Knyazoviczki Barbara 1 - Fodor Marietta 2 Különböző eredetű nyers tejek összehasonlító vizsgálata Fourier transzformációs közeli infravörös spektroszkópiai módszerrel Comparative analysis of raw milk from different species with Fourier transform near-infrared spectroscopy Fodor.Marietta@etk.szie.hu 1 Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar, egyetemi hallgató 2 Szent István Egyetem, Élelmiszertudományi Kar, Alkalmazott Kémia Tanszék, egyetemi docens Bevezetés Mai rohanó világunkban egyre többen szenvednek különböző civilizációs betegségekben, mint például a különböző ételallergiák. Az ételallergia gyakorlatilag az immunrendszer kóros válasza. A jelenséggel akkor találkozunk, ha az immunrendszer téves módon veszélyesnek ismer fel valamely ételösszetevőt - legtöbbször fehérjét -, és beindítja a védekezési reakciót ellene. Magyarországon az egyik leggyakoribb ételallergia a tejallergia. A jelenség hátterében az áll, hogy a szervezetben a tejfehérjét lebontó emésztőenzimek a tejben lévő fehérjét tévesen allergénnek minősíti és ennek következtében az immunrendszerből különböző allergiás reakciót váltanak ki. A teajallergiáért alapvetően az α- és a β-laktoglobulin valamint a bovin szérumalbumin, és bovin immunglobulin (savófehérjék) valamint a kazein csoport tagjai (α1-, α2, β- és κ-kazein) a felelősek. Miután táplálkozási szokásaink között a tehéntejfogyasztás igen fontos szerepet tölt be, sajnos a túlhajszolt életvitel, és az ennek következtében legyengült immunrendszer mellett a tehéntej okozta allergén reakciók egyre gyakrabban jelentkeznek. Irodalmi adatok megerősítik, hogy a kecsketej, kedvezőbb fehérje-összetétele következtében kevésbé allergizáló hatású élelmiszer, mint a tehéntej. Ezért munkánk során összehasonlító vizsgálatokat végeztünk nyers, kezeletlen tehén- és kecsketej mintákkal. Célkitűzés Munkánk során a következő kérdésekkel foglalkoztunk: Fourier transzformációs közeli infravörös (FT-NIR) technika alkalmazásával hasonlítottuk össze a különböző eredetű nyers tejeket. Elsősorban arra kerestük a választ, látható-e eltérés a spektrumok között. Nyers tehén- és kecsketej FT-NIR spektrumának minőségi és mennyiségi értékelése Lineáris diszkriminancia analízis (LDA) alkalmazása a különböző eredetű tejminták elkülönítésére Eltarthatóság vizsgálata lineáris diszkriminancia analízis (LDA) alkalmazása kecsketej minták eltarthatóságának vizsgálatára Kecske kolosztrum összetételének és spektrumának változása a laktáció első hetében Anyag és módszerek Vizsgált minták Háztáji tehén- és kecsketej képezte vizsgálataink alapját. A minták kezeletlenek voltak, háztartási hűtési körülmények között (+4 - +6 C) tároltuk őket. 155
Vizsgálati módszerek A spektrum felvételeket Bruker MPA (Ettlingen, Németország) FT-NIR készülékkel rögzítettem. Abszorbancia A készülék jellegzetes paraméterei: Mérési tartomány: 12 500 4000 cm -1 Mintatartó: Folyadékminták esetében termosztálható mintakamra (40 C). A mintatartó átfolyó üvegküvetta, optikai úthossza 1 mm Detektor: TE-InGaAs,. Felbontás: 8 cm -1 Spektrumkép: 32 alspektrum készül, s ezek átlagaként kapjuk meg a mintáról a felvételt. Kiértékelés módszerek A spektrumok rögzítése és spektrális vizsgálata OPUS 7.2 (Ettlingen, Németország) készülék szoftverrel történt. Eredmények A kemometriai kiértékelés Statistica 8.0 (Statsoft, Tulsa, Oklahoma, USA) programmal történt. Spektrumok vizsgálata, minőségi és mennyiségi kiértékelésük Méréseink során összevetettük a nyers tehéntej és kecsketej FT-NIR spektrumát, azonosítottuk a jellegzetes területeket (1. ábra). 0 1 2 3 4 5 Víz Tehéntej Kecsketej 9000 8000 7000 6000 5000 4000 Hullámszám, cm -1 1. ábra: Nyers tehéntej, kecsketej és a víz FT-NIR spektruma A spektrumok karakterisztikája gyakorlatilag teljes mértékben megegyezik, s jól látható, hogy a víz jellegzetes rezgési területei gyakorlatilag uralják a teljes spektrumképet. A spektrumok minőségi kiértékeléséhez elkészítettük a 2. derivált görbét (2. ábra), amelyen már jól elkülöníthetők a tej elsősorban fehérje-, zsír- és laktóztartalmára - jellemző területek. 156
Abszorbancia 2. derivált -0.0006-0.0002 0.0002 Víz Tehéntej Kecsketej V1. 1. 3. 2. V2. 9000 8000 7000 6000 Hullámszám, cm -1 5000 4000 2. ábra Nyers tehéntej, kecsketej és a víz FT-NIR spektrumának 2. deriváltja A 2. ábrán jelölt rezgési tartományokat az 1. táblázatban részleteztük. 1. táblázat: A nyers tehéntej, kecsketej és a víz FT-NIR spektrumának jellegzetes rezgési átmenetei Tartomány Rezgési átmenet Molekula (cm-1) V1 6900-6800 víz OH vegyérték-rezgésének 1. felhangja Víz V2 5200-5150 OH vegyérték/hoh deformációs valamint az OH deformációs-rezgés 2. felhangjának kombinációja 1 5880 aromás CH vegyérték-rezgésének 1. felhangja Fehérje 2 3 4930-4800 primer amidok C=O karbonil csoport vegyérték-rezgésének 2. felhangja 4670 CH/C=O kötések vegyérték-rezgéseinek és a CH kötés deformációs-rezgésének kombinációja 4650-4500 NH; CH; C=O és CN kötések deformációs és vegyértékrezgéseinek kombinációja Víz Fehérje Zsír, laktóz Fehérje 4300 CH kötés deformációs-rezgésének 2. felhangja Zsír, laktóz 4000-4200 CH és C-C kötések valamint a CH vegyérték/c-c vegyértékés C-O-C vegyértékrezgéseinek kombinációja Zsír, laktóz Korábbi munkák eredményeként rendelkezésünkre állt FT-NIR kiértékelő függvény nyers tejek szárazanyag-, zsír-, fehérje- és laktóztartalmára. Vizsgált mintáink átlagos összetételét, és összehasonlításul az irodalmi adatokat a 2. táblázatban foglaltuk össze. 157
2. táblázat: Tejminták beltartalmi adatai (mért, irodalmi) Főkomponens (m/m%) Tehéntej Kecsketej Mért Irodalmi Mért Irodalom Szárazanyag 13,7 12,1 12,7 13,0 Zsír 3,6 3,7 4,4 4,1 Fehérje 3,5 3,3 3,4 3,6 Laktóz 4,7 4,7 4,6 4,5 Bár összetételük szempontjából bizonyos komponensek (szárazanyag- és zsírtartalom) esetében láthatunk eltérést a kétféle tejmintánál, kérdés, hogy ez az eltérés a spektrális adatokban elegendő-e ahhoz, hogy LDA módszerrel elválasszuk a mintákat egymástól. Ehhez a vizsgálathoz növényi eredetű (rizs, szója és mogyoró) tejminták spektrumait is felhasználtuk. Az LDA eredményeket és a csoportosítás ellenőrzését a 3/a és 3/b ábrán mutatjuk be. Az LDA egy felügyelt mintázat-felismerési módszer, amelynél a minták spektrumadatai a független változók, a függő változók jelen esetben a minta eredete. A spektrális adatok lineáris kombinációját keressük, amely az eredet alapján kialakított csoportokat a legjobban tudja elkülöníteni. Ahogy azt korábban (1. és 2. ábra) is bemutattuk, a spektrumokban bekövetkező változás jellemzően az 1. vagy 2. derivált görbék esetén különíthető el a víz jelétől. Ezért a kiértékelés előtt első deriválás adatelőkezelést hajtottunk végre a spektrum adatain, majd ezt követően végeztük el az LDA vizsgálatot. 3/a. ábra: Különböző eredetű tejminták LDA vizsgálata A 3a. ábrán egyértelműen elkülönülő csoportokat tudunk megkülönböztetni attól függően, hogy tehéntej, kecsketej vagy növényi eredetű tejmintáról beszélünk. 95%-os konfidencia szinten vizsgálva a csoportosítást, mindössze egy tehéntej és egy kecsketej minta besorolása hibás. Mint minden statisztikai eljárást, így az LDA eredményét is minden esetben ellenőrizni kell. Ez több módszerrel lehetséges, melyek közül a legegyszerűbb, egy random csoportbeosztás segítségével lehetséges. 158
3/b. ábra: Különböző eredetű tejminták LDA vizsgálat ellenőrzése Amennyiben az ellenőrzés során az eredeti csoportbontás összekeveredik (3b ábra), akkor az eredeti csoportosítás nem volt véletlen, az LDA mintázat felismerést sikeresnek minősíthetjük. Az ellenőrzés során a minták összekeveredtek, így az LDA során sikeresen különítettük el a spektrumadatok alapján a tehéntej, kecsketej és növényi eredetű mintákat, a mintázat-felismerést az ellenőrzés megerősítette. Romlás során bekövetkező változások a spektrumképben LDA módszerrel elemeztük, hogy háztartási hűtési körülmények (4-6 C) között tárolt kezeletlen kecsketej minták spektrumában a tárolási idő előrehaladtával bekövetkező változást. Az LDA vizsgálatot a korábban leírtaknak megfelelően ebben az esetben is a spektrumadatok 1. deriválás adatelőkezelését követően végeztük el. Az LDA mintázatfelismerés eredményét és az eremény ellenőrzését a 4a,b. ábrán mutatjuk be. A vizsgálatokat 10 napon keresztül végeztük, de a 4/a,b. ábrán az átláthatóság kedvéért csak 4 csoportot különböztettünk meg. Az LDA eredményként sikeres mintázat felismerést tudunk bemutatni, amelyet az ellenőrzés eredménye is alátámaszt. 159
4/a. ábra: Kecsketej eltarthatóságának vizsgálata LDA eljárással (a) 4/b. ábra: Kecsketej eltarthatóságának vizsgálata LDA eljárással - az eredmények ellenőrzése (b) Kecske kolosztrum vizsgálata Kecsketej minták esetében lehetőségünk volt márciusi ellést követően a kolosztrum vizsgálatára. Méréseinket 7 napon keresztül végeztük, ennek eredményét mutatjuk be az 5/a,b. ábrán. 160
-0.03-0.02-0.01 0.00 Abszorbancia 1. derivált 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Abszorbancia Előtej 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap 5. nap 6. nap 9000 8000 7000 6000 Hullámszám, cm -1 5000 4000 5/a. ábra: Kecsketej kolosztrum spektruma 1 2 Előtej 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap 5. nap 6. nap V1 3 V2 8500 8000 7500 7000 6500 6000 Hullámszám, cm -1 5500 5000 4500 4000 5/b. ábra: Kecsketej kolosztrum spektrum 1. deriváltja A spektrumok magasságbeli változása egyértelműen jelzik a beltartalmi paraméterek változását. Az 1. derivált ábrán jelölt jellegzetes rezgési átmenetek a 2. ábrához kapcsolódóan már ismertettük (1. táblázat). Hangsúlyos változás figyelhető meg a 2. és a 3. területen, amely változás a minta fehérje- zsír- és laktóztartalmával áll összefüggésben. A kolosztrum minták beltartalmi paramétereinek kiértékeléséhez ismét a rendelkezésünkre álló FT-NIR becslési függvényt alkalmaztuk, eredményeinket a 3. táblázatban foglaltuk össze. 161
3. táblázat: Kecske kolosztrum beltartalmi paraméterei Szárazanyag Zsír Fehérje Laktóz m/m% Előtej 20,1 8,1 9,3 5,7 1. napos 17,4 7,7 4,9 4,7 2. napos 18,9 9,1 5,3 4,8 3. napos 13,6 4,3 4,0 4,6 4. napos 13,4 3,3 3,6 4,6 5. napos 12,5 4,3 3,8 4,7 6. napos 12,3 3,2 3,6 4,7 Változás -38,8% -61,7% -61,3% -17,5% A spektrumokban látható eltéréseket a beltartalmi adatok változásában is láthatjuk. A legnagyobb eltérés a zsír- és a fehérjetartalom esetén figyelhető meg. A laktóz-tartalomban csak kismértékű (17%) csökkenés látunk, és ez a csökkenés gyakorlatilag a szülést követő 1. napon már bekövetkezik, és ettől kezdve állandósul. A 2. 3. nap némi hullámzás figyelhető meg, amely véleményünk szerint elsősorban az ellést követő élettani változásokkal magyarázható. Összefoglalás, következtetések Különböző kezeletlen, nyers tehén- és kecsketejek FT-NIR vizsgálata során megállapítottuk, hogy a spektrumkép víztől elkülönülése 1. vagy 2. derivált adatelőkezelést követően érzékelhető a legjobban. A derivált görbén sikerült azonosítani a víz jellegzetes kombinációs és felharmónikus rezgési átmenetei mellett a fehérjék, zsírok és a laktóz rezgési területeit. A rendelkezésünkre álló FT-NIR becslési függvény segítségével kiértékeltük mintáink szárazanyag-, zsír-, fehérje- és laktóztartalmát. Adataink jó egyezést mutatnak az irodalmi adatokkal. LDA alkalmazásával sikeres mintázat-felismerést hajtottunk végre a tejminták eredete, valamint a kecsketej eltarthatóságának vizsgálata terén,. Mindkét esetben a spektrumok 1. derivált adatelőkezelése után végeztük a mintázat-felismerést. Az LDA eljárások ellenőrzése alátámasztotta eredményeinket. Kecske kolosztrumának vizsgálata során nyomon követtük a transzmissziós és 1. derivált adatelőkezelést követően a spektrumképet. A görbesereg alakulása előre vetítette a beltartalmi adatokban várható változást az idő előre haladtával. Az 1. derivált adatelőkezeléses spektrumképen egyértelmű, hogy a laktáció folyamán a fehérje- és a zsírtartalom mellett a szárazanyag-tartalom változása is jelentős. Köszönetnyilvánítás A szerzők köszönetet mondanak az NTP-HHTDK-16-0082 pályázat nyújtotta támogatásnak 162
Irodalomjegyzék Fagan, C.C ; O'Donnell, C.P; Rudzik, L; Wüst, E (2009) Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. Chapter 10 Milk and Dairy Products p 241 273 Fox P.F. Uniacke-Lowe T. McSweeney P.L.H. and O Mahony J.A. (2015) Dairy Chemistry and Biochemistry 2nd Edition pp. 598 Hastie, T., Tibshirani, R. and Friedman, J. (2001), Linear Methods for Classification, The Elements of Statistical Learning; Data Mining, Inference, and Prediction, Springer, New York, pp. 84 90. Jenness, R. (1980) Composition and characteristics of goat milk: review 1968-1979. J. Dairy Sci. 63, 1605-1630 Jensen, R.G. (2002) The composition of bovine milk lipids: January 1995 to December 2000. J. of Dairy Science 85. 295-350 Karoui, R.; De Baerdemaeker, J.; (2007). A review of the analytical methods coupled with chemometric tools for the determination of the quality and identity of dairy products. Food Chemistry, 102, 3, p 621-640 McSweeney P. L. H. and Fox P. F. (2013) Advanced Dairy Chemistry: Volume 1A: Proteins: Basic Aspects. 4th Edition Springer pp 557 Porep, J.U.; Kammerer, D.R.; Carle R (2015) On-line application of near infrared (NIR) spectroscopy in food production. Trends in Food Science & Technology, 46, 2, Part A p. 211-230 Subramanian, A.; Prabhakar, V. ; Rodriguez-Saona L. (2011). Analytical Methods. Infrared Spectroscopy in Dairy Analysis. Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), p 115-124 Walstra, P., Wouters, J.T.M. and Geurts, T.J. (2005) Dairy science and technology. 2nd Edition. CRC/Taylor and Francis, Boca Raton p. 808 Workman J. Jr. (2000) The Handbook of Organic Compounds, vol 1. NIR, IR, R, and UV-Vis Spectra Featuring Polymers and Surfactants Academic Press Boston p 169-236 163