Analog input Analog input 157.34272 167.83224 178.32175 188.81127 Relaxáció (prekontrakció %) Channel 8 Channel 8 Analog input Volts Volts Channel 12 A dózis-függő módon vazorelaxációt Vehikulum 15.80 144.59917 157.74455 170.88993 184.03531 okoz egér aortában Volts 24.20 20.00 29.785970 0,2 μm 23.54 23.54 28.40 24.892985 Channel 12 20.00 20.00 20.000000 16.46 0,6 μm 15.107015 22.282037 2 μm 144.59917 157.74455 133.20846 146.52931 159.85015 173.17100 133.20846 146.52931 159.85015 173.17100 16.46 12.91 12.91 22.905952 20.000000 20.000000 17.717963 70 60 50 40 157.34272 167.83224 178.32175 188.81127 30 20 10 0 15.435927 156.53849 164.73893 172.93938 181.13983 0 0,2 0,6 2 (μm) 17.094048 14.188097
Analog input Analog input 157.34272 167.83224 178.32175 188.81127 Relaxáció (prekontrakció %) Volts Volts Endotheliális NO közvetíti a 0,6 μm vazorelaxáns hatását Vad típusú (T) egér 23.580729 60 50 20.000000 40 Endotheliális NO-szintetáz deficiens (enos-ko) egér aorta 0,6 μm 30 20 10 0 16.419271 12.838542-10 33.692220 T *** enos-ko 26.846110 20.000000
Channel 7 Channel 1 165.60534 178.34421 191.08308 203.82195 Channel 5 Volts Volts Thrombin hatására nem deszenzitizálódnak a hatását közvetítő receptorok Thrombin 0,1 U/ml Thrombin 1 U/ml Thrombin 0,1 U/ml 30.05 0,6 μm 25.03 20.00 14.97 Vehikulum Thrombin 1 U/ml 32.46 165.60534 178.34421 191.08308 203.82195 26.23 20.00 Signaling pathways Dobó, Schroeder, Jenny, Cervenak, Závodszky, Gál Molecular Immunology, Volume 61, Issue 2, 2014, 69-78 13.77
Channel 12 Channel 3 144.59917 157.74455 170.88993 184.03531 Volts Volts Kis dózisú nem okoz deszenzitizációt 0,2 μm 0,6 μm 22.88 20.00 17.12 0,2 μm Thrombin 0,1 U/ml 28.40 14.24 24.20 20.00 15.80
Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos enos és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal Benyó Zoltán SE Klinikai Kísérleti Kutatóés Humán Élettani Intézet Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program konferencia Budapest, 2015. március 21.
Szfingolipid mediátorok S1P Sph szerkezeti lipid SMase ceramidase SMaseD SM Cer SPC
Szfingolipid mediátorok receptorai Fluo-4 fluorescence Fluo-4 fluorescence 3 0 0 2 5 0 No caged-s1p HepG2 S1P S1P 1 2 0 0 1 5 0 1 0 0 1 µm S1P ARG120 GLU 121 ARG 292 5 0 1 mm ATP 0 0 60 120 180 240 300 200 40 µm caged-s1p 150 100 5 0 Parrill AL, ang D, Bautista DL, Van Brocklyn JR, Lorincz Z, Fischer DJ, Baker DL, Liliom K, Spiegel S, Tigyi G (2000) J Biol Chem 275(50):39379-84., ang DA, Lorincz Z, Bautista DL, Liliom K, Tigyi G, Parrill AL (2001) J Biol Chem 276(52):49213-20. Time (s) 0 0 60 120 180 240 300 A HepG2 sejtek plazmamembránján nincsenek S1P receptorok. Meyer zu Heringdorf D, Liliom K, Schaefer M, Danneberg K, Jaggar JH, Tigyi G, Jakobs KH (2003) FEBS Lett 554(3):443-9
Melyik fehérje közvetíti az intracelluláris hatást? SPC ER G IP 3 S1P G Ca 2+ SPC S1P Sph SphK G GPCR FceRI RTK Az S1P és az SPC az IP 3 -receptortól függetlenül az ER thapsigarginszenzitív tartályaiból szabadítja fel a Ca 2+ -ionokat. A kalmodulinról ismert, hogy szabályozza az IP 3 -receptort. Hipotézisünk: az S1P és/vagy az SPC a kalmodulinra hatva mobilizálhatja intracellulárisan a Ca 2+ -ionokat. 4 Ca 2+ apokalmodulin Ca 2+ -kalmodulin
Az SPC a kalmodulin kompetitív gátlószere Kovacs E, Tóth J, Vértessy BG, Liliom K (2010) Dissociation of calmodulin-target peptide complexes by the lipid mediator sphingosylphosphorylcholine: implications in calcium signaling. J Biol Chem 285(3):1799-808 Kovacs E, Liliom K (2008) Sphingosylphosphorylcholine as a novel calmodulin inhibitor. Biochem J 410(2):427-37
Kalmodulin kölcsönhatása szfingozinnal Affinitás + sztöchiometria 1. process 2. process Sph : CaM ~300 : 1 ~ 30 : 1 Kd 4.2 ± 2.6 nm 0.13 ± 0.09 µm Sph+apoCaM Sph Ca 2+ -CaM kristályszerkezete Funkcionális esszék 1. process 2. process Sph : CaM ~80 : 1 ~ 8 : 1 Kd 6.0 ± 1.9 nm 0.64 ± 0.20 µm Sph+Ca 2+ -CaM
A kalmodulin SPC és Sph hatására zárt inhibitorikus konformációt vesz fel Sph SPC M13 target peptid Kovacs E, Harmat V, Tóth J, Vértessy BG, Módos K, Kardos J, Liliom K (2010) Structure and mechanism of calmodulin binding to a signaling sphingolipid reveal new aspects of lipid-protein interactions. FASEB J 24 (10): 3829-3839
enos és MLCK az értónus szabályozásában S1P szfingozin in vivo? S1Pr S1P PLC Ca 2+ CaM enos NO S1Pr sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció
A szfingozin gátolja az enos aktivitását in vitro Az enos enzimet növekvő koncentrációjú kalmodulinnal aktiváltuk. 100 mm szfingozin mindegyik koncentrációban gátlást fejt ki. Az enos enzimet közepes koncentrációjú kalmodulinnal aktiváltuk. A szfingozin koncentráció-függő módon gátolja az enost. A szfingozin gátolja a kalmodulin-függő foszfodiészterázt, kalcineurint, neuromodulint és enost.
Szfingozin (B panel: 10 µm, D panel: 50 µm) ill. vehikulumának (A és C panelek) hatása az acetilkolin endotélium-függő vazorelaxációs hatására A B C D
Szfingozin (10 µm és 50 µm) ill. vehikulumának hatása az NO-donor nátrium-nitroprusszid (SNP) vazorelaxáns hatására
Szfingozin (30 nmol/g, i.a.) hatása az artériás középnyomásra és a szívfrekvenciára Artériás középnyomás (Hgmm) 120 450 115 425 110 105 100 95 90 Artériás középnyomás Szívfrekvencia 400 375 350 325 300 275 250 Szívfrekvencia (1/perc) 85 225 80-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Idő (perc) 200
A szfingozin kalmodulin-függő módon gátolja az enos aktivitását artéria-szeleteken ex vivo S1P S1Pr Sph PLC Ca 2+ CaM enos NO Sph? S1P S1Pr sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció
enos és MLCK az értónus szabályozásában S1P Szfinganin? Ceramid? S1Pr S1P PLC Ca 2+ CaM enos NO S1Pr sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció
Köszönetnyilvánítás Ruisanchez Éva Juhász Tünde Köszönjük a MedInProt támogatását!