Use of mesenchymal stem cells in musculoskeletal tissue engineering Tézisek Kupcsik László Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológia doktori iskola, vezető: Erdei Anna Molekuláris sejt- és neurobiológia program, vezető: Sass Miklós Témavezető: Sass Miklós, D.Sc. A kísérletes munka témavezetője: Mauro Alini, Ph.D. 2009
Bevezetés Az őssejtterápia az új évezred biológiájának egyik legnagyobb ígérete. A helyreállító orvoslás egészen biztosan kamatoztatni tudná ezen sejtek gyógyító potenciálját. Az embrionális és magzati őssejtek óriási potenciállal rendelkeznek, ugyanakkor veszélyeket is rejtenek a tumorképző potenciáljuk miatt, és a differenciációjuk is nehezen szabályozható. A csontvelőátültetés során ma már rutinszerűen használnak nagy növekedési potenciállal rendelkező donorsejteket hogy a sérült vérképző rendszert helyreállítsák. Ezeket a sejteket hematopoetikus őssejteknek nevezik. A csontvelőben jelen vannak egyéb, nem hematopoetikus felnőtt őssejtek is. Ezek egyéb mezenchimális szövetekben is megtalálhatók, és az ortopéd orvoslás területén bennük rejlő lehetőségeket csak most kezdik felfedezni. Ezek a sejtek alkalmasak lehetnek csont- és porcregenerációra, valamint ín, ínszalag, izom és egyéb mezenchimális eredetű szövetek helyreállítására. A kutatásaink során a csontvelő eredetű mezenchimális őssejtek (MSC) csont- és porcsejt-differenciójának optimalizálási lehetőségeit vizsgáltuk. Az első kísérletsorozatban a sztatinok feltételezett csontsejt-differenciációt kiváltó hatását vizsgáltuk in vitro. Először 1999-ben fedezték fel, hogy alkalmazásuk megnövelte a kísérleti patkányok csonttömegét. (Mundy et al., 1999) Később több tanulmány is azt az eredményt hozta, hogy a sztatinok egyes oszteoblaszt sejtvonalak működését pozitívan befolyásolják.(maeda et al., 2004) Ugyanakkor több publikáció is figyelmeztetett, hogy a sejtek épségét és a sejtvázat is hátrányosan érinti az alkalmazásuk.(ghosh et al., 1997; Vamvakopoulos and Green, 2003) A potenciálisan veszélyes és drága növekedési faktorokkal szemben előnyösebb lenne ezeket az egyszerű szerves vegyületeket használni a MSC-ek oszteoblasztikus differenciáltatására. Egy következő kísérletsorozatban tehát a lovastatin és szimvasztatin humán MSC-eken való használhatóságát vizsgáltuk, különös tekintettel a oszteoblaszt markerekre, a citotoxicitásra, valamint a sejtmorfológiára. A rekombináns növekedési faktorok használatát úgy is el lehet kerülni, hogy a sejtekre bízzuk azok előállítását. Az ehhez szükséges gének bejuttathatók például adenovírus vektorok segítségével. Ez a stratégia nem vezetett eredményre birka állatmodell esetén. (Egermann et al., 2006) Ezért egy következő kísérletsorozatban arra kerestük a választ,
hogy van-e valami különbség a humán és birka MSC-ek és oszteoblasztok adenovirális BMP-2-re adott válasza között in vitro. Végül a SOX9 transzkripciós faktor alkalmazásának lehetőségét vizsgáltuk csontszövet létrehozására. A SOX9 a porcsejt-differenciáció egyik kulcsszereplője. Kifejeződése jelentősen megnő a differenciációs folyamat során, és csökken a sejtek végső, hipertróf fázisba lépésekor. (Okubo and Reddi, 2003) Több porcra jellemző fehérje termelését is növeli. Emiatt ez a transzkripciós faktor ideális beavatkozási pont a MSC-ek porcképző indukciójára. Először optimalizáltuk a sejttenyésztés módszereit és a génbevitelt, majd a SOX9 túltermeltetés és a mechanikai stimuláció hatását vizsgáltuk abban a reményben hogy a kezelések javítják és stabilizálják a porcsejt-fenotípust ezekben a sejtekben. Módszerek A humán őssejteket csontvelőből izoláltuk. A sejteket egysejtréteg-kultúrában növesztettük, majd a kísérletek alatt fibrin-poliuretán mátrixban szuszpendáltuk azokat. A következő génbeviteli módszereket próbáltuk ki: vírus kapszidfehérje, elektroporáció, kationos transzfekció, adenovirális transzdikció (lantofekció). A porcképzés serkentése érdekében a 3D (fibrin-poliuretán) mátrixot mechanikai stimulációnak tettük ki egy saját készítésű bioreaktorban. A citotoxicitás meghatározására a következő módszereket használtuk: calcein-ethidium kombinált festés, laktát-dehidrogenáz aktivitás, fluoreszcens annexin-v-propidium-jodid kombinált festés (apoptózis). A relatív sejtszámot (túlélést) DNS mennyiség meghatározásával és MTT módszerrel állapítottuk meg. A génexpressziót real-time RT-PCR módszerrel vizsgáltuk. Ezt mind a csont- mint a porcdifferenciációs kísérletek során alkalmaztuk. A differenciáció követésére biokémiai és szövettani módszereket használtunk: alkalikus foszfatáz aktivitás, Ca-45 beépülés, von Kossa festés, S-35 beépülés (szulfatált glükózaminoglikánok), DMMB kolorimetria (teljes GAG termelés), hidroxiprolinmeghatározás (teljes kollagéntermelés). Az immunológiai módszerek közül a következőket alkalmaztuk: ELISA (TGF-β1), a Western-blot (SOX9) és az aggrecan gerincfehérje immunhisztokémiai detektálása.
Eredmények 1. Mindkét sztatin (lovasztatin és szimvasztatin) megnövelte a BMP-2 expressziót. Hatásukra 1 µm-os koncentráció felett szintén megnőtt az extracelluláris mátrixba történő Ca-45 beépülés mértéke. 2. Ugyanakkor viszont ezen koncentrációk használata esetén a sztatinok jelentősen lecsökkentették a sejtszámot, befolyásolták a sejtek alakját, és apoptotikus festődést váltottak ki. 3. Ezek a hatások, valamint az extracelluláris Ca-lerakódás mikroszkópos képe arra engednek következtetni, hogy a megfigyelt kalcifikáció nem fiziológiás oszteoblaszt működés eredménye, hanem ektopikus, és összefüggésben van a megfigyelt apoptotikus elváltozásokkal. 4. A humán BMP-2 növekedési faktor adenovirális bevitele serkentette a MSC-ek oszteoblaszt differenciációját, valamint az oszteoblaszt sejtek működését mind humán, mind birka eredetű sejtek esetén. A rekombináns módszerrel előállított fehérjefaktor hatástalan volt mindkét faj esetén 50 ng/ml koncentrációban. 5. Bebizonyítottuk, hogy az ismert fibrindegradáció-inhibitor, az ε-aminokapronsav, használható in vitro porcszövetképző alkalmazások fejlesztésekor, mert nem befolyásolja a porcsejtdifferenciációt. 6. Több különböző transzfekciós módszer (vírus kapszidfehérje, elektroporáció, kationos transzfekció) adenovirális transzdukcióval való összehasonlítása során azt találtuk, hogy MSC-eknél jelenleg csak az utóbbival érhető el a további céljainknak megfelelő 80-90%-os hatékonyság. 7. A SOX9-túltermeltetés sikeresen elindította az in vitro porcsejtdifferenciációt mindenféle külső növekedési fator vagy dexametazon használata nélkül. 8. Ennek hatására több porcsejt-specifikus gén kifejeződése megnőtt, ezek között voltak jól ismert célgének (COL2A1, ACAN, COMP), valamint kevésbé ismert gének is, mint például az L-SOX5 és a SOX6. Rámutattunk az utóbbi gének promóter régiójában lévő feltételezett SOX9 kötő szekvenciákra. 9. A mechanikai stimuláció több más marker gén expresszióját megnövelte (PRG4, COMP, COL10A1)
10. A két kezelés együttes alkalmazása (SOX9 + mechanikai stimuláció) szinergisztikus módon serkentette a szulfatált glükózaminoglikánok termelését. 11. Igen valószínű, hogy ez a szintén megnövekedett TGF-β1 termelés hatása, mivel a kettő között egyértelmű pozitív lineáris korreláció áll fenn, és ettől független eredményeink is arra mutatnak rá, hogy a mechanikai stimuláció ezen a fehérjefaktoron keresztül hat a MSC-ekre.(Li et al., 2009) Következtetések A kutatásaink célja a MSC-ek alkalmazási lehetőségeinek vizsgálata volt két mezenchimális szövet, a csont- és a porcszövet helyreállító orvoslására. Ezen tudományterület egyik nagy kihívása az őssejtek megfelelő irányú és mértékű differenciáltatása. Ez nemcsak nehezen elérhető, de szem előtt kell tartani a későbbi klinikai alkalmazhatóságot is. Fenti eredményeink azt mutatják, hogy a feltételezett csontképzést serkentő faktorok, a szimva- és lovasztatin megnövelték egyes oszteoblasztokra jellemző mutatók értékét, de ugyanakkor az apoptózist is serkentették. Emiatt, és sztatinok csontreszorpciót bizonyítottan gátló hatása alapján feltételezhető, hogy a néhány korai kísérletben kimutatott csont ásványianyag-tartalom növekedés inkább a csökkent reszorpció, mint a megnövekedett formáció következménye. Az is elképzelhető, hogy ezen szerek in vivo hatásmechanizmusa jelentősen különbözik az általunk látottaktól, hiszen az élő szervezetben jelenlévő egyéb sejttípusok módosíthatják azt, például kompenzálhatják a sztatinok in vitro sejthalált kiváltó hatását. A sejtdifferenciáció faktorait maguk a sejtek is képesek szintetizálni. Ennek alkalmazási lehetőségeit vizsgáltuk a kísérletek következő részében. A humán és birka MSC-ek és oszteoblasztok igen hasonlóan reagáltak a humán BMP-2-vel való stimulációra. Mivel az in vitro működőképes adenovirális bevitel kísérleti állatokban (birka) hatástalannak bizonyult, arra következtettünk, hogy ennek hátterében nem a fajok közötti inkompatibilitás áll, hanem egyéb ok, például erős immunválasz az adenovírus vektorral szemben.
Végül a SOX9 gén bevitelével történő porcsejtdifferenciáció lehetőségét tárgyaltuk. Arra jutottunk, hogy ez a transzkripciós faktor nem képes teljes értékű porcsejteket létrehozni MSC-ekből, de a sejtek fenotípusa mechanikai stimulációval tovább javítható. A génbevitel tehát valóban igen hatékony eszköz az MSC differenciáció irányítására, de a legtöbb esetben a beviteli és in vitro sejttenyésztő módszerek további finomhangolása szükséges a benne rejlő potenciál kiaknázására. Bibliográfia Egermann M, Lill CA, Griesbeck K, et al. Effect of BMP-2 gene transfer on bone healing in sheep. Gene Ther 2006; 13 (17):1290-9. Ghosh PM, Mott GE, Ghosh-Choudhury N, et al. Lovastatin induces apoptosis by inhibiting mitotic and post-mitotic events in cultured mesangial cells. Biochim Biophys Acta 1997; 1359 (1):13-24. Li Z, Kupcsik L, Yao SJ, Alini M, Stoddart MJ. Mechanical Load Modulates Chondrogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells through the TGF-beta Pathway. J Cell Mol Med 2009. Maeda T, Matsunuma A, Kurahashi I, et al. Induction of osteoblast differentiation indices by statins in MC3T3-E1 cells. J Cell Biochem 2004; 92 (3):458-71. Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 1999; 286 (5446):1946-9. Okubo Y, Reddi AH. Thyroxine downregulates Sox9 and promotes chondrocyte hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun 2003; 306 (1):186-90. Vamvakopoulos JE, Green C. HMG-CoA reductase inhibition aborts functional differentiation and triggers apoptosis in cultured primary human monocytes: a potential mechanism of statin-mediated vasculoprotection. BMC Cardiovasc Disord 2003; 3:6.
Saját publikációk Grad S, Kupcsik L, Gorna K, Gogolewski S, Alini M. The use of biodegradable polyurethane scaffolds for cartilage tissue engineering: potential and limitations. Biomaterials 2003; 24 (28):5163-71. Kupcsik L, Meury T, Flury M, Stoddart M, Alini M. Statin-induced calcification in human mesenchymal stem cells is cell-death related. Journal of Cellular and Molecular Medicine 2008. Epub doi:10.1111/j.1582-4934.2008.00545.x Kupcsik L, Alini M, Stoddart MJ. Epsilon-Aminocaproic Acid Is a Useful Fibrin Degradation Inhibitor for Cartilage Tissue Engineering. Tissue Eng Part A 2008. Epub doi:10.1089/ten.tea.2008.0400 Li Z, Kupcsik L, Yao SJ, Alini M, Stoddart MJ. Chondrogenesis of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Fibrin-Polyurethane Composites. Tissue Eng Part A 2008. Epub doi:10.1089/ten.tea.2008.0247 Li Z, Kupcsik L, Yao SJ, Alini M, Stoddart MJ. Mechanical Load Modulates Chondrogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells through the TGF-beta Pathway. J Cell Mol Med 2009. Epub doi:10.1111/j.1582-4934.2009.00780.x