Dako EnVision+ System-HRP (DAB) Nyúlban termelt elsıdleges antitestekkel történı használatra Kód K4010 15 ml Kód K4011 110 ml Alkalmazás In vitro diagnosztikai felhasználásra. Ezek az elıirások érvényesek a Dako EnVision+ System, Peroxidase-HRP rendszerre. Ez a kit antigének nyúlban termelt, a felhasználó által alkalmazott, elsıdleges ellenanyagok felhasználásával történı minıségi kimutatására szolgál fénymikroszkóppal, normál és patológiás, paraffinba ágyazott szöveteken, fagyasztott metszeteken vagy sejt-preparátumokon A szövetek elıkészítéséhez számos fixáló használható, pl. etanol, B-5, Bouin fixáló, cink-formiát, és semlegesre pufferelt formalin. Hivatkozva az Általános útmutató az immunhisztokémiai festésekhez illetve a detektáló rendszerek IHC eljárási Útmutatóinak az (1) Az eljárás alapelvei (2) A szükséges de nem biztosított anyagok (3) Tárolás, (4) Minta elıkészítés (5) Festési eljárás (6) Minıség ellenırzés (7) Problémamegoldás (8) A festés kiértékelése (9) Általános korlátozások c. fejezeteire. Összefoglalás és magyarázat Az eljárás alapelvei Az EnVision+ System-HRP két lépéses IHC festési technika. Ez a rendszer egy HRP-vel jelölt polimeren alapszik, amelyhez a másodlagos antitestet hozzákötötték. A jelölt polimer nem tartalmaz avidint vagy biotint. Ennek következtében a májban, lépben, limfoid szövetekben és fagyasztott metszeten fellépı endogén avidinbiotin aktivitás, mely nem specifikus festıdést okoz, kiküszöbölhetı, vagy szignifikánsan csökkenthetı. Minden reagens az EnVision+ System-HRP rendszerben használatra kész, kivéve a Liquid DAB+ Substrate- Chromogen oldatot. Ez a rendszer rendkívül érzékeny módszer, ennek eredményeképpen az elsıdleges antitest optimális hígítása akár 20x nagyobb lehet, mint a hagyományosan használt PAP technikákban, és jóval nagyobb, mint a hagyományos ABC vagy LSAB eljárásokban alkalmazottaknál. Ez az eljárás egy fejlett jelgenerátor rendszert kínál alacsony koncentrációban jelen lévı antigének detektálására, vagy alacsony titerő elsıdleges antitestekhez. A nyúlban elıállított elsıdleges antitestek jól reagálnak a jelölt polimerrel. A pozitív festıdés vagy annak hiányának értékelését ki kell egészíteni morfológiai és hisztológiai vizsgálatokkal, megfelelı kontrollal. Az endogén peroxidáz aktivitás gátolható a minták 5 perces Peroxidase Block ban történı inkubálásával. A mintát ezután egy megfelelıen meghatározott és hígított nyúl elsıdleges antitesttel inkubáljuk, majd ezt követi a jelölt polimerrel történı inkubáció, melyek egyenként 30 percig tartanak. Megjegyzendı, hogy azok az antitestek, melyek enzimes elıkezelést vagy antigén feltárást igényelnek, az elsıdleges antitesttel és a jelölt polimerrel 5-10 perccel tovább inkubálandók. A festést egy 5-10 perces 3,3 -diaminobenzidine (DAB+) substrate-chromogen oldattal történı inkubációval fejezzük be, mely barna elszinezıdést eredményez az antigén jelenlétében. (A DAB potenciális karcinogén, lásd a Figyelmeztetések fejezetet!) Reagensek Kód K4010: Az alábbi kitben található anyagok 150 szövetmetszet vizsgálatához elegendıek, 100 µl oldat/metszet felhasználással: Flakon Mennyiség Leírás száma. 1 1x15 ml Peroxidase Block 2 1x15 ml Jelölt Polimer 0.03% hidrogén-peroxid, mely nátrium-azidot is tartalmaz 3a 1x18 ml Szubsztrát Puffer Peroxidázzal jelölt polimer, kecske anti-nyúl immunoglobulinokhoz kötve, Tris- HCl pufferben, mely stabilizátor fehérjét és fertıtlenítıt tartalmaz. Szubsztrát Puffer oldat, ph=7.5, hidrogén-peroxidot és tartosítószert tartalmaz. 3b 1x1 ml Liquid DAB+ Chromogen 3,3'-diaminobenzidin kromogén oldat (127933-001) P04047HU_01_K4010_K4011/2015.07 p. 1/6
Kód K4011: Az alábbi kitben található anyagok 1100 szövetmetszet vizsgálatához elegendıek, 100 µl oldat/metszet felhasználással: Flakon Mennyiség Leírás száma. 1 1x110 ml Peroxidase Block 2 1x110 ml Jelölt Polimer 0.03% hidrogén-peroxid, mely nátrium-azidot is tartalmaz 3a 1x120 ml Szubsztrát Puffer Peroxidázzal jelölt polimer, kecske anti-nyúl immunoglobulinokhoz kötve, Tris- HCl pufferben, mely stabilizátor fehérjét és fertıtlenítıt tartalmaz. Szubsztrát Puffer oldat, ph=7.5, hidrogén-peroxidot és tartosítószert tartalmaz. 3b 1x5 ml Liquid DAB+ Chromogen 3,3'-diaminobenzidin kromogén oldat. Szükséges, de nem biztosított anyagok Kiegészítık 1 Kalibrált teszt tubus 1 Mőanyag Pasteur pipetta Nedvszívó kendık Kontroll szövet, pozitív és negatív Magfestı anyag, víz bázisú, mint pl. a Mayer s Hematoxylin, vagy a Lillie szerint módosított Mayer s hematoxilin. (kód S3309) Fedılemezek Desztillált víz Abszolut és 95%-os etanol Fénymikroszkóp (20x 800x) Fedıanyag, mint pl Glycergel fedıanyag (kód C0563) vagy Faramount, vízbázisú fedıanyag használatra kész (kód S3025) vagy nem vízbázisú tartós fedıanyag, Ultramount (kód S1964) Elsıdleges antitestek és negatív kontroll reagens Tárgylemezek, poli-l-lizinnel fedett vagy szilanizált tárgylemez (kód S3003) Festı edények vagy kádak Idımérı (3-40 perces intervallumban mérjen) Öblítı palackok Mosó pufferoldat Xilol, toluol, vagy xilol helyettesítık Esetlegesen szükséges, de nem biztosított anyagok Ammónium-hidroxid, 15 mol/l 0.037 mol/l-re hígítva PAP Toll (kód S2002) Óvintézkedések 1. Megfelelı szakmai képzettséggel alkalmazható. 2. A termék nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmaz, ami tiszta formában erısen mérgezı kémiai anyag. Bár a termékben lévı koncentrációban nem minısül veszélyesnek, a nátrium-azid ólom és réz vezetékben erısen robbanékony fém-azidot képezhet. Az elhasznált anyagot kiöntés elıtt hígitsuk nagymennyiségő folyóvízzel, hogy a fémazid képzıdést megakadályozzuk. 1,2 3. Ne használjuk a reagenst a lejárati idı után. Ha a reagenst más körülmények közt tároltuk, mint ami a termékleírásban szerepel, akkor a felhasználónak magának kell validálnia. 4. Ne helyettesítsük a reagenst más lot számú, vagy más gyártó kitjébıl származó oldattal. 5. Az enzimek és a szubsztrát kromogén károsodik, ha erıs fény éri. Ezért ne tároljuk a kit részeit, illetve ne végezzük a festést nagyon erıs fényben, direkt napon. 6. A leirttól eltérı inkubációs idık és hımérsékletek hibás eredményt adhatnak, ilyen változtatások validálása a felhasználóra hárul. 7. Mint minden biológiai eredető termék, megfelelı kezelést igényel az alkalmazás során. 8. Használjunk megfelelı egyéni védıfelszerelést, hogy elkerüljük a bır vagy a szem sérülését. 9. A fel nem használt oldatot a jogszabályi elıírásoknak megfelelıen semmisítsük meg. 10. A Biztonsági Adatlap kérésre bármely szakmai felhasználó rendelkezésére áll. (127933-001) P04047HU_01_K4010_K4011/2015.07 p. 2/6
Veszély DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Rákot okozhat. H341 Feltehetıen genetikai károsodást okoz. P201 Használat elıtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. P202 Ne használja addig, amíg az összes biztonsági óvintézkedést el nem olvasta és meg nem értette. P281 Az elıírt egyéni védıfelszerelés használata kötelezı. P308 + P313 Expozíció vagy annak gyanúja esetén: orvosi ellátást kell kérni. P405 Elzárva tárolandó. P501 A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Tárolás EnVision+ System-HRP reagenseit 2-8 C-on kell táro lni, fagyasztani nem szabad. Nem használható fel a jelzett lejárati idın túl. Bármely reagens érzékelhetı megváltozása, mint pl kicsapódás, instabilitást vagy minıség romlást jelez. Ilyen esetekben a reagens(ek) nem használható(k). Reagens elıkészítés Nincs egyértelmő a jele a termék instabilitásának. Ezért pozitív és negatív kontrollt is végezni kell a a beteg mintájával egyidıben. Váratlan eredmény esetén, mely nem magyarázható a laboratóriumban alkalmazott módszerekkel, illetve a termékkel kapcsolatos probléma felmerülésekor forduljon a Dako technikai szervízhez. Mosó puffer oldat A TBST, 0.05 mol/l Tris pufferelt sóoldat Tween-nel (kód S3006) a javasolt mosó puffer oldat automatához és manuális IHC festésekhez is. A TBS, 0.05 mol/l Tris pufferelt sóoldat (kód S1968) és a PBS, 0.02 mol/l foszfát pufferelt sóoldat (kód S3024) szintén alkalmas mosó puffer oldat manuális festésekhez. Nátrium-azid tartalmú mosó puffer oldatok alkalmazása nem ajánlott. A nátrium-azid inaktiválja a HRP-t, így negatív festést eredményez. A fel nem használt puffert 2-8 C-on ke ll tárolni. Ha az oldat zavaros lesz, ki kell önteni. A peroxidáz blokkoló, a szubsztrát és a magfestı anyag leöblítésére desztillált víz használható. Elsıdleges antitest A Dako-nél koncentrált antitestek érhetıek el, de az optimális hígitást a felhasználónak kísérleti úton kell meghatároznia. Az EnVision+ System-HRP nagy érzékenységének következtében az antitest hígítások 5-20x nagyobbak lehetnek, mint a hagyományosan alkalmazott IHC eljárásokban szokásos. A hígítások 1% borjúszérum albumin (Antibody Diluent, kód S0809) tartalmú, 0.05 mol/l Tris-HCl puffer, ph 7.2-7.6 alkalmazásával készíthetık. Ezen kit alkalmazásakor a legtöbb elsıdleges antitestnek 30 perc inkubációs idı szükséges. Az NP-sorozatú, Plus használatra kész antitestek a Dako Plus nagy érzékenységő detektáló rendszer alkalmazására vannak opitimalizálva, és használatuk azzal javasolt. A Dakonál koncentrált antitestek is elérhetıek. A koncentrált antitestek optimalizálása a végfelhasználó feladata. A hígítások elkészíthetık az antitest hígítóval (Antibody Diluent (kód S0809)) vagy más hígítószerrel, mely 0.05 mol/l Tris-HCl puffert, és 1% borjú szérum albumint (BSA) tartalmaz. A Dako N sorozatú használatra kész antitestjei nincsenek a Plus detektáló rendszerekre optimalizálva. Negatív kontroll reagens Ideális esetben a negatív kontroll reagens olyan antitestet tartalmaz, mely nem mutat specifikus reakciót emberi szövetekkel vagy normál/nem-immun szérummal a hígított elsıdleges antitesttel azonos oldatban/mátrixban. A negatív kontroll antitestnek azonos alosztályba kell tartoznia és azonos állatfajból kell erednie, mint az elsıdleges antitest, azonos koncentrációban kell tartalmaznia immunoglobulint vagy fehérjét, mint az elsıdleges antitest, azonos hígítószerrel végezve a hígítást. A negatív kontroll és az elsıdleges antitest inkubációs idejének is hasonlónak kell lennie. A Dako NP sorozatú, Plus használatra kész antitestjeihez javasolt az Universal Negative Control(s)+, mint negatív kontroll reagens. Ezek a kontrollok optimalizálva vannak egér (kód NP015) és nyúl (kód NP001) NP sorozatú Plus antitestekhez. Szubsztrát kromogén oldat Az alábbi eljárásban 1 ml szubsztrát kromogén elegendı 10 szövetmetszet vagy 5 sejtkenet értékeléséhez. 1. lépés A festeni kivánt metszetek számától függıen vigyünk át megfelelı mennyiségő puffer oldatot a 3a (Substrate Buffer) palackból a mellékelt kalibrált teszt tubusba. 2. lépés A puffer minden ml-jéhez adjunk 1 cseppet (20 µl) a 3b palackból (Liquid DAB+ Chromogen) Azonnal rázzuk össze, és alkalmazzuk a szövetekhez a mellékelt Pasteur pipettával. Az elkészített szubsztrát-kromogén oldat kb. 5 napig tárolható 2-8 C-on. Ezt az oldatot alaposan rázz uk fel használat elıtt. Az esetleges kiválások nem befolyásolják a festési minıséget. A teszt tubust és a pipettát minden használat után alaposan öblitsük el. Teljes mennyiségében felhasználva a 18 ml szubsztrát puffer oldat (K4010-s kit) 150 teszt elvégzéséhez elegendı. Egy kis felesleges mennyiség fennmaradhat. A 120 ml szubsztrát oldat (K4011-s kit) 1100 teszt elvégzéséhez elegendı. Egy kis felesleges mennyiség fennmaradhat. (127933-001) P04047HU_01_K4010_K4011/2015.07 p. 3/6
Magfestés A festési reakció színes végterméke alkoholban oldhatatlan, és használható alkohol vagy vízbázisú magfestı anyagokkal, mint a Mayer hematoxilin, vagy a Lillie féle módosított Mayer hematoxilin (kód S3309). A hematoxilines magfestés után öblitsük le a lemezt alaposan desztillált vízzel, majd merítsük a szövetmetszetet 0.037 mol/l koncentrációjú ammónia fürdıbe, vagy hasonló kékítı anyaggal. A 0.037 molos ammónia oldat készíthetı 2.5 ml tömény (15 mol/l) ammónia-hidroxid oldat 1 liter vízben való elkeverésével. A fel nem használt 0.037 mol/l-s ammónia szobahımérsékleten (20-25 C) tárolható jól záró üvegben 1 2 hónapig. Alternatív magfestési módokról informálódjon a gyártók leírásából. Fedıanyag Vízbázisú fedıanyagként ajánlott a Glycergel Mounting Medium (kód C0563) vagy a használatra kész Faramount Aqueous Mounting Medium (kód S3025). A Glycergelt közvetlenül a használat elıtt legalább 50 C-ra fel kell melegíteni. Nem-vízbázisú fedıanyag (Ultramount, kód S1964) szintén használható. Minta elıkészítés Hivatkozva az Általános útmutató az immunhisztokémiai festésekhez és/vagy az antitest leírására. Az IHC festés elıtt a szövetet fixálni kell és elı kell készíteni a festésre. A fixálás megakadályozza az autolízist és a metszet bomlását és megırzi az antigenitását. Fokozza a szövet alkotórészek refraktív indexét és a sejtes elemek ellenállóképességét az elıkészítés (víztelenítés) során. A szövet elıkészítés lépései a dehidratálás, a dehidratáló anyag eltávolítása, a beágyazó anyag infiltrálása, a beágyazás és a szövet metszése. Az IHC szövetelıkészítésben használt legalapvetıbb fixáló anyagokról az Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez c. kiadványban található információ. Ezek csak útmutatások. Az optimális eljárást a felhasználó határozza meg és a rendszer validálást is ı végzi. Festési eljárás Megjegyzések az eljáráshoz A felhasználónak gondosan át kell olvasnia ezeket az útmutatókat, hogy közelebbrıl megismerje a kit tartalmát a felhasználás elıtt. A reagensek és az útmutatások a kit optimális használatára vonatkoznak. A reagensek további hígítása illetve az inkubációs idık vagy hımérsékletek megváltoztatása hibás eredményt okozhat. Minden reagenst szobahımérsékletőre kell melegíteni ((20 25 C) az immunfestés elıtt. Hasonlóképpen minden inkubációt szobahımérsékleten kell végezni. Ne hagyjuk a szövetmetszeteket kiszáradni a festési eljárás alatt. A kiszáradt szövetmetszetben gyakoribb a nem-specifikus festések megjelenése. Fedjük be a lemezeket, ha huzatnak vannak kitéve. Ha elhúzódó inkubáció szükséges, tegyük a szöveteket nedves környezetbe. Az EnVision+ System-HRP érzékenysége tovább növelhetı az inkubációs lépések (2. és 3. lépés) hosszának 5-10 perces növelésével. Festési eljárás 1. lépés PEROXIDÁZ BLOKKOLÁS Itassuk fel a felesleges puffert. Szálmentes anyag felhasználásával (mint pl Kimwipe vagy gézlap). Óvatosan töröljük körbe a mintát, hogy a maradék folyadékot eltávolítsuk, és az oldat csak az elıírt területen maradjon. Használjon elegendı mennyiségő peroxidáz blokkolót az 1. palackból a minta befedéséhez. Inkubációs idı 5 (±1) perc. Óvatosan öblítsük le mosópalackból desztillált vízzel vagy puffer oldattal (ne irányítsuk közvetlenül a szövetre), és helyezzük friss puffer fürdıbe. 2. lépés ELSİDLEGES ANTITEST VAGY NEGATÍV KONTROLL REAGENS Itassuk fel a felesleges puffert, mint az elıbb. Használjunk elegendı mennyiségő, optimálisan hígított elsıdleges antitest vagy negatív kontroll reagenst a minta fedésére. Inkubációs idı 30 (±1) perc. Óvatosan öblítsük le mosópalackból desztillált vízzel vagy puffer oldattal (ne irányítsuk közvetlenül a szövetre), és helyezzük friss pufferfürdıbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a lemezek a puffer fürdıben maradhatnak az elsıdleges antitesttel történı inkubáció (2. lépés) után egy órán keresztül szobahımérsékleten (20 25 C) anélkül, hogy ez hatással lenne a festési eredményre. 3. lépés PEROXIDÁZZAL JELÖLT POLIMER Itassuk fel a felesleges puffert, mint az elıbb. Használjunk elegendı mennyiségő jelölt polimert a 2. palackból a minta befedéséhez. Inkubációs idı 30 (±1) perc. Öblítsük a lemezeket, mint a 2. lépésben. (127933-001) P04047HU_01_K4010_K4011/2015.07 p. 4/6
4. lépés SZUBSZTRÁT KROMOGÉN Itassuk fel a felesleges puffert, mint az elıbb. Használjunk elegendı mennyiségő elıkészített DAB+ szubsztrát-kromogén oldatot a minta befedéséhezt. (lásd a Reagens elıkészítés c. részt). Inkubációs idı 5-10 perc. Óvatosan öblítsük le mosópalackból desztillált vízzel (ne irányítsuk közvetlenül a szövetre). A szubsztrát kromogént győjtsük veszélyes anyag győjtı konténerben a további megsemmisítésig. 5. lépés HEMATOXILINES MAGFESTÉS (OPCIONÁLIS) Merítsük a lemezeket vízbázisú hematoxilines (kód S3309) fürdıbe. Az inkubáció hossza a használt hematoxilin erısségétıl függ. Óvatosan öblítsük le desztillált vízfürdıben. Mártsuk10-szer a lemezeket 0.037 molos ammónia oldatba vagy hasonló kékítı anyagba. Öblítsük a lemezeket desztillált vagy ioncserélt vízfürdıben, 2-5 percig. 6. lépés FEDÉS A mintákat fedhetjük vízbázisú fedıanyaggal, mint pl. Glycergel Mounting Medium (kód C0563) vagy a Faramount (kód S3025), és nem-vízbázisú fedıanyaggal mint pl Ultramount (kód S1964). A metszeteket lehet vízteleníteni és tartósan fedni is. Minıség ellenırzés Festés kiértékelés Korlátozások A szövetfeldolgozás és a felhasználók laboratóriumi technikai eljárásainak különbségei miatt az eredmények szignifikánsan változóak lehetnek, ami szükségessé teszi a rendszeres házon-belüli ellenırzést a következı folyamatokkal együtt. További információkért lásd az Amerikai Patológus Kollégium (CAP) Tanusítási Program az immunhisztokémiában c kiadványának minıség ellenırzési útmutatóját, és a 3-5 referencia irodalmat. Minden antitesthez tartozó specifikációs lapon további részletek találhatók az érzékenységrıl és az immunreaktivitásról. Pozitív és negatív kontrollal kapcsolatos további információk az Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez c. kiadványban találhatók. Értékelési útmutatók a Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez c. kiadványban találhatók. Hivatkozva a Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez c. kiadványban található általános korlátozásokra. A szövetfestés a megfelelı kezelés és a festés elıtti megfelelı szövetfeldolgozástól függ. A nem megfelelı fixálás, fagyasztás, felolvasztás, mosás, szárítás, melegítés, metszés vagy szennyezıdés más szövetekkel vagy folyadékokkal mőtermékeket, antitest csapdákat okozhat, vagy negaítv eredményhez vezethet. Régi vagy nem pufferolt fixáló anyagok használata, vagy extrém hımérséklet (több mint 60 C) a szövetelıkészítés során csökkenti a festés érzékenységét. Endogén peroxidáz vagy pszeudoperoxidáz aktivitás, ami megtalálható vérfehérjékben mint pl. hemoglobin, myoglobin, citokróm és kataláz illetve eozinofil sejtekben. 6,7 Ez az aktivitás gátolható a minták peroxidáz blokkoló anyaggal történı inkubálásával (1. palack), 5 perc az elsıdleges antitest alkalmazása elıtt. Vér és csontvelı kenetek és fagyasztott szövetek is kezelhetık ezzel a reagenssel, noha ez az eljárás nem szünteti meg a vérfehérjék vörösesbarna színét. Alternatív megoldásként metanol-hidrogén-peroxid alkalmazható. Ezen eljárás során néhány antigén denaturálódhat. Olyan betegek szövetmintáinál, akik Hepatitis B-vel fertızöttek, és a Hepatitis B felületi antigén (HbsAg) jelen van, megjelenhet nem specifikus festıdés a HRP-vel. 8 A másodlagos antitesttel azonos állatból eredı normál/nem-immun szérumokat alkalmazva a blokkoló lépésnél téves negatív vagy pozitív festés jöhet létre, az auto-antitestek vagy a természetes antitestektıl függıen. A kitben biztosított reagensek optimálisan vannak hígítva. A további hígitással elveszhet az antigén detektálhatósága. Hiba elhárítás Probléma Lehetséges ok Javasolt intézkedés 1. Nincs festés egy lemezen sem. 2. Gyenge festıdés minden lemezen. 3. Erıs háttérfestıdés minden lemezen. 1a. A reagenseket nem megfelelı sorrendben használták. 1b. Nátrium azid van a puffer fürdıben. 2a. A metszetek túl sok folyadékot tartalmaznak a vízfürdı után. 2b. A lemezeket nem inkubálták elég sokág az antitestben vagy a szubsztrát keverékben. 3a. A minta magas endogén peroxidáz aktivitást mutat. 1a. A reagnes felhasználás áttekintése. 1b. Használjunk friss, azid mentes puffert. 2a. Óvatosan öntsük le a felesleges oldatot, mielıtt felitatnánk a metszet körül. 2b. Tekintsük át a javasolt inkubációs idıket. 3a. Alkalmazzunk hosszabb inkubációs idıt a peroxidáz blokkoló oldattal (1. flakon). (127933-001) P04047HU_01_K4010_K4011/2015.07 p. 5/6
3b. A paraffin nincs tökéletesen eltávolítva. 3c. A lemezek nincsenek elég alaposan leöblitve. 3d. A normálisnál gyorsabb szubsztrát festıdés, például szobahımérsékletnél magasabb hımérséklet miatt. 3e. A metszetek kiszáradtak a festés alatt. 3f. A reagensek nem specifikus kötıdése a szövetmetszethez. 3b. Használjunk friss xilol vagy toluol fürdıt. Ha sok metszetet festünk egyszerre, a második xilol fürdı tartalmazzon friss xilolt. 3c. Alkalmazzunk friss oldatokat a pufferfürdıkben és a mosópalackokban. Alternatív megoldás: TBST 0.05 mol/ltris puffer, mely tartalmaz 0.3 mol/l NaCl-t és 0.1% Tween-t (kód S3306). 3d. Alkalmazzunk rövidebb inkubációt a szubsztrát kromogén oldattal. 3e. Használjunk nedves kamrát. Csak 3-4 lemezt töröljünk szárazra egyszerre a reagens alkalmazása elıtt. 3f. Alkalmazzunk irreleváns fehérjét tartalmazó blokkoló oldatot. 3g. Az antitest túl koncentrált. 3g. Alkalmazzuk az elsıdleges antitestet nagyobb hígításban. MEGYJEGYZÉS: Ha a probléma nem azonosítható a fentiek alapján, vagy a javasolt intézkedések nem hoznak megoldást, további segítségért kérjük forduljon a Dako technikai szervízéhez. További információk a festési technikákról és a minta elıkészítésrıl megtalálhatók az Immunkémiai festési eljárások - Kézikönyv 9 (elérhetı a Dako-nél), az Immunhisztológiai atlasz 10, az Immunperoxidáz technikák, a tumor diagnózis gyakorlati megközelítése 11 c. kiadványokban. Referenciák 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976 2. Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976. 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order kód C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Corporation 1989 10. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 11. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Egyéb referenciák Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Edition 07/15 (127933-001) P04047HU_01_K4010_K4011/2015.07 p. 6/6