EBV VCAIgGELISA PKS medac Magyar 128PKSVPU/010708
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ 8006351 Fax: ++49/ 4103/ 8006359 RENDELÉSI CÍM Tel.: ++49/ 4103/ 8006111 Fax: ++49/ 4103/ 8006113 128PKSVPU/010708
EBV VCAIgGELISA PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, EpsteinBarr vírusspecifikus kapszid antigén (VCA) elleni IgG antitestek kvantitatív kimutatására szérumból Katalógusszám: 128PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS Az EpsteinBarr vírus (EBV) a Herpesviridae családba tartozik. Duplaszálú DNSt, kapszidot, burkot és bevonatot tartalmaz. Az EBVre jellemzı, hogy latensen élethosszig perzisztál a szervezetben a primer fertızés után. Az összes felnıtt 90 95 %a EBVvel fertızött világszerte. A lefolyás, EBV primer fertızés immunkompetens egyénekben korai gyermekkorban fordul elı, általában tünetmentes. Fiatal felnıttekben az EBV fertızés mirigyláz (Pfeiffer kór) formában jelentkezik. Kissé immunszuppresszált egyénekben klinikailag csendes reaktiváció elıfordulhat. Masszívan immunszuppresszált egyénekben EBVasszociált poliklonális Bsejt limfoma fordul elı. A Hodgkinlimfomák 60 %ában EBV DNS van jelen. Az endémiásan jelentıs EBVasszociált tumor megbetegedések a Burkitt limfóma és a nasopharyngealis karcinoma. Az antitest kimutatáshoz szükséges releváns antigén komplexek az EBV specifikus nukleáris antigén (EBNA), a vírus kapszid antigén (VCA) és a korai antigén (EA). Immunkompetens egyénekben a antitestek kimutatása a primer és korábbi fertızések, illetve a szeronegativitás megkülönböztetése céljából az EBV diagnózis fókusza. Az EBV szerológia fontos lehet a lymphadenopathya és tisztázatlan neurológiás betegségek addicionális diagnosztikájában. A releváns EBV szerológia összefüggésében az EBNA1 IgG meghatározás az elsı lépés. Pozitív eredmény korábbi fertızésre utal. Negatív EBNA1 IgG esetén a VCA IgG és IgM meghatározás alapvetıen fontos a fertızés státuszának megkülönböztetésében. Az EBV VCAIgGELISA PKS medac a vírus kapszid gp 125 fehérje elleni specifikus IgG antitesteket mutatja ki. A teszt gyorsan és könnyen kivitelezhetı. A kalibrációs görbe használatával lehetıvé válik az antitest koncentráció kimutatása, lehetıvé téve a megbízható nyomon követést. 128PKSVPU/010708 1
A TESZT ELVE A lemezt EBV VCA gp 125 vírus antigénnel vonták be. A mintában levı VCA gp 125 specifikus antitestek szelektíven kötıdnek az antigénhez. Peroxidázzal konjugált antihumán IgG antitestek kötıdnek a VCA gp 125specifikus IgG antitestekhez (P = peroxidáz). Inkubáció a TMBszubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le. A teszt elınyei A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhetı csíkok lehetıvé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken. Egypontos mennyiségi meghatározás, kalibrációs görbe nem szükséges. 128PKSVPU/010708 2
A KIT TARTALMA Katalógusszám: 128PKS 1. MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk, zöld színő (kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, U alakú, EBV VCA gp 125 antigénnel bevont, BSA és ph indikátor, felhasználásra kész. 2. CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 3. CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCSt, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 4. CAL Kalibrátor: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCSt, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 5. WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, ProClin TM 300 tartalmú. 6. VIRDIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 7. CON Konjugátum: 3 fiola, mindegyik 4,5 ml, HRPkonjugált kecske antihumán IgG, felhasználásra kész, zöld színő, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 8. TMB TMBszubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész. 9. STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H 2 SO 4 ), felhasználásra kész. 128PKSVPU/010708 3
1. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS Anyag/Reagens Állapot Tárolás Stabilitás Teszt kit bontatlan 2...8 C lejárati idı végéig Mikrotiterlemez bontott 2...8 C zacskóban 6 hét szárítószerrel Kontrollok/ bontott 2...8 C 6 hét kalibrátor Mosó puffer hígított 2...8 C 6 hét Mintahígító bontott 2...8 C 6 hét Konjugátum bontott 2...8 C 6 hét TMBszubsztrát bontott 2...8 C 6 hét Leállító oldat bontott 2...8 C lejárati idı végéig Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2. SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK 2.1. Víz injekcióhoz (H 2 O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosó puffer hígításához. 2.4. Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. 37 Cos inkubátor. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 650 nm szőrıkkel. 3. A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát. 3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. 128PKSVPU/010708 4
Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színőek. A lyukakban idınként elıforduló zöldesbarna elszínezıdést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja. 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel. Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, konjugátum, kalibrátor) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a mintahígító, a mosó puffer, a TMBszubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények csak a használati utasítás pontos betartása esetén nyerhetık. 4. MINTÁK 4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas. 4.2. A szérumok elıkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroorganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:200 arányban hígítjuk a mintahígítóval. Javasoljuk, hogy készítsen egy kezdeti 1:50 hígítást (pl. 10 µl szérum + 490 µl mintahígító). A további 1:4 hígításhoz a szükséges mennyiséget készítse el. A mérési tartományon kívül esı mintákat tovább lehet hígítani. 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat. (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges. 128PKSVPU/010708 5
5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl negatív és pozitív kontrollt, hígított mintát egyegy lyukba és 50 µl kalibrátort duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kék/zöldre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahımérsékleten 30 percig nedves kamrában tarthatjuk. 5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva. 5.4. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel! 5.5. Adjuk a konjugátumot (zöld színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl konjugátumot pipettázzunk a lyukakba, ha manuálisan dolgozzuk fel. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 µl konjugátumot pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában elıforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük. 5.6. Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con (± 1 o C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva. 5.7. Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.4.). 5.8. Adjunk 50 µl TMBszubsztrát oldatot minden lyukba (A1be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik. 128PKSVPU/010708 6
5.9. Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1 be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Neg. kontroll Poz. controll Kalibrátor Minta Háttér (A1) Negatív kontroll 50 µl Pozitív kontroll 50 µl Kalibrátor 50 µl Minta 50 µl Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal Konjugátum 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal TMBszubsztr. 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Leállító oldat Inkubáljuk 30 percig 37 Con sötétben 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometrikus leolvasás 450 nmen (ref. 620 650 nm) *) Manuális/automatikus módszer (ld. 5.5.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) Olvassuk le az OD értékeket 450 nmen (referencia hullámhossz 620 650 nm). Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl. Gyártási tételspecifikus adatok A kitben található gyártási tételspecifikus adatlap az alábbi információkat tartalmazza: Gyártási tételspecifikus kalibrációs görbe A és b görbe paraméterek A kalibrátor névleges OD értéke A kalibrátor alsó OD határértéke A pozitív kontroll névleges koncentráció tartománya(au/ml) 128PKSVPU/010708 7
Validitási kritériumok A negatív kontroll OD értéke < 0,150. A pozitív kontroll egységértéke a gyártási tételspecifikus adatlapon megadott tartományon belül legyen. A kalibrátor átlagos OD értéke a gyártási tételspecifikus adatlapon megadott also határérték felett legyen. Ismételjük meg az eljárást, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak! Az eredmények korrekciója A pozitív kontroll és a minták mért OD értékeit az alábbiak szerint korrigáljuk: kalibrátor névleges OD értéke OD korrigált = x OD mért kalibrátor mért OD értéke Az eredmények kvantifikációja A korrigált OD értékhez tartozó koncentráció AU/mlben leolvasható a gyártási tételspecifikus kalibrációs görbérıl (ld. gyártási tételspecifikus adatlap). Alternatívaképpen, a koncentráció az alábbi képlettel is számolható: a Koncentráció [AU/ml] = b/ 1 OD korrigált A legtöbb új ELISA leolvasó lehetıvé teszi a képlet programozását, megkönnyítve az automatikus adatfeldolgozást. A mérési tartomány 9tıl 200 AU/mlig terjed. A tartomány alá esı mintákat < 9 AU/mlként, a fölé esıket > 200 AU/mlként kell értelmezni. Ezeket az értékeket nem szabad extrapolálni. A cutoff 10 AU/ml. Szürke zóna = cutoff ± 10 % (= 9 11 AU/ml) Figyelem! Fontos megjegyzés! A kvantifikáció matematikai algoritmusa miatt negatív, vagy nem definiált AU értékeket kaphatunk az alábbi esetekben: Az anál nagyobb korrigált OD értékő erısen pozitív mintákat negatívnak, vagy nem definiált AU értékőnek számoljuk (0val osztás nem megengedett). Ezeket a mintákat nagyobb hígításokban újra kell vizsgálni, vagy > 200 AU/mlként kell értelmezni. 128PKSVPU/010708 8
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE /A MÓDSZER KORLÁTAI A szürke zóna alsó határánál kisebb egység értékő minták NEGATÍVnak tekintendık. A szürke zónába esı egység értékő minták KÉTESnek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében. A szürke zóna felsı határánál nagyobb egység értékő minták POZITÍVnak tekintendık. Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal, továbbá az EBNA1 IgG, a VCA IgM eredményekkel és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni. Egyedi esetekben más herpeszvírusok elleni antitestekkel történı keresztreakció nem zárható ki. A lipidek és a hemoglobin emelkedett koncentrációja a mintában nem befolyásolja a teszt eredményeket. 6.C. A MEDAC KITEKKEL VÉGZETT EBVSZEROLÓGIA DIAGNOSZTIKUS ÉRTELMEZÉSE Az eredményeknek a fertızés státuszára vonatkozó alábbi értelmezése csak immunkompetens egyénekben végzett vizsgálatokra érvényes. EBNA1 IgG VCA IgG VCA IgM Értelmezés szeronegatív + +/±/ régi fertızés +/±/ + elsıdleges fertızés Minden más kombináció tisztázatlannak értelmezendı. Tisztázatlan eredmény esetén további differenciál diagnosztikai módszerek szükségesek az értelmezéshez. A tisztázatlan eredmények csökkentése érdekében a medac EBV ELISA panel használatát javasoljuk. 128PKSVPU/010708 9
7. TELJESÍTİKÉPESSÉGI JELLEMZİK Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS FAJLAGOSSÁG 352 szérumot vizsgáltak a diagnosztikus kiértékelés során. Az eredményeket Prof. Dr. Enders és munkatársai, Stuttgart laboratóriumában és az Institute of Virology of the University Homburg/Saar intézményben értékelték ki. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük: Elızetes definíció (IFA) negatív kétes pozitív EBV VCAIgGELISA negatív 184 0 5 PKS medac kétes 0 0 1 pozitív 4 0 158 Érzékenység = 96,3 % Fajlagosság = 97,9 % Egyezés: 97,2 % 7.B. PONTOSSÁG Minta Teszten belüli szórás Minta Tesztek közötti szórás átlag AU SD CV (%) n átlag AU SD CV (%) n PC 36,1 1,52 4 23 PC 36,0 1,03 3 13 N 1 8,0 0,47 6 23 N 6 7,9 0,24 3 13 N 2 28,1 1,04 4 22 N 7 16,5 0,72 4 13 N 3 28,9 2,73 9 22 N 8 25,4 4,72 19*) 13 N 4 69,1 3,10 5 22 N 9 26,7 1,07 4 13 N 5 112,1 8,87 8 22 N 10 108,1 5,46 5 13 N 11 122,8 9,50 8 13 PC = pozitív kontroll; *)akut szérum (VCA IgM pozitív) 128PKSVPU/010708 10
ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK A kereszt szennyezés elkerülése érdekében ne cseréljük fel a fiolákat és kupakjaikat. A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében. Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében. Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is). EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani. Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAgra, HIV1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erısen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk. MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendık. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: 2008.07.01. 128PKSVPU/010708 11
IRODALOM Bauer, G.: EpsteinBarrVirus Bedeutung und Möglichkeiten der Labordiagnostik. Therapeutische Umschau 51(8), 558562 (1994). Bauer, G.: The rational basis for efficient EpsteinBarr Virus (EBV) serology. Clin. Lab. 41(9), 623634 (1995). Hille, A., Klein, K., Baumler, S., Grasser, F.A., MuellerLantzsch, N.: Expression of EpsteinBarr virus nuclear antigen 1, 2A and 2B in the baculovirus expression system: serogical evaluation of human antibodies to these proteins. J. Med. Virol. 39 (3), 233241 (1993). Linde, A.: Diagnosis of EpsteinBarr Virus related diseases. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100, 8388 (1996). Mertens, T., Haller, O., Klenk, H.D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten. 6570, Urban & Fischer Verlag (2004). Modrow, S., Falke, D. (Hrsg.): Molekulare Virologie. 454460, Spektrum Akademischer Verlag (1997). Prang, N.S., Schwarzmann, F.: Aktuelle Perspektiven in der Diagnostik EpsteinBarrVirus assoziierter Erkrankungen. Immun. Infekt. 4, 144151 (1997). 128PKSVPU/010708 12