Bócsai Andera 1 Ancsin Zsolt 1 Zándoki Erika 2 Fernye saba 1 Mézes Miklós 1 Balogh Krisztián 1 Rövidtávú -2 toin terhelés hatása a máj egyes lipidperoidációs és antioidáns paramétereire különböző életkorú brojlercsirkékben Age-dependent effects of short-term -2 toin eposure on some lipid peroidation and antioidant parameter in broiler chicken liver Bocsai.Andrea@mkk.szie.hu 1 zent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar, 2100 ödöllő, áter Károly u. 1. 2 MA-Kaposvári Egyetem Mikotoinok az élelmiszerláncban Kutatócsoport, 7400 Kaposvár, uba ándor u. 40. Összefoglalás Kísérletünkben különböző dózisú -2 toin terhelés rövidtávú hatását mértük fel különböző életkorú brojlercsirkékben. A obb 500-as brojler kakasokkal (n=432) folytatott kísérletsorozatunkban 6 hétig tartó nevelés során hetente végeztünk -2 toin terhelést. A hat egymást követő rövidtávú terhelés során minden alkalommal egy kontroll és két különböző dózisú (3, illetve 5 ) -2 toinnal szennyezett takarmányt fogyasztó csoportot alakítottunk ki. A 36 órás mikotoin-terhelés során a terhelés kezdetét követően 8, 12, 24 és 36 óra elteltével csoportonként 6-6 madárból vett májmintákból meghatároztuk a a lipidperoidációs folyamatok intenzitását jelző markereket és a glutation redo rendszer egyes paramétereit. Megállapítottuk, hogy a -2 toin terhelés hatására a májban a lipidperoidációs folyamatok iniciációs szakaszát jelző konjugált dién és trién tartalom a 3. és a 6. élethéten mutatott dózisfüggő emelkedést. Az alkalmazott -2 toin dózisok tehát fokozott szabadgyök-képződést indukáltak a májban, amely aktiválta a glutation redo rendszert, szignifikáns mértékben megnövelve a glutation-peroidáz aktivitását a 2., 4., 5. és 6. élethéten. A glutation redo rendszerben kitüntetett szerepet betöltő ko-szubsztrát (redukált glutation) mennyisége a 4., 5. és 6. héten mutatott szignifikáns mértékű növekedést a mikotoin-terhelés hatására. Mindezek a változások az antioidáns védelmi rendszerben azt eredményezték, hogy az hatékony védelmet jelentett az alkalmazott -2 toin szabadgyök-képződést előidéző hatásával szemben a vizsgált időtartam (36 óra) alatt, így a lipidperoidációs folyamatok meta-stabil végterméke, a malondialdehid koncentráció nem mutatott statisztikailag is igazolható emelkedést a mikotoin-terhelés hatására a 6 hetes vizsgálatsorozat alkalmával. Bevezetés A brojlercsirkék számára előállított teljes értékű takarmánykeverékek jelentős részarányát jelentő gabonamagvak gyakran szennyezettek mikotoinokkal. Közép-Európában, így hazánkban is, a leggyakrabban a Fusarium penészgombák másodlagos anyagcseretermékei elsődlegesen a trichotecén-vázas mikotoinok általi szennyezettség a legjellemzőbb (Kotal et al., 1999). Ebbe a csoportba tartozik a -2 toin is, melyet a mérsékelt éghajlati övben széleskörűen elterjedt Fusarium sporotrichioides penészgomba is termel (Binder et al., 2007). A takarmányban jelenlevő -2 toin dózisfüggő módon termeléscsökkenést okoz és toikus hatású baromfi fajok esetében (iaz, 2005); és az egyik legmérgezőbb trichotecén-toinként tartják számon (Bamburg et al., 1968). A -2 toin, illetve annak az állati szervezetben képződő metabolitja, a -2 toin az A-típusú epoitrichotecének közé tartozó hőstabil molekula, így a takarmány-, illetve élelmiszer feldolgozás során változatlan formában jelen van a termékben (Lancova et al., 2008). Mindkét mikotoin gátolja eukarióta sejtekben a fehérje- és a N szintézist (olladay, 1995), reaktív epoi-csoportja révén pedig elősegíti az oigén szabadgyökök kialakulását, mely oidatív stresszt idézhet elő a szövetekben (Iwahashi, 1982). A reaktív oigéngyökök által elindított láncreakciót az állati szervezet enzimatikus és nem enzimatikus antioidáns védőrendszere segítségével igyekszik fiziológiás szinten tartani (avies, 1995). E rendszer részei a gyökfogó 53

antioidáns molekulák (pl. redukált glutation) vagy az enzimatikus védelemben kitüntetett szereppel bíró szelénfüggő glutation-peroidáz enzimcsalád (Erdélyi et al., 1999). A reaktív oigén gyökök által kiváltott oidáció iránt főként a többszörösen telítetlen zsírsavak érzékenyek, azonban a peroidáció kisebb-nagyobb mértékben károsíthatja a fehérjéket és a nukleinsavakat is. A -2 toin által indukált oidatív stresszt a hosszútávú kísérletek során képződött lipidperoidációs termékek mennyiségi mérésével bizonyították, ugyanakkor kevés adattal rendelkezünk annak rövidtávú és különböző életkorú brojlercsirkékre kifejtett hatásáról. Jelen kísérletünk célja a különböző dózisú -2 tointerhelés rövidtávú (36 óráig tartó) hatásának lipidperoidációra, és a glutation redo rendszer mennyiségére, illetve aktivitására gyakorolt hatásának vizsgálata volt különböző életkorú brojlercsirkékben. Anyag és módszer Kísérletsorozatunkat obb 500-as brojler kakasokkal (n=432) végeztük, 6 hétig tartó nevelés során. A hat egymást követő héten végzett rövidtávú terhelés során minden alkalommal egy kontroll és a -2 toin két különböző koncentrációjával (3 mg -2 toin/kg, illetve 5 mg -2 toin/kg takarmány) szennyezett takarmányt fogyasztó csoport került kialakításra. A kezelt csoportok által fogyasztott takarmányok -2 toinnal történt mesterséges szennyezése után annak pontos értéke L módszerrel került visszamérésre. A 36 órás mikotoin-terhelés során a 8., 12., 24. és 36. órában csoportonként 6-6 madárból post mortem májmintákat vettünk, amelyeket a biokémiai vizsgálatok elvégzéséig -20 o -on tároltuk. Meghatároztuk a a lipidperoidációs folyamatok intenzitását jelző markereket, nevezetesen a konjugált dién és -trién tartalmat és a malondialdehid (MA) koncentrációt, valamint glutation redo rendszer néhány paraméterét, így a redukált glutation () koncentrációt és a glutation-peroidáz () aktivitás. A konjugált dién és -trién tartalom meghatározása a májminták lipid tartalmának 2,2,4-trimetilpentánban való kivonását követően 232 nm-en, illetve 268 nm-en mutatott abszorpció alapján történt (AOA, 1984). A malondialdehid koncentráció meghatározását Mihara és mtsai. (1980) módszere alapján végeztük savanyú közegben, magas hőmérsékleten, 2-tiobarbitursavval történő komple képzés során. A redukált glutation koncentrációt edlak és Lindsay (1968) módszere alapján mértük 5,5 -ditio-bisz-2-nitrobenzoesav reagenssel. A glutation-peroidáz aktivitást Matkovics és mtsai (1988) módszere alapján határoztuk meg egy végpontos direkt assay-vel, redukált glutation és kumol-hidroperoid ko-szubsztrátok jelenlétében. A koncentrációt és a aktivitást a májhomogenizátum 10.000 g szupernatans frakciójában mértük, az értékeket a minták fehérjetartalmára vonatkoztatottuk, amelyet Folin-fenol reagenssel mértünk szarvasmarha szérum albumin standard felhasználásával (Lowry és mtsai, 1952). Az eredmények statisztikai értékelését raphad rism for Windows 5.04 programmal (raphad oftware Inc., 2010) végeztük. A normalitás vizsgálatot követően végzett varianciaanalízis (ANOVA) során a ukey-féle többszörös összehasonlító tesztet alkalmaztuk a szignifikáns (p<0,05) különbségek megállapítására. Eredmények és értékelésük A -2 toin terhelés hatására a májban a lipidperoidációs folyamatok kezdeti (iniciációs) szakaszát jelző konjugált dién és trién tartalom csak a 3. és a 6. élethéten mutatott dózisfüggő emelkedést (1. táblázat). 54

1. táblázat A -2 toin különböző koncentrációinak hatása eltérő korú brojlercsirkék májának konjugált dién ( O232) és konjugált trién ( O268) tartalmára 0,577± 0,044 0,206± 0,444± 0,025 0,199± 0,349± 0,111 0,175± 0,027 0,534± 0,206± 0,398± 0,124 0,025 0,570± 0,045 0,203± Kontroll 8. óra 12. óra 24. óra 36. óra Kontrolroll -2 3 roll -2-2 -2-2 -2-2 1. hetes madarak 0,545± 0,550± 0,522± 0,574± 0,521± 0,572± 0,560± 0,504± 5b± 0,539ab± 0,193± 0,474± 0,044 0,204± 0,362± 0,154 0,174± 0,033 8± 0,183± 0,530± 0,088 0,198± 0,540± 0,072 0,193± 0,026 0,190± 0,457± 0,039 0,198± 0,415± 0,140 0,177± 0,030 0,497± 0,061 0,197± 0,019 0,381± 0,165 0,171± 0,552± 0,045 0,192± 0,188± 0,424± 0,185± 0,005 0,301a± 0,103 0,154a± 0,021 0,544± 0,055 0,204b± 0,010 0,392± 0,132 0,027 0a± 0,173± 0,043 0,195± 0,430± 0,060 0,185± 0,503b± 0,193b± 0,443± 0,029 0,175a± 0,519± 0,049 0,195± 1b± 0,080 0,200± 0,024 0,048 0,058 0,176± 0,210b± 2. hetes madarak 0,440± 0,503ab± 0,048 0,023 0,185± 0,192± 0,009 3. hetes madarak 0,483b± 0,514± 0,025 0,049 0,183b± 0,202± 0,008 4. hetes madarak 0,483± 0,543± 0,120 0,128 0,192ab 0,212± ±0,026 0,027 5. hetes madarak 0,447± 7± 0,177 0,048 0,187± 0,209± 0,034 6. hetes madarak 0,556b± 0,471± 0,054 0,082 0,193± 0,022 0,035 0,205b± 0,519b± 0,192± 0,457± 0,125 0,187± 0,030 0,388± 0,170 0,675± 0,064 0,214± 0,395± 0,162± 0,182a± 0,477a± 0,455± 0,176± 0,484± 0,093 0,190± 0,612± 0,202± 0,408± 0,033 0,209b± 0,473± 0,054 0,176± 0,551± 0,074 0,207± 0,018 0,404± 0,145 0,038 0,621± 0,084 0,203± 0,023 0,415± 0,034 0,163± 0,188a± 5± 0,473± 0,316± 0,089 0,154± 0,018 0,624± 0,063 0,205± 0,428± 0,024 5-2 0,498a± 0,046 0,176a± 0,010 0,443± 0,035 0,162± 0,490± 0,099 0,179± 0,028 0,334± 0,122 0,156± 0,022 0,608± 0,040 0,194± 0,432± 0,019 a,b azonos sorban ez eltérő mintavételi időpontok esetében a különböző betűvel jelölt átlagértékek szignifikáns mértékben (p<0,05) különböznek. Az alkalmazott -2 toin dózisok fokozott szabadgyök-képződést indukáltak a májban, mely aktiválta a glutation redo rendszert, szignifikáns mértékben megnövelve annak aktivitását (glutation-peroidáz aktivitás) a 2., 4., 5. és 6. élethéten (2. táblázat). A glutation redo rendszerben kitüntetett szerepet betöltő ko-szubsztrát (redukált glutation) mennyisége a 4., 5. és 6. héten mutatott szignifikáns mértékű növekedést a mikotoin-terhelés eredményeképpen (2. táblázat). Mindezek a változások az antioidáns védelmi rendszerben azt eredményezték, hogy az hatékony védelmet jelentett az alkalmazott -2 toin szabadgyök-képző hatásával szemben a vizsgált időtartam (36 óra) alatt, így a lipidperoidációs folyamatok meta-stabil végterméke, a malondialdehid koncentráció (nem közölt adatok) nem mutatott statisztikailag is igazolható emelkedést a mikotoin-terhelés hatására a 6 hetes vizsgálatsorozat alkalmával. 55

2. táblázat A -2 toin különböző koncentrációinak hatása eltérő korú brojlercsirkék májának redukált glutation koncentrációjára (, umol/g fehérje) és glutation-peroidáz aktivitására (, E/g fehérje) 4,43± 0,10 4,04± 0,15 3,15± 0,33 2,72± 0,29 7,40b± 2,19 7,44± 1,83 3,81a± 0,31 3,11± 0,69 4,67± 4,05± 1,01 3,79a± 0,70 2,87a± Kontroll 8. óra 12. óra 24. óra 36. óra 3 Kontrolrolroll -2-2 -2-2 -2-2 -2 1. hetes madarak 3,83± 0,40 3,54± 0,52 3,71± 0,64 3,44± 5,18ab± 5,03± 1,29 5,17b± 0,60 4,32± 0,84 5,17± 0,86 5,04± 0,98 5,02b± 0,60 3,54a± 0,68 4,30± 3,63± 0,84 3,86± 3,76± 0,57 5,07a± 1,38 6,42± 2,43 5,52b± 0,51 4,78± 5,09± 0,76 4,75± 0,47 5,27b± 5,04b± 4,16± 3,47± 0,53 3,44± 0,25 3,08± 0,19 6,21± 2,66 6,21± 2,10 4,49a± 0,79 3,58± 5,92± 1,56 5,43± 4,49± 1,04 3,43a± 0,83 3,72± 0,56 3,20± 3,62± 0,74 3,45± 0,64 5,53± 1,44 5,34± 1,70 5,92b± 4,34± 1,14 5,73± 0,72 5,57± 0,33 4,95± 0,50 3,99ab± 0,47 5,01± 1,28 3,98± 1,40 3,09ab± 0,56 2,92ab± 0,61 2. hetes madarak 3,76± 3,68± 0,62 3,23± 1,19 2,41a± 0,66 3. hetes madarak 1,02 5,37± 1,04 5,33± 0,91 5,69± 4. hetes madarak 4,88ab ±0,77 3,90± 4,94± 1,15 4,15a± 0,42 5. hetes madarak 6,07± 1,55 6,02± 1,58 4,41a± 0,62 3,97± 0,94 6. hetes madarak 5,02± 0,57 4,67b± 0,85 5,11± 0,81 3,96b± 0,61 3,92b± 3,93± 3,39b± 0,41 5,35± 5,61± 1,03 4,84± 0,55 4,26a± 5,34b± 0,50 0,45 4,94± 1,11 2,71a± 2,77a± 0,69 3,29± 0,36 3,06ab± 0,24 4,79± 5,63± 1,17 5,57± 1,17 4,99b± 0,41 5,13ab± 4,68± 0,48 4,34± 1,18 2,98± 0,36 2,58± 0,29 2,80± 0,27 2,24± 0,32 4,95± 1,35 5,25± 1,65 4,54± 0,85 3,89± 0,55 3,31a± 0,68 2,89a± 0,77 4,40± 0,35 3,50± 3,46± 1,18 3,12± 0,51 2,63± 0,37 5,49± 1,07 5,72± 1,07 5,49± 0,71 4,76± 0,87 4,77b± 1,00 4,36b± 0,75 4,93± 1,02 5-2 2,85± 0,94 2,91± 0,96 2,73± 2,57± 0,52 5,02± 0,66 5,98± 0,70 5,14± 1,12 4,11± 0,78 4,39ab± a,b azonos sorban ez eltérő mintavételi időpontok esetében a különböző betűvel jelölt átlagértékek szignifikáns mértékben (p<0,05) különböznek. 5,00± 1,03 1,10 4,49± 1,23 4,06± 0,28 4,90± 0,97 4,13b± 0,31 4,91± 1,34 4,90± 1,32 Köszönetnyilvánítás A kutatás a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (BO/261/13), az OKA (-104823) és a Kutató Kari Kiválósági ámogatás - Research entre of Ecellence - 11476-3/2016/FEKU támogatásával valósult meg. 56

Felhasznált irodalom AOA (1984): Official Methods of Analysis (28.054) 14th edition. Arlington, VA, UA Bamburg, J.R., Riggs, N.V. - trong, F.M. (1968): he structure of toins from two strains of Fusarium tricinctum. etrahedron Lett. 24: 3329-3326. Binder, E.M., an, L.M., hin, L.J., andl, J., Richard, J. (2007): Worldwide occurrence of mycotoins in commodities, feeds and feed ingredients. Anim. Feed ci. echnol. 137: 265-282. avies, K.J.A. (1995): Oidative stress, the parado of aerobic life. In: Rice-Evans,., alliwell, B., Land,.. (Eds.), Free Radical and Oidative tress: Environment, rugs and Food Additives. London, ortland ress, pp. 1 31. iaz,.e. (ed.) (2005): he Mycotoin Blue Book. Nottingham University ress, Nottingham Erdélyi, M., Mézes, M., Virág, y. (1999): A szeléndependens glutation-peroidáz enzimek az állati szervezetben: 1. zerkezet, funkció és szabályozás. Biokémia. 23(4): 82-88. olladay,.., mith, B.J., Luster, M.I. (1995): B lymphocyte precursor cells represent sensitive targets of 2 mycotoin eposure. oicol. Appl. harmacol. 131(2): 309-315. Iwahashi, M. (1982): Mechanism of cytotoic effect of -2 toin on a protozoa. roc. Assoc. Jpn. Mycotoin 4: 23-30. Kotal, F., oladová, K., ajslová, J., oustka, J., Radová, Z. (1999): etermination of trichothecenes in cereals. J. hromatograph. A. 830: 219-225. Lancova, K, ajslová, J., Kostelanska, M., Kohoutkova, J., Nedelnik, J., Moravcova,., Vanova, M. (2008): Fate of trichothecene mycotoins during the provessing: milling and baking. Food Addit. ontam. art A 25(5): 650-659. Lawrence, R., Burk, R. (1978): pecies, tissue and subcellular distribution of non e-dependent glutathione peroidase activity. J. Nutr. 108: 211-215. Lowry, O.., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951): rotein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. hem. 193: 265-275. Matkovics, B., zabó, L., z.varga, I. (1988): Lipidperoidáció és redukált glutation anyagcsere enzimek aktivitás meghatározása biológiai mintákban. Lab. iagn. 15. 248-250. Mihara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. (1980): hiobarbituric acid value of fresh homogenate of rat as parameter of lipid peroidation in ageing, l4 intoication and vitamin E deficiency. Biochemical Medicine 23: 302-311. edlak, I., Lindsay, R.. (1968): Estimation of total, protein-bound and non-protein sulfhydryl groups in tissues with Ellmann s reagent. Anal. Biochem. 25: 192-205. 57