helyett részben ergoszterint tartalmazó; csökkent koleszterint; valamint normál koleszterint tartalmazó vörösvértestek voltak. Megállapítottuk, hogy a csökkent koleszterintartalmú és a részben ergoszterin-tartalmú membránon igen gyors a 86 Rb + transzport, ami néhány perc alatt eléri a módosított sejtek és az extracelluláris tér közti egyensúlyi ioneloszlásnak megfelelő értéket. A változatlan szterolösszetételű sejtek esetében ez az egyensúly lassabban alakul ki. A módosított koleszterintartalmú sejtek 86 Rb + -permeabilitása három hat-szorosa a normál koleszterintartalmú sejtekének, ami a koleszterinnek a pórusképződést gátló hatására utal. A különböző szterol-összetételű vörösvértestmembránokon azonos koncentrációjú SRE hatására lizált és módosított sejtek koncentrációja tekintetében nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést. Ez a tény arra utal, hogy a szterolok nem befolyásolják a SRE penetrációját a membránba. Csökkent koleszterint, vagy részben ergoszterint tartalmazó membránon a SRE hozzáadása után mért hemoglobin efflux kinetikája igen hasonló a normál szterolösszetételű sejteken mért hemoglobin transzportéhoz. Ami azt valószínűsíti, hogy a szterolok nem játszanak szerepet a SRE-pórusok inaktivációjában. A bemutatott eredmények alapján arra következtethetünk, hogy a szterolok nem befolyásolják a SRE bejutását a membránba, de jelentősen megnövelik már beépült SRE csatornaképző aktivitását. Feiginnek és mtsainak BLM-en nyert eredményei szerint a koleszterin közvetlenül nem vesz részt a SRE pórusok felépítésében, de a membránban megnöveli a SREpórusképződéshez szükséges aktiválási energiát. Ez az adat értelmezheti az általunk tapasztalt megnövekedett pórusképző aktivitást részleges koleszterin-kivonás hatására. Az ergoszterin a koleszterinnél kisebb mértékben növeli meg a SRE-csatornaképzéshez szükséges energiát, ami összhangban van azzal az eredményünkkel, hogy a koleszterin helyett részben ergoszterint tartalmazó vörösvértestmembránban ugyancsak nagyobb a SRE-pórusképződés, mint a normál szterolösszetételű sejteken. Ez az eredményünk fontos lehet a SRE-nek (vagy bizonyos származékainak) későbbi terápiás alkalmazása szempontjából. A terápiában megcélzott gombasejtek ugyanis ergoszterint tartalmaznak, így ezekre várhatóan a SRE erősebben hat, mint a koleszterin-tartalmú emberi 9
vörösvértestekre. A SP22A hemolízist okozó és pórusképző hatása emberi vörösvértestmembránon Kimutattuk, hogy a SP22A az emberi vörösvértestek egy részén hemolízist okoz, a lízis 10-15 perc alatt alakul ki és a sejtek térfogatának növekedésével jár. Ez az eredmény egybevág Hutchison és mtsai feltételezésével, hogy a syringopeptinek által okozott hemolízis kolloid ozmotikus mechanizmus alapján jön létre: a sejtekben képződő pórusokon keresztül az ionok és a víz beáramlását követően a sejtek megduzzadnak, és a megnövekedett térfogat szétfeszíti a sejtet. A SP22A hemolízist okozó hatása 2 x 10 6 molekula/sejt-nél nagyobb koncentráció esetén volt mérhető és a lízis mértéke a koncentrációval szigmoid függvény szerint változott. A lízis Hill szerinti ábrázolásából a Hill együttható 2,8-nak adódott, ami azt jelzi, hogy a hemolízis SP22A molekulák oligomerizációjának eredménye, a monomerek száma az oligomerben legalább 3. Meg kell említeni, hogy a Hill féle ábrázolás során nyert egyenes meredeksége gyakran alábecsüli az oligomerek számát, ezért jelen esetben is inkább csak közelítő becslésre alkalmas. Kimutattuk, hogy a SP22A már a lízisküszöb alatti koncentrációban is jelentősen megnöveli a membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitását: SP22A (4 x 10 5 molekula/sejt koncentráció) hatására gyorsan megindul a 86 Rb + kiáramlása, és 7 x 10 5 molekula/sejtnél nagyobb SP22A koncentrációnál a 86 Rb + -efflux eléri az összes vörösvértest intra és extracelluláris tere közötti egyensúlyi ioneloszlásnak megfelelő (N értéket. A 37 C-on mért 86 Rb + efflux kinetikáját egyetlen exponenciális függvénnyel jellemeztük, a transzport sebessége 80 perc alatt sem változik. Ebből arra következtetünk, hogy a SP22A-pórusok még testhőmérsékleten sem inaktiválódnak. Ezt BLM-en végzett méréseink is megerősítik, a DOPS/DOPE (1/1)-ből készített lipid bilayer membránon 2,5 órán keresztül nem változott a SRE-pórusok vezetőképessége 23 C-on. Megállapítottuk, hogy a SP22A-val kezelt membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitási állandója a SP22A koncentráció harmadik hatványával arányos. Ez arra utal, hogy a pórusképzés a SP22A oligomerizáció eredménye és a pórusképzésben résztvevő monomerek száma legalább 3. 10
A SRE és a SP22A emberi vörösvértestmembránra gyakorolt hatásainak összehasonlítása SRE hatására a vörösvértestek egy része igen gyorsan hemolízist szenved. A hemolízist túlélő sejtek mérete nem változik a SRE hozzáadása után, azaz a hemolizált sejtek nem záródnak vissza. Ez arra utal, hogy a lízis irreverzibilis folyamat. A SP22A által okozott lízis 10 15 percig tart és a sejtek duzzadásával jár. Ebből arra következtettünk, hogy a SP22A által okozott hemolízis kolloid ozmotikus mechanizmus eredménye. A SRE által okozott gyors hemolízis mechanizmusát még nem ismerjük pontosan. A hemolízis mindkét lipodepszipeptid esetén egy küszöbkoncentráció (2 x 10 6 molekula/sejt) felett jelentkezik. A hemolízis mértékét a CLP koncentráció függvényében Hill szerint ábrázolva megállapítottuk, hogy mindkét lipodepszipeptid által előidézett hemolízis oligomerizációval járó folyamat eredménye, ahol a monomerek száma minimum 2 3. Mindkét CLP, a SRE és a SP22A is megnöveli az emberi vörösvértestmembrán 86 Rb + -áteresztőképességét, az emberi vörösvértestmembránban kétféle, kis és nagy pórusokat képez, amiken keresztül az ionok (SP22A-pórusokon a 86 Rb +, SREpórusokon a 86 Rb + és a hemoglobin) szabad diffúzióval áramlanak kifelé. A nagy pórusok 6 kis pórusból álló clusterek. SRE esetében a kis pórusokkal rendelkező ún. módosítatlan sejtek permeabilitása elhanyagolható a nagy pórusokat is tartalmazó ún. módosított sejtek permeabilitásához képest. Ezért a 86 Rb + transzport csak ez utóbbiakon keresztül zajlik, és eléri az egyensúlyi ioneloszlást a módosított sejtek intracelluláris tere és az extraceluláris tér között. Ezzel szemben a SP22A esetében valamennyi sejt módosított, így a transzport az összes sejten keresztül zajlik addig, amíg el nem éri az egyensúlyi eloszlásra jellemző értéket (N ). A SP22A-val kezelt vörösvértestmembránon 86 Rb + efflux a lízisküszöb egyötödénél, 4 x 10 5 molekula/sejt koncentráció felett mérhető. A membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitási állandója a SP22A koncentrációval hatványfüggvény szerint változik, a koncentráció harmadik hatványával arányos. Ez jó egyezést mutat a hemolízis alapján számolt Hill együttható értékével (2,8) és megerősíti, hogy a SP22Anál a lízis és az ionpermeabilitás-növekedés egyaránt oligomerizációs folyamat, a több 11
molekulából álló SP22A-pórusok kialakulásának következménye. A SRE esetében az a minimális koncentráció, ami felett 86 Rb + - ill. hemoglobin-efflux mérhető, megegyezik a hemolízist okozó hatásnál nyert küszöbkoncentrációval. E koncentráció felett a SRE-vel kezelt membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeábilitási együtthatója és a SRE koncentráció között közel lineáris összefüggés. Ez a lineáris kapcsolat nincs ellentmondásban az oligomerizációval, tekintetbe véve, hogy a SRE-pórusok inaktiválódnak. Az inaktivációra annak alapján lehetett következtetni, hogy SRE hatására a hemoglobin efflux 37 C-on két exponenciális függvény eredőjeként jellemezhető, a transzportsebességi állandó 15 20 perccel a SRE hozzáadása után csökken. A SP22A esetében csatorna-inaktiváció a vizsgálat ideje alatt nem volt megfigyelhető. A SP22A pórusok inaktiválódásának hiánya a két CLP eltérő szerkezetével magyarázható. A két molekula nettó töltése ugyan azonos, és a lipid-farokrész nagysága is közel egyező, mégis a SRE-t alkotó 9 aminosav többsége poláros, a SP22A pedig nagyobb részt apoláros aminosavakból áll, tehát erősebben lipofil. A SP22A mérete is nagyobb a SRE méreténél. Úgy véljük, hogy a membrán lipidmolekulái között a nagyobb, hidrofób molekula szerkezetileg kevésbé idegen, ezért az inaktivációs védekező mechanizmus kisebb valószínűséggel alakul ki ellene, mint a hidrofilebb SRE-pórusok ellen. A SRE esetében a szervezetnek ez a védekező mechanizmusa egyben e vegyület terápiás előnyét is jelezheti a SP22A-val szemben. A 86 Rb + -ra és a hemoglobinra vonatkozó transzport-sebességi állandók aránya a SRE-vel kezelt membrán esetében megfelel a hemoglobin- és a hidratált 86 Rb-ion felületek arányának, ez támasztja alá, hogy mindkét ion szabad diffúzióval jut ki a SRE pórusokon keresztül. A SP22A-pórusokon keresztül a 86 Rb-ionok szabadon áramolhatnak, ugyanakkor a hemoglobin nem. Ez az eredmény összhangban áll Dalla Serra és mtsainak eredményeivel. Az általunk alkalmazott koncentrációban ugyanis a SRE-pórusok átmérője 3,3 3,4 nm, így e pórusokon a kb. 3 nm átmérőjű hemoglobin monomer szabadon átjuthat, ezzel szemben a SP22A-pórus átmérője koncentrációtól függetlenül 1,8 nm, ennélfogva az ennél nagyobb méretű hemoglobin monomer nem haladhat át a SP22A-pórusokon. A 2 x 10 6 molekula/sejt SRE-vel ill. SP22A-val kezelt membrán 86 Rb + -ra vonatkozó permeabilitási állandóinak összehasonlítása azt mutatja, hogy az utóbbi körülbelül négyszerese a SRE-vel kezeltének. Lipid bilayer membránon nyert 12
eredményeink azt mutatják, hogy azonos vezetőképesség-növekedés előidézéséhez a SRE-ből tízszeres koncentráció alkalmazása szükséges, mint SP22A-ból. A SP22A SRE-hez viszonyított erősebb lipofil tulajdonsága arra utal, hogy az előbbi megoszlási hányadosa nagyobb lehet az utóbbiénál. Meghatároztuk a SRE-nek, ill. a SP22A-nak a vörösvértestmembrán és az extracelluláris tér közötti megoszlási hányadosát, ami SRE esetében kb. négyszer nagyobb érték, mint SP22A-nál. Ennek alapján megállapítottuk, hogy SP22A hatására létrejött nagy permeabilitás a membránba beépült SP22A molekulák nagyobb pórusképző aktivitásárval értelmezhető. A SRE-nek a SP22A-hoz viszonyított kisebb pórusképző aktivitása nem csökkenti az első vegyület terápiás értékét a másodikkal szemben, ellenkezőleg, a humán vörösvértestmembránon kapott kisebb hatás a vegyület kisebb toxicitását mutatja. Az a tapasztalat, hogy a szterolban szegény, vagy részben ergoszterint tartalmazó, a gombasejt membránjához közelítő szterol-összetételű vörösvértesteken a SRE pórusképző aktivitása jelentősen megnövekedett, biztató lehet a SRE későbbi, terápiás felhasználása szempontjából. IV. Új tudományos eredmények 1. Mindkét általunk vizsgált lipodepszipeptid, a SRE és a SP22A is hemolizálja a vörösvértestek egy részét és megnöveli a vörösvértestmembrán ionpermeabilitását. 2. A membrán ionpermeabilitás-növelő hatás pórusképződésen alapul, amely a lízishez hasonlóan oligomerizációs folyamat eredménye. 3. A SRE megoszlási hányadosa nagyobb, pórusképző hatása kisebb, mint a SP22A-é. 4. A SRE pórusok időben hőmérséklettől függően inaktiválódnak, a SP22A pórusok nem. A testhőmérsékleten 15-20 percnél jelentkező inaktivációnak szerepe lehet a sejtek védekező mechanizmusában a membrán szerkezeti integritását megbontó idegen anyag ellen. 5. Csökkent koleszterin-tartalmú vagy részben ergoszterint tartalmazó vörösvértestmembránon a SRE pórusképző hatása megnövekedett. Ennek 13
jelentősége lehet a SRE-nek vagy származékainak későbbi terápiás felhasználása szempontjából. V. Saját közlemények: I. Blasko, K., Schagina, L. V., Agner, G., Kaulin, Yu. A., Takemoto, J. Y., Membrane sterol composition modulates the pore forming activity of syringomycin E in human red blood cells, Biochim. Biophys. Acta 1373: 163 169, 1998. II. Agner, G., Kaulin, Yu. A., Schagina, L.V., Takemoto, J.Y., Blasko, K., Effect of temperature on the formation and inactivation of syringomycin E pores in human red blood cells and bimolecular lipid membranes, Biochim. Biophys. Acta 1466: 79 86, 2000. III. Agner, G., Kaulin, Yu. A., Gurnev, P. A., Szabo, Zs., Schagina, L. V., Takemoto, J. Y., Blasko, K., Membrane permeabilizing activities of cyclic lipodepsipeptides, SP22A and syringomycin E from Pseudomonas syringae pv. syringae in human red blood cells and in bilayer lipid membranes, Bioelectrochemistry 52: 161 167, 2000. VI. Előadások, poszterek: I Ágner G., Tölgyesi F., Ullrich B., Blaskó K., Membránpotenciál meghatározása humán vörösvértesteken fluoreszcencia intenzitás mérése alapján, Pharma kollokvium, Budapest, 1997, II Agner, G., Schagina, L.V.,. Kaulin, Yu. A, Takemoto, J.Y., Blaskó, K., Steroldependent pore formation of syringomycin E on red blood cell membranes. J. Eur. Biophys, (1997) 26/1, p.66. (II. European Biophysical Congress, Orléans, 1997). III Agner, G., Schagina, L.V.,. Kaulin, Yu. A, Takemoto, J.Y., Blaskó, K., Sterolmodulated pore formation of syringomycin E on red blood cell membranes. A Magyar Biofizikai Társaság XVIII. Vándorgyűlése, Pécs, 1997. IV Agner, G., Blaskó, K., Syringomycin E membrán ionpermeabilitására gyakorolt hatásának vizsgálata emberi vörösvértesteken, IV. Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 1998. 14
V Agner, G., Blaskó, K., Syringomycin E emberi vörösvértestmembrán ionpermeabilitásra gyakorolt hatásának vizsgálata, SOTE PhD Tudományos Napok 99, Budapest, 1999. VI Blaskó, K., Agner, G., Syringomycin E csatornaképződés kinetikai vizsgálata vörösvértest membránon, A Magyar Biofizikai Társaság XIX. Vándorgyűlése, Kecskemét, 1999. 15