Miért hasznos az enzimgátlások tanulmányozása? Metabolikus utak, szabályozó mechanizmusok feltárása pl. az enzimaktivitás szabályozása természetes inhibítorokon keresztül valósulhat meg Következtethetünk az enzim működés mechanizmusára pl. milyen kölcsönhatást alakít ki a szubsztráttal, aktív centrum topológia A gyógyszerek nagy része enzim inhibítor gyógyszeriparban a drog tervezés alapja az enzim kinetikai jellemzése és háromdimenziós szerkezetének meghatározása (Röntgen krisztallográfia; ligand- enzim komplex kölcsönhatásának vizsgálata) -specifikus, nagy affinitású enzim inhibítorok tervezése Penicillin, Ampicillin, irreverzibilis inhibítorok baktérium sejtfalszintézisét gátolják Methotrexate: tumor ellenes szer DNS metabolizmust gátolja aktívan növekedő sejtben Jövő: enzimterápia - specifikus vivőrendszerrel az enzimet a beteg sejthez juttatják Jövő: enzimterápia - specifikus vivőrendszerrel az enzimet a beteg sejthez juttatják, ahol a megfelelő nem toxikus prodrogot az enzim aktivál, a felszabadult drog a beteg szövetben fejtheti ki hatását
Enzimreakciók jellemzői Enyhe körülmények között játszódnak le pl. állandó nyomáson, szűk hőmérséklet intervallumban, jellemző ph tartományban Nincsen melléktermék Jól szabályozhatók ph; ionerősség; kis molekulákkal gátolhatók ill. aktiválhatók a reakció sebességét a nem katalizált reakcióhoz képest 10 6-10 12 -szeresére is megnövelhetik Gyakran használnak kofaktorokat, koenzimeket, prosztetikus csoportokat (NAD + ; átmeneti fémek, flavin) Nagy fokú szubsztrátspecificitás
Termodinamika I. főtétele: zárt rendszerben azok a változások mehetnek végbe, amelyekben az rendszer belső energiája állandó marad, azaz U=0. (energia megmaradás elve U= H+ W W=pV biológiai rendszerben végbemenő folyamatok állandó térfogaton és nyomán zajlanak : W=0 Termodinamika II. főtétele az S, entrópia segítségével megadja az I. főtétel által megengedett spontán, önként végbemenő változások irányát. Zárt rendszer entrópiája valamely spontán, önként lejátszódó folyamatban nő: ΔS > 0 ΔS= Q/T R. Clausius (1864) Zárt rendszerben a belső energia változásának csak egy része alakítható Zárt rendszerben a belső energia változásának csak egy része alakítható hasznos munkává Gibbs féle szabadenergia (G)
Energia átalakulás Termodinamika I. főtétele Termodinamika II. főtétele Szabad- energia Energia átalakulás Energia átalakulások Hasznos munkára fordítható energia Hasznos munkára nem fordítható energia Hasznos munkára nem fordítható energia Spontán folyamatok iránya -entrópia növekedés A különbözõ energiafajták átalakulásakor végső soron termikus energiává degradálódnak (disszipáció). ipáció)
Gibbs-féle SZABADENERGIA (G) A két fõtétel egyesítése; Gibbs-féle szabadenergia (P és T konst.) változása az a maximális energia, ami hasznos munkára fordítható. Δ G = Δ H TΔ S (J.W. Gibbs, 1878) Önként lejátszódó folyamat: Δ G < 0 exergonikus Szabadenergia befektetés szükséges : Δ G > 0 endergonikus Termodinamikai egyensúly: Δ G = 0 csak a rendszerre vonatkozik Mivel a szabadenergia állapotfüggvény, a változását csak a végállapot (a termékek szabadenergiájának összege) és a kezdeti állapot (a kiindulási anyagok szabadenergiájának összege) szabja meg, azaz független az átalakulás tényleges molekuláris mechanizmusától. A ΔG nem ad információt a reakciók sebességérõl, amit a tõle teljesen független aktivációs szabadenergia szab meg (ΔG ).
A reakciók kinetikai és termodinamikai kontrollja Termodinamika II. főtéle leírja a reakciók spontán irányát - termodinamika kontroll Δ G = Δ H TΔ S Önként lejátszódó folyamat: Δ G < 0 exergonikus Kinetikai kontroll (ΔG ): az átmeneti állapot (a reakció folyamán fellépő ő legmagasabb energia állapot) szabad energiája a meghatározó ΔG, : aktiválási szabad energia Enzimreakciókban a ΔG,(aktiválási szabad energia) csökken, a nem katalizált reakcióhoz képestc :
Enzimreakciókban a ΔG,(aktiválási szabadenergia) csökken Nem katalizált Ebben a mértékben csökkenti az enzim az aktiválási energiát Enzimmel Kinetikai kontroll (ΔG ): az átmeneti állapot szabad energiája ΔG, : aktiválási szabad energia
Átmeneti állapot, a reakció folyamán legnagyobb energiájú állapot, aktiválási szabadenergiával jellemezhető ΔG, Enzim katalízis : az aktiválási szabad energia csökkentése Átmeneti állapot (reakció előrehaladásának mértéke)
Hogyan csökkenti az enzim részvétele a szabad energiát? Specifikusan megköti a szubsztrátot - enzim-szubsztrát komplex képzése Szubsztrát kötődés megfelelő orientációban A reaktánsok megfelelő távolságban tartása A szubsztrát megfelelő kötésének fellazítása, hidrát burok megszüntetése Az átmeneti állapot stabilizálása
Acetil-CoA + oxálacetát citrát Enzymes orient substrate molecules, bringing together the atoms that will bond. 1. Az enzim molekula orientálja és térben közel viszi a reaktánsokat (szubsztrátokat) és az őket körülvevő hidrátburkot megszünteti
Reakció kinetika Reakció sebesség Nem katalizált reakció
Kezdeti sebesség- enzim koncentráció függése: lineáris Enzim Katalizált reakció Kezdeti sebesség szubsztrát koncentráció függése hiperbola lefutású Nem katalizált reakció
Reakció sebess ség B régió: Nulladrendű reakció Arégió: Látszólagos elsőrendű reakció A régió Szubsztrát koncentráció B régió
koncentráció t (min)
k 1 k 2 E+S ES P+E k -1 1. E + S ES Gyors előegyensúly 2. ES k 2 P + E lassú lépés é 3. Az enzimreakció sebességmeghatározó lépése Az ES komplex keletkezésének és bomlásának sebessége megegyezik: STEADY-STATE S feltétel etéte d[es]/dt = 0 des/dt = k 1 [E] [S] k- 1 [ES] k 2 [ES] = 0 4. Anyagmérleg: E o = [E] + [ES]
V = k 2 [E o ][S] (k -1 + k )/k 2 1 +[S] V = k 2 [E o ][S] +[S] K M V = v max [S] K M +[S]
Michaelis Menten egyenlet kinetikai állandói Michaelis-Menten Menten állandó: K M = (k -1 + k 2 )/ k 1 dimenzió : M (μm) Az a szubsztrátkoncentráció, ahol az enzimreakció sebessége v max /2 Ha : k2 << k -1 K M = K S az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója Katalitikus állandó /átviteli szám: k 2 = k cat dimenzió : 1/min; 1/sec V max = k 2 [E o ]
Fiziológiás körülmények
Az enzim katalízis hatékonysága k ][S] V = cat [E o +[S] K M 1. Ha [S] >> K M a sebesség megegyezik Vmax 2. Ha [S] << K M a sebesség sokkal kisebb mint k cat V = k 2 K M [E o][s] -fiziológiás körülmény Specificitás állandó: k 2 K M Dimesion: M -1 s -1 Az enzim katalízis hatékonyágát jeliemzi
Az enzim katalízis hatékonyságát jeliemzi: kcat/km
Az enzim katalízis sebességének felső határa Specificitás állandó k 2 = K M 1 2 k 2 k 1 k -1 + k 2 k -1 <<k 2 Az enzim katalízis sebességének felső határa az ES komplex képződésének maximális sebessége, amely diffúzió kontrollált : 10 8 10 9 M -1 s -1 Szénsav anhidráz 600 000 1/s 3-ketoszteroid izomeráz 280 000 1/s Laktát dehidrogenáz 1 000 1/s
Michaelis-Menten egyenlet linearizációja I.KETTŐS RECIPROK vagy LINEWEAVER-BURK ábrázolás: 1/v Lineweaver-Burk egyenes 1 v = K M 1 1 + max [ S] vmax v 1/v MAX tgα = K M / V max -1/K M 1/[S] ordinátán való metszéspont: 1/V max abcisszán való metszéspont : -1/K M
Lineweaver-Burk-féle ábrázolás előnye/hátránya Kettős reciprok ábrázolással szeparált változók (1/v és 1/S), az ábrázolás egyértelműen megmutatja különböző paraméterek sebességre ill. [S]-ra kifejtett hatását Kis szubsztrát koncentrációhoz tartozó mérési hiba a kettős reciprok ábrázolásnál, súlyánál nagyobb arányban jelenik meg Jó indikátora a gátlások típusának megállapítására
Michaelis-Menten egyenlet linearizációja II. HANES-FÉLE ÁBRÁZOLÁS [S] / V = K M / Vmax + [S] / Vmax [S] /v Hanes egyenes tgα = 1 / V max ordinátán való metszéspont: K M / V max K M /v MAX abszciszán való metszéspont: -K M -K M [S] Széles [S] tartományban hűen tükrözi a mért v értékeket!
Michaelis-Menten egyenlet linearizációja 1/MM egyenlet mindkét oldalának szorzása v max v III. EADIE-HOFSTEE LINEARIZÁCIÓ: V= -( K M V/ [S] ) + Vmax tgα = - K M 1 v = K M 1 1 + max [ S] vmax v v/[s] v max v Eadie-Hofstee MAX /K egyenes M Sebesség mérés hibája mind a két tengelyen megjelenik és elhajlást okoz Jól tükrözi ha a Michaelis Menten kinetikától való eltérést v MAX V/[S] V
MM egyenlet linearizációja kinetikai paraméterek meghatározása Line-Weaver Burke kettős reciprok ábrázolás Eadie- Hofstee Hanes Wolf 1 1 K M 1 = + 1/v vs 1/S v V V S max max alacsony [S]-nál hiba v v = V K max v vs v/s M S S K M 1 = + S S/v versus S v V V max max Kisebb hiba alacsony [S]-nál pontosabb Vmax
Nem lineáris regresszió Számítógép segítségével nem-lineáris regressziós analízissel, iterációval állapítjuk meg a kísérleti eredményünket legjobban leíró függvény paramétereit. V =f(s) hiperbola egyenlet alapján becsült K M,V max kezdeti értékeknél megoldjuk. Az így képzett elméleti görbe eltérését a kísérleti adatoktól a legkisebb négyzetek módszerével állapítjuk meg. Addig változtatjuk K M,Vmax értékét amíg az eltérés a kísér- leti adatoktól eléri a minimumot. i Model: Hyperbl V [M/ /s] y = P 1 x/ x +P 2 v max K M P1 2.65575 0.16203 P2 372.21439 34.58494
SPECIFIKUS GÁTLÁSOK I. REVERZIBILIS II. IRREVERZIBILIS vagy teljes gátlás 1. KOMPETITÍV Kovalens módosítás 2. NEM-KOMPETITÍV Affinitás jelölés 3. UNKOMPETITÍV Mechanizmus csapda 4. VEGYES TÍPUSÚ 5.Szubsztrát felesleg és termék gátlás
I.1.Kompetitív gátlás Az inhibítor és a szubsztrát verseng az aktív centrumhoz való kötődésért Elegendően nagy szubsztrát koncentráció esetén a gátló anyag nem befolyásolja az enzim-szubsztrát komplex bomlásának sebességét -változatlan Vmax érték Látszólag a szubsztrát kötésének erőssége megváltozik, növekszik a K M értéke
Kompetitív gátlás [I] nő
S + E + I k 1 k -1 ES k 2 P + E K I KOMPETITÍV GÁTLÁS EI Inhibitor kontans : az EI komplex disszociációs állandója E + I EI EI E + I [E] [I] [EI] = K I Disszociációs állandó [EI] = [E] [I] / KI K If =1/K I KIf = [EI] / [E] [I] EI kompex képződési (formációs) állandója
1. A STEADY-STATE FELTÉTEL: d[es]/dt =0 S + E + I k 1 k -1 ES k 2 P + E des/dt = k 1 [E] [S] k- 1 [ES] k 2 [ES] [ ES] = II. ANYAGMÉRLEG: [Eo ]= [E] + [ES] + [EI] [ S][ E] K M K M K I EI Kompetitív gátlás E = [ E [ ](1 + 0 ] [ S ] [ I] + K M K V =k 2 [ES] I v max [ S] [ v ] = I K M (1 + ) K I + [ S] K M látszólagos növekedése, amely az [I] és K I függvénye : app K M = K M (1+ [I] / K I )
Kompetitív gátlás- Lineweaver-Burk linearizáció: V= V MAX [S] / [K M (1+ [I] / K I )+S] 1/V=[K M (1+ [I] /K I )] / (V max [S]) + [S]/ V max [S] 1/V=(K M (1+ [I] / K I )/V max ) 1/ [S]) + 1/ V max 1/v [I] 2 [I] 1 [I]=0 tgα = K M (1+ [I] K I )/V max 1/v MAX -1/K M app -1/K M 1/[S]
Kompetitív gátlás
Inhibítor konstans megállapítása 1. kompetitív gátlás esetén K app M =K M +(K M /K) I [I] K M app M Meredekség= K M / K I K M [I]
Inhibítor konstans megállapítása 2. kompetitív gátlás esetén Kompetitív gátlás Dixon-féle ábrázolása 1/v [S]=K M /2 [S]=K M [S]=2K M 1/v max -K Id [I] K i -K Id 1/V=(K M (1+ [I] /K I ) / V max ) 1/ [S]) + 1/ V max
Inhibítor konstans megállapítása 2. kompetitív gátlás esetén Dixon-féle ábrázolás alapján 1/V=(K M (1+ [I] /K I ) / V max ) 1/ [S]) + 1/ V max Két különböző szubsztrát koncentráció esetén a kezdeti sebesség reciproka vs Inhibítor koncentráció függvény a maximális sebességnél metszi egymást 1/v MAX + (1+[I] /K I )K M /v MAX ) 1/[S] 1 = 1/v MAX + (1+[I] /K I )K M /v MAX ) 1/[S] 2 (1+[I]/K I ) / [S] 1 =(1+[I]/K I ) / [S] 2 Akkor igaz ha: 1+[I] /K I =0 I [I]= -K I
Példák Kompetitív inhibítorra - 1. Methotrexate (Pirimidin Bioszintézisben dihidrofolát reduktáz gátló) vagy aminopterin Dihidrofolát szerkezeti analógja a methotrexate, amely 1000-szer erősebben kötődik a dihidrofolát reduktázhoz mint fiziológiás szubsztrátja
Dihidrofolát reduktáz katalizált reakció
Kompetitív inhibítor 2.: malonát (Citrát ciklusban szukcinát dehidrogenázt gátló) FAD + FADH, H + No Reaction
Inhibítornak és szubsztrátnak eltérő a szerkezete Inhibítor nem az aktív centrumhoz kötődik A szubsztrát kötődése konformációs változást indukál ezáltal az inhibítor képes kötődni az ES komplexhez Az inhibítor kötődése meggátolja a termékképződést Nagyobb mennyiségű szubsztrátum nem ellensúlyozza a gátlást Unkompetitív Inhibíció
Unkompetitív Gátlás Inhibítornak és szubsztrátnak eltérő a szerkezete Inhibítor nem az aktív centrumhoz kötődik A szubsztrát kötődése konformációs változást á t indukál ezáltal az inhibítor kötődni képes az ES komplexhez Az inhibítor kötődés meggátolja a termékkeletkezést Nagyobb mennyiségű szubsztrátum nem ellensúlyozza a gátlást animáció
UNKOMPETITÍV GÁTLÁS S + E k 1 ES k 2 P + E k -1 + I K I EIS Inhibítor jelenlétében csökken V MAX értéke és látszólag csökken K m is?
Unkompetitív gátlás 1/V [I] 3 [I] 2 [I] 1 =0 app 1/Km 1/K m 1/[S]
1. ANYAGMÉRLEG UNKOMPETITÍV GÁTLÁS K E+S s k ES 2 P+E 2. [Eo ]= [E] + [EIS] + [ES] [E]o = [ES] (1+ [I] / K I )+ [E] [E][S] Ks = KM = [ES] = [ES] [E][S] [KM] + I K I EIS v=(k 2 [E]o [S] ) / ((1+ [I] / K I ) [S]+ K M v max (1+[I] / K [S] I ) V= K M + 1+[I] /K [S] I app app V max = V max /(1 (1+[I]/ K I ) K M = K M /(1 (1+ [I]/ K I ) látszólag csökken
(1) (2) (3) (4) Visszahelyettesítés (2)-es maid az (1)-es egyenletbe
Unkompetitív gátlás Kettős reciprok ábrázolás 1/V [I] 3 [I] 2 [I] 1 1/[S] Meredekség nem változik
Unkompetitív Dihidrofolát reduktáz- NADP+ kötődés Dihidrofolát reduktáz- NADP+ kötődés Inhibitor kötődése az ES komplexhez meghatározott sor- rendben történik pl. termékgátlás több szubsztrátos rendszerek esetén
Herbicid glifozát Roundup : N-foszfonmetilglicin Unkompetitív inhibítora az 1-karboxiviniltranszferáz i ilt enzimnek 1-karboxiviniltranszferáz enzim két szubsztrátja :3-foszfosikimát és foszfoenolpiruvá Unkompetitív inhibítor: a szabad enzimhez nem kötődik csak a 3-foszfosikimát-Enzim Komplexhez, versenyezve a foszfoenolpiruváttal
Aromás aminosavak szintézise növényekben
1-karboxiviniltranszferáz Roundup glifozát gátlás N-foszfonometilglicin
Nem-kompetitív gátlás Az Inhibítor kötődhet a szabad enzimhez és a szubsztrát kötött enzimhez is, a kötődés véletlenszerű Sem az inhibítor sem a szubsztrát nem gátolja meg a másik kötődését Az enzim-inhibítor i és enzim-szubsztrát-inhibítor i komplexből termék nem képződik úgynevezett dead-end komplex
Nem-kompetitív inhibíció S + E k 1 k 2 ES P + E k -1 + I + I K I K I EI EIS EI és EIS komplexek disszociációs állandója egyenlő
Nem-kompetitív gátlás Inhibitor kötődése nem meghatározott sorrendben történik az E-hez és ES komplexhez (random)
VEGYES GÁTLÁS speciális esete a Nem-kompetitív gátlás S + E k 1 k 2 1 ES P+E + I k -1 + I K I K I EI EIS Ha K I EI = K I EIS : nem-kompetitív gátlásról beszélünk V max értéke csökken, míg K m értéke nem változik Ha K EI I = K EIS I : vegyes gátlás
Nem-kompetitív gátlás K s k 2 1/V MAX = y tengelymetszet -1/K M K M /V MAX = meredekség V = [V MAX /(1+ [I] / K I )] [S] [S] +K M Az inhibítor azonos affinitással kötődik az enzimhez és az enzimszubsztrát komplexhez, mindkét esetben keletkező EI és ESI komplex inhibítor állandója azonos (K I ) ;
K M V max értéke csökken, míg K m értéke nem változik
Nem-kompetitív inhibítorok Kis molekulák esetén valósul meg pl. protonálódás, fém kötődés (részben irreverzibilis) Fluorid Enoláz inhibítora α-glükóz - invertáz Doxycycline Kollagenáz inhibítora
A metabolit fluxus az enzim állandó aktivitását tartja fenn - A metabolit fluxus az enzim állandó aktivitását tartja fenn, - enzim aktivitás a B pontban
Az enzim a metabolikus út közepén- hogyan gátol egy inhibítor
Különböző gátlás típusok
Kompetitív Gátlás típusok összefoglalása 1. Unkompetitív Nem-kompetitív (vegyes gátlás speciális esete
Gátlás típusok kettős reciprok ábrázolása kompetitív Nem-kompetitív unkompetitív
Reverzibilis gátlás Teljes gátlás vagy lineáris gátlás app K M app V max 1 app V max [I] Kompetitív vagy specifikus gátlás [I] K app M app V max app V max = V max Nem változik Unkompetitív vagy katalitikus gátlás app K M app V app Nem változik V max V max Vegyes gátlás Tiszta nem-kompetitív gátlás app K M app app V max app V max app Nem változik K M =K M V max
Gátlás típusa app V app MAX K M kompetitív V MAX K M (1+ [I]/ K EI ) Nem-kompetitív V MAX /(1+ [I] /K EI ) K M unkompetitív V MAX /(1+ [I] / K ESI ) K M /(1+ [I] /K ESI ) vegyes V MAX /(1+[I] /K ESI ) K M (1+ [I] /K EI ) (1+ [I] / K ESI )
Szubsztrát felesleg ggátlás Esetei: 1.Ha az enzimreakcióhoz az szükséges, hogy a szubsztrát két vagy több csoportjával kötődjön az Aktív centrumhoz; akkor nagy [S]-nál előfordulhat, hogy nem ugyanazon molekula kötődik több Csoportján keresztül, hanem egy új S molekula csoportja létesíti a hiányzó kötéseket 2. Nagy [S]-nál a szubsztrát nemcsak az aktív centrumhoz, hanem nem-kompetitív módon más Helyhez is kötődik 3. Ha az enzim aktivátor jelenlétében működik, és a szubsztrát komplexet képez az aktivátorral, ez- által l kivonja az aktivátort t az enzim felületéről 4 Nagy [S] ionerősség növekedést okoz amellyel 4. Nagy [S] ionerősség növekedést okoz, amellyel aspecifikusan gátolhatja az enzimet
Unkompetitív gátláshoz hasonló: nincsen EI komplex
Szubsztrát felesleg gátlás Pl.: k 1 k 2 S+E SE + P +E S K SI SES v= k 2 E o S / (K M + S + S 2 /K SI ) -1/Ks 1/K I
Subsztrát felesleg Gátlás v= k 2 E o S / (K M + S + S 2 /K SI ) Alacsony szubsztrát koncentráció S 2 /K S1 << 1 a gátlást nem észleljük v v = max S K + S M Nagy szubsztrát koncentráció K M /S << 1 erős gátlás v v = max 1 + S K S 1