HYPERGLYCAEMIÁS ÁLLAPOTOK HATÁSA AZ ÉRREAKTIVITÁSRA Doktori értekezés tézisei Dr. Kocsis Erzsébet témavezető: Dr. med. habil. Koltai Mária Zsófia Gottsegen György Országos Kardiológiai Intézet Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti Orvostudományok 5. program Budapest 2002.
1. Bevezetés Átfogó klinikai epidemiológiai vizsgálatok adatai szerint cukorbetegekben jelentősen nagyobb a szív-érrendszeri megbetegedések és halálozások száma az átlag népességhez képest. A koszorúerek atherosclerosisa fiatalabb életkorban és agresszívebb formában jelenik meg a cukorbetegekben. Ugyanakkor pusztán ez a jelenség nem tehető felelőssé az emelkedett szív-érrendszeri rizikóért diabetesben, hisz az megjelenik azon cukorbetegekben is, akikben coronariasclerosis nem igazolható. Az egyéb kockázati tényezőktől független, cukorbetegségben mégis megnövekedett cardialis eredetű halálozás okaként számításba kell tehát venni a szívizomzatot, annak érrendszerét és beidegzését érintő elváltozásokat, melyeknek komplexitása hozza létre a diabeteses cardiopathiaként meghatározott kórélettani jelenséget. Bizonyított, hogy a microangiopathiás elváltozások a szívizomzat érrendszerében is megjelennek, illetve a microangiopathiás szövődményként megjelenő neuropathia cardialis autonóm beidegzést érintő kórformájának kialakulása egyértelműen rontja a cukorbetegség prognózisát. A diabetesben megfigyelhető megnövekedett szív-érrendszeri rizikó kialakulásában tehát szerepe lehet mind a macroangiopathiás, mind a microangiopathiás elváltozásoknak. Klinikai vizsgálatok azt igazolják, hogy a specifikus, microvascularis szövődmények kialakulásában a hyperglycaemia az elsődleges kóroki tényező, a macrovascularis szövődmények patomechanizmusában azonban a hyperglycaemia mellett az anyagcserezavar egyéb jelenségeinek is meghatározó szerepe van. Számos vizsgálati adat erősíti meg, hogy a macroangiopathia kialakulása az inzulinrezisztenciával illetve az ahhoz kapcsolódó kóros metabolikus és keringési eltérésekkel (atherogén dyslipidaemia, hypertonia, fokozott véralvadékonyság) áll összefüggésben, a hyperglycaemiás állapot kialakulása pedig a szív-érrendszeri rizikó további fokozódásával jár. Az érelváltozások kialakulásának kórfolyamatában a strukturális károsodásokat megelőzik az érreaktivitás kóros változásai. Így experimentális és klinikai diabetesben is már az érfal morfológiailag detektálható elváltozásainak megjelenése előtt az érreaktivitást érintő, funkcionális elváltozások tapasztalhatók. Mind a macro-, mind a microvasculaturában fokozódik az érösszehúzódási hajlam, ezt kísérheti az 3
érelernyedési képesség károsodása. Ezen folyamatok a szöveti ischaemia kialakulására hajlamosítanak diabetesben. Számos klinikai illetve kísérletes adat bizonyítja, hogy a diabetesben bekövetkező, korai, funkcionális érreaktivitás változás oka az endothel megváltozott működésében keresendő. Mind a diabeteses, mind az izolált hyperglycaemiás állapot az endotheliális vasoconstrictor (endothelin-1, angiotensin II, vasoconstrictor prostanoidok) és vasodilator faktorok (nitrogén-monoxid - NO, prostacyclin, endothelium derived hyperpolarizing factor - EDHF) közötti élettani egyensúly megbomlásához vezethet. Nem tekinthető tisztázottnak azonban, hogy milyen - érreaktivitás változásban megjelenő endothelfunkciót érintő változások következnek be diabetesben illetve izolált hyperglycaemiában a cardiovascularis szövődmények kialakulása szempontjából meghatározó jelentőségű femoralis és coronaria érterületen, és az mely endogén vasoactiv mechanizmusok részvételével történik. 2. Célkitűzések Jelen munka célja az endothelfunkció érreaktivitás változásban megjelenő módosulásainak vizsgálata experimentális diabetes mellitusban. A hyperglycaemiás állapot lehetséges kóroki szerepének tisztázására vizsgáltuk továbbá, hogy a környezeti magas glukózkoncentráció okoz-e - a diabeteses állapotban megfigyelhetőekkel rokon - funkcionális változásokat in vitro és in vivo modellekben. Vizsgálni kívántuk izolált femoralis arteriák endothelfüggő relaxációját alloxandiabeteses állapotban illetve magas glukózkoncentrációjú közegben. Az endogén vasoactiv mechanizmusok (L-arginin-NO-ciklikus guanosin monophosphate: cgmp és cyclooxygenase anyagcsereutak) kölcsönhatásának elemzésére célul tűztük ki a cyclooxygenase gátlás hatásának vizsgálatát az acetilkolin kiváltotta relaxációra. Megfeleltethető in vivo modellként az arteria femoralis acetilkolin kiváltotta vezetőképesség változásainak elemzését tűztük célul anyagcsere-egészséges illetve alloxan-diabeteses, valamint acut, localis hyperglycaemiás állapotokban. Vizsgálni kívántuk exogén angiotensin II hatását a koszorúér keringésre, illetve izolált koszorúér preparátumok prostanoid synthesisére, anyagcsere-egészséges és 4
alloxan-diabeteses állapotban. Előző tanulmányainkból ismert, hogy a vasoactiv prostanoidok termelődését -adrenerg mechanizmusok modulálják, így elemeztük adrenerg blokád hatását a fenti folyamatokban. A koszorúerek endothelfüggő relaxációs képességének experimentális diabetesben bekövetkező esetleges módosulásait az acetilkolin kiváltotta in vitro relaxáció illetve az in vivo vezetőképesség változás vizsgálatával kívántuk meghatározni. Közvetett vizsgálómódszerekkel (cgmp felszabadulás mérése, NO synthase illetve cyclooxygenase gátló alkalmazása) kívántuk elemezni az egyes endogén vasoactiv mechanizmusok részvételét a funkcionális változások kialakulásában. Megvizsgáltuk, hogy a diabetes indukciója után azonnal megkezdett inzulinkezeléssel, illetve in vitro L- arginin szubsztitúcióval kivédhetők-e a diabeteses állapotban tapasztalható változások. Annak tisztázására, hogy magának a hyperglycaemiás állapotnak lehet-e kóroki szerepe az experimentális diabetesben tapasztalható koszorúér reaktivitás változásban, célul tűztük ki az acetilkolin kiváltotta relaxáció vizsgálatát izolált koszorúereken magas glukózkoncentrációjú közegben illetve in vivo acut, localis hyperglycaemiában. 3. Módszerek 3.1.Kísérleti állatok vizsgálatainkat 66 kezeletlen és 17 inzulin-kezelt (0,5-1,5 IU/kg/nap sc.) alloxan-diabeteses (560 mol/kg alloxan-monohydrat iv.), valamint 101 anyagcsere-egészséges, mindkét nemű, korcs kutyán végeztük a vizsgálatokra 3 hónappal a diabetes kiváltása után került sor 3.2. In vitro vizsgálati módszerek izolált érpreparátumokon elemeztük az acetilkolin (3 nml/l-10 mol/l) kiváltotta endothelfüggő relaxációt az izometriás tónusváltozások mérésével (F-30 transducer, Hugo Sachs), közvetett vizsgálómódszerekkel - cyclooxygenase (3 mol/l indomethacin) illetve NO synthase gátló (100 mol/l N -nitro-l-arginin) 5
alkalmazása - elemeztük az egyes endogén vasoactiv mechanizmusok kölcsönhatásának szerepét a tapasztalt változásokban mértük anyagcsere-egészséges és diabeteses állatok koszorúereinek cgmp termelését radioimmunoassay (Amersham) segítségével basalis állapotban, majd acetkolin (0,1-10 mol/l) stimuláció után mértük anyagcsere-egészséges és diabeteses állatok koszorúereinek prostanoid termelését radioimmunoassay segítségével basalis állapotban, majd angiotensin II (50 nmol/l) stimuláció után 3.3. In vivo vizsgálati módszerek pentobarbitallal (133 mol/kg iv.) altatott kutyákban monitoroztuk az artériás középnyomást, a szívfrekvenciát (Statham P23Db), a femoralis illetve koszorúér vérátáramlást (Gould SP 2202 elektromágneses flowmeter) a vasoactiv anyagokat illetve acut, localis hyperglycaemia (25 mmol/l) kiváltására a glukózt intraarteriás infúzió formájában adagoltuk (STC 526 pumpa, Terumo), a koszorúerek esetében diagonális ágon keresztül bevezetett katéteren (Vygon 13210), a femoralis arteriák esetében Seldinger technikával bevezetett katéteren keresztül 4. Eredmények 4.1. Az in vitro vizsgálatok eredményeinek összefoglalása 3 mol/l prostaglandin F 2 (PGF 2 ) indomethacin inkubáció után számottevően erősebb érösszehúzódást váltott ki alloxan-diabeteses állatok femoralis érgyűrűiben, anyagcsere-egészséges kontrollokhoz viszonyítva magas glukózkoncentrációjú (25,5 mmol/l) közegben anyagcsere-egészséges kutyák femoralis érgyűrűi erősebb kontrakciókkal reagáltak PGF 2 adására a normál glukózkoncentráció mellett vizsgált kontrollokhoz képest, mind alapállapotban mind cyclooxygenase gátló adása után 6
az alloxan-diabeteses állapot nem okozott lényeges változást az arteria femoralis készítmények acetilkolin kiváltotta endothelfüggő relaxációjának mértékében, magas glukózkoncentrációjú közeg viszont jelentősen rontotta azt, indomethacin nem okozott számottevő különbséget az acetilkolin hatásában az acetilkolin kumulatív adagolásával kiváltott endothelfüggő relaxáció csökkent mértékű volt diabeteses állatok koszorúérgyűrűiben az anyagcsere-egészséges kontrollokhoz viszonyítva. Az alloxan-diabeteses állatok coronaria preparátumaiban a superfusatum basalis cgmp szintje jelentősen kisebb volt mint az anyagcsere-egészséges kontrollokéban, acetilkolin illetve L-arginin (1 mmol/l) hozzáadására csak az egészséges koszorúér készítményekben növekedett a cgmp szint a diabetes indukciója után egy héttel kezdett inzulinkezelés jelentősen javította a koszorúerek relaxációs képességét, az inzulin-kezelt állatok koszorúereiben az acetilkolin kiváltotta érelernyedés mértéke nem különbözött számottevően az anyagcsere-egészséges kontrollokétól magas glukózkoncentrációjú közeg jelentősen rontotta az anyagcsere-egészséges állatokból származó koszorúerek acetilkolin kiváltotta relaxációját cycloxygenase gátló hatására csak a kezeletlen diabeteses állatok koszorúereiben csökkent az eleve károsodott - acetilkolin kiváltotta relaxáció mértéke angiotensin II növelte az egészséges kutyákból származó coronaria érgyűrűk PGI 2 termelését, diabeteses állatok koszorúereiben ez a serkentés nem következett be. -adrenerg blokád (5 mol/l phentolamin) kivédte a PGI 2 termelődés fokozódást az egészséges koszorúerekben, ellenben a diabeteses erek prostanoid szintézisét nem befolyásolta számottevően 4.2. Az in vivo vizsgálatok eredményeinek összefoglalása az intraarteriális acetilkolin infúzió (2,25-36 pmol/kg/min) kiváltotta arteria femoralis vezetőképesség fokozódás mértékében nem mutatkozott számottevő különbség az anyagcsere-egészséges, alloxan-diabeteses illetve acut, localis hyperglycaemiás csoportok között, ezen a jelenségen cyclooxygenase gátlás (10 mol/kg indomethacin) sem változtatott 7
az intraarteriális acetilkolin infúzió kiváltotta koszorúér vezetőképesség fokozódás mind alloxan-diabeteses, mind acut, localis hyperglycaemiás állapotban csökkent mértékű volt normoglycaemiás kontrollokhoz viszonyítva az inzulin-kezelt diabeteses állatok coronaria keringésében az acetilkolin kiváltotta vezetőképesség fokozódás nem tért el számottevően az anyagcsereegészséges állapotban tapasztalttól az intracoronariásan infundált indomethacin csak a kezeletlen diabeteses csoportban csökkentette az acetilkolin hatását, olyannyira, hogy a koszorúér vezetőképességének fokozódása helyett annak csökkenése következett be intracoronariás angiotensin II infúzió (63-1000 pmol/kg) hatására bekövetkező vérnyomásemelkedés mértéke jelentősen nagyobb volt a diabeteses állatokban, -adrenerg blokád (2 mol/kg phentolamin) nem befolyásolta az egészséges állatok reakcióit, ellenben a diabeteses csoportban a vérnyomásemelkedés még kifejezettebbé vált angiotensin II intracoronariás infúziója dózisfüggő koszorúér áramlásfokozódást váltott ki mind anyagcsere-egészséges, mind alloxan-diabeteses állatokban, ennek mértéke nem tért el számottevően a fenti két vizsgálati csoportban. adrenerg blokád hatására az angiotensin II okozta áramlásfokozódás csökkent az anyagcsere-egészséges csoportban, ellenben az alloxan-diabeteses kutyák reakciói nem változtak számottevően 5. Új megállapítások magas környezeti glukózkoncentráció hatására anyagcsere-egészséges állatokból származó arteria femoralis preparátumokon fokozódik a PGF 2 kiváltotta érösszehúzódás és csökken az acetilkolin kiváltotta relaxáció mértéke, ezen cyclooxygenase gátlás nem változtat magas környezeti glukózkoncentráció hatására akárcsak alloxan-diabeteses állapotban csökken a koszorúerek acetilkolin kiváltotta endothelfüggő relaxációja, in vitro és in vivo vizsgálva, cyclooxygenase gátlás hatására hyperglycaemiás állapotban nem, csak diabeteses állapotban csökken tovább a relaxáció mértéke 8
a diabetes indukciója után egy héttel megkezdett inzulinkezelés kivédte a koszorúerek endothelfüggő relaxációs képességének károsodását experimentális diabetesben in vivo, az angiotensin II kiváltotta koszorúér áramlásfokozódás mértékét anyagcsere-egészséges állatokban csökkentette az -adrenerg blokád, ellenben alloxan-diabeteses állapotban nem változtatta meg azt e jelenségnek megfeleltethetően exogén angiotensin II izolált diabeteses koszorúerekben nem fokozta a PGI 2 termelődést, ellenben anyagcsereegészséges erekben serkentette azt, -adrenerg blokád megszűntette a csoportok közötti fenti különbséget Eredményeink arra utalnak, hogy mind az experimentális diabetes, mind a magas környezeti glukózkoncentráció befolyásolja az endothelium exogén vasoconstrictor és vasodilatator hatásokat moduláló képességét, a kialakuló dysfunctio mintázata azonban nem teljesen egyezik meg a fenti két vizsgált kórélettani állapotban, illetve kialakulása az érintett érterületnek is függvénye. 9
6.1. Az értekezés témájában megjelent közlemények 1. Koltai MZ, Pósa I, Kocsis E, Rösen P, Pogátsa G: Role of vascular adrenergic mechanisms in the haemodynamic and PGI 2 stimulating effects of angiotensin in diabetic dogs. Molecular and Cellular Biochemistry 163/164:151-157:1996 2. Koltai MZ, Hadházy P, Pósa I, Kocsis E, Winkler G, Rösen P, Pogátsa G: Characteristics of coronary endothelial dysfunction in experimental diabetes. Cardiovascular Research 34:157-163:1997 3. Kocsis E, Pacher P, Pósa I, Nieszner E, Pogátsa G, Koltai MZ: Hyperglycaemia alters the endothelium-dependent relaxation of canine coronary arteries. Acta Physiologica Scandinavica 169:183-187:2000 6.2. Egyéb közlemények 1. Kecskeméti V, Pacher P, Szalai G, Wollák I, Tekes K, Pósa I, Kocsis E: Electrophysiological characteristics of ventricular muscles from diabetic hearts. Acta Physiologica Hungarica 84:295-295:1996 2. Pósa I, Kocsis E, Koltai MZ, Pogátsa G: A glimepirid haemodynamikai és a szívizom laktát-anyagcseréjére gyakorolt hatása kutyán. Diabetologia Hungarica 4:87-94:1996 3. Pogátsa G, Koltai MZ, Pósa I, Kocsis E, Papp JG: Effect of hypoglycaemic sulphonylureas on vagal functions. Clinical and Experimental Cardiology 1:25-28:1996 4. Pogátsa G, Koltai MZ, Winkler G, Kocsis E: Benfotiamin preventív hatása a cardialis autonom neuropathia kialakulására. Magyar Belorvosi Archivum 50:443-448:1997 5. Nieszner É, Pósa I, Kocsis E, Pogátsa G, Préda I, Koltai MZ: A prekondicionálás jelenségének módosulása kezelt és kezeletlen diabetes mellitusban. Diabetologia Hungarica 8:1:19-26:2000 10
6. Cai W, Vosschulte R, Afsah-Hedjri A, Koltai MZ, Kocsis E, Scholz D, Kostin S, Schaper W, Schaper J: Altered balance between extracellular proteolysis and antiproteolysis is associated with adaptive coronary arteriogenesis. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 32:997-1011:2000 7. Székely L, Richter T, Jákics J, Haán A, György M, Kocsis E, Balázs P, Pártos O, Lengyel M, Koltai MZ, Villányi J, Horkay F: Transmyocardiális laser revascularisatio egy új (erbium:glass) laserforrás első klinikai alkalmazása. Cardiologia Hungarica 2:133-140:2001 8. Cai W, Koltai MZ, Kocsis E, Scholz D, Schaper W, Schaper J: Connexin 37, not Cx40 and Cx43, is induced in vascular smooth muscle cells during coronary arteriogenesis. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 33(5):957-967:2001 9. Kecskeméti V, Bagi Z, Pacher P, Pósa I, Kocsis E, Koltai MZ: New trends in the development of oral antidiabetic drugs. Current Medicinal Chemistry 9:53-71:2002 10. Pósa I, Kocsis E, Nieszner É, Koltai MZ, Pogátsa G: Effects of low daily dose sulphonylureas in diabetic dog hearts. Arzneimittel-Forschungen/Drug Research: nyomdában 11. Nieszner É, Pósa I, Kocsis E, Pogátsa G, Préda I, Koltai MZ: Influence of diabetic state and that of different sulphonylureas on the size of myocardial infarction with and without ischaemic preconditioning in rabbits. Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes: nyomdában 11