1/11. oldal Használati utasítás a Biofortuna SSPGo TM HLA Typing Kitshez (tipizáló készletek) 5. CE átdolgozás, 2014. Január 1. Rendeltetés A Biofortuna HLA SSPGo készletek kvalitatív DNS alapú készletek, amelyek a HLA allélok alacsony felbontású készletekkel vagy az allélok csoportspecifikus amplifikációjának köztes/közepes felbontású készletekkel való meghatározására szolgálnak. A közepes felbontású készletek általános definíciója szerint az eredmények többsége két számjeggyel egyértelműen meghatározható; pl. DQB1*02, DQB1*05, stb. A nagy felbontás általában azt jelenti, hogy az allélok nagy része négy számjeggyel határozható meg, pl. DQB1*02:01, DQB1*05:01, stb. A készlet olyan in vitro diagnosztikai termék, amelyet kizárólag képzett szakszemélyzet használhat. 2. Bevezetés A HLA molekulák fontos szerepet játszanak az immunitásban, és ezen belül a szervezet saját és nem saját antigénjeinek felismerésében; a legtöbb szervátültetés előtt el kell végezni a HLA-genotipizálást és a HLA-egyeztetést. A HLA antigének meghatározzák a T-sejt-mediált immunválasz specificitását, ezért a HLA-genotipizálás hasznos vizsgálati eszköz az immunrendszer rendellenességeinek vagy a patogénekre, vakcinákra vagy orvosi kezelésre adott immunválasznak a kimutatásában. A HLA-genotipizálás olyan betegségek diagnosztizálásra is alkalmas, amelyekben kimutatták, hogy a HLA allélokról kóroki tényezők lehetnek. A legtöbb HLA gén igen polimorf, és általában DNS-genotipizálás szükséges a HLA antigén pontos meghatározásához. A szekvenciaspecifikus primereket (SSP) használó PCR genotipizálás 1 a HLA-genotipizálás egy olyan gyors módszere, amely kifejezetten a közepes felbontást igénylő esetek vizsgálatára alkalmas. A Biofortuna SSP készletek teljesen kiszárított reakciókomponenseket tartalmaznak, ideértve a polimerázt is, így a felhasználónak a PCR elvégzése előtt mindössze a DNS-t kell hozzáadnia. Minden tőlünk telhetőt megteszünk azért, hogy a készletfrissítések összhangban legyenek az IMGT adatbázisban szereplő új HLA összehangolt eredményekkel. A készletfrissítések az alábbi weboldalról tölthetők le: www.biofortuna.com. 3. A teszt leírása A PCR SSP azon az elven alapul, hogy csak azok a primerek amplifikálódnak, amelyek esetében a 3 terminus teljesen megegyezik a célszekvenciával. Az eltérő (mismatched) primerek nem adnak pozitív amplifikációs terméket 2. Az ún. housekeeping gén konzervált régióját amplifikáló belső kontroll primerpár minden PCR-reakciókeverékben szerepel; a belső kontroll primerpár a PCR-reakció megfelelőségét jelzi. Az SSP genotipizálás
2/11. oldal általában több reakciót alkalmaz, melyek együtt vizsgálva jelzik a genotípust. Az amplifikált termékek vizualizálása agaróz gél-elektroforézis rendszerekkel történik, amelyek méretük alapján elkülönítik a DNS-fragmentumokat. 4. A készlet tartalma Polipropilén PCR-lemezek vagy -csíkok, amelyek 8 96 PCR-csőből állnak (a készlet típusától függően), minden egyes cső előre kimért fagyasztva szárított primert, polimerázt, dntp-ket* és puffert tartalmaz. A lemezeket vagy csíkokat zárólappal vagy kupakkal lezárva, egyenként, fóliatasakban csomagolva szállítjuk, amelyben egy tasak deszikkálószert is elhelyezünk. PCR-csöveket lezáró lapok és kupakok. 1 db használati utasítás. Analitikai bizonylat. Az értelmezési táblázatok és az anyagbiztonsági adatlap (MSDS) a Biofortuna weboldaláról tölthetők le: www.biofortuna.com. Amennyiben nem tudja letölteni a weboldalról a dokumentumokat, kérjük, lépjen érintkezésbe területi képviselőjével. *A CleanAmp dntp-k licence a Biofortuna SSPGo termékekben való használatra a Trilink Biotechnologies Inc.-től származik. 5. Nem mellékelt reagensek, berendezések és eszközök Megfelelő, kalibrált pipetták és steril pipettahegyek, pl. P10 pipetta 10 µl-es szűrővel ellátott pipettahegyekkel. DNS izolációs készlet/eszköz. UV spektrofotométer. Polipropilén csövek. Steril, molekuláris tisztaságú víz. Az alábbi specifikációkkal rendelkező PCR-készüléket kell használni: 96 cellás PCR-készülék 104 C-os, fűtött fedéllel az olajmentes működtetés érdekében. Rampsebesség (felfűtési/hűtési sebesség): 1,0 C/sec. Hőmérséklet-tartomány: 4,0 99,9 C. A hőmérséklet pontossága: ± 0,25 C a 35 99,9 C-os tartományban. A hőmérséklet-kalibráció visszavezethető egy referenciaszabványhoz. A PCR-készüléket a 8. részben található PCR-ciklus-paraméterek segítségével állítsa be. Megjegyzés: A PCR-készülékre vonatkozó specifikus információkért olvassa el a gyártó által biztosított felhasználói útmutatót. A PCR-készülékeket az American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ([Amerikai Hisztokompatibilitási és Immungenetikai Társaság], ASHI) vagy a European Federation of Immunogenetics ([ Európai Immungenetikai Társaság], EFI) akkreditációs szabályainak megfelelően kell kalibrálni. Gél-elektroforézis reagensek (agaró z, 0,5 TBE, 1000 bázispáros DNS molekulatömeg-marker, 10 mg/ml etídium-bromid). Gél-elektroforézis berendezés ( futtatókádak, tápegység, géldokumentációs rendszer UV-transzilluminátorral). Szoftver, hogy segítse a kézi elemzés SSPGo kit vizsgálati eredmények és az archív adatok tárolására is letölthető a Biofortuna honlapján www.biofortuna.com. Megjegyzés: A fenti körülmények, például a rampsebesség megváltoztatása befolyásolhatja a teszteredmények értelmezését. 6. Biztonság és figyelmeztetések In vitro diagnosztikai alkalmazásra. A vizsgálatokat kizárólag megfelelően képzett szakszemélyzet végezheti.
3/11. oldal A tipizálási eredményeket megfelelő képesítéssel rendelkező személyzetnek kell ellenőriznie, és amennyiben az eredményeket klinikai döntéshozáshoz használják, másik tipizálási módszerrel meg kell azokat erősíteni. A reagenseket a jó laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően kell kezelni. Különítse el a pre- és a poszt-pcr munkaterületeket. Ne vigye vissza a poszt-pcr anyagokat a pre-pcr munkaterületre. Biológiai veszélyre vonatkozó figyelmeztetések: kezeljen minden vérterméket fertőzésveszélyesként. Biológiai veszélyre vonatkozó figyelmeztetések: az etídium-bromid potenciális karcinogén anyag. Használata során mindig viseljen védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és védőszemüveget. Biológiai veszélyre vonatkozó figyelmeztetések: gondossággal járjon el az UV-források kezelése során mindig viseljen védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és védőszemüveget. Soha ne nézzen közvetlenül UV-fényforrásba. Az anyagbiztonsági adatlapok a www.biofortuna.com weboldalról tölthetők le. 7. Tárolás és stabilitás A Biofortuna SSPGo készletek 2 28 C-os hőmérsékleten tárolandók. Miután a PCR-csöveket kivette a fóliatasakból, a reagenseket 3 órán belül DNS-sel rehidrálni kell. A lejárati időpontot lásd a csomagoláson. Ne használja fel a terméket a csomagoláson feltüntetett időponton túl. Ne használja fel a terméket, ha a fóliatasak sérült, vagy ha hiányzik a deszikkálószer a tasakból. Kizárólag a zárólapokat és -kupakokat használva biztosítsa, hogy a PCR-csövek a DNS hozzáadása után szorosan le legyenek zárva, mivel ennek hiányában a nem megfelelően lezárt csövekben a PCR-amplifikáció során párolgás léphet fel. Fordítson különös figyelmet a csövek széleinek, sarkainak lezárására. 1. megjegyzés: Ha szükséges, a tasakból kivett, még nem hidrált PCR-lemezeket és -csíkokat a DNS hozzáadása előtt 3 órán keresztül legfeljebb 21 C-on és legfeljebb 60%-os páratartalom mellett lehet tartani. 2. megjegyzés: Miután DNS-sel hidrálta, a tasakból közvetlenül azelőtt kivett a PCR-csíkok és -lemezek legfeljebb 24 órán keresztül tárolhatók 2 8 C-os hőmérsékleten, feltéve ha a csöveket jól lezárja, hogy megakadályozza a párolgást. 8. Használati utasítások A DNS-mintára vonatkozó követelmények A vizsgálat egyes reakcióit úgy optimalizálták, hogy 50 100 ng DNS-t használjanak fel, alapvető fontosságú azonban, hogy az egyes reakciókat pontosan 10 µl folyadékkal rehidrálják. Ezért a vizsgálatot 5 10 ng/µl DNS-koncentráció esetén kizárólag 10 µl DNS-sel lehet végezni. Kizárólag steril, molekuláris tisztaságú víz segítségével hígítsa a DNS-t. Vigyázat! Győződjön meg róla, hogy a végső DNS-minta nem tartalmaz 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA-nál többet. Kizárólag citráttal kinyert DNS-t és EDTA-val gyűjtött mintát használjon. Mivel a heparin gátolhatja a PCR-t, azt ajánljuk, hogy a DNS-t ne extrahálják heparinizált vérmintákból. A hemoglobin bizonyítottan interferál az SSPGo HLA készletekkel, ha 1 mg/dl-nél nagyobb koncentrációban van jelen a DNS-mintában. A DNS bármelyik hagyományos extrakciós módszerrel kinyerhető. Kérjük, biztosítsa, hogy a DNS-minta OD 260/280 értéke UV-spektrofotometriával mérve 1,66 és 1,94 közé essen. Pre-PCR utasítások i. Vegyen ki egy SSPGo lemezt vagy csíkot a fóliatasakból. ii. Jegyezze fel a teszt tételszámát. iii. Győződjön meg róla, hogy a teljes fagyasztva szárított pellet (PCR -reagens) a lemez vagy a csövek alján látható, mielőtt eltávolítja a zárólapot vagy kupakot. Ha nem, óvatosan ütögesse meg a csövet, hogy a pellet annak aljára kerüljön.
4/11. oldal Kérjük, vegye figyelembe, hogy az egyes tesztlókuszok esetében az első reakció mindig halvány rózsaszínű a készlet többi részével ellentétben (vörös, amikor hidrált.) Egyes PCR-lemezek tartalmaznak egy bíbor színű integrális templát nélküli kontroll reakciót a lemez utolsó csövében. iv. Steril eszközzel pipettázzon 10 µl DNS-oldatot a lemez vagy csík minden egyes reakciócellájába. Lásd a DNSmintára vonatkozó követelmények című 8. rész megjegyzését. Amennyiben a lemez tartalmazza a bíbor színű integrális templát nélküli kontrollt, pipettázzon a cellába 10 µl mintahígítót (DNS nélkül). Lásd a Templát nélküli kontrollra vonatkozó megjegyzést a 8. részben. v. Gondoskodjon arról, hogy a DNS minden egyes reakciócellában még a hőkezelés előtt hozzákapcsolódjon a száraz reagensekhez. vi. Zárja le a reakciócellákat a zárólappal vagy PCR-cső-kupakokkal. A párolgás megelőzése érdekében szorosan zárja le a cellákat. Fordítson különös figyelmet a cella széleinek, sarkainak lezárására. vii. Helyezze a lemezeket vagy a csíkokat a közvetlenül a PCR-készülékbe. Ügyeljen arra, hogy a csövek teljes egészükben a tartóban legyenek, és a fedél megfelelően zárjon. Amennyiben nem tartja be az itt közölt utasításokat, ez az egyes PCR-reakciók hibáját okozhatja a PCR-elegy párolgása és lecsapódása miatt. viii. Futtassa a PCR-programot (lásd a PCR-paramétereket). ÚJRASZUSZPENDÁLÁSRA VONATKOZÓ MEGJEGYZÉS: ügyeljen arra, hogy amikor a PCR-csöveket a fóliatasakból eltávolítja, a reagenseket azonnal rehidrálni kell a DNS-sel. További információkért lásd az 1. és 2. megjegyzést. TEMPLÁT NÉLKÜLI KONTROLLRA VONATKOZÓ MEGJEGYZÉS: egyes készletek a lemez utolsó reakciócellájában tartalmaznak egy templát nélküli kontrollt (NTC) is. Ez a reakciócella bíbor színű festéket tartalmaz annak érdekében, hogy megkülönböztethető legyen a többi reakciócellától. Az NTC-t úgy tervezték, hogy kimutassa a PCR szennyeződését, illetve a genomi DNS-szennyeződést, amely esetlegesen jelen lehet a DNS újraszuszpendálásához felhasznált vízben. Amennyiben a PCR-szennyeződés fennáll, különféle méretű amplikon(ok) jelennek meg. PCR-LEMEZEK/-CSÍKOK MAGASSÁGI PROFILJÁRA VONATKOZÓ MEGJEGYZÉS: javasoljuk, hogy a lemezek és a csíkok magassági profilja egyenlő legyen, ha ugyanabba a PCR-készülékbe helyezi őket. Az eltérő magassági profilok esetében nem megfelelő az érintkezés a PCR-készülék fűtött fedelével, ami gyenge vagy sikertelen PCR-amplifikációt okozhat. PCR-paraméterek Az alábbi PCR-paramétereket kell használni. Gondoskodjon arról, hogy a ramp- (felfűtési/hűtési) sebesség másodpercenként 1 C legyen, és kapcsolja be a fedélfűtési funkciót. A teljes használati utasításért lásd a PCRkészülék gyártójának felhasználói kézikönyvét. A PCR-készülékeket az American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ([Amerikai Hisztokompatibilitási és Immungenetikai Társaság], ASHI) vagy a European Federation of Immunogenetics ([Európai Immungenetikai Társaság], EFI) akkreditációs szabályainak megfelelően kell kalibrálni. Denaturálás 94 C 5 perc Denaturálás 96 C 15 másodperc Kapcsolódás (annealing) 66 C 50 másodperc 10 ciklus Meghosszabbítás 72 C 30 másodperc Denaturálás 96 C 15 másodperc Kapcsolódás (annealing) 64 C 50 másodperc 20 ciklus Meghosszabbítás 72 C 30 másodperc TARTÁS ( HOLD ) 15 C-on legfeljebb 72 óráig a gélfuttatás előtt. Ha szükséges, a PCR-lemezek 2-8 C-on legfeljebb 24 óráig tárolhatók a gélfuttatás előtt. Mindig gondoskodjon arról, hogy a lemezek jól le legyenek zárva.
5/11. oldal Gél-elektroforézis A következő utasítások a horizontális agaróz gél-elektroforézisre vonatkoznak. Készítsen el 2% agaróz gélt 0,5 TBE (Tris/borát/EDTA) pufferben. Amikor a gél lehűlt kb. 60 C-ra, adjon hozzá etídium-bromidot 0,5 µg/ml-es végkoncentrációban. Töltse ki a gélt, és helyezze be a mikrotiter fésűket (pl. 12 8 cella 9 mm-es sortávolsággal). A gél megszilárdulása után vegye ki a fésűket, és öntsön a gélre 0,5 TBE puffert, úgy, hogy az befedje a gélt. Vigye fel a teljes PCR-terméket sorrendben a 2%-os agarózgélre, jegyezze fel az egyes reakciók pozícióját. 1000 bp-os létra használata javallott a méretmeghatározáshoz. Futtassa a gélt 20 percig 10 V/cm feszültség mellett. A készülékre vonatkozó részleteket lásd az elektroforézis készülék gyártójának használati utasításaiban. A gélek megjelenítéséhez képalkotó berendezésként UV-transzilluminátoros UV-géldokumentációs rendszert kell használni. Megjegyzés: A nem megfelelő elektroforézis nagyméretű, 600 bp-nál nagyobb amplikonok és kontrollamplikonok egybeolvadásához vezethet. Kérjük, győződjön meg arról, hogy az elektroforézis megfelelő az ilyen amplikonok kimutatásához. A túl hosszú ideig tartó elektroforézis a kisméretű amplikonok elvesztését eredményezheti. 9. Értelmezés Az SSPGo készleteket úgy tervezték, hogy az eredményeket manuálisan is meg lehessen határozni a www.biofortuna.com weboldalról letölthető értelmezési táblázatok segítségével. Amennyiben nem tudja elérni a weboldalt, kérjük, lépjen kapcsolatba a területi képviselőjével. Az értelmezési táblázatok tételspecifikus megjegyzéseket tartalmazhatnak, amelyek fontosak lehetnek az értelmezés szempontjából. A készlet- és a tételszám egyeztetése után rögzítse a gél fényképét a megfelelő értelmező sablonhoz. Vizsgálja meg a gél képét. Minden egyes reakció esetében egy pozitív kontrollsávnak is meg kell jelennie. Lásd az értelmezési táblázatokat, mivel az eltérő méretű lehet a különböző SSPGo termékek esetében. Előfordulhat, hogy a belsőkontroll sávok halványabban jelennek meg, amikor az allélspecifikus sávok is láthatók. Ha a képen látható allélspecifikus sáv, ám kontrollsáv nem, ezt ennek ellenére is pozitív eredményként kell értelmezni. Ne vegye figyelembe a 70 bp-nál rövidebb sávokat, mert ezek a nem kapcsolódott primereket jelölik. Határozza meg a pozitív reakciókat. A pozitív reakciókat a várt méretű sávok megjelenése jelzi, ahogyan ezt az értelmezési táblázatok is mutatják. Kérjük, vegye figyelembe, hogy egy adott reakcióban akár többféle méretű termék is lehet; ezek multiplex reakciók eredményei, és az értelmezési táblázatokban szerepelnek. Hasonlítsa össze a pozitív reakciókat az értelmezési táblázatokban szereplő ábrákkal. Egy reakció pozitív eredménye legalább egy, az értelmezési táblázatban szereplő, vonatkozó allél jelenlétét jelzi. Az allélok több csőben is amplifikálhatók amennyiben az allél jelen van, minden vonatkozó reakció esetében pozitív eredményt kell adnia. Kontrollsáv Allélspecifikus sáv Az elektroforézis iránya 1. ábra: Példák pozitív reakciókra, amelyeket allélspecifikus sávok és kontrollsávok jelenléte jelez (1 3. reakció); negatív reakciókra, amelyeket a kontrollsávok jelenléte és az allélspecifikus sávok hiánya jelez (4 7. reakció); valamint sikertelen reakcióra, amelyet a sávok hiánya jelez (8. reakció). Ügyeljen arra, hogy a készlet tételszáma egyezzen az értelmezési táblázat tételszámával. Szoftver, hogy segítse a kézi elemzés SSPGo kit vizsgálati eredmények és az archív adatok tárolására is letölthető a Biofortuna honlapján www.biofortuna.com.
6/11. oldal 10. Minőségbiztosítás és minőség-ellenőrzés Minden egyes SSPGo tételt minőség-ellenőrzésnek vetünk alá, mielőtt a termék elhagyná a Biofortuna gyárát. Az egyes készlettételekből származó mintákat meghatározott humán DNS-mintapanel alapján ellenőrizzük a megfelelő teljesítmény biztosítása érdekben. Minden egyes reakciót minimum 47 jól karakterizált sejtvonal DNS-minta alapján validálunk. A Biofortuna azt ajánlja, hogy a laboratóriumok maguk is validálják az új tipizáló termékeket, mielőtt klinikai mintákkal használnák azokat. Kizárólag megfelelően oktatásban részesült és képzett szakszemélyzet végezhet diagnosztikai tipizálást, és az eredményeket a személyzet egy másik tagjának ellenőriznie kell. 11. Klinikai adatok Egy in vitro diagnosztikaieszköz-tesztelő vizsgálatban öt vizsgálóhelyen hasonlították össze az SSPGo HLA Typing Kits teljesítményét a One Lambda Labtype SSO előrejelző készülék teljesítményével. Az SSPGo vizsgálata érdekében végrehajtott lókusztipizálás az alábbi lókuszokhoz biztosított eredményeket: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA- DQB1, HLA-DRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 és HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8. Az SSPGo HLA Typing Kits klinikai teljesítménye nem kevesebb mint 95%-os megbízhatóság mellett, összesítve 98,3-100%-ban megfelelt az előrejelző készülék eredményének (SSO módszer) az I. és II. osztályú HLA allélek tesztelésében; a minta tesztelése teljes vérből származó DNS 5 10 ng/μl-es koncentrációja mellett zajlott. Ha kizárunk három (3) bizonyítottan nem egyező genotípus-meghatározási eredményt, 100% -osnak bizonyul az egyezés a minden egyes készlet 3-3 tételével elvégzett 1222 mintaelemzés esetében az Amerikai Egyesült Államok és az Egyesült Királyság területén lévő vizsgálóhelyek tesztjében. A SSPGo HLA Typing kits teszteredményeinek vizsgálóhelyek közötti ismételhetőségének vizsgálatát három vizsgálóhelyen végeztük 8 reprezentatív SSPGo PCR-reakció esetében, 4 ng/μl és 11 ng/μl-es koncentrációjú, biztosított DNS-minta segítségével. Ezek a koncentrációk a tesztkészletek koncentrációtartományának szélső értékeit képviselik. A 960 egyedi reakcióból 958 bizonyult azonosnak a DNS mintákkal, ezek egyenlően oszlottak meg a három külső vizsgálóhely között, ez összesen 99,7%-os eredménynek felel meg (alsó ellenőrzési határ: 0,995). A készletek közötti ismételhetőség vizsgálatát egy kiválasztott SSPGo HLA tesztkészlet három tételén végeztük egy vizsgálóhelyen, egy kezelő által végrehajtva. A DNS koncentrációtartománya 5 10 ng/μl volt. A SSPGo HLA tipizálás készletek közötti megismételhetősége 100%-osan megegyezett az előrejelző eszköz eredményeivel a SSPGo HLA tipizáló teszt három (3) készletén végezve; készletenként 130 DNS-mintából 130, összesen 390 bizonyult egyezőnek. Megegyező SSPGo HLA pozitív megerősítést kaptunk az I. és II. osztályú allélek esetében a LABType SSO segítségével végzett összehasonlító tesztelése során a klinikai mintákon. Az SSPGo HLA belső tesztje egyező eredményeket mutatott a referencia DNS-mintákkal, kivéve az elérhetetlen minták esetében, mint például bizonyos ritka HLA-DPB1 allélek és ritka HLA-B allélek és allélcsoportok, mint például az alábbiak: B*59:01, B*78 és B*83:01. Az alábbi allélcsoportok nem kerültek megerősítésre: B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01, DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01, DPB*85:01 és DPB*105:01. 12. Irodalomjegyzék 1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67. 2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.
7/11. oldal 13. SSPGo hibaelhárítás útmutató Probléma Lehetséges ok Megoldás Nincs amplifikáció a Az alkalmazott DNS koncentrációja nem Mérje meg a DNS mennyiségét OD 280 értéken, és ügyeljen arra, hogy reakciónként összesen 50 100 ng DNS-t adjon 10 µl térfogathoz. reakciókban megfelelő PCR-inhibitorok vannak a DNS-mintában Ne használjon heparinizált vért. Kerülje az 1 mg/dl-nél több hemoglobint tartalmazó DNS-mintát. Az alkalmazott DNSminta minősége nem megfelelő Ellenőrizze a DNS minőségét. Az OD 260/280 aránynak 1,66 és 1,94 között kell lennie az UV-spektrofotométer adatai alapján. Gondoskodjon arról, hogy a DNS teljesen újraszuszpendálódjon az oldatban használat előtt. A reagensek nem teljesen szuszpendálódtak újra A PCR-készülék nem megfelelően van beállítva Gondoskodjon arról, hogy a DNS-minta molekuláris tisztaságú vízben legyen hígítva, és ne tartalmazzon 2,5 mm Tris/0,25 mm EDTA-nál többet. Gondoskodjon arról, hogy a pelletek teljesen rehidrált állapotban legyenek a DNS hozzáadásakor. Ügyeljen arra, hogy reakciónként 10 µl DNS-oldatot használjon. Gondoskodjon arról, hogy a PCR-programot helyesen állítsa be a használati utasításoknak megfelelően. Ügyeljen arra, hogy a PCR-készülék fűtött fedele megfelelően legyen rögzítve és lezárva. Elektroforézissel kapcsolatos problémák További útmutatásért lásd a PCR-készülék használati utasításait. Gondoskodjon arról, hogy az elektroforézis tartály áram alatt legyen; ellenőrizze a tápegységet, és tisztítsa meg az elektródákat. Futtassa a gélt 0,5 TBE pufferben. Ügyeljen arra, hogy 0,5 µg/ml friss etídium-bromidot használjon. Ellenőrizze, hogy a gél megjelenítésekor az UV-megvilágítás megfelelő mértékű-e. Nem megfelelően zárták le a lemezeket További útmutatásért lásd a gyártó futtatókádra és tápegységre vonatkozó használati utasítását. A nem megfelelően lezárt lemezek párologhatnak a PCR során. A Biofortuna az ajánlott zárólapokat a készletben szállítja. További zárólapokért vegye fel a kapcsolatot a forgalmazóval. Véletlenszerű kontrollés/vagy allélspecifikus- amplikon- Gélhibák Ügyeljen arra, hogy az összes cellát megfelelően lezárja. Fordítson különös figyelmet a cellák PCR-lemezhez vagy -csíkhoz közeli széleinek, sarkainak lezárására. Gondoskodjon arról, hogy minden cellát helyes sorrendben a gélbe töltsön, és hogy a cellákba azonos mennyiséget töltsön a PCRreakciókból. A gyártó utasításai szerint kalibrálja a pipettákat.
8/11. oldal Probléma Lehetséges ok Megoldás kiesés Ellenőrizze, hogy a zsebek megfelelően ki legyenek alakítva a gélben. Gondossággal járjon el a fésűk kivételekor, mivel azok felszakíthatják a zsebek alját. Ügyeljen arra, hogy az agaróz teljesen fel legyen oldódva a gél öntése előtt. Ügyeljen arra, hogy a gélt ne futassa túl sokáig, mivel a kisebb amplikonok túlfuthatnak a végén. Ügyeljen arra, hogy a gélt elég sokáig futtassa ahhoz, hogy a sávok elkülönüljenek. PCR-készülékkel kapcsolatos problémák Használjon friss etídium-bromid oldatot. A hibák különösen a vizsgálati készlet szélén előfordulók abból fakadhatnak, hogy a fedél nem elég szorosan lett rögzítve. Ez a PCR-reakció során a PCR-csőben a cső felétől felfelé eső részen párolgáshoz és kondenzációhoz, valamint PCR-hibához vezethet. Kérjük, kövesse a gyártó PCR-készülék karbantartására és kalibrálására vonatkozó útmutatását. Párolgással kapcsolatos problémák DNS-problémák következtében fellépő, szórványos hibák A használati utasítások alapján ellenőrizze, hogy a PCR-paraméterek helyesek-e. Ügyeljen arra, hogy az összes cella megfelelően le legyen zárva. Fordítson különös figyelmet a cellák PCR-lemezhez vagy -csíkhoz közeli széleinek, sarkainak lezárására. Ügyeljen arra, hogy a fedélfűtés be legyen kapcsolva, és a fedél által kifejtett nyomás megfelelő legyen. Gondoskodjon róla, hogy a Biofortuna zárólapjait használja (a készletben szállítva). További zárólapokért vegye fel a kapcsolatot a forgalmazóval. Nincs DNS: gondoskodjon arról, hogy minden cellában legyen DNS. Helytelen mennyiség: gondoskodjon arról, hogy minden egyes reakció esetében 10 µl DNS-oldat kerüljön hozzáadásra. Elmosódott gélkép Gyenge amplifikáció DNS DNS-koncentrációval kapcsolatos problémák Túl sok vagy túl kevés hozzáadott DNS: 200 ng feletti vagy 20 ng alatti koncentráció PCR-hibát okozhat. A DNS-ben lévő szennyeződés szórványos vagy kiterjedt amplifikációs problémákhoz vezethet. Ellenőrizze a DNS koncentrációját és tisztaságát. Túl sok DNS hozzáadása a PCR-reakcióhoz elmosódott gélképet eredményezhet. Degradáció vagy túl kis tisztaság lehet a kiváltó ok. Szerezzen be új DNS-mintát. Ellenőrizze, hogy a DNS-koncentráció nem túl magas, vagy alacsony. Optimális: reakciónként 50 100 ng DNS 10 µl-ben.
9/11. oldal Probléma Lehetséges ok Megoldás PCR-készülékkel Kérjük, kövesse a gyártó PCR-készülék karbantartására és kapcsolatos problémák kalibrálására vonatkozó útmutatását. Gélhibák A használati utasítások alapján ellenőrizze, hogy a PCR-paraméterek helyesek-e. Ügyeljen arra, hogy az egyes zsebekbe azonos reakciómennyiséget töltsön (5 µl és 10 µl között). Nem specifikus amplifikáció Nem értelmezhető amplifikációs mintázat DNS-koncentrációval kapcsolatos problémák A reakciócellákat nem a helyes sorrendben töltötték be Új allélt azonosítottak Az információt helytelenül specifikus sávként értelmezik A reakciócellákat nem a helyes sorrendben töltötték be Egyedi PCR-hiba Hiányzó kis amplikonok Új allélt azonosítottak a mintában A gyártó utasításai szerint kalibrálja a pipettákat. Használjon friss etídium-bromid oldatot. Ellenőrizze, hogy a DNS-koncentráció nem túl magas vagy alacsony. Optimális: reakciónként 50-100 ng DNS 10 µl-ben. Ellenőrizze a PCR-reakciók és a gélsávok helyes sorrendjét. Előzze meg a gél túlfolyását a szomszédos cellákból oly módon, hogy megfelelő mennyiséget tölt be, és ügyeljen arra, hogy a gél megszilárduljon a fésűk eltávolítása előtt. Korábban nem szekvenált allélok jelentkezhetnek új amplifikáció mintázattal. Ha régi értelmező mintát használ, töltse le az aktuális mintát a www.biofortuna.com weboldalról. Amennyiben ez sem tartalmazza az új mintázatot, ismételje meg a vizsgálatot egy másik Biofortuna készlet használatával, vagy szekvenciánként azonosítsa a tipizálási információkat. Ellenőrizze az Értelmezési táblázatokat a helyes sávméret tekintetében. Ellenőrizze, hogy a specifikus amplifikációk mérete helyes-e, illetve hogy az információt (átszennyezés, primer dimer) helytelenül amplifikációként értelmezték-e. Ellenőrizze a PCR-reakciók és a gélsávok helyes sorrendjét. Ellenőrizze, hogy minden belső pozitív kontroll jelen van-e. Végezze el újra az értelmezést úgy, hogy ne legyenek hiányzó reakciók. Túl hosszú elektroforézis, a kis amplikonok túlfutottak a gél végén vagy az etídium-bromid fronton, illetve elvesztek, mert bejutottak az előző gélzsebbe. Végezzen az Ön gélrendszerének megfelelő elektroforézist. Előfordulhat, hogy új allélokat fedeznek fel, ami olyan amplifikációs mintázatot eredményezhet, amely nem egyezik a jelenlegi alléllel (allélekkel). Kérjük, lépjen kapcsolatba területi képviselőjével.
10/11. oldal 14. Átdolgozások listája Átdolgozás: A 4. és 5. verzió között Az átdolgozás dátuma: 2014. január 21. Rész Az átdolgozás leírása 4. rész: A készlet tartalma A készletben levő lezárók hozzáadása 5. rész: Nem mellékelt reagensek, berendezések és eszközök A 96 helyes PCR-készülék specifikációinak frissítése A készlet tárolási körülményeinek megváltozása 2 28 o C-ra A nem hidrált PCR lemezek és csíkok kezelése A hidrált PCR lemezek és csíkok kezelése 8. rész: Használati utasítások A DNS hígítása steril, molekuláris tisztaságú vízben Az interferáló anyagok, és a DNS-tisztasági irányelvek frissítésének hozzáadása Az OD 260/280 mérések frissítése Hozzáadva a fagyasztva szárított pellet helyzete a minta hozzáadása előtt A felsokszorozott termék tárolásai körülményeinek hozzáadása A gél-elektroforézis időtartamára vonatkozó megjegyzés hozzáadása 9. rész: Értelmezés Mondat a tételspecifikus megjegyzésekről 11. rész: Klinikai adatok Újonnan hozzáadott rész 14 rész: Átdolgozások listája Újonnan hozzáadott rész A készlet tételszámának pontosan meg kell egyeznie az értelmező táblázaton szereplő tételszámmal.
11/11. oldal 15. Jelmagyarázat X Vizsgálatok száma P Képviselő az Európai Közösségben Tekintse át a használati utasítást i M V H Gyártás helye In vitro diagnosztikum Lejárat napja 4: s28 : Tárolási hőmérséklet g Tételszám Forgalmazó Global Trade Item Number 16. A gyártó kapcsolattartási információi Biofortuna Ltd 1 Hawkshead Road Croft Business Park Bromborough, CH62 3RJ, UK T: +44 (0) 151 334 0182 E: info@biofortuna.com W: www.biofortuna.com 17. Fordítások FranÇaise: Deutsch: Español: Italiano: České: Danske: Έλληνες: Magyar: Norske: Polska: Português: Россию: Slovenskému: Türk: Svenska: Traductions disponibles Übersetzungen verfügbar Traducciones disponibles Traduzioni disponibili Překlady k dispozici Tilgængelige oversættelser διαθέσιμες μεταφράσεις Fordítás rendelkezésre áll Oversettelser tilgjengelig Dostępne tłumaczenia Traduções disponíveis Переводы доступны Preklady k dispozícii Çeviriler mevcut Översättningar tillgängliga www.biofortuna.com