AZ OXIDATÍV STRESSZ, NITROGÉN OXID ÉS ASZIMMETRIKUS DIMETHYLARGININ KÖZÖTTI KAPCSOLAT A KLINIKUM ÉS ALAPKUTATÁS TÜKRÉBEN Doktori tézisek Dr. Tóth János Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Témavezetı: Hivatalos bírálók: Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Koller Ákos egyetemi tanár, MTA Doktora Dr. Nagy Judit egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Somogyi Anikó, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Ligeti László egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Székács Béla egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Hamar János egyetemi magántanár, Ph.D. Budapest 2007
BEVEZETÉS A mikroerek egyik fontos funkciója a szöveti vérkeringés szabályozása és a perifériás ellenállás kialakítása, ami elsısorban a vázizom arteriolák feladata. Az egyik kulcsfontosságú helyi mechanizmus, ami a véráramlást szabályozza, a véráramlás növekedés hatására kialakuló fali nyíróerı. A gyulladás nagyon fontos kórélettani mechanizmusokat indít be, ami atherosclerosishoz, magasvérnyomáshoz és egyéb érkárosodásokhoz vezet. Ezzel együtt a reaktív oxigén gyökök (ROS), mint jelátvivı molekulák, módosíthatják az erek tónusát, valamint strukturális változásokat okozhatnak a mikrocirkulációban, és hozzájárulhatnak az atherosclerosis kialakulásához. Ismert, hogy a NO szintáz enzim L-arginint használ szubsztrátként, valamint az, hogy az L- arginin pótlás vazodilatációt okoz. A metilált L-arginin származékok, úgymint N ω -nitro-larginin (L-NNA), NG-monomethyl-L-arginin (L-NMMA) vagy N ω -nitro-l-arginin-methylészter (L-NAME) gátolják a NO szintázt, így a csökkent NO felszabadulás csökkent vazodilatációt okoz. Számos betegségben, úgymint hyperhomociszteinemia, diabetes mellitus, hipertónia, emelkedhet a szérum metilált L-arginin szintje, mint például az aszimmetrikus dimetilarginin (ADMA). Az emelkedett ADMA szint érfunkcióra gyakorolt hatása eddig nem ismert. A miokardiális infarktus következtében kialakult csökkent szívfunkció gyakran együtt jár a perifériás erek diszfunkciójával, valamint a gyulladásos paraméterek változásával, ami összefüggésben lehet az emelkedett angiotensin II (Ang II) szinttel. Ezért feltételeztük, hogy a miokardiális infarktus után a brachiális artéria áramlás függı dilatációjának (FMD) mértéke korrelációt mutat a gyulladásos paraméterekkel (tumor nekrózis faktor alfa (TNFα), C reaktív protein (CRP)). Szintén feltételeztük, hogy az angiotenzin konvertáló enzim (ACEI) gátlásával a TNFα és CRP csökkentése révén javulni fog az endothel funkció. Számos klinikai tanulmányban leírták, hogy az ACE gátlók, valamint az angiotenzin receptor blokkolók csökkentik a plazma ADMA szintjét. In vivo és in viro bizonyítékok szintén arra utalnak, hogy hipertóniában az angiotensin II és ADMA emelkedett szintje között kapcsolat van. Szintén ismert, hogy az angiotensin II hatására növekszik az intracelluláris oxidatív stressz az endothel sejtekben, és az ACE gátlás növelheti az antioxidáns védekezı mechanizmusok hatékonyságát. CÉLKITŐZÉS 1. Az ADMA hatásának vizsgálata az áramlás függı dilatációra. 2. Az ADMA arteriola átmérıjére gyakorolt hatásának vizsgálata. 3. Sejtszintő mechanizmusok vizsgálata, melyek érintettek az ADMA által létrehozott arteriolás tónusnövekedésben. 4. Az endothel funkció vizsgálata ACE blokkolók hatására. 5. A gyulladásos paraméterek és áramlás függı dilatáció közötti kapcsolat vizsgálata. MÓDSZEREK A Arteriolák izolálása és a videomikroszkópos technika A kísérleteket hím Wistar patkányok (250-300 g) izolált gracilis arterioláin végeztük (belsı érátmérı 150±7 µm és a passzív átmérı 220±8 µm, 80 Hgmm-en). Az erek belsı átmérıjét mikroangiométerhez csatlakoztatott videomikroszkópos rendszerrel mértük, és kiírón valamint analóg digitális átalakítóval PowerLab szoftverrel regisztráltuk. 1
Az arteriolák funkciójának vizsgálatához endothelium függı vazodilatátor acethylcholint és endotheliumtól függetlenül ható nátrium nitroprussidot használtunk. A szervfürdıben levı arteriolát növekvı dózisú ADMA-val, a ciklooxigenáz enzim gátló indomethacinnal és szuperoxid dizmutáz polietilén glikollal (PEG SOD) inkubáltuk..- Az izolált vázizom arteriola falában keletkezı O 2 kimutatását lucigenin kemilumineszcenciával (CL), valamint hydroethidinnel végeztük. MÓDSZEREK B Ötven, Q hullámú miokardiális infarktuson átesett, csökkent bal kamrai funkciójú (EF 30-40%), AHA NY II-III klasszifikációjú betegen végeztük a vizsgálatokat. A randomizált vizsgálat során az egyik csoport quinaprilt (10 mg nap), a másik csoport enalaprilt (10 mg nap) kapott. A brachiális artéria endothel funkcióját (FMD) non invazív módon vizsgáltuk nagy felbontású ultrahangot használva. A betegek testtömeg indexe (BMI), vérnyomása (BP), a brachiális artéria alap átmérıje, standard laboratóriumi paraméterei között nem volt szignifikáns különbség. A vizsgálatok során mértük a betegek bal kamrai ejekciós frakcióját (EF%), tumor nekrózis faktor alfa (TNFα monoklonalis antitest) és C-reaktív protein (CRP, Dade-Behring) koncentrációját. EREDMÉNYEK Áramlás-függı válaszok és ADMA Az izolált arteriolák átmérıje az intraluminális áramlás fokozatos növelése során (5, 10, 15, és 20 µl/min) kontroll körülmények között értágulatot okozott (162 µm-rıl 176 µm-re). Az áramlás megszőnése után az arteriola átmérıje visszatért a kiindulási állapotba. ADMA (10-4 M) jelenlétében az arteriolák alap átmérıje csökkent, és az áramlás lépcsızetes növelése nem okozott érátmérı növekedést, míg kontroll körülmények között 22,7±2,35% érátmérı növekedést találtunk. A fali nyíróerı növekedése kontroll körülmények között értágulatot okozott, míg ADMA jelenlétében a fali nyíróerı növekedése ellenére sem alakult ki értágulat. Az alap értónus és ADMA Az izolált vázizom arterioláknak 80 Hgmm nyomásra spontán aktív tónusa alakult ki, vazoaktív anyag használata nélkül (aktív átmérı: 149,6±13,9 µm, passzív átmérı: 218,4±9,6 µm p<0,05). Az ADMA szignifikáns érátmérı csökkenést okozott (19,6±7,3%, kontroll 149,6±13,9 µm vs. ADMA 127,4±10,44 µm). ADMA jelenlétében szignifikánsan csökkent dilatációt találtunk a NO donor SNP hatására, míg a 8-br-cGMP és a nifedipin hatását nem befolyásolta 10-4 M ADMA. Szuperoxid termelés az érben ADMA jelenlétében Ethidium bromiddal (EB) festett erek fluoreszcenciáját vizsgáltuk kontroll körülmények között és ADMA inkubációt követıen. Az ADMA hatására az EB festés után intenzívebb festıdést mértünk a kontroll erekhez viszonyítva, míg további (PEG)-SOD inkubáció csökkentette az ér falában a fluoreszcenciát. További vizsgálatokat végeztünk, hogy meghatározzuk a szuperoxid jelenlétét, ezért artéria femoralist használva lucigenin chemilumineszcenciát (CL) mértünk. Azt találtuk, hogy ADMA jelenlétében a CL 2
szignifikánsan nagyobb volt (121±9 beütés/perc/szövet mm 2 ) a kontrollhoz viszonyítva (78±4 beütés/perc/szövet mm 2 ), míg (PEG)-SOD szignifikánsan csökkentette a CL. Eredmények B A vizsgálatba bevont betegek kora (43,2±7,1 év), testtömeg indexe (26,7±2,1 kg/m 2 ), szisztolés és diasztolés vérnyomása, ejekciós frakciója nem mutatott különbséget, és ezen paraméterek nem változtak a vizsgálat során. Az ejekciós frakció értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a betegek között (33,6+3,5%), a kontroll csoporthoz viszonyítva (61,5±7,1 %). A betegek a NYHA II-III osztályba voltak sorolhatók. FMD, TNFα és CRP quinapril és enalapril kezelés elıtt és kezelés után Az átlagos FMD érték a brachiális artérián 3% alatt volt, ami szignifikánsan alacsonyabb, míg a szérum TNFα és CRP szintek magasabbak voltak az egészséges kontroll csoporthoz viszonyítva. Nyolc hetes quinapril kezelést követıen szignifikánsan nıtt az FMD, ami 12 hét után is mérhetı volt (FMD kezelés elıtt: 2,95±0,42%; 8. hét: 5,96±1,1%; 12. hét: 6,42±1,21%). A szérum TNFα és CRP szintje szignifikánsan csökkent 8 és 12 hét quinapril kezelés során. Az enalapril csoportban nem volt szignifikáns különbség a kezelés elıtt és kezelés után az FMD értékekben (kezelés elıtt: 3,3±0,33%; 8. hét: 3,5±0,38%; 12. hét: 3,48±0,47%), és a szérum TNFα és CRP szintje emelkedett maradt a kezelés hatására. MEGBESZÉLÉS Kísérleteink eredménye alapján kimondhatjuk, hogy izolált gracilis izom arteriolában az aszimmetrikus dimethylarginin 1) gátolja az áramlás-nyíróerı-kiváltotta érátmérı növekedést, melyet az endogén termelıdött nitrogén oxid okozott, míg nem hatott a nifedipin és 8 br-cgmp kiváltotta érátmérı növekedésre, 2) a szuperoxid dizmutáz visszafordította az ADMA-okozta alap érátmérı csökkenést, 3) az ADMA hydroethidin fluoreszcenciával és lucigenin chemilumineszcenciával kimutatható oxidatív stresszt okozott, 4) infarktust követı, csökkent szívfunkciójú betegeknél az FMD alacsonyabb, a szérum TNFα és CRP magasabb a kontrollhoz viszonyítva, 5) quinapril kezelés után, ami növelte az FMD-t és csökkentette a TNFα, CRP-t egy erıs negatív korreláció mutatkozott az FMD és szérum TNFα és CRP között, 6) erıs pozitív korrelációt találtunk a szérum TNFα és CRP szintek között. Az ADMA normál koncentrációja 0,355±0,066 µm, ami oxidatív stresszel összefüggı betegségekben növekedhet, mivel az ADMA elbontását végzı dimethylarginin dimethylaminohydroláz enzim (DDAH) aktivitása csökken. Nagy testtömeg indexszel rendelkezı betegekben (BMI 26 kg/m 2 ) a plazma ADMA koncentrációja szignifikánsan nagyobb (1,44 µmol/l, míg alacsony BMI-vel rendelkezı egyénekben 1,31 µmol/l). Szintén számos tanulmányban leírták, hogy a plazma ADMA koncentrációja szignifikánsan 3
nagyobb a dohányzókban, mint a nem dohányzókban. Az ADMA intracelluláris koncentrációja a vörösvértestekben 40,61±7,15 µm. Ezek az ADMA koncentrációk képesek gátolni a NOS-t, kóros érfunkciót okozva. Kísérleteinkben 10 6-10 4 M koncentrációjú ADMA-t használtunk, hogy az in vivo körülményeket minél jobban utánozzuk. ADMA jelenlétében az arteriolák alap átmérıje csökkent, és az áramlás lépcsızetes növelése nem okozott érátmérı növekedést, míg kontroll körülmények között érátmérı növekedést találtunk. A fali nyíróerı növekedése kontroll körülmények között értágulatot okozott, míg ADMA jelenlétében a fali nyíróerı növekedése ellenére sem alakult ki értágulat. Az ADMA szignifikáns érátmérı csökkenést okozott. ADMA jelenlétében szignifikánsan csökkent dilatációt találtunk a NO donor SNP hatására, míg a 8-br-cGMP és a nifedipin hatását nem befolyásolta 10-4 M ADMA. Ethidium bromiddal (EB) festett erek fluoreszcenciáját vizsgáltuk kontroll körülmények között és ADMA inkubációt követıen. Az ADMA hatására az EB festés után intenzívebb festıdést mértünk a kontroll erekhez viszonyítva, míg további (PEG)-SOD inkubáció csökkentette az ér falában a fluoreszcenciát. További vizsgálatokat végeztünk, hogy meghatározzuk a szuperoxid jelenlétét, ezért artéria femoralist használva lucigenin chemilumineszcenciát (CL) mértünk. Azt találtuk, hogy ADMA jelenlétében a CL szignifikánsan nagyobb volt a kontrollhoz viszonyítva, míg (PEG)-SOD szignifikánsan csökkentette a CL. Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az ADMAokozta érátmérı csökkenés kiváltója a szuperoxid. A renin-angiotenzin rendszer upregulációja az erekben levı oxidatív stressz növelı hatású, így csökkentve a NO biológiai hozzáférhetıségét. Az ACE gátló quinapril használatával növelhetı az endothelium függı értágulat feltehetıen a NAD(P)H oxidáz enzim aktivitásának csökkentése valamint a szuperoxid dizmutáz enzim aktivitásának növelése révén. Azt találtuk, hogy a TNFα és CRP szérum szintje szignifikánsan emelkedett, az FMD csökkent a kezelés elıtt. Nyolc hetes quinapril kezelést követıen szignifikánsan nıtt az FMD, ami 12 hét után is mérhetı volt. A szérum TNFα és CRP szintje szignifikánsan csökkent 8 és 12 hét quinapril kezelés során. Az enalapril csoportban nem volt szignifikáns különbség a kezelés elıtt és kezelés után az FMD értékekben, és a szérum TNFα és CRP szintje emelkedett maradt a kezelés hatására. A quinapril és enalapril hatásának különbözısége feltételezhetıen a quinapril nagyobb szöveti affinitásnak köszönhetı, ami megmagyarázhatja az eltérı endothel funkciót javító hatást. Eredményeink egybevágnak korábbi klinikai vizsgálatok eredményeivel pl. AIRE, ami a ramipril és TRACE, ami pedig a trandolapril hatásait vizsgálta, jelezve az ACE gátlók pozitív hatását az infarktus korai szakaszában, csökkentik a szívelégtelenséget, a moralitást és a hirtelen szívhalált. A csökkent NO felszabadulás elıidézheti a nagyerek falának merevségét és a mikroerek ellenállásának növekedését, az ischaemiás szív újabb terhelését és szívelégtelenséget okozva. Az alacsony dózisú quinapril kezelés jótékony hatása nem a vérnyomás csökkentı hatásának tudható be, hanem az endothel funkció javításának. Hosszú távú ACE gátló kezelés növelheti az ADMA lebontását végzı dimethylarginin dimethylaminohydroláz enzim aktivitását az Ang II-kiváltotta szuperoxid termelés csökkentése révén. A jelen eredményekbıl következik, hogy nagy szöveti specificitású ACE gátló kezelés növeli az endothel funkciót, csökkenti az érfalban a gyulladást és az oxidatív stresszt, így csökkentheti a miokardiális infarktus után kialakuló érbetegséget és szívelégtelenséget. 4
A tézissel összefüggı közlemények Janos Toth, Anita Racz, Pawel Kaminski, Michael Wolin, Zsolt Bagi, Akos Koller Asymmetric dimethylarginine (ADMA) inhibits flow/shear stress dependent dilation of isolated arterioles and increases basal tone via superoxide release Hypertension, 2007 Mar;49(3):563-8. Epub 2007 Jan 22. IF: 6.331 Imre Kovacs, Janos Toth, Jeno Tarjan, Akos Koller Correlation of flow-mediated dilation with inflammatory markers in patients with impaired cardiac function. Beneficial effects of inhibition of ACE. European Journal of Heart Failure; Vol. 5, Issue 8 (2006) 451-459. IF: 3.546 Egyéb közlemények Imre Kovács, Albert Császár, János Tóth, György Siller, Attila Farkas, Jenı Tarján, Judit Horváth, Akos Koller Correlation between flow-mediated dilation and erectile dysfunction, European Urology, submitted 2007 IF: 3.542 Erika Toth, Zsolt Bagi, Janos Toth, Anita Racz, Pawel M. Kaminski, Michael S. Wolin, Akos Koller Role of polyol pathway in development of oxidative stress-induced dysfunction of arterioles. Role of diminished NO and enhanced PGH 2 /TXA 2 mediation American Journal of Physiology Submitted IF: 3.560 Kovacs Imre, Csaszar Albert, Koller Akos, Farkas Attila, Horvath Judit, Toth Janos, Tarjan Jeno, Nagy Lajos Pleiotrop effects of atorvastatin for the arterial endothelial function in patients with primer hypercholesterinaemia Cardiologia Hungarica 2004; 34: 114-119 Absztraktok Imre Kovacs, Janos Toth, Akos Koller Quinapril improves flow mediated dilatation (FMD) in patients with impaired cardiac function; correlation between FMD, CRP and TNF alpha European Society of Cardiology, Heart Failure Update 2004 Wroclaw, Poland European Journal of Heart Failure Supplements V. 3,supplement 1 June 2004, 108/28-29. Janos Toth, Istvan Wittman, Judit Nagy, Akos Koller The endogenous inhibitor of nitric oxide synthase, asymmetric dimethylarginine (ADMA) inhibits flow dependent dilation of isolated arterioles 23rd Conference of the European Society for Microcirculation, Lisbon, Portugal, 2004. szept. 8-11. Journal of Vascular Research 41, supplement 2, 2004, 58. Janos Toth, Csongor Cseko, Erika Toth, Imre Kovacs, Akos Koller Asymmetric dimethyl L arginine (ADMA) inhibits endothelium dependent regulation of arteriolar resistance XXXV International Congress of Physiological Sciences 2005, San Diego, USA2005, San Diego, USA The FASEB Journal March 7, 2005 Volume 19, No.:5 A1678 Imre Kovacs, Albert Csaszar, Janos Toth, Gyorgy Siller, Attila Farkas, Jeno Tarjan, Judit Horvath, Akos Koller Positive Correlation between erectile and endothelial dysfunctions XXXV International Congress of Physiological Sciences 2005, San Diego, USA The FASEB Journal March 7, 2005 Volume 19, No.:5 A1238 5
Akos Koller, Erika Toth, Csongor Cseko, Janos Toth, Imre Kovacs, Zsolt Bagi Role of Polyol pathway in oxidative stress-induced arteriolar dysfunction in diabetes mellitus (DM) XXXV International Congress of Physiological Sciences 2005, San Diego, USA The FASEB Journal March 4, 2005 Volume 19, No.:4 A633 Akos Koller, Nora Erdei, Attila Toth, Istvan Edes, Janos Toth, Zsolt Bagi High intraluminal pressure reduces tachyphylaxis to angiotensin II in isolated arterioles XXXVI International Congress of Physiological Sciences 2006, San Francisco, USA The FASEB Journal, March 6, 2006 Vol. 20, No.4 A306 Janos Toth, Pawel M. Kaminski, Michael S. Wolin, Akos Koller Superoxide released to asymmetric dimethylarginine (ADMA) interferes with the vasomotor responses of isolated arterioles XXXVI International Congress of Physiological Sciences 2006, San Francisco, USA The FASEB Journal, March 7, 2006 Vol. 20, No.5 A1149 Tara Goetschkes, Janos Toth, Bela Debreczeni, Robert Tamas, Akos Koller Hydrogen peroxide elicits prostaglandins-mediated constriction of isolated skeletal muscle venules XXXVI International Congress of Physiological Sciences 2006, San Francisco, USA The FASEB Journal, March 7, 2006 Vol. 20, No.5 A1400 Peter Banga, Anita Racz, Erika Toth, Janos Toth, Akos Koller Temperature-dependent modulation of myogenic tone of isolated gracilis and coronary arterioles XXXVI International Congress of Physiological Sciences 2006, San Francisco, USA The FASEB Journal, March 7, 2006 Vol. 20, No.5 A1404 6