HercepTest Kódszám: K5204

HercepTest Kódszám: K5204 20. kiadás Immuncitokémiai festéshez. A készlet 35 teszthez elegendı (70 lemez). (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 1/54

Tartalom Oldal Felhasználási terület... 4 Összefoglaló és magyarázat emlı... 5 Háttér... 5 Jellemzık... 5 Az eljárás elve emlı... 6 Reagensek emlı... 6 Mellékelt anyagok... 6 Szükséges, de nem mellékelt anyagok... 7 Tárolás emlı... 8 A minta elıkészítése emlı... 8 Paraffinba ágyazott metszetek... 8 A szövetek kezelése festés elıtt... 9 Óvintézkedések emlı... 9 HASZNÁLATI UTASÍTÁS emlı... 11 A. A reagens elıkészítése... 11 A.1 Epitópkinyerı oldat... 11 A.2 Mosópuffer... 11 A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB)... 11 A.4 Kontrasztfestés... 11 A.5 Rögzítıszer... 11 B. Festési eljárás... 12 B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban... 12 B.2 Festési protokoll... 12 Minıség-ellenırzés emlı... 15 A festés értelmezése emlı... 16 Korlátozások emlı... 19 Általános korlátozások... 19 Termékspecifikus korlátozások... 19 Teljesítményjellemzık emlı... 20 Háttér... 20 Összehasonlító vizsgálatok... 20 Összehasonlítás a klinikai vizsgálattal (CTA)... 20 Pontosság... 21 Megismételhetıség... 22 Immunreaktivitás... 23 Hibaelhárítás emlı... 24 (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 2/54

Összefoglaló és magyarázat gyomor... 27 Háttér... 27 Jellemzık... 27 Az eljárás elve gyomor... 27 Reagensek gyomor... 28 Mellékelt anyagok... 28 Szükséges, de nem mellékelt anyagok... 29 Tárolás gyomor... 29 A minta elıkészítése gyomor... 30 Paraffinba ágyazott metszetek... 30 A szövetek kezelése festés elıtt... 30 Óvintézkedések gyomor... 31 HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor... 33 A. A reagens elıkészítése... 33 A.1 Epitópkinyerı oldat... 33 A.2 Mosópuffer... 33 A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB)... 33 A.4 Kontrasztfestés... 33 A.5 Rögzítıszer... 33 B. Festési eljárás... 34 B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban... 34 B.2 Festési protokoll... 34 Minıség-ellenırzés gyomor... 37 A festés értelmezése gyomor... 38 Korlátozások gyomor... 42 Általános korlátozások... 42 Termékspecifikus korlátozások... 42 Teljesítményjellemzık gyomor... 43 Háttér... 43 Megismételhetıség... 46 Immunreaktivitás... 48 Hibaelhárítás gyomor... 49 Irodalomjegyzék... 52 Jelmagyarázat... 54 (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 3/54

Felhasználási terület In vitro diagnosztikai alkalmazásra szolgál. A HercepTest szemikvantitatív immuncitokémiai assay, amely a HER2 fehérje túlzott mértékő expressziójának a kimutatására szolgál a szövettani értékeléshez rutinszerően feldolgozott emlırákszövetekben, valamint gyomor-adenokarcinómában beleértve a gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómákat szenvedı páciensekbıl származó, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott rákszövetben. A HercepTest javallott felhasználási területe olyan betegek vizsgálata, akiknél Herceptin (trastuzumab) kezelés jöhet szóba (lásd a Herceptin tájékoztatóját). MEGJEGYZÉS kizárólag az emlırák esetében: A Herceptin klinikai vizsgálatokban részt vevı alanyokat kísérleti immuncitokémiai klinikai vizsgálat (CTA) alapján választottuk ki. A vizsgálatokban részt vett alanyok egyikét sem a HercepTest alapján választottuk ki. A HercepTest és a CTA összehasonlítása független mintán történt, és elfogadhatóan egyezı eredményeket mutatott ki. A HercepTest és a Herceptin klinikai eredményének tényleges korrelációját nem állapítottuk meg. MEGJEGYZÉS kizárólag gyomorrák esetében: A Hoffmann-La Roche cég által szponzorált III. fázisú BO18255 (ToGA) tanulmányban részt vevı betegek mindegyikét a Dako HercepTest (IHC) és a Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) készletek használatával választották ki. Az inoperábilis, lokálisan elırehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomor-adenokarcinómában vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómában szenvedı betegek HER2-státuszának felmérésére szolgáló mindkét teszt klinikai használhatóságát kimutatta a vizsgálat. Ebben a dokumentumban gyomorrákként szerepel a gyomor adenokarcinómája, beleértve a gyomor-nyelıcsı adenokarcinómáját is. Az emlırák esetében történı alkalmazással kapcsolatban kérjük, tájékozódjon a 5 26. oldalról. A gyomorrák esetében történı alkalmazással kapcsolatban kérjük, tájékozódjon a 27 51. oldalról. Fontos: Kérjük, hogy különösen a megfestett szövetmetszetek értékelésekor vegye figyelembe az emlırák és a gyomorrák szövetei közötti különbségeket. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 4/54

Emlırák Összefoglaló és magyarázat emlı Háttér A humán HER2 gén (más néven ERBB2 vagy NEU) kódolja a gyakran HER2 fehérjének vagy p185 HER2 -nek nevezett fehérjét. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozinkináz, amely homológ az epidermális növekedési faktor receptorral (EGFR vagy HER1) (1 8). A HER2 fehérje normális komponens, amely többféle epithelialis sejttípusban is kifejezıdik (8). Az emlırákos betegek egy kis hányadánál a HER2 fehérje expressziója emelkedett a malignus transzformáció és a tumorfejlıdési folyamat következtében (9). A HER2 fehérje emelkedett expressziója az emlırákos sejtek felszínén adta az ötletet, hogy terápiás antitest célpontja legyen. A Herceptin (trastuzumab) humanizált monoklonális antitest (10), amely nagy affinitással kötıdik a HER2 fehérjéhez, és kimutatottan gátolja a HER2 fehérjét emelkedetten expresszáló humán tumorsejtek proliferációját in vitro és in vivo (11 13). Jellemzık A HercepTest a Herceptin klinikai vizsgálataiban alkalmazott kísérleti immunocitokémiai klinikai vizsgálat alternatívájaként lett kifejlesztve. A HercepTest eredményességét a HER2 fehérje emelkedett expressziójának meghatározásában független vizsgálattal értékeltük, összehasonlítva a HercepTest és a CTA eredményeit 548 emlıtumor-minta esetében, amelyek egyike sem a Herceptin klinikai vizsgálataiban részt vett alanytól származott. Az eredmények e szövetmintákon 79%-os megfelelést mutattak a két vizsgálat esetében. A koncordanciadatok azt is jelzik, hogy a HercepTest egy 3+ eredménye nagy valószínőséggel megfelel a CTA egy pozitív eredményének, amely teljesítette volna a vizsgálatba történı felvétel követelményeit (2+ vagy 3+). A HercepTest egy 2+ eredménye már nem korrelál olyan jól a CTA eredményeivel. A HercepTest 2+ eredményeinek körülbelül 42%-a (53/126) negatív volt a CTA szerint (0 1+), ami nem tette volna lehetıvé a felvételt a Herceptin klinikai vizsgálatába. A HercepTest a HER2 fehérje emelkedett expressziójára nézve lehet negatív (0 és 1+ festési intenzitás), enyhén pozitív (2+ festési intenzitás), illetve erısen pozitív (3+ festési intenzitás). A HercepTest nem arra készült, hogy diagnosztikai információt adjon a páciens vagy az orvos számára, és ilyen célra nem is lett bevizsgálva. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 5/54

Emlırák Az eljárás elve emlı A HercepTest a rutinszerően feldolgozott, paraffinba ágyazott minták teljes kétlépéses immuncitokémiai festési eljárásához szükséges reagenseket tartalmazza. A humán HER2 fehérje primer nyúl antitesteivel végzett inkubálást követıen a készlet a dextrán technológiára alapuló, azonnal használható megjelenítı reagenst alkalmazza. A reagens közös dextrán polimer alapra kapcsolt másodlagos kecske eredető nyúlellenes immunglobulin molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból áll, így kiküszöbölhetı a kapcsolt ellenanyag és a peroxidáz-konjugált ellenanyag egymást követı alkalmazása. A Megjelenítı reagens humán immunglobulinokkal és magzati borjú szérummal való keresztreakcióját szilárdfázisú abszorpcióval távolítjuk el. Az ezután hozzáadott kromogén enzimatikus átalakulása látható reakcióterméket eredményez az antigén helyén. A minta ezután kontrasztfesthetı és fedılemezzel ellátható. Az eredmények fénymikroszkóppal értelmezhetık. A festési menetek validálásához három darab, formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlırák-sejtvonalat tartalmazó, 0, 1+ és 3+ festési intenzitású kontrollmintát mellékelünk. E sejtvonalak festési intenzitása korrelál a receptorok sejtenkénti számával. A HercepTest, Kód: K5204, felhasználható kézi, illetve Autostainer berendezéssel végzett automatikus festésnél. Reagensek emlı Mellékelt anyagok Az alább felsorolt anyagok 35 teszt elvégzésére elegendı (35 minta a HER2 fehérje primer antitestével inkubálva, illetve 35 minta a megfelelı negatív kontroll reagenssel inkubálva). A tesztek számát a következı anyagokból szövetmetszetenként 3 csepp (100 µl) felhasználásával számítottuk: 1, 2, 3 és 4 jelő ampullák és szubsztrát kromogén oldat (DAB). A készlet legfeljebb 5 különálló festési menethez elegendı anyagot tartalmaz. Ampulla száma Mennyiség 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml Leírás Peroxidáz-blokkoló reagens: 3% hidrogén-peroxidban 15 mmol/l nátrium-azid (NaN 3 ). Nyúl anti-humán HER2 fehérje: Használatra kész, affinitás alapján tisztított antitest. Kiszerelés: 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2; stabilizáló fehérjét tartalmaz. Immunogén: A HER2 fehérje szintetikus C-terminálszakasza (intracitoplazmás rész) KLH-hoz (keyhole limpet hemocianin) kapcsolva. Specificitás: HER2 fehérje. Tisztításai módszer: Az antitest affinitás alapján tisztított immobilizált HER2 fehérje peptid felhasználásával. Megjelenítı reagens: Torma-peroxidázzal és affinitás alapján tisztított kecske eredető nyúlellenes immunoglobulinnal konjugált dextrán polimer. Tris/HCl pufferben, stabilizáló fehérjével és mikrobaölı szerrel kiszerelve. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 6/54

Emlırák 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml 5 lemez Negatív kontrollreagens: Normál nyúl szérum immunglobulin frakciója a HER2 fehérje antitestének megfelelı fehérjekoncentrációban. Kiszerelés: 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2; stabilizáló fehérjét tartalmaz. DAB puffer-szubsztrát: Szubsztrát pufferoldat, ph 7,5; <0,1% hidrogénperoxidot, stabilizátort, stimulálót és mikrobaölı szert tartalmaz. DAB kromogén: 5%-os 3,3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid kromogén oldat. Epitópkinyerı oldat (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l-es citrátpuffer detergenssel. Mosó puffer (10x): Tris/HCl puffer tisztítószerrel és mikrobaölı szerrel. Kontroll lemezek: Minden lemezen három formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszet a HER2 fehérje expressziójának eltérı szintjeit mutató emlıkarcinóma sejtvonalakkal: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) és SK-BR-3 (3+). A kontroll lemezek hıkezeltek, így a metszetek jobban tapadnak az üveghez. A metszetek jobb tapadását célzó további hıkezelés ronthatja a megfestıdést. MEGJEGYZÉS: Minden reagenst, epitópkinyerı oldatot és mosópuffert kifejezetten e teszt céljára készítettünk. A teszt megadott jellemzıinek elérése érdekében ne helyettesítse az anyagokat. Mosópuffernek azonban a Dako S3006 kódszámú terméke is használható. Szükséges, de nem mellékelt anyagok Nedvszívó törlık Ammónium-hidroxid, 15 mol/l 37 mmol/l-re hígítva Kontrasztfestés: Hematoxilin, például vízalapú Mayer's Hematoxylin, Dako, Kód: S3301 (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.4) Fedılemezek Határoló toll, például a Dako Pen, Kód: S2002 Desztillált vagy ionmentesített víz (mosóvíz) Szárító kemence, 60 C vagy alacsonyabb hımérséklet fenntartására alkalmas Etanol, abszolút és 95%-os Párakamra (opcionális) Fénymikroszkóp (4 40x optikai nagyítás) Rögzítıszer, például a Dako Faramount, Kód: S3025, vagy Glycergel, Kód: C0563 Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenırzéséhez (lásd a Minıség-ellenırzés címő részt) Tárgylemezek, SuperFrost Plus, poly-l-lysine bevonatú lemezek, vagy Dako Silanized Slides, Kód: S3003 (lásd A minta elıkészítése címő részt) (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 7/54

Emlırák Festıedények vagy fürdık Stopperóra (2 40 perces idıközök mérésére alkalmas) Mosópalackok Vízfürdı fedéllel (az Epitópkinyerı oldatot 95 99 C-on képes tartani) Xilén, toluén vagy xilént helyettesítı anyag Tárolás emlı 2 8 C között tárolandó. A csomagoláson feltüntetett lejárati dátumon túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak a feltételeket ellenıriznie kell (14a, 14b). Felhívjuk a figyelmét arra, hogy a kontroll lemezeket is 2 8 C-on kell tárolni. A termék instabilitásának semmilyen nyilvánvaló jele nincs. Ezért a beteg mintáival párhuzamosan pozitív és negatív kontrollokat kell futtatni. Ha nem várt festés figyelhetı meg, mely a laboratóriumi eljárások módosulásával nem magyarázható, és a HercepTest termékkel kapcsolatba hozható probléma gyanúja merül fel, azonnal vegye fel a kapcsolatot a Dako mőszaki szolgálatával. A minta elıkészítése emlı A biopsziás mintákat úgy kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon immuncitokémiai festésre. A mintákon a szövetelıkészítés szabványos módszerét kell alkalmazni (15). Paraffinba ágyazott metszetek A rutinszerő feldolgozásra semleges pufferelt formalinban vagy Bouin fixálószerrel tartósított és paraffinba ágyazott szövetek megfelelnek a célnak. A biopsziás mintákat például 3 4 mm-es kockákra vágva 18 24 órán keresztül fixálja semleges pufferelt formalinban. A szöveteket ezután dehidratálja alkoholokban és xilénben, majd olvasztott parafinnal 60 C-nál nem magasabb hımérsékleten infiltrálja. A megfelelıen fixált és beágyazott, HER2 fehérjét kifejezı szövetek hővös helyen korlátlan ideig tárolhatók a metszetkészítés és felhelyezés elıtt (15 25 C) (15, 16). Az Egyesült Államokban az klinikai laboratórium fejlesztésérıl szóló 1988-as törvény 42 CFR 493.1259(b) szakasza kimondja, hogy A megfestett lemezeket a vizsgálat napjától számított legalább tíz évig, a feldarabolt mintákat pedig a vizsgálat napjától számított legalább két évig a laboratóriumnak meg kell ıriznie (16). A szövetmintákat 4 5 µm vastagságúra kell metszeni és tárgylemezre helyezni, majd szobahımérséklető levegın legalább 12 órán át (vagy amíg megszárad), vagy 37 C fokon egy éjszakán át, vagy 60 C fokon egy órán át kell szár ítani. FIGYELMEZTETÉS: Egy óránál hosszabb ideig tartó, 60 C-os vagy annál magasabb hıhatás a speciális membránasszociált HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését vagy elvesztését okozhatja (17). Az antigenitás megırzése érdekében a tárgylemezre (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine vagy szilanizált tárgylemez) vitt szövetmetszeteket 4 6 héten belül kell megfesteni, ha szobahımérsékleten (20 25 C) tárolják ıket (18). A HER2 fehérje kiértékeléséhez és a tumorban jelenlétének ellenırzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Legalább 5 lemez az ajánlott, 1 lemez a tumor jelenlétének megállapításához, 2 lemez a HER2 fehérje értékeléséhez (1 lemez a 2. számú ampullával, 1 pedig a 4. számú ampullával történı inkubáláshoz), és 2 lemez biztonsági tartaléknak. A HercepTest kalciummentesített szöveteken való használatának validálása nem történt meg, így az nem ajánlott. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 8/54

Emlırák A mintakészítéssel kapcsolatos további tudnivalókért tanulmányozza a Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) címő kiadványát, illetve a szakirodalom-jegyzékben 15. és 16. tétel alatt hivatkozott kiadványokat. A szövetek kezelése festés elıtt Az assay optimális mőködéséhez specifikus epitópkinyerı módszert, 10 mmol/l citrát pufferben forralást kell alkalmazni. Az Epitópkinyerı oldat a HercepTest készletben megtalálható. A módszerben a 10 mmol/l citrát pufferbe (20) merített lemezeken fixált metszeteket melegítjük olyan kalibrált vízfürdıbe merítve, amely képes fenntartani az Epitópkinyerı oldat szükséges hımérsékletét (95 99 C). A tengerszint felett magasa bban elhelyezkedı laboratóriumok maguk találják meg a legjobb módszert a vízfürdı szükséges hımérsékletének fenntartásához. Az epitóp kinyerését vízfürdıben kell végezni. Más melegítési módokat is teszteltek, de azok nem adtak reprodukálható eredményeket. Az epitóp kinyerése után azonnal megkezdjük a festési eljárást. A leírt eljárástól való eltérés befolyásolhatja az eredményeket. Óvintézkedések emlı 1. In vitro diagnosztikai alkalmazásra szolgál. 2. Csak foglalkozásszerő felhasználók részére! 3. Ampulla, Peroxidáz-blokkoló reagens, 3%-os hidrogén-peroxid oldatot tartalmaz. Szakembereknek kérésre anyagbiztonsági adatlapot adunk. 4. Ampulla, DAB kromogén, tartalma 5-<10% bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammónium-tetraklorid, felirata: H350 H341 P201 Veszély P280 P308 + P313 P405 P501 Rákot okozhat. Feltehetıen genetikai károsodást okoz. Használat elıtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. Védıkesztyő/védıruha/szemvédı/arcvédı használata kötelezı. Expozíció vagy annak gyanúja esetén: Orvosi ellátást kell kérni. Elzárva tárolandó. A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználó legyen alaposan tájékozott a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. 5. A 8. Wash Buffer (10x), tartalma 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride és 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt. Allergiás reakciót okozhat. A Wash Buffer (10x) a következı címkézéssel van ellátva: Figyelem H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 9/54

Emlırák 6. A termék nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmaz, mely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, mely során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Megsemmisítéskor, megelızendı a fém-azidok vízvezetékekben történı lerakódását, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni (21, 22). 7. A 2., 3. és 4. ampulla állati eredető anyagot tartalmaz. Mint bármely biológiai eredető termék esetén, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 8. A kontroll lemezeket és mintákat fixálás elıtt és után, valamint minden velük érintkezı anyagot fertızésre alkalmasként kezeljen, és a megfelelı óvintézkedésekkel mentesítse (23). A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bırrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bı vízzel. 9. Óvja a reagenseket a mikrobaszennyezıdéstıl, hogy elkerülje a nem specifikus megfestıdést. 10. A megadottól eltérı inkubálási idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. Egy óránál hosszabb ideig tartó, 60 C-on vagy annál magasabb hımérsékleten történı szárítás a speciális membránasszociált HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését vagy elvesztését okozhatja (17). 11. A reagensek az optimális mértékben vannak hígítva. További hígítás az antigén gyengébb festıdését okozhatja. 12. Minden reagenst, epitópkinyerı oldatot és mosópuffert kifejezetten e teszt céljára készítettünk. A teszt megadott jellemzıinek elérése érdekében ne helyettesítse az anyagokat. Mosópuffernek azonban az S3006 kódszámú termék is használható. 13. A Megjelenítı reagens és a DAB kromogén károsodhat, ha túlzottan erıs fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit, és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napsütésben. 14. Viseljen megfelelı személyi védıeszközöket a bırrel és szemmel történı érintkezés elkerülése érdekében. További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. 15. A paraffinmaradványok hamis negatív eredményeket okozhatnak. 16. Az ajánlottól eltérı reagensmennyiség használata esetén elıfordulhat, hogy a HER2 immunreaktivitás nem lesz látható. Ha a körülrajzolt szövetmetszetet nem fedi teljes mértékben a 3 csepp (100 µl) reagens, akkor 3 további cseppet kell hozzáadni. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 10/54

Emlırák HASZNÁLATI UTASÍTÁS emlı A. A reagens elıkészítése Érdemes a következı reagenseket a festés elıtt elkészíteni: A.1 Epitópkinyerı oldat Desztillált vagy ionmentesített vízzel 1:10 arányban hígítson a 7. ampulla tartalmából (Epitópkinyerı oldat 10x) a tervezett festési eljáráshoz elegendı mennyiséget. A fel nem használt hígított oldat 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.2 Mosópuffer A desztillált vagy ionmentesített vízzel 1:10 arányban hígítson a 8. ampulla tartalmából (Mosópuffer 10x) a mosáshoz szükséges mennyiséget. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A puffert öntse ki, ha kicsapódás látható benne. Desztillált vagy ionmentesített víz használható az öblítésre a peroxidáz-blokkoló reagenssel, szubsztrát kromogén oldattal és hematoxilinnel végzett inkubálás után. Minden más öblítési lépésben mosópuffert kell használni. A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB) Az alábbi eljárás 1 ml szubsztrát kromogén oldatot eredményez. Minden 1 ml aliquot tíz szövetmetszethez elegendı. Lépés 1: Lépés 2: Vigyen át 1 ml DAB puffer-szubsztrátot az 5. ampullából egy vizsgálócsıbe. lépés: Adjon hozzá egy csepp (25 30 µl) DAB kromogént a 6. ampullából. Keverje össze és pipettázza a szövetmetszetekre. Az elkészített szubsztrát kromogén oldat (DAB) 2 8 C-on tárolva körülbelül 5 napig stabil. Ezt az oldatot felhasználás elıtt alaposan keverje fel. Az oldatban esetleg létrejövı csapadék nem befolyásolja a festés minıségét. MEGJEGYZÉS: Az 6. ampullában lévı DAB kromogén színe átlátszótól világos levendulaszínig változhat. Ez nem befolyásolja a termék viselkedését. A hígítást a jelen tájékoztatóban foglaltak szerint végezze. Túl nagy mennyiségő DAB kromogén hozzáadása a DAB puffer-szubsztráthoz a pozitív jel romlását eredményezi. A.4 Kontrasztfestés A DAB festési reakció színes végterméke alkoholban és vízben oldhatatlan. Alkalmazzon hematoxilines kontrasztfestést, és a hematoxilin festési intenzitását állítsa be a Dako HercepTest értelmezési kézikönyv Emlırák címő dokumentumban bemutatott szinthez hasonlóan. Alkoholvagy vízalapú hematoxilin, például az S3301 kódszámú Dako Mayer's Hematoxylin használható. A hematoxilines kontrasztfestés után végezzen alapos öblítést desztillált vagy ionmentesített vízzel, majd merítse a szöveteket 37 mmol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe (lásd a B.2 szakasz 6. lépését). A szalmiákszesz (37 mmol/l) 2,5 ml 15 mol/l-es (koncentrált) ammónium-hidroxid és 1 liter desztillált vagy ionmentesített víz keverésével készül. A fel nem használt 37 mmol/l-es szalmiákszesz szobahımérsékleten (20 25 C) szorosan lezárt palackban le gfeljebb 12 hónapig tárolható. A.5 Rögzítıszer Nem vizes, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Azonban vízalapú rögzítı is elfogadható. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Kód: S3025, vagy Glycergel Mounting (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 11/54

Emlırák Medium, Kód: C0563 ajánlott vizes rögzítéshez. A felhasználás elıtt körülbelül 40 (± 5) C-ra melegítve folyósítsa meg a Glycergel -t. B. Festési eljárás B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A felhasználó használat elıtt alaposan tanulmányozza ezeket az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel (lásd Óvintézkedések). Az immunfestés elıtt a reagenseket hozza szobahımérsékletre (20 25 C). Ugyanígy minden inkubálást szobahımérsékleten végezzen. Ne hagyja a metszeteket megszáradni a festési eljárás közben. A megszáradt szövetmetszeteken erısebb nem specifikus festıdés jelentkezhet. A huzatnak kitett lemezeket takarja le. Ha hosszabb ideig inkubál, helyezze a szöveteket párás környezetbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a primer antitest inkubálása után (3. lépés) a lemezek szobahımérsékleten (20 25 C) legfeljebb egy óráig a puffe rben tarthatók anélkül, hogy a festés eredményességét ez befolyásolná. Paraffinmentesítés és rehidratálás: Festés elıtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidratálni kell. Ügyeljen a paraffin teljes eltávolítására. A visszamaradó beágyazó anyag nagyobb nem specifikus megfestıdést eredményezhet. Ezt a lépést szobahımérsékleten (20 25 C) végezze. 1. Helyezze a lemezeket xilénfürdıbe, és inkubálja 5 (±1) percig. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket abszolút etanolba. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket 95%-os etanolba. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd legalább 30 másodpercre helyezze a lemezeket desztillált vagy ionmentesített vízbe. A B.2 szakasz 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg az epitóp kinyerését. A xilénes és alkoholos oldatokat 40 lemez után cserélni kell. Xilén helyett használható toluén vagy xilént helyettesítı anyag, például Histoclear. MEGJEGYZÉS: A készletben található reagensek és utasítások az optimális teljesítmény eléréséhez lettek összeállítva. A reagensek további hígítása, az inkubálási hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. A felhasználó laboratóriumában a szövetek feldolgozásának és a technikai eljárásoknak az eltérései érvényteleníthetik az assay eredményeit a betegek Herceptin terápiába való beválasztását illetıen. B.2 Festési protokoll Szobahımérsékleten, 20 25 C között. 1. lépés: Epitóp kinyerése Töltse meg a festıedényeket, pl. Coplin-csészéket hígított Epitópkinyerı oldattal (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.1 szakasz). Helyezze az Epitópkinyerı oldatot tartalmazó festıedényeket vízfürdıbe. Melegítse fel a vízfürdıt és az Epitópkinyerı oldatot 95 99 C-ra. Felmelegítéskor az epitópkinyerı oldat zavarossá válik. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le a csészéket. Merítse a szobahımérséklető, paraffinmentesített lemezeket a festıedényekben lévı elıre felmelegített Epitópkinyerı oldatba. MELEGÍTSE FEL A VÍZFÜRDİT ÉS AZ (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 12/54

EPITÓPKINYERİ OLDATOT ISMÉT 95 99 C-RA. Inkubálja 40 (±1) percig 95 99 C-on. A lemezekkel együtt vegye ki a teljes edényt a vízfürdıbıl. Hagyja a lemezeket az epitópkinyerı oldatban 20 (±1) percig szobahımérsékleten hőlni. Emlırák Öntse le az Epitópkinyerı oldatot, majd öblítse le a metszeteket a hígított mosópufferben (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.2 szakasz). Az optimális eredmény elérése érdekében az epitóp kinyerése után és a festés megkezdése elıtt 5 20 percig áztassa a metszeteket a mosópufferben. MEGJEGYZÉS: Az Epitópkinyerı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. 2. lépés: Peroxidáz-blokkoló reagens Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert. Pihementes törlıvel (például Kimwipe törlıvel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajtamaradó folyadék eltávolítására és a reagensek elıírt területen tartására. Rajzolja körül a szövetmetszetet Dako tollal. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) peroxidáz-blokkoló reagenst. Inkubálja 5 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan desztillált vagy ionmentesített vízzel, vagy mosópufferrel (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. 3. lépés: Primer antitest vagy negatív kontroll reagens Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) Anti-HER2 fehérje vagy negatív kontroll reagenst. Inkubálja 30 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan mosópufferrel (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a 3. lépés után a lemezek szobahımérsékleten (20 25 C) legfeljebb egy óráig a mosópufferben tar thatók anélkül, hogy a festés eredményességét ez befolyásolná. 4. lépés: Megjelenítı reagens Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) Megjelenítı reagenst. Inkubálja 30 (±1) percig. Öblítse le a lemezeket az 3. lépésben leírtak szerint. 5. lépés: Szubsztrát kromogén oldat (DAB) Törölje le a lemezeket a fentiek szerint. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) szubsztrát-kromogén oldatot (DAB). Inkubálja 10 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan desztillált vagy ionmentesített vízzel (ne öntse közvetlenül a szövetre). A visszamaradó szubsztrát kromogén oldatot (DAB) a megfelelı hulladékkezelésig győjtse veszélyes anyagok számára kialakított tárolóba. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 13/54

6. lépés: Kontrasztfestés (az utasítások hematoxilinre vonatkoznak) Emlırák Merítse a lemezeket hematoxilin fürdıjébe. A használt hematoxilin erısségétıl függıen 2 5 percig inkubálja. Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében óvatosan öblítse le a lemezeket. Ügyeljen arra, hogy ne maradjon rajtuk hematoxilin. Opcionális: Mártsa a lemezeket 10-szer 37 mmol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe (lásd az A.4 szakaszt). Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében óvatosan öblítse a lemezeket 2 5 percig. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás hosszától és a felhasznált hematoxilin erısségétıl függıen a kontrasztfestés a sejtmagok halvány vagy sötétkék elszínezıdését eredményezi. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 7. lépés: Felhelyezés Nem vizes, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Azonban vízalapú rögzítıszer is elfogadható. A minták vizes rögzítıszerrel, pl. a S3025 kódszámú Dako Faramount, vagy a C0563 kódszámú Glycergel rögzíthetık és lefedhetık. MEGJEGYZÉS: A lemezek alkalmas idıben bármikor kiértékelhetık. Azonban némi fakulás következhet be, ha a vizes rögzítıszerrel lefedett lemezeket egy hétnél hosszabb ideig erıs fény éri. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahımérsékleten (20 25 C) tárolja. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 14/54

Emlırák Minıség-ellenırzés emlı A szövetek fixálásának és a felhasználó laboratóriumában történı feldolgozásának és beágyazásának eltérései az eredmények jelentıs szórását okozhatják, ezért a Dako által biztosított ellenırzı minták mellett szükséges a rendszeres belsı ellenırzés. Az Egyesült Államokban további tudnivalókért lásd a College of American Pathologists (CAP) Immunhisztokémiai minısítı programjának minıség-ellenırzési követelményeit, a CLSI (korábban NCCLS) Immuncitokémiai Minıségbiztosítás Elfogadott Iirányelveit (24), valamint az irodalomjegyzék 25. számú munkáját. 1. táblázat. A napi minıség-ellenırzés célja. Szövet: A páciens mintájával azonos módon fixált és feldolgozott Specifikus antitest és szekunder antitest Nem specifikus antitest* vagy puffer és a specifikus antitesttel használttal azonos szekunder antitest Pozitív kontroll: A kimutatni kívánt célantigént tartalmazó szövet vagy sejtek (a páciens szövetében található). Az ideális kontroll a gyengén pozitívan festıdı szövet, mivel ez a legérzékenyebb az antitesttel, illetve az antigénlebomlással szemben Az elemzés minden lépését ellenırzi. Validálja a reagenseket és eljárásokat a HER2 fehérje festése során. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Negatív kontroll: Várhatóan negatív szövetek vagy sejtek (megtalálható lehet a páciens szövetmintájában vagy a pozitív kontroll mintában) Antitest sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni, nem kívánt keresztreaktivitásának kimutatása. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Páciens szövetmintája Specifikus festés kimutatása Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Dako által mellékelt kontroll lemez Csak a festési eljárást ellenırzi * A specifikus antitestével azonos fajtól származó szérum, de nem ugyanazon antigén ellen. Nem specifikus antitestkötés kimutatása, pl. az antitest Fc részének kötıdése a szövethez. Kontroll lemez (mellékelve): A mellékelt kontrollminták mindegyike a készlet reagálásának ellenırzésére három formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlırák-sejtvonalat tartalmaz, melyek festési értékei 0, 1+ és 3+. Festési eljárásonként egy lemezt fessen meg. A Dako által biztosított kontrollminták sejtvonalainak kiértékelése jelzi a festési menet érvényességét. Pozitív kontrollszövet: A kontroll legyen friss autopsziás/biopsziás/sebészeti minta, a páciens mintájával azonos módon fixálva, feldolgozva és beágyazva. A pozitív kontrollszövetek a megfelelıen elıkészített szövetekre és a helyes festési technikákra utalnak. Minden egyes festési menetben, minden egyes vizsgálati körülményhez mellékelni kell egy pozitív kontrollszövetet. A pozitív kontrollszövetek gyenge pozitív festést adjanak, hogy a primer antitest érzékenységének finom változásait is ki tudják mutatni. A készletben mellékelt kontrollminták vagy a páciens mintáitól eltérı módon feldolgozott minták csak a reagens mőködését igazolják, a szövet elıkészítésérıl nem adnak visszajelzést. Pozitív kontrollszövetként egy korábban HER2 fehérjét 2+ értékkel emelkedetten expresszáló invaszív (infiltráló) emlırák-szövet használata ideális. MEGJEGYZÉS: Az ismert pozitív kontrollszöveteket a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelıségének ellenırzésére használja, NE a páciensek mintáinak diagnosztizálásához. Ha a pozitív kontrollszövet nem mutat megfelelı pozitív festést, a páciens mintáinak eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. Negatív kontrollszövet: A minden festési menetben a páciens mintáival azonos módon fixált, feldolgozott és beágyazott negatív (HER2 fehérjére ismerten negatív) kontrollszövettel ellenırizze a primer ellenanyag specificitását és a háttérfestést. Negatív kontrollszövetnek megfelel a vastagbél, a máj vagy a pajzsmirigy szövete. A legtöbb szövetmetszetben elıforduló több különféle (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 15/54

sejttípus belsı negatív kontrollhelyeket kínál (ezt a felhasználónak ellenıriznie kell). A normál emlıvezeték belsı negatív kontrollként szolgálhat. Emlırák Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben vagy a belsı negatív kontrollszövetben, akkor a páciens mintáinak eredményét érvénytelennek kell tekinteni, és a tesztet újra kell futtatni. Nem specifikus negatív kontrollreagens: A nem specifikus festés értékelésére és az antigén helyén a specifikus festés jobb értelmezéséhez a primer antitest helyett használja a mellékelt negatív kontrollreagenst a páciens mintáinak egy metszetén. A negatív kontrollreagens inkubálási idejének a primer antitestének kell megfelelnie. Assay ellenırzése: Az ellenanyag vagy festırendszer diagnosztikai eljárásban történı elsı felhasználása elıtt a felhasználónak ellenıriznie kell az ellenanyag specificitását. Ehhez tesztelni kell azt több, ismert pozitív és negatív szövetet jelzı, ismert immuncitokémiai tulajdonsággal rendelkezı mintán. Lásd a tájékoztató jelen szakaszában fentebb vázolt minıség-ellenırzési eljárásokat és a CAP Immunhisztokémiai Minısítı Programjának minıség-ellenırzési követelményeit, és/vagy a CLSI (korábban NCCLS) Immuncitokémiai Minıségbiztosítás Elfogadott Irányelveit (24). Ezeket a minıség-ellenırzési eljárásokat minden új antitest-tételnél, illetve az assay paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A HER2 fehérjére ismert, 0 3+ erısségő festést adó, valamint negatív szövetek, pl. a colon, a máj vagy a pajzsmirigy szövetei megfelenek az assay ellenırzéséhez. A festés értelmezése emlı A HER2 fehérje emelkedett expressziójának meghatározásához kizárólag a membrán festési intenzitását és mintáját szabad értékelni a 2. táblázatban bemutatott skála alapján. A lemez értékelését patológus szakember végezze fénymikroszkóp segítségével. Az immuncitokémiai festés értelmezésére és értékelésére 10x-es nagyítású objektív a megfelelı. 20 40x-es nagyítású objektív az értékelés megerısítéséhez hasznos. A citoplazma festıdését nem specifikus festıdésnek kell tekinteni, és nem szabad belefoglalni a membrán festési intenzitásának értékelésébe (8). A 0, 1+, 2+ és 3+ erısségő festés megkülönböztetéséhez lásd a Dako HercepTest értelmezési kézikönyv Emlırák címő dokumentumban a festéserısségeket szemléltetı képeket. Csak invazív emlıkarcinómás betegek mintáit értékelje. Ha egyazon mintában megtalálható in situ és invazív karcinóma, akkor csak az invazív komponenst értékelje. 2. táblázat. Sejtmembrán festıdési erısségének kritériumai. Festıdési minta Érték (Jelentés a kezelıorvosnak) HER2 fehérje emelkedett expressziójának értékelése (Jelentés a kezelıorvosnak) észlelhetı festıdés, vagy a membrán festıdése a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ában észlelhetı 0 Negatív Halvány/alig kivehetı membránfestıdés észlelhetı a tumorsejtek több mint 10%-ában. A sejtek membránja részlegesen festıdött 1+ Negatív Gyenge/közepes erısségő membránfestıdés észlelhetı a tumorsejtek több mint 10%-ában. Erıs membránfestıdés észlelhetı a tumorsejtek több mint 10%-ában. 2+ 3+ Gyengén pozitív Erısen pozitív A HercepTest a HER2 fehérje emelkedett expressziójára nézve lehet negatív (0 és 1+ festési intenzitás), enyhén pozitív (2+ festési intenzitás), illetve erısen pozitív (3+ festési intenzitás). A HercepTest nem arra készült, hogy diagnosztikai információt adjon a páciens vagy az orvos számára, és ilyen célra nem is lett bevizsgálva. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 16/54

Emlırák A lemezeket minden festési menetben a 3. táblázatban megadott sorrendben meg kell vizsgálni meghatározandó a festési menet érvényességét, és lehetıvé téve a szövetminta festési intenzitásának félkvantitatív kiértékelését. 3. táblázat. A lemezek kiértékelésének sorrendje. Lemezek kiolvasási sorrendje Magyarázat 1. A három sejtvonalat tartalmazó kontroll lemez A sejtmembrán 3+ erısségő barna festıdése (győrőszerő) a SK-BR-3 jelő 3+ kontroll sejtvonalban, részleges barna győrő az MDA-175 jelő 1+ kontroll sejtvonalban, és a festıdés elmaradása az MDA-231 jelő 0 kontroll sejtvonalban érvényes assay-t jelez Pontonkénti vagy szaggatott membránfestıdés a pozitív 1+ MDA-175 sejtvonal kevés vagy közepes mennyiségő sejtjében. Ebben a sejtvonalban a citoplazma Golgirégiójának pontszerő festıdése is megfigyelhetı Az MDA-231 jelő 0 kontroll sejtvonalban (HER2 fehérje festésére negatív) megjelenı barna festıdés azt jelenti, hogy az assay-ben nem specifikus festıdés történt. Az assay eredményei érvénytelenek lehetnek túlfestıdés miatt 2. Pozitív kontrollszövet Barna membránfestıdést kell észlelni. A citoplazma és a negatív szövetek festıdése nem lehet erısebb mint 1+ 3. Negatív kontrollszövet A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének HIÁNYA megerısíti a készlet sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni keresztreaktivitásának hiányát. Ha specifikus membránfestés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. 4. Negatív kontroll használatával festett, betegbıl származó szövetminta Reagens 5. A primer antitest használatával festett, betegbıl származó szövetminta A specifikus membránfestıdés hiánya igazolja, hogy a primer antitest megjelöli a cél antigént A negatív kontrollreagenssel kezelt minta citoplazmájában végbemenı egyéb sárgás vagy barna festıdés, például kötıszövetben, leukocitában, eritrocitában vagy nekrotikus szövetben nem specifikus háttérfestésnek tekintendı, és az adatlap megjegyzések rovatában jelentendı A HER2 fehérje emelkedett expressziója barna győrőként észlelhetı a primer antitesttel kezelt tumorsejtek sejtmembránján 1. Kontroll lemez (mellékelve): A HercepTest assay-vel megfestett kontroll-lemezt kell elsıként értékelni, hogy meggyızıdhessen arról, hogy az összes reagens megfelelıen mőködik-e. A sejtmembránnál található barna (3,3 -diaminobenzidin, DAB) reakciótermék a pozitív reaktivitás jele. A sejtmembrán kerületi (győrőszerő) barna festıdése az SK-BR-3 jelő, 3+ kontroll sejtvonalban, részleges barna győrő az MDA-175 jelő, 1+ kontroll sejtvonalban, valamint a festıdés elmaradása az MDA-231 jelő, 0 kontroll sejtvonalban érvényes assay-t jelez Ha a kontroll sejtvonalak bármelyike esetében az ezen kritériumoktól való eltérés figyelhetı meg, a páciens mintáinak minden eredményét érvénytelennek kell tekinteni. 2. Pozitív kontrollszövet: Ezután a pozitív kontrollszövetet kell megvizsgálni. Ez a lemez ellenırzi, hogy a fixálás és az epitóp kinyerése sikeres-e. A festés értelmezéséhez használjon ép sejteket, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek gyakran nem specifikusan festıdnek (26). A festıdés a tumorszövetben a sejtmembrán barna elszínezıdéseként jelentkezik. A citoplazma és a negatív szövetek barna festıdése nem lehet erısebb, mint ami az 1+ festési intenzitásnak megfelel. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 17/54

Emlırák 3. Negatív kontrollszövet: A pozitív kontrollszövet után meg kell vizsgálni a negatív kontrollszövetet ellenırizendı a cél antigén primer antitest általi megjelölésének specifikusságát. A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének hiánya megerısíti a készlet sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni keresztreaktivitásának hiányát. Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. Ezen felül a pozitív kontrollszövet negatív részei negatív kontrollszövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak ellenıriznie kell. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy gyenge reakció (0 1+ festési intenzitás) észlelhetı a legtöbb normál epithelialis szövetben. Alkalmazható negatív kontrollszövetek például: vastagbél, máj és pajzsmirigy. A nem specifikus festıdés, amennyiben van, megjelenésében diffúz. A formalinban túlzottan fixált szövetekben a kötıszövet helyenkénti festıdése figyelhetı meg. 4 + 5. Páciens szövetmintája: A páciens mintáit utoljára vizsgálja meg a HercepTest segítségével. A pozitív festıdés intenzitását a negatív kontrollreagens nem specifikus háttérfestésének kontextusában értékelje. Mint minden immuncitokémiai teszt esetében, a negatív eredmény azt jelenti, hogy az antigén nem volt észlelhetı, nem pedig azt, hogy az antigén nincs jelen a vizsgált sejtekben vagy szövetben. A HercepTest immunreaktivitásával kapcsolatos tudnivalókat lásd az Összefoglalás és magyarázat és a Korlátozások és teljesítményjellemzık címő részekben. További ajánlások a HercepTest festésének értelmezéséhez A HER2 fehérje emelkedett expressziója szempontjából vizsgált legtöbb metasztázisos emlıkarcinóma 0 vagy 3+ értéket kap. Míg az esetek legtöbbje egyértelmő, a fennmaradó 1+ és 2+ értékő minták egy részének értelmezése nehezebb lehet. A HercepTest festésének értelmezésekor kövesse az alábbi útmutatásokat. Értékelje ki a kontroll sejtvonalakat az assay mőködésének validálására. Értékelje ki a pozitív és negatív kontroll lemezeket. Az elsı értékeléskor ajánlott a szövetminta hematoxilines és eozines festése (H&E). (A tumor esetleg nem szembetőnı a HercepTest -tel festett mintán. A H&E módszerrel festett lemezre szüksége van a patológusnak a tumor jelenlétének igazolásához.) A HercepTest -tet a minta azonos paraffinkockájából származó párosított metszeten (metszetsorozaton) végezze el. A HER2 fehérje emelkedett expressziójának vizsgálatára megfestett metszeteket elıször kis nagyításon értékelje. A pozitív esetek túlnyomó többsége kis nagyításon egyértelmően megállapítható. A minta jól tartósított és megfestett területeit használja a pozitív tumorsejtek százalékának meghatározásához. Általában az esethez rendelhetı érték kis nagyításon is nyilvánvaló. Ha az 1+ és 2+ határesetén kis nagyításon nehéz dönteni, akkor az érték általában 1+. A membrán festıdésének ellenırzéséhez használjon 20 40x-es optikai nagyítást. Ha a tumorsejtek többsége teljes membránfestıdést mutat, akkor a festıdés erıssége 2+ vagy 3+. Növelje az optikai nagyítást 20 40x-ra az érték megerısítéséhez. A 3+ esetek többségében a tumorsejtek legalább 80%-a festıdik, és a membrán festése erıs. Ha a mintában a 10%-os határérték körül van a pozitív tumorsejtek száma, akkor ajánlott legalább 100 tumorsejtet megszámolni a megfestett sejtek arányának meghatározásához. Ha a tumorsejtek több mint 10%-ában gyenge vagy közepes erısségő teljes membránfestıdés tapasztalható, akkor a minta értéke 2+. Ehhez általában a fennmaradó tumorsejtek többségének nem teljes membránfestıdése társul. Ha a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ánál festıdött a membrán teljesen körkörösen, és a többi tumorsejtnél esetleg nem teljes a festıdés, akkor az érték 1+. Ha a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ánál festıdött a membrán teljesen körkörösen vagy részlegesen, akkor az érték 0. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 18/54

Emlırák Korlátozások emlı Általános korlátozások 1. Az immunocitokémia egy többlépcsıs diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelı reagensek és a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint az immuncitokémiai lemez elıkészítése és a festési eredmények értelmezése területén. 2. A szövetfestés sikere a szöveteknek a festést megelızı kezelésétıl és feldolgozásától függ. A helytelen fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezıdés hamis eredményt, az antitest befogódását vagy hamis negatív eredményt adhat. Az inkonzisztens eredményeket okozhatják a fixálási és beágyazási módszer eltérései vagy a szövetelıkészítés inherens szabálytalanságai. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 4. A pozitív festés vagy annak hiányának klinikai értelmezését a klinikai megjelenés, morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok kontextusában kell végezni. A festés vagy annak hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatoknak és megfelelı kontrolloknak, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatoknak kell kiegészíteniük. A festett preparátum értelmezése olyan képesített patológus feladata, aki ismeri az antitesteket, reagenseket és az alkalmazott módszereket. A festést tanúsítvánnyal ellátott laboratóriumban kell végezni, olyan patológus felügyelete alatt, aki a festett lemezeket megtekinti, és biztosítja a pozitív és negatív kontrollok megfelelıségét. 5. A hepatitisz B vírussal fertızött személyektıl származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidázra nem specifikus festıdést mutathatnak (27). 6. A reagensek váratlan reakciót adhatnak az elızıleg nem tesztelt szövettípusokon. Az antigén neoplazmában és más patológiás szövetekben való expressziójának biológiai változékonysága következtében a váratlan reakciókat még a tesztelt szövetekben sem lehet teljesen kizárni (28). A dokumentált váratlan reakcióval kapcsolatban forduljon a Dako mőszaki szolgálatához. 7. Hamis pozitív eredmény lehet látható a fehérjék nem immunológiai kötése vagy a szubsztrát reakciótermékei miatt. Ezt okozhatja még pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm C) (28). 8. A festési eljárást szobahımérsékleten (20 25 C-on) végezze. Termékspecifikus korlátozások 1. Az MDA-175 jelő 1+ kontroll sejtvonalban jelen lévı antigén idıvel lebomlik. A kontroll lemez által adott eredményeket a kontroll lemez felhasználhatósági idejéhez viszonyítva értékelje. Az MDA-175 sejtek negatív festıdése jelentheti mindössze azt, hogy a kontroll lemez már nem használható. A kontroll-lemezeket 2 8 C-on kell tá rolni. 2. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A mintákat a lemezen rögzítéstıl számított 4 6 héten belül meg kell festeni, ha szobahımérsékleten (20 25 C) tárolják ıket (29). 3. Az optimális és megismételhetı eredmények eléréséhez a HER2 fehérje olyan hıindukált epitópkinyerést igényel, amelyben a szövetek fixálása (semleges pufferelt formalin vagy Bouin fixálószer) és paraffinba ágyazása rutinszerően zajlik. Ezt az elıkezelést a teljes festési eljárást megelızıen kell elvégezni. Lásd a Minta elıkészítése részben a A szövetek kezelése festés elıtt szakasz utasításait. 4. A HER2 fehérje hıindukált epitópkinyerését csak kalibrált vízfürdıvel végezze. Más melegítési módokat is teszteltek, de azok nem adtak reprodukálható eredményeket. 5. Ne helyettesítse a készlet reagenseit más sorozatszámú reagensekkel vagy más gyártótól származó reagensekkel. Az egyetlen kivétel a mosópuffer, amely az S3006 kódszámú Dako Wash Buffer termékkel helyettesíthetı. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 19/54

6. A citoplazma festıdésének értékelése hamis eredményeket adhat. Az eredmények értékelésekor csak a sejtmembrán festési intenzitását tekintse. Emlırák 7. A megfestett kontroll lemezeket csak a festési menet validálására használja, ne pontozza vele a szövetmetszetek festési reakcióját. 8. Idınként erıs helyi festıdés (3+), azaz forró pontok láthatók. Ez az egyenetlen fixálás és/vagy szövetfeldolgozás eredménye lehet. Ajánlott ugyanabból a mintából egy második szövetkocka immunfestése. 9. A HercepTest használatát nem semleges pufferelt formalinban vagy Bouin fixálószerben fixált minták esetében nem validálták. 10. Az emlıszövetben lévı normál epithelium festıdésének 0 és 1+ között kell lennie. Ha a normál epithelium 1+ feletti erısségő festıdését észleli, akkor a tesztet meg kell ismételni. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy a normál mandula és a nyelıcsövi epithelium akár 2+ erısséggel is festıdhet. Teljesítményjellemzık emlı Háttér A Herceptin vizsgálatába beválasztható betegeket azonosító klinikai vizsgálat (CTA) kísérleti jellegő volt és nincs folytatása. A HercepTest a CTA összehasonlítható alternatívájaként lett kifejlesztve. A Herceptin biztonságosságát és hatékonyságát véletlen kiválasztásos, ellenırzött klinikai vizsgálatban és egy nagy, nyílt vizsgálatban értékelték (Lásd a Herceptin tájékoztatóját). A központi laboratóriumban CTA-val végzett immuncitokémiai vizsgálat a Herceptin klinikai vizsgálataiba beválasztott betegek mindegyikénél kimutatta a HER2 fehérje emelkedett expresszióját. A betegek akkor voltak beválaszthatók a Herceptin kezelésbe, ha a tumor 2+ vagy 3+ szinten mutatta a HER2 fehérje emelkedett expresszióját (a 0 3+ skálán, ahol 3+ a legmagasabb szint). E vizsgálatok alcsoport-elemzésének eredménye azt mutatta, hogy azok a betegek, akiknek a szövetei erısen pozitívak (3+) voltak a HER2 fehérje emelkedett expressziója szempontjából, nagyobb mértékben részesültek a Herceptin elınyeibıl, mint azok, akiknek a szövetei gyengén pozitívak (2+) voltak. A HER2 fehérje emelkedett expressziójának mértéke potenciálisan fontos elırejelzıje a Herceptin kezelés hatékonyságának. Mivel a Herceptin vizsgálataiban részt vett egyik beteg sem a HercepTest alapján lett beválasztva, a pozitivitás mértékének és a Herceptin kezelés klinikai elınyeinek korrelációja nem ismert. Összehasonlító vizsgálatok A HercepTest jellemzésére két vizsgálatot végeztünk. 1) Összehasonlítás a klinikai vizsgálattal (CTA). 2) A pontosság öt további vizsgálattal összehasonlítva. Összehasonlítás a klinikai vizsgálattal (CTA) A HercepTest -et összehasonlítottuk a CTA-val a Herceptin terápiába beválasztható betegek azonosítása szempontjából 274 darab HER2 fehérje pozitív (2+ vagy 3+) és azonos számú HER2 fehérje negatív emlırák-szövet mintán. A 4. táblázat mutatja az eredményeket 2 x 2 -es diagramban, ahol 0 és 1+ negatívnak, 2+ és 3+ pozitívnak tekintett eredmény. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 20/54

Emlırák 4. Táblátzat. A HercepTest és a CTA 2 x 2 -es konkordanicamátrixa (minták száma). Klinikai vizsgálat Pozitív Negatív Összesen HercepTest Pozitív 216 59 275 Negatív 58 215 273 Összesen 274 274 548 Konkordancia: 79% (76 82%) 95% konfidencia intervallum. A HercepTest teljes bináris konkordanciája a CTA-val 79% volt (431/548), a 2 oldalú 95%-os szintő konfidencia intervallum 76 82%. Az eredmények huszonegy százaléka (21%) a két módszer nem egyezését mutatta. A HercepTest 0 3+ skálán elhelyezkedı eredményeiben a HER2 fehérje emelkedett expresszióját negatívnak (0 és 1+ festési intenzitás), gyengén pozitívnak (2+ festési intenzitás) vagy erısen pozitívnak (3+ festési intenzitás) értelmeztük. 5. táblázat. A HercepTest és a CTA 3 x 3-as konkordanicamátrixa. Klinikai vizsgálat 3+ 2+ 0-1+ Összesen HercepTest 3+ 107 36 6 149 2+ 16 57 53 126 0-1+ 8 50 215 273 Összesen 131 143 274 548 A konkordanciavizsgálat 3 x 3-as mátrixban való megjelenítés azt mutatja, hogy a HercepTest ben egy 3+ érték nagy valószínőséggel megfelel a CTA egy olyan pozitív eredményének, amely lehetıvé tette volna a felvételt a Herceptin vizsgálatba (2+ vagy 3+). A HercepTest egy 2+ eredménye már nem korrelál olyan jól a CTA eredményeivel. A HercepTest 2+ eredményeinek körülbelül 42%-a (53/126) negatív volt a CTA szerint (0 1+), ami nem tette volna lehetıvé a felvételt a Herceptin klinikai vizsgálatába. Pontosság A HercepTest -et 2 mikroszkópos lemezen is vizsgáltuk, amelyek paraffinba ágyazott szövetmetszeteket tartalmaztak 168 emlıtumorból. Ezeket a tumorokat korábban öt különbözı módszerrel vizsgáltuk a HER2 gén amplifikációja és a HER2 fehérje emelkedett expressziója szempontjából, ezek: belsı Southern blot, a DNS amplifikációjára fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH), Northern blot RNS-analízis, Western blot, és immuncitokémia (ICC) fagyasztott szöveten (29). Az eredményeket a 6. táblázat mutatja be. 6. táblázat. A HercepTest, valamint a génamplifikáció és a HER2 fehérje emelkedett expresszióját vizsgáló tesztek kombinált eredményeinek (OE) összehasonlítása. Referencia OE osztályozás + - Összesen HercepTest + 43 0 43-26 99 125 Összesen 69 99 168 Pozitív egyezés: 43/69 = 62% Negatív egyezés: 99/99 = 100% Az eredmények 85%-os (142/168) egyezést mutatnak (95% szintő konfidencia intervallum 78 89%) a HercepTest pozitív (2+ és 3+) és a negatív (0 és 1+) festési intenzitásai között. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 21/54

Emlırák Az 5 különbözı módszer által negatívnak talált egyik minta sem lett pozitív a HercepTest -tel, míg az 5 különbözı módszer kombinált eredményei a pozitív esetre nagyobb számot adtak. Megismételhetıség Meneten belüli megismételhetıség: A meneten belüli megismételhetıséget egy laboratórium 5 különbözı ICC festési intenzitású mintán tesztelte. Minden mintát három példányban vizsgáltak maszkolt véletlen kiválasztásos formában. Ezt a protokollt alkalmazták kézi festésnél, majd automatizált festésnél. Minden minta 100%-osan megismételhetı eredményt adott. Menetek közötti megismételhetıség: A menetek közötti megismételhetıséget három laboratórium 4 napon keresztül 5 különbözı ICC festési intenzitású mintán tesztelte véletlen kiválasztásos és maszkolt módszerrel automatizált eljárásban. Egy laboratórium a protokollt kézi módszerrel is megismételte. Kitőnı megismételhetıséget tapasztaltak a pozitív és negatív eredmények megoszlásában (0 és 1+, illetve 2+ és 3+) egy automatizált módszert alkalmazó laboratórium két mintája kivételével, amelyek értéke 1+ és 2+ között változott. A 2+ és 3+ értékő minták megismételhetısége 100%-os. Laboratóriumok közötti megismételhetıség: A laboratóriumok közötti megismételhetıséget három, földrajzilag elkülönülı laboratóriumban tesztelték 40 darab azonos, véletlen kiválasztásos és maszkolt mintán, amelyek különbözı ICC festési intenzitással rendelkeztek. A friss metszeteket elküldték a tesztelı laboratóriumokba patológus által végzett kézi és automatizált kiértékelésre. A laboratóriumok közötti százalékos egyezés 82% és 90% között változott a pozitív/negatív dichotómiában, ahol 0 és 1+ negatív, míg 2+ és 3+ pozitív a HER2 fehérje emelkedett expressziójának vonatkozásában. A CTA-t végzı refrencialaboratórium eredményeivel összehasonlítva 12,5% (15/120) összevethetı eredmény nem mutatott egyezést a negatív (0 vagy 1+) és pozitív (2+ vagy 3+) besorolást illetıen. További 10% (12/120) diszkrepancia volt jelen a 2+ és 3+ értékek között. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 22/54

Emlırák Immunreaktivitás A 7. táblázat összefoglalja a HercepTest immunreaktivitását a normál szövetek ajánlott panelével. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott és a tájékoztatóban leírt módon HercepTest -tel festett. 7. táblázat. A HercepTest normál szövetekre mutatott reaktivitásának összefoglalása. Szövettípus (Vizsgált mennyiség) Mellékvese (3) Csontvelı (3) Agy/Kisagy (3) Agy/Kisagy (3) Emlı (3) Méhnyak (3) Vastagbél (3) Nyelıcsı (3) Szív (3) Vese (3) Máj (3) Tüdı (3) Mesothelialis sejtek (3) Petefészek (3) Hasnyálmirigy (3) Mellékpajzsmirigy (3) Perifériás ideg (3) Agyalapi mirigy (3) Prosztata (3) Nyálmirigy (3) Vázizom (3) Bır (3) Vékonybél (3) Lép (3) Gyomor (3) Here (3) Csecsemımirigy (3) Pajzsmirigy (3) Mandula (3) Méh (3) Pozitív szövetelem-festıdés és festıdési minta Emlımirigy (1/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás) Vese velıállomány tubulusai (3/3 szövet, 1 2+ festıdési intenzitás, a sejtek 5 50%-a mutatja, citoplazmatikus) Prosztatamirigy/ductusok (3/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 50%-a mutatja, citoplazmatikus) Verejtékmirigyek (1/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 30%-a mutatja, citoplazmatikus) Hengerhám, felszín (1/3 szövet, 2+ festıdési intenzitás, a sejtek 25%-a mutatja) Epithelium (1/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 25%-a mutatja) Laphám (3/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 80%-a mutatja) A jelentett festıdés minden szövet esetében membránban történt, hacsak másképp nem jelezzük. Mindhárom minta minden szövettípusnál ugyanolyan festési intenzitást mutatott, hacsak másképp nem jelezzük. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 23/54

Emlırák Hibaelhárítás emlı A teendıkért lapozza fel a Dako korábban hivatkozott kézikönyvének Hibakeresés címő részét (19), vagy hívja a Dako mőszaki szolgálatát, ha szokatlan festıdést kíván jelenteni. Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. A lemezek nem festıdnek 1a. A reagenseket nem a megfelelı sorrendben alkalmazta. 1a. Ellenırizze a reagensek használatát 2. A lemezek festése halvány 1b. Nátrium-azid van a mosóoldatban 1c. A felvitt metszeteket ért túlzott hıhatás a deparaffinálást megelızıen, és a hı indukálta antigén feltárás a látható HER2 immunreaktivitás elvesztéséhez vezethet. 2a. Az epitóp kinyerése nem megfelelı 2b. A reagens inkubálási ideje nem megfelelı 2c. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak 2d. A felvitt metszetek ért túlzott hıhatás a deparaffinálást megelızıen, és a hı indukálta antigén feltárás a látható HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését okozhatja. 2e. Az alkalmazott reagensmennyiség nem elegendı 1b. Használjon a készletben mellékelt mosópufferbıl frisset 1c. Szobahımérséklető levegın szárítsa a szövetmetszeteket legalább 12 órán át, illetve amíg meg nem száradnak. Alternatív módszerként a szárítás végezhetı 37 C-on egy éjszakán át, vagy 60 C-on, maximum egy órán át. A metszetek magasabb hımérsékleten történı szárítása csak kalibrált kemencében, egyenletes hıeloszlás mellett végezhetı (17). 2a. Ügyeljen arra, hogy az Epitópkinyerı oldat hımérséklete teljes 40 percen át tartsa a 95 99 C-ot, majd hagyja további 20 percig hőlni 2b. Nézze át a Festési eljárás címő rész utasításait 2c. Ügyeljen arra, hogy a páciens szövetmintája ne legyen túlfixálva, és ne használjon helyettesítı fixálószert 2d. Szobahımérséklető levegın szárítsa a szövetmetszeteket legalább 12 órán át, illetve amíg meg nem száradnak. Alternatív módszerként a szárítás végezhetı 37 C-on egy éjszakán át, vagy 60 C-on, maximum egy órán át. A metszetek magasabb hımérsékleten történı szárítása csak kalibrált kemencében, egyenletes hıeloszlás mellett végezhetı (17). 2e. Ellenırizze az alkalmazott reagensmennyiséget (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 24/54

Emlırák Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 3. A lemezek háttérfestése túl erıs 3a. A paraffin nincs teljesen eltávolítva 3a. Használjon friss tisztítóoldatot, és járjon el a B.1 szakaszban foglaltak szerint 4. A szövet leválik a lemezrıl 5. Túlságosan erıs specifikus festés 3b. Keményítıtartalmú adalékot használtak a metszetek tárgylemezekre rögzítéséhez 3c. A lemezek nem alaposan lettek leöblítve 3d. A metszetek megszáradtak a festési eljárás alatt 3e. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak 3f. A reagensek nem specifikus kötése a szövethez 4a. Nem megfelelı lemez használata 5a. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak 5b. Nem megfelelı hıforrás használata epitópkinyeréshez, pl. gızölı, mikrohullámú sütı vagy autokláv 5c. A reagens inkubálási ideje túl hosszú 5d. Nem megfelelı mosóoldatot alkalmaztak 3b. A metszeteknek az üveg tárgylemezekhez való rögzítése során kerülje a keményítıtartalmú adalékok használatát. Sok adalék immunreaktív. 3c. Használjon friss oldatokat a pufferfürdıkben és mosópalackokban 3d. Használjon párakamrát. A reagens alkalmazása elıtt egyszerre csak három-négy lemezt kenjen be 3e. Ügyeljen arra, hogy a jóváhagyott fixálószert használja. Más fixálószer túl erıs háttérfestést okozhat 3f. Ellenırizze a minta fixálási módját és nekrózis jelenlétét 4a. Használjon szilanizált lemezeket, például S3003 kódszámú Dako Silanized Slides, SuperFrost Plus vagy poly-l-lysine bevonatú lemezeket 5a Ügyeljen arra, hogy csak jóváhagyott fixálószert és fixálási módot alkalmazzon 5b. Ügyeljen arra, hogy csak vízfürdıt használjon az epitóp kinyerésének lépésénél 5c. Nézze át a Festési eljárás címő rész utasításait 5d. Csak a készlethez ajánlott mosópuffert használja (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 25/54

Emlırák Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 6. Az 1+ kontrollminta sejtvonalának halvány festése 6a. Helytelen epitópkinyerı protokoll alkalmazása 6a. Merítse a lemezeket az elımelegített epitópkinyerı oldatba. Az epitópkinyerı oldat hımérsékletét emelje ismét 95 99 C-ra, és végezzen elıkezelést teljes 40 percen át 6b. reakció a szubsztrát kromogén oldattal (DAB) 6b. Ügyeljen arra, hogy a teljes 10 perces inkubálási idıt kitöltse. Ügyeljen arra, hogy csak egy csepp DAB kromogént adjon a 1 ml DAB pufferelt szubsztráthoz 7. Az epitópkinyerı oldat felmelegítéskor zavaros 8. Az epitópkinyerı oldat tárolás közben zavarossá válik (felmelegítés elıtt) 6c. A kontrollminta bomlása 7. Felmelegítéskor az oldat zavarossá válik 8. Az oldatot nem megfelelıen tárolták vagy túllépték az oldat lejárati idejét 6c. Ellenırizze a csomagoláson feltüntetett lejárati dátumot és a készlet tárolási körülményeit 7. Ez normális jelenség és nem befolyásolja a festést 8. Ellenırizze a csomagoláson feltüntetett lejárati dátumot és a készlet tárolási körülményeit. Dobja ki az epitópkinyerı oldatot. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako technikai szolgálatát. A festési technikákkal és a minta elıkészítésével kapcsolatos további tudnivalókat a Dako korábban hivatkozott kézikönyvében találja (19) (kapható a Dako-nál), Atlas of Immunohistology (30) and Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 26/54

Gyomorrák Összefoglaló és magyarázat gyomor Háttér A humán HER2 gén (más néven ERBB2 vagy NEU) kódolja a gyakran HER2 fehérjének vagy p185 HER2 -nek nevezett fehérjét. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozin-kináz, amely homológ az epidermális növekedésifaktor-receptorral (EGFR vagy HER1) (1 8). A HER2 fehérje normális komponens, amely többféle epiteliális sejttípusban is expresszálódik (8). A HER2 fehérje túlzott mértékő expresszióját és a HER2 gén amplifikációját gyomorrákban számos tanulmányban kimutatták. IHC vagy FISH módszerrel a páciensek körülbelül 20%-ában mutatható ki a HER2-pozitivitás (32). Preklinikai in vitro és in vivo tanulmányok során bebizonyították, hogy a trasztuzumab (Herceptin ) hatékony különbözı gyomorrák-modellekben, ami a klinikai tanulmányok elindításához vezetett (32 36). Egy III. fázisú BO18255 tanulmányban, a ToGA vizsgálatban, inoperábilis, lokálisan elırehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomoradenokarcinómában vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómában szenvedı HER2- pozitív betegeket randomizáltak, majd 5-FU vagy capecitabin és ciszplatin kezelésben részesítették ıket, vagy külön, vagy trasztuzumabbal kombinációban. Azon páciensek esetében, akik trasztuzumabból és kemoterápiából álló, kombinált kezelésben részesültek, az összesített túlélés (overall survival OS) statisztikailag szignifikáns növekedését figyelték meg (37, 38). A trasztuzumab humanizált monoklonális antitest, amely nagy affinitással kötıdik a HER2 fehérjéhez, és kimutatottan gátolja a HER2 fehérjét emelkedett mértékben expresszáló humán tumorsejtek proliferációját in vitro és in vivo (33 36). Jellemzık A ToGA vizsgálatba való besorozáshoz 3803 beteg HER2 státuszát mérték fel. Ebben a vizsgálatban kimutatták mind a HER2 fehérje túlzott expresszióját IHC módszerrel (HercepTest, Dako), mind a HER2 gén amplifikációját FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako) módszerrel. Értékelhetı vizsgálati eredményeket kaptak az IHC vagy a FISH vizsgálattal 3665 mintánál, 3280 mintánál pedig mindkét vizsgálattal. A ToGA vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy IHC vagy FISH vizsgálattal meghatározva, a ToGa HER2 kiválasztási kritériumai alapján az elırehaladott gyomorrákban szenvedı betegek 22,1%-a volt HER2-pozitív (38). Kérjük, hogy a HercepTest használatával kapcsolatos további információkat illetıen tájékozódjon a Herceptin terméktájékoztatójából olyan páciensek értékelésében, akiknél megfontolandó a trasztuzumabkezelés. Az eljárás elve gyomor A HercepTest a rutinszerően feldolgozott, paraffinba ágyazott minták teljes kétlépéses immuncitokémiai festési eljárásához szükséges reagenseket tartalmazza. A humán HER2 fehérjével szembeni primer, nyúl eredető antitestekkel végzett inkubálást követıen a készlet a dextrán technológiára alapuló, azonnal felhasználható megjelenítı-reagenst alkalmazza. A reagens közös dextrán polimer alapra kapcsolt másodlagos, kecske eredető, nyúlellenes immunglobulin-molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból áll, így kiküszöbölhetı a kapcsolt ellenanyag és a peroxidáz-konjugált ellenanyag egymást követı alkalmazása. A Megjelenítı reagens humán immunglobulinokkal és magzati borjú szérummal való keresztreakcióját szilárdfázisú abszorpcióval távolítjuk el. Az ezután hozzáadott kromogén enzimatikus átalakulása látható reakcióterméket eredményez az antigén helyén. A minta ezután kontrasztfesthetı és fedılemezzel ellátható. Az eredmények fénymikroszkóppal értelmezhetık. A festési menetek validálásához három darab, formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlırák-sejtvonalat tartalmazó, 0, 1+ és 3+ festési intenzitású kontrollmintát mellékelünk. E sejtvonalak festési intenzitása korrelál a receptorok sejtenkénti számával. A HercepTest, Kód: K5204, felhasználható kézi, illetve Autostainer berendezéssel végzett automatikus festésnél. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 27/54

Gyomorrák Reagensek gyomor Mellékelt anyagok Az alább felsorolt anyagok 35 teszt elvégzésére elegendı (35 minta a HER2 fehérje primer antitestével inkubálva, illetve 35 minta a megfelelı negatív kontroll reagenssel inkubálva). A tesztek számát a következı anyagokból szövetenként 3 csepp (100 µl) felhasználásával számítottuk: 1, 2, 3 és 4 jelő ampullák és szubsztrát kromogén oldat (DAB). A készlet legfeljebb 5 különálló festési menethez elegendı anyagot tartalmaz. Ampulla száma Mennyiség 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml Leírás Peroxidáz-blokkoló reagens: 3% hidrogén-peroxidban 15 mmol/l nátrium-azid (NaN 3 ). Nyúl anti-humán HER2 fehérje: Használatra kész, affinitás alapján tisztított antitest. Kiszerelés: 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2; stabilizáló fehérjét tartalmaz. Immunogén: A HER2 fehérje szintetikus C-terminálszakasza (intracitoplazmás rész) KLH-hoz (keyhole limpet hemocianin) kapcsolva. Specificitás: HER2 fehérje. Tisztításai módszer: Az antitest affinitás alapján tisztított immobilizált HER2 fehérje peptid felhasználásával. Megjelenítı reagens: Torma-peroxidázzal és affinitás alapján tisztított kecske eredető nyúlellenes immunoglobulinnal konjugált dextrán polimer. Tris/HCl pufferben, stabilizáló fehérjével és mikrobaölı szerrel kiszerelve. Negatív kontrollreagens: Normál nyúl szérum immunglobulin frakciója a HER2 fehérje antitestének megfelelı fehérjekoncentrációban. Kiszerelés: 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2; stabilizáló fehérjét tartalmaz. DAB puffer-szubsztrát: Szubsztrát pufferoldat, ph 7,5; <0,1% hidrogén-peroxidot, stabilizátort, stimulálót és mikrobaölı szert tartalmaz. DAB kromogén: 5%-os 3,3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid kromogén oldat. Epitópkinyerı oldat (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l-es citrátpuffer detergenssel. Mosó puffer (10x): Tris/HCl puffer tisztítószerrel és mikrobaölı szerrel. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 28/54

Gyomorrák 5 lemez Kontroll lemezek: Minden lemezen három formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszet a HER2 fehérje expressziójának eltérı szintjeit mutató emlıkarcinóma sejtvonalakkal: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) és SK-BR-3 (3+). A kontroll lemezek hıkezeltek, így a metszetek jobban tapadnak az üveghez. A metszetek jobb tapadását célzó további hıkezelés ronthatja a megfestıdést. MEGJEGYZÉS: Minden reagenst, epitópkinyerı oldatot és mosópuffert kifejezetten e teszt céljára készítettünk. A teszt megadott jellemzıinek elérése érdekében ne helyettesítse az anyagokat. Mosópuffernek azonban a Dako S3006 kódszámú terméke is használható. Szükséges, de nem mellékelt anyagok Nedvszívó törlık Ammónium-hidroxid, 15 mol/l 37 mmol/l-re hígítva Kontrasztfestés: Hematoxilin, például vízalapú Mayer's Hematoxylin, Dako, Kód: S3301 (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.4) Fedılemezek Határoló toll, például a Dako Pen, Kód: S2002 Desztillált vagy ionmentesített víz (mosóvíz) Szárító kemence, 60 C vagy alacsonyabb hımérséklet fenntartására alkalmas Etanol, abszolút és 95%-os Párakamra (opcionális) Fénymikroszkóp (4 40x optikai nagyítás) Rögzítıszer, például a Dako Faramount, Kód: S3025, vagy Glycergel, Kód: C0563 Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenırzéséhez (lásd a Minıség-ellenırzés címő részt) Tárgylemezek, SuperFrost Plus, poly-l-lysine bevonatú lemezek, vagy Dako Silanized Slides, Kód: S3003 (lásd A minta elıkészítése címő részt) Festıedények vagy fürdık Stopperóra (2 40 perces idıközök mérésére alkalmas) Mosópalackok Vízfürdı fedéllel (az Epitópkinyerı oldatot 95 99 C-on képes tartani) Xilén, toluén vagy xilént helyettesítı anyag Tárolás gyomor 2 8 C között tárolandó. A csomagoláson feltüntetett lejárati dátumon túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak a feltételeket ellenıriznie kell (14a, 14b). Felhívjuk a figyelmét arra, hogy a kontroll lemezeket is 2 8 C-on kell tárolni. A termék instabilitásának semmilyen nyilvánvaló jele nincs. Ezért a beteg mintáival párhuzamosan pozitív és negatív kontrollokat kell futtatni. Ha nem várt festés figyelhetı meg, mely a laboratóriumi eljárások módosulásával nem magyarázható, és a HercepTest termékkel kapcsolatba hozható probléma gyanúja merül fel, azonnal vegye fel a kapcsolatot a Dako mőszaki szolgálatával. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 29/54

Gyomorrák A minta elıkészítése gyomor A gyomor adenokarcinómájából vett mintákat, beleértve a gyomor-nyelıcsı átmenetbıl származó biopsziákat, kimetszett szöveteket és rezekátumokat is, megfelelıen kell kezelni annak érdekében, hogy a szövetet immuncitokémiai festés céljára megırizzük. A mintákon a szövetelıkészítés szabványos módszerét kell alkalmazni (15). Kis biopsziás minták vizsgálata esetében ügyeljen arra, hogy az intakt tumormorfológia megmaradjon, illetve, hogy elegendı tumorsejt legyen az IHC-értékeléshez. Ha a HercepTest analízist biopsziás mintán hajtja végre, a HER2 státusz megbízható meghatározása érdekében javasolt, hogy több (7 8) értékelhetı biopsziás minta álljon rendelkezésre a tumor különbözı régióiból. Paraffinba ágyazott metszetek Semleges, pufferelt formalinban tartósított és paraffinba ágyazott szövetek alkalmasak a használatra. A biopsziás mintákat például 3 4 mm-es blokkokra vágva, 18 24 órán keresztül fixálja semleges pufferelt formalinban. A biopsziás mintákat a ToGA vizsgálat során 6 8 órán át fixáltuk (a tanulmányra vonatkozóan lásd (37)). A szöveteket ezután dehidratálja alkoholokban és xilénben, majd olvasztott parafinnal 60 C-nál nem magasabb hımérsékleten infiltrálja. A megfelelıen fixált és beágyazott, HER2 fehérjét kifejezı szövetek hővös helyen korlátlan ideig tárolhatók a metszetkészítés és felhelyezés elıtt (15 25 C) (15, 16). Az Egyesült Államokban az klinikai laboratórium fejlesztésérıl szóló 1988-as törvény 42 CFR 493.1259(b) szakasza kimondja, hogy A megfestett lemezeket a vizsgálat napjától számított legalább tíz évig, a feldarabolt mintákat pedig a vizsgálat napjától számított legalább két évig a laboratóriumnak meg kell ıriznie (16). A szövetmintákat 4 5 µm vastagságúra kell metszeni és tárgylemezre helyezni, majd szobahımérséklető levegın legalább 12 órán át (vagy amíg megszárad), vagy 37 C fokon egy éjszakán át, vagy 60 C fokon egy órán át kell szár ítani. FIGYELMEZTETÉS: Egy óránál hosszabb ideig tartó, 60 C-os vagy annál magasabb hıhatás a speciális membránasszociált HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését vagy elvesztését okozhatja (17). Az antigenitás megırzése érdekében a tárgylemezre (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine vagy szilanizált tárgylemez) vitt szövetmetszeteket 4 6 héten belül kell megfesteni, ha szobahımérsékleten (20 25 C) tárolják ıket (18). A HER2 fehérje kiértékeléséhez és a tumorban jelenlétének ellenırzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Legalább 5 lemez az ajánlott, 1 lemez a tumor jelenlétének megállapításához, 2 lemez a HER2 fehérje értékeléséhez (1 lemez a 2. számú ampullával, 1 pedig a 4. számú ampullával történı inkubáláshoz), és 2 lemez biztonsági tartaléknak. A HercepTest kalciummentesített szöveteken való használatának validálása nem történt meg, így az nem ajánlott. A mintakészítéssel kapcsolatos további tudnivalókért tanulmányozza a Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) címő kiadványát, illetve a szakirodalom-jegyzékben 15. és 16. tétel alatt hivatkozott kiadványokat. A szövetek kezelése festés elıtt Az assay optimális mőködéséhez specifikus epitópkinyerı módszert, 10 mmol/l citrát pufferben forralást kell alkalmazni. Az Epitópkinyerı oldat a HercepTest készletben megtalálható. A módszerben a 10 mmol/l citrát pufferbe (20) merített lemezeken fixált metszeteket melegítjük olyan kalibrált vízfürdıbe merítve, amely képes fenntartani az Epitópkinyerı oldat szükséges hımérsékletét (95 99 C). A tengerszint felett magasa bban elhelyezkedı laboratóriumok maguk találják meg a legjobb módszert a vízfürdı szükséges hımérsékletének fenntartásához. Az epitóp kinyerését vízfürdıben kell végezni. Más melegítési módokat is teszteltek, de azok nem adtak reprodukálható eredményeket. Az epitóp kinyerése után azonnal megkezdjük a festési eljárást. A leírt eljárástól való eltérés befolyásolhatja az eredményeket. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 30/54

Gyomorrák Óvintézkedések gyomor 1. In vitro diagnosztikai alkalmazásra szolgál. 2. Csak foglalkozásszerő felhasználók részére! 3. Ampulla, Peroxidáz-blokkoló reagens, 3%-os hidrogén-peroxid oldatot tartalmaz. Szakembereknek kérésre anyagbiztonsági adatlapot adunk. 4. Ampulla, DAB kromogén, tartalma 5-<10% bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammónium-tetraklorid, felirata: H350 H341 P201 Veszély P280 P308 + P313 P405 P501 Rákot okozhat. Feltehetıen genetikai károsodást okoz. Használat elıtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. Védıkesztyő/védıruha/szemvédı/arcvédı használata kötelezı. Expozíció vagy annak gyanúja esetén: Orvosi ellátást kell kérni. Elzárva tárolandó. A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználó legyen alaposan tájékozott a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. 5. A 8. Wash Buffer (10x), tartalma 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride és 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxánt. Allergiás reakciót okozhat. A Wash Buffer (10x) a következı címkézéssel van ellátva: Figyelem H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Óvatos öblítés vízzel több percen keresztül. Adott esetben kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 6. A termék nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmaz, mely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, mely során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Megsemmisítéskor, megelızendı a fém-azidok vízvezetékekben történı lerakódását, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni (21, 22). 7. A 2., 3. és 4. ampulla állati eredető anyagot tartalmaz. Mint bármely biológiai eredető termék esetén, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 8. A kontroll lemezeket és mintákat fixálás elıtt és után, valamint minden velük érintkezı anyagot fertızésre alkalmasként kezeljen, és a megfelelı óvintézkedésekkel mentesítse (23). A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bırrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bı vízzel. 9. A nem specifikus festıdés elkerülése érdekében óvja a reagenseket a mikrobiális szennyezıdéstıl. 10. A megadottól eltérı inkubálási idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. Egy óránál hosszabb ideig tartó, 60 C-on vagy annál magasabb hımérsékleten (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 31/54

Gyomorrák történı szárítás a speciális membránasszociált HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését vagy elvesztését okozhatja (17). 11. A reagensek az optimális mértékben vannak hígítva. További hígítás az antigén gyengébb festıdését okozhatja. 12. Minden reagenst, epitópkinyerı oldatot és mosópuffert kifejezetten e teszt céljára készítettünk. A teszt megadott jellemzıinek elérése érdekében ne helyettesítse az anyagokat. Mosópuffernek azonban az S3006 kódszámú termék is használható. 13. A Megjelenítı reagens és a DAB kromogén károsodhat, ha túlzottan erıs fény éri. A rendszer komponenseinek tárolását és a festést ne végezze erıs fényben, például közvetlen napsütésben. 14. Viseljen megfelelı személyi védıeszközöket a bırrel és szemmel történı érintkezés elkerülése érdekében. További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. 15. A paraffinmaradványok hamis negatív eredményeket okozhatnak. 16. A gyomor adenokarcinómájából és a gyomor-nyelıcsı átmenet karcinómájából származó megfestett biopsziás minták HercepTest eredményeinek pontos értékeléséhez ajánlott, hogy egy, legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló csoportot vizsgáljon meg. A legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló csoport 5 HER2-re jellemzı festést mutató sejt kapcsolatát jelenti. 17. A gyomorrák biopsziás mintáinak heterogén volta miatt fontos, hogy a megbízható eredmény érdekében több (7 8), a tumor különbözı helyeirıl származó biopsziás darabon végezze el a HER2 IHC vizsgálatot. 18. Az ajánlottól eltérı reagensmennyiség használata esetén elıfordulhat, hogy a HER2 immunreaktivitás nem lesz látható. Ha a körülrajzolt szövetmetszetet nem fedi teljes mértékben a 3 csepp (100 µl) reagens, akkor 3 további cseppet kell hozzáadni. 19. Ajánlott egynél több gyomorrák reszekcióból származó szövetblokk vizsgálatának elvégzése, ha a vizsgálati minta nagy fokú heterogenitást mutat (41). (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 32/54

Gyomorrák HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor A. A reagens elıkészítése Érdemes a következı reagenseket a festés elıtt elkészíteni: A.1 Epitópkinyerı oldat Desztillált vagy ionmentesített vízzel 1:10 arányban hígítson a 7. ampulla tartalmából (Epitópkinyerı oldat 10x) a tervezett festési eljáráshoz elegendı mennyiséget. A fel nem használt hígított oldat 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.2 Mosópuffer A desztillált vagy ionmentesített vízzel 1:10 arányban hígítson a 8. ampulla tartalmából (Mosópuffer 10x) a mosáshoz szükséges mennyiséget. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A puffert öntse ki, ha kicsapódás látható benne. Desztillált vagy ionmentesített víz használható az öblítésre a peroxidáz-blokkoló reagenssel, szubsztrát kromogén oldattal és hematoxilinnel végzett inkubálás után. Minden más öblítési lépésben mosópuffert kell használni. A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB) Az alábbi eljárás 1 ml szubsztrát kromogén oldatot eredményez. Minden 1 ml aliquot tíz szövetmetszethez elegendı. 1 lépés: Vigyen át 1 ml DAB puffer-szubsztrátot az 5. ampullából egy vizsgálócsıbe. lépés: 2 lépés: Adjon hozzá egy csepp (25 30 µl) DAB kromogént a 6. ampullából. Keverje össze és pipettázza a szövetmetszetekre. Az elkészített szubsztrát kromogén oldat (DAB) 2 8 C-on tárolva körülbelül 5 napig stabil. Ezt az oldatot felhasználás elıtt alaposan keverje fel. Az oldatban esetleg létrejövı csapadék nem befolyásolja a festés minıségét. MEGJEGYZÉS: Az 6. ampullában lévı DAB kromogén színe átlátszótól világos levendulaszínig változhat. Ez nem befolyásolja a termék viselkedését. A hígítást a jelen tájékoztatóban foglaltak szerint végezze. Túl nagy mennyiségő DAB kromogén hozzáadása a DAB puffer-szubsztráthoz a pozitív jel romlását eredményezi. A.4 Kontrasztfestés A DAB festési reakció színes végterméke alkoholban és vízben oldhatatlan. Alkalmazzon hematoxilines kontrasztfestést, és a hematoxilin festési intenzitását állítsa be a Dako HercepTest értelmezési kézikönyv Gyomorrák címő dokumentumban bemutatott szinthez hasonlóan. Alkohol- vagy vízalapú hematoxilin, például az S3301 kódszámú Dako Mayer's Hematoxylin használható. A hematoxilines kontrasztfestés után végezzen alapos öblítést desztillált vagy ionmentesített vízzel, majd merítse a szöveteket 37 mmol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe (lásd a B.2 szakasz 6. lépését). A szalmiákszesz (37 mmol/l) 2,5 ml 15 mol/l-es (koncentrált) ammónium-hidroxid és 1 liter desztillált vagy ionmentesített víz keverésével készül. A fel nem használt 37 mmol/l-es szalmiákszesz szobahımérsékleten (20 25 C) szorosan lezárt palackban legfeljebb 12 hónapig tárolható. A.5 Rögzítıszer Nem vizes, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Azonban vízalapú rögzítı is elfogadható. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Kód: S3025, vagy Glycergel Mounting Medium, Kód: C0563 ajánlott vizes rögzítéshez. A felhasználás elıtt körülbelül 40 (± 5) C-ra melegítve folyósítsa meg a Glycergel -t. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 33/54

Gyomorrák B. Festési eljárás B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A felhasználó használat elıtt alaposan tanulmányozza ezeket az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel (lásd Óvintézkedések). Az immunfestés elıtt a reagenseket hozza szobahımérsékletre (20 25 C). Ugyanígy minden inkubálást szobahımérsékleten végezzen. Ne hagyja a metszeteket megszáradni a festési eljárás közben. A megszáradt szövetmetszeteken erısebb nem specifikus festıdés jelentkezhet. A huzatnak kitett lemezeket takarja le. Ha hosszabb ideig inkubál, helyezze a szöveteket párás környezetbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a primer antitest inkubálása után (3. lépés) a lemezek szobahımérsékleten (20 25 C) legfeljebb egy óráig a puffe rben tarthatók anélkül, hogy a festés eredményességét ez befolyásolná. Paraffinmentesítés és rehidratálás: Festés elıtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidratálni kell. Ügyeljen a paraffin teljes eltávolítására. A visszamaradó beágyazó anyag nagyobb nem specifikus megfestıdést eredményezhet. Ezt a lépést szobahımérsékleten (20 25 C) végezze. 1. Helyezze a lemezeket xilénfürdıbe, és inkubálja 5 (±1) percig. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket abszolút etanolba. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket 95%-os etanolba. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd legalább 30 másodpercre helyezze a lemezeket desztillált vagy ionmentesített vízbe. A B.2 szakasz 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg az epitóp kinyerését. A xilénes és alkoholos oldatokat 40 lemez után cserélni kell. Xilén helyett használható toluén vagy xilént helyettesítı anyag, például Histoclear. MEGJEGYZÉS: A készletben található reagensek és utasítások az optimális teljesítmény eléréséhez lettek összeállítva. A reagensek további hígítása, az inkubálási hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. A felhasználó laboratóriumában a szövetek feldolgozásának és a technikai eljárásoknak az eltérései érvényteleníthetik az assay eredményeit a betegek Herceptin terápiába való beválasztását illetıen. B.2 Festési protokoll Szobahımérsékleten, 20 25 C között. 1 lépés: Epitóp kinyerése Töltse meg a festıedényeket, pl. Coplin-csészéket hígított Epitópkinyerı oldattal (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.1 szakasz). Helyezze az Epitópkinyerı oldatot tartalmazó festıedényeket vízfürdıbe. Melegítse fel a vízfürdıt és az Epitópkinyerı oldatot 95 99 C-ra. Felmelegítéskor az epitópkinyerı oldat zavarossá válik. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le a csészéket. Merítse a szobahımérséklető, paraffinmentesített lemezeket a festıedényekben lévı elıre felmelegített Epitópkinyerı oldatba. MELEGÍTSE FEL A VÍZFÜRDİT ÉS AZ EPITÓPKINYERİ OLDATOT ISMÉT 95 99 C-RA. Inkubálja 40 (±1) percig 95 99 C-on. A lemezekkel együtt vegye ki a teljes edényt a vízfürdıbıl. Hagyja a lemezeket az epitópkinyerı oldatban 20 (±1) percig szobahımérsékleten hőlni. Öntse le az Epitópkinyerı oldatot, majd öblítse le a metszeteket a hígított mosópufferben (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.2 szakasz). (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 34/54

Az optimális eredmény elérése érdekében az epitóp kinyerése után és a festés megkezdése elıtt 5 20 percig áztassa a metszeteket a mosópufferben. Gyomorrák MEGJEGYZÉS: Az Epitópkinyerı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. 2. lépés: Peroxidáz-blokkoló reagens Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert. Pihementes törlıvel (például Kimwipe törlıvel vagy gézlappal) óvatosan törölje körbe a mintát a rajtamaradó folyadék eltávolítására és a reagensek elıírt területen tartására. Rajzolja körül a szövetmetszetet Dako tollal. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) peroxidáz-blokkoló reagenst. Inkubálja 5 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan desztillált vagy ionmentesített vízzel, vagy mosópufferrel (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. 3. lépés: Primer antitest vagy negatív kontroll reagens Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) Anti-HER2 fehérje vagy negatív kontroll reagenst. Inkubálja 30 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan mosópufferrel (ne öntse közvetlenül a szövetre), majd helyezze friss pufferfürdıbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a 3. lépés után a lemezek szobahımérsékleten (20 25 C) legfeljebb egy óráig a mosópufferben tar thatók anélkül, hogy a festés eredményességét ez befolyásolná. 4. lépés: Megjelenítı reagens Ütögetéssel távolítsa el a felesleges puffert és törölje le a lemezeket a fent leírt módon. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) Megjelenítı reagenst. Inkubálja 30 (±1) percig. Öblítse le a lemezeket az 3. lépésben leírtak szerint. 5. lépés: Szubsztrát kromogén oldat (DAB) Törölje le a lemezeket a fentiek szerint. A minta lefedéséhez használjon 3 csepp (100 µl) szubsztrát-kromogén oldatot (DAB). Inkubálja 10 (±1) percig. A palackból folyatva öblítse le óvatosan desztillált vagy ionmentesített vízzel (ne öntse közvetlenül a szövetre). A visszamaradó szubsztrát kromogén oldatot (DAB) a megfelelı hulladékkezelésig győjtse veszélyes anyagok számára kialakított tárolóba. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 35/54

6. lépés: Kontrasztfestés (az utasítások hematoxilinre vonatkoznak) Gyomorrák Merítse a lemezeket hematoxilin fürdıjébe. A használt hematoxilin erısségétıl függıen 2 5 percig inkubálja. Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében óvatosan öblítse le a lemezeket. Ügyeljen arra, hogy ne maradjon rajtuk hematoxilin. Opcionális: Mártsa a lemezeket 10-szer 37 mmol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe (lásd az A.4 szakaszt). Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében óvatosan öblítse a lemezeket 2 5 percig. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás hosszától és a felhasznált hematoxilin erısségétıl függıen a kontrasztfestés a sejtmagok halvány vagy sötétkék elszínezıdését eredményezi. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 7. lépés: Felhelyezés Nem vizes, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Azonban vízalapú rögzítıszer is elfogadható. A minták vizes rögzítıszerrel, pl. a S3025 kódszámú Dako Faramount, vagy a C0563 kódszámú Glycergel rögzíthetık és lefedhetık. MEGJEGYZÉS: A lemezek alkalmas idıben bármikor kiértékelhetık. Azonban némi fakulás következhet be, ha a vizes rögzítıszerrel lefedett lemezeket egy hétnél hosszabb ideig erıs fény éri. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahımérsékleten (20 25 C) tárolja. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 36/54

Gyomorrák Minıség-ellenırzés gyomor A szövetek fixálásának és a felhasználó laboratóriumában történı feldolgozásának és beágyazásának eltérései az eredmények jelentıs szórását okozhatják, ezért a Dako által biztosított ellenırzı minták mellett szükséges a rendszeres belsı ellenırzés. Az Egyesült Államokban további tudnivalókért lásd a College of American Pathologists (CAP) Immunhisztokémiai minısítı programjának minıség-ellenırzési követelményeit, a CLSI (korábban NCCLS) Immuncitokémiai Minıségbiztosítás Elfogadott Iirányelveit (24), valamint az irodalomjegyzék 25. számú munkáját. 8. táblázat. A napi minıség-ellenırzés célja. Szövet: A páciens mintájával azonos módon fixált és feldolgozott Specifikus antitest és szekunder antitest Nem specifikus antitest* vagy puffer és a specifikus antitesttel használttal azonos szekunder antitest Pozitív kontroll: A kimutatni kívánt célantigént tartalmazó szövet vagy sejtek (a páciens szövetében található). Az ideális kontroll a gyengén pozitívan festıdı szövet, mivel ez a legérzékenyebb az antitesttel, illetve az antigénlebomlással szemben Az elemzés minden lépését ellenırzi. Validálja a reagenseket és eljárásokat a HER2 fehérje festése során. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Negatív kontroll: Várhatóan negatív szövetek vagy sejtek (megtalálható lehet a páciens szövetmintájában vagy a pozitív kontroll mintában) Antitest sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni, nem kívánt keresztreaktivitásának kimutatása. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Páciens szövetmintája Specifikus festés kimutatása Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Dako által mellékelt kontroll lemez Csak a festési eljárást ellenırzi * A specifikus antitestével azonos fajtól származó szérum, de nem ugyanazon antigén ellen. A nem specifikus antitestkötés kimutatására, pl. az antitest Fc részének a szövethez való kötıdéséhez. Kontroll lemez (mellékelve): A mellékelt kontrollminták mindegyike a készlet reagálásának ellenırzésére három formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlırák-sejtvonalat tartalmaz, melyek festési értékei 0, 1+ és 3+. Festési eljárásonként egy lemezt fessen meg. A Dako által biztosított kontrollminták sejtvonalainak kiértékelése jelzi a festési menet érvényességét. Pozitív kontrollszövet: A kontroll legyen friss autopsziás/biopsziás/sebészeti minta, a páciens mintájával azonos módon fixálva, feldolgozva és beágyazva. A pozitív kontrollszövetek a megfelelıen elıkészített szövetekre és a helyes festési technikákra utalnak. Minden egyes festési menetben, minden egyes vizsgálati körülményhez mellékelni kell egy pozitív kontrollszövetet. A pozitív kontrollszövetek gyenge pozitív festést adjanak, hogy a primer antitest érzékenységének finom változásait is ki tudják mutatni. A készletben mellékelt kontrollminták vagy a páciens mintáitól eltérı módon feldolgozott minták csak a reagens mőködését igazolják, a szövet elıkészítésérıl nem adnak visszajelzést. Pozitív kontrollszövetként egy korábban HER2 fehérjét 2+ értékkel emelkedetten expresszáló gyomor-adenokarcinóma vagy a gyomor-nyelıcsı átmenetben lévı adenokarcinóma-szövet használata ideális. MEGJEGYZÉS: Az ismert pozitív kontrollszöveteket a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelıségének ellenırzésére használja, NE a páciensek mintáinak diagnosztizálásához. Ha a pozitív kontrollszövet nem mutat megfelelı pozitív festést, a páciens mintáinak eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 37/54

Gyomorrák Negatív kontrollszövet: A minden festési menetben a páciens mintáival azonos módon fixált, feldolgozott és beágyazott negatív (HER2 fehérjére ismerten negatív) kontrollszövettel ellenırizze a primer ellenanyag specificitását és a háttérfestést. Negatív kontrollszövetnek megfelel a vastagbél, a máj vagy a pajzsmirigy szövete. A legtöbb szövetmetszetben elıforduló több különféle sejttípus belsı negatív kontrollhelyeket kínál (ezt a felhasználónak ellenıriznie kell). Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintáinak eredményét érvénytelennek kell tekinteni, és a tesztet meg kell ismételni. Nem specifikus negatív kontrollreagens: A nem specifikus festés értékelésére és az antigén helyén a specifikus festés jobb értelmezéséhez a primer antitest helyett használja a mellékelt negatív kontrollreagenst a páciens mintáinak egy metszetén. A negatív kontrollreagens inkubálási idejének a primer antitestének kell megfelelnie. Assay ellenırzése: Az ellenanyag vagy festırendszer diagnosztikai eljárásban történı elsı felhasználása elıtt a felhasználónak ellenıriznie kell az ellenanyag specificitását. Ehhez tesztelni kell azt több, ismert pozitív és negatív szövetet jelzı, ismert immuncitokémiai tulajdonsággal rendelkezı mintán. Lásd a tájékoztató jelen szakaszában fentebb vázolt minıség-ellenırzési eljárásokat és a CAP Immunhisztokémiai Minısítı Programjának minıség-ellenırzési követelményeit, és/vagy a CLSI (korábban NCCLS) Immuncitokémiai Minıségbiztosítás Elfogadott Irányelveit (24). Ezeket a minıség-ellenırzési eljárásokat minden új antitest-tételnél, illetve az assay paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A HER2 fehérjére ismert, 0 3+ erısségő festıdést adó gyomor vagy gyomor-nyelıcsı átmenetben lévı adenokarcinómák, valamint negatív szövetek, pl. a vastagbél, a máj és a pajzsmirigy szövetei megfelelnek az assay ellenırzéséhez. A festés értelmezése gyomor A HER2 fehérje expressziójának meghatározásához kizárólag a membrán festési intenzitását és mintáját szabad értékelni a 9. táblázatban bemutatott skála alapján. A lemez értékelését patológus szakembernek kell végeznie fénymikroszkóp segítségével. Az immunhisztokémiai festés értelmezésére és értékelésére 10x-es nagyítású objektív a megfelelı. 5 40x-es nagyítású objektív hasznos az értékelés megerısítéséhez. A citoplazma festıdését nem specifikus festıdésnek kell tekinteni, és nem szabad belefoglalni a membrán festési intenzitásának értékelésébe (8). A 0, 1+, 2+ és 3+ erısségő festés megkülönböztetéséhez lásd a Dako HercepTest értelmezési kézikönyv Gyomorrák címő dokumentumban a festéserısségeket és mintázatokat szemléltetı képeket. Kizárólag a gyomorrákban és a gyomor-nyelıcsı átmenet rákjában szenvedı betegek mintáit értékelje. Ha ugyanabban a mintában megtalálható intesztinális metaplázia és gyomor adenokarcinóma is, akkor csak a gyomor-adenokarcinóma komponenst értékelje. A HercepTest módszerrel megfestett biopsziák értelmezéséhez legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló csoport javasolt. A legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló csoport 5 HER2-re jellemzı festést mutató sejt kapcsolatát jelenti. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 38/54

Gyomorrák 9. táblázat. A HER2 immunhisztokémiai festés értelmezése és értékelése Érték Sebészeti minta Festıdési minta Biopsziás minta Festıdési minta A HER2 túlzott expressziójának értékelése 0 reaktivitás, vagy membránhoz kötıdı reaktivitás figyelhetı meg a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ában. reaktivitás vagy membránhoz kötıdı reaktivitás egyetlen (vagy < 5 tagból álló csoport) tumorsejtben sem Negatív 1+ Halvány/alig észrevehetı, membránhoz kötıdı reaktivitás a tumorsejtek 10%- ában; a sejtek csak a membránjuk egy részén reaktívak A megfestett tumorsejtek százalékos arányától függetlenül halvány/alig észrevehetı, membránhoz kötıdı reaktivitás egy tumorsejtcsoportban ( 5 sejt) Negatív 2+ Gyenge közepes teljes, bazolaterális vagy laterális, membránhoz kötıdı reaktivitás a tumorsejtek 10%-ában 3+ Erıs teljes, bazolaterális vagy laterális, membránhoz kötıdı reaktivitás a tumorsejtek 10%-ában Irányelvek Hofmann és mtsai. szerint (40) A megfestett tumorsejtek százalékos arányától függetlenül gyengén-közepes mértékben teljes, bazolaterális vagy laterális, membránhoz kötıdı reaktivitás egy tumorsejtcsoportban ( 5 sejt) A megfestett tumorsejtek százalékos arányától függetlenül erısen teljes, bazolaterális vagy laterális, membránhoz kötıdı reaktivitás egy tumorsejtcsoportban ( 5 sejt) Bizonytalan Pozitív A HercepTest a HER2 fehérje emelkedett expressziójára nézve lehet negatív (0 és 1+ érték), bizonytalan (2+ érték), illetve pozitív (3+ érték). A HercepTest nem arra készült, hogy diagnosztikai információt adjon a beteg vagy az orvos számára, és ilyen célra nem is lett bevizsgálva. A lemezeket minden festési menetben a 10. táblázatban megadott sorrendben meg kell vizsgálni meghatározandó a festési menet érvényességét, és lehetıvé téve a szövetminta festési intenzitásának félkvantitatív kiértékelését. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 39/54

Gyomorrák 10. táblázat. A lemezek kiértékelésének sorrendje. Lemezek kiolvasási sorrendje Magyarázat 1. A három sejtvonalat tartalmazó kontroll lemez A sejtmembrán 3+ erısségő barna festıdése (győrőszerő) a SK-BR-3 jelő 3+ kontroll sejtvonalban, részleges barna győrő az MDA-175 jelő 1+ kontroll sejtvonalban, és a festıdés elmaradása az MDA-231 jelő 0 kontroll sejtvonalban érvényes assay-t jelez Pontonkénti vagy szaggatott membránfestıdés a pozitív 1+ MDA-175 sejtvonal kevés vagy közepes mennyiségő sejtjében. Ebben a sejtvonalban a citoplazma Golgirégiójának pontszerő festıdése is megfigyelhetı Az MDA-231 jelő 0 kontroll sejtvonalban (HER2 fehérje festésére negatív) megjelenı barna festıdés azt jelenti, hogy az assay-ben nem specifikus festıdés történt. Az assay eredményei érvénytelenek lehetnek túlfestıdés miatt 2. Pozitív kontrollszövet Barna membránfestıdést kell észlelni. A citoplazma és a negatív szövetek festıdése nem lehet erısebb mint 1+ 3. Negatív kontrollszövet A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének HIÁNYA megerısíti a készlet sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni keresztreaktivitásának hiányát. Ha specifikus membránfestés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. 4. Negatív kontroll használatával festett, betegbıl származó szövetminta Reagens 5. A primer antitest használatával festett, betegbıl származó szövetminta A specifikus membránfestıdés hiánya igazolja, hogy a primer antitest megjelöli a cél antigént A negatív kontrollreagenssel kezelt minta citoplazmájában végbemenı egyéb sárgás vagy barna festıdés, például kötıszövetben, leukocitában, eritrocitában vagy nekrotikus szövetben nem specifikus háttérfestésnek tekintendı, és az adatlap megjegyzések rovatában jelentendı A HER2 fehérje emelkedett expressziója barna győrőként észlelhetı a primer antitesttel kezelt tumorsejtek sejtmembránján 1. Kontroll lemez (mellékelve): A HercepTest assay-vel megfestett kontroll-lemezt kell elsıként értékelni, hogy meggyızıdhessen arról, hogy az összes reagens megfelelıen mőködik-e. A sejtmembránnál található barna (3,3 -diaminobenzidin, DAB) reakciótermék a pozitív reaktivitás jele. A sejtmembrán kerületi (győrőszerő) barna festıdése az SK-BR-3 jelő, 3+ kontroll sejtvonalban, részleges barna győrő az MDA-175 jelő, 1+ kontroll sejtvonalban, valamint a festıdés elmaradása az MDA-231 jelő, 0 kontroll sejtvonalban érvényes assay-t jelez Ha a kontroll sejtvonalak bármelyike esetében az ezen kritériumoktól való eltérés figyelhetı meg, a páciens mintáinak minden eredményét érvénytelennek kell tekinteni. 2. Pozitív kontrollszövet: Ezután a pozitív kontrollszövetet kell megvizsgálni. Ez a lemez ellenırzi, hogy a fixálás és az epitóp kinyerése sikeres-e. A festés értelmezéséhez használjon ép sejteket, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek gyakran nem specifikusan festıdnek (26). A festıdés a tumorszövetben a sejtmembrán barna elszínezıdéseként jelentkezik. A citoplazma és a negatív szövetek barna festıdése nem lehet erısebb, mint ami az 1+ festési intenzitásnak megfelel. 3. Negatív kontrollszövet: A pozitív kontrollszövet után meg kell vizsgálni a negatív kontrollszövetet ellenırizendı a cél antigén primer antitest általi megjelölésének specifikusságát. A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének hiánya megerısíti a készlet sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni keresztreaktivitásának hiányát. Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. Ezen felül a pozitív kontrollszövet negatív részei negatív kontrollszövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak ellenıriznie kell. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy gyenge reakció (0 1+ festési intenzitás) észlelhetı a legtöbb normál epithelialis szövetben. Alkalmazható negatív kontrollszövetek például: vastagbél, máj és pajzsmirigy. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 40/54

Gyomorrák A nem specifikus festıdés, amennyiben van, megjelenésében diffúz. A formalinban túlzottan fixált szövetekben a kötıszövet helyenkénti festıdése figyelhetı meg. 4 + 5. Páciens szövetmintája: A páciens mintáit utoljára vizsgálja meg a HercepTest segítségével. A pozitív festıdés intenzitását a negatív kontrollreagens nem specifikus háttérfestésének kontextusában értékelje. Mint minden immuncitokémiai teszt esetében, a negatív eredmény azt jelenti, hogy az antigén nem volt észlelhetı, nem pedig azt, hogy az antigén nincs jelen a vizsgált sejtekben vagy szövetben. A HercepTest immunreaktivitásával kapcsolatos tudnivalókat lásd az Összefoglalás és magyarázat és a Korlátozások és teljesítményjellemzık címő részekben. További ajánlások a HercepTest festésének értelmezéséhez A gyomor és a gyomor-nyelıcsı átmenet HER2 fehérjét igazoltan emelkedetten expresszáló adenokarcinómája 0 3+ értéket kapott. Míg a 0 és a 3+ értékő esetek egyértelmőek, a fennmaradó 1+ és 2+ értékő minták egy részének értelmezése nehezebb lehet. A HercepTest festésének értelmezésekor kövesse az alábbi útmutatásokat. Értékelje ki a kontroll sejtvonalakat az assay mőködésének validálására. Értékelje ki a pozitív és negatív kontroll lemezeket. Az elsı értékeléskor ajánlott a szövetminta hematoxilines és eozines festése (H&E). (A tumor esetleg nem szembetőnı a HercepTest -tel festett mintán. A H&E módszerrel festett lemezre szüksége van a patológusnak a tumor jelenlétének igazolásához.) A HercepTest -tet a minta azonos paraffinkockájából származó párosított metszeten (metszetsorozaton) végezze el. A HER2 fehérje emelkedett expressziójának vizsgálatára megfestett metszeteket elıször kis nagyításon értékelje. A pozitív esetek túlnyomó többsége kis nagyításon egyértelmően megállapítható. Az 1+ értékő esetekben a membránhoz kötıdı festıdés megerısítéséhez alkalmazzon 40x-es nagyítást. A 2+ értékő esetekben a membránhoz kötıdı festıdés megerısítéséhez alkalmazzon 10 20x-os nagyítást. Sebészeti minták A minta jól tartósított és megfestett területeit használja a pozitív tumorsejtek százalékának meghatározásához. Ha a tumorsejtek többsége teljes, bazolaterális vagy laterális membránfestıdést mutat, akkor a festıdés erıssége 2+ vagy 3+. Ha a sebészeti mintákban a tumorsejtek 10 vagy nagyobb százalékában erıs intenzitású teljes, bazolaterális vagy laterális membránfestıdés tapasztalható, akkor a minta értéke 3+. Ha a sebészeti mintákban a tumorsejtek 10 vagy nagyobb százalékában gyenge közepes intenzitású teljes, bazolaterális vagy laterális membránfestıdés tapasztalható, akkor a minta értéke 2+. Ha a sebészeti mintákban a tumorsejtek 10 vagy nagyobb százalékában csak részben festıdik meg a membrán halvány/alig észrevehetı intenzitással, akkor a minta értéke 1+. Ha a sebészeti mintákban a tumorsejtek kevesebb mint 10%-a mutat festıdést, a festıdési mintázattól függetlenül (pl. teljes, bazolaterális vagy laterális, illetve a membrán egy részére kiterjedı festıdést), akkor az érték 0. Ha nem figyelhetı meg semmilyen festıdés, akkor a sebészi minta értéke 0. Biopsziás minták A legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló csoport 5 HER2-re jellemzı festést mutató sejt kapcsolatát jelenti. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 41/54

Gyomorrák Ha egy, legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló tumorsejtcsoportban erıs teljes, bazolaterális vagy laterális membránfestıdés figyelhetı meg, a biopsziás minta értéke 3+, a megfestett tumorsejtek százalékos arányától függetlenül. Ha egy, legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló tumorsejtcsoportban gyenge közepes teljes, bazolaterális vagy laterális membránfestıdés figyelhetı meg, a biopsziás minta értéke 2+, a megfestett tumorsejtek százalékos arányától függetlenül. Ha egy, legalább 5 megfestett tumorsejtbıl álló tumorsejtcsoportban halvány/alig észrevehetı membránfestıdés figyelhetı meg, és a sejtek membránjának csak egy része festıdött, a biopsziás minta értéke 1+, a megfestett tumorsejtek százalékos arányától függetlenül. Ha nincs festıdés, illetve ha membránfestıdés figyelhetı meg kevesebb mint 5 tumorsejtben, a biopsziás minta értéke 0. Korlátozások gyomor Általános korlátozások 1. Az immunocitokémia egy többlépcsıs diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelı reagensek és a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint az immuncitokémiai lemez elıkészítése és a festési eredmények értelmezése területén. 2. A szövetfestés sikere a szöveteknek a festést megelızı kezelésétıl és feldolgozásától függ. A helytelen fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezıdés hamis eredményt, az antitest befogódását vagy hamis negatív eredményt adhat. Az inkonzisztens eredményeket okozhatják a fixálási és beágyazási módszer eltérései vagy a szövetelıkészítés inherens szabálytalanságai. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 4. A pozitív festés vagy annak hiányának klinikai értelmezését a klinikai megjelenés, morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok kontextusában kell végezni. A festés vagy annak hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatoknak és megfelelı kontrolloknak, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatoknak kell kiegészíteniük. A festett preparátum értelmezése olyan képesített patológus feladata, aki ismeri az antitesteket, reagenseket és az alkalmazott módszereket. A festést tanúsítvánnyal ellátott laboratóriumban kell végezni, olyan patológus felügyelete alatt, aki a festett lemezeket megtekinti, és biztosítja a pozitív és negatív kontrollok megfelelıségét. 5. A hepatitisz B vírussal fertızött személyektıl származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidázra nem specifikus festıdést mutathatnak (27). 6. A reagensek váratlan reakciót adhatnak az elızıleg nem tesztelt szövettípusokon. Az antigén neoplazmában és más patológiás szövetekben való expressziójának biológiai változékonysága következtében a váratlan reakciókat még a tesztelt szövetekben sem lehet teljesen kizárni (28). A dokumentált váratlan reakcióval kapcsolatban forduljon a Dako mőszaki szolgálatához. 7. Hamis pozitív eredmény lehet látható a fehérjék nem immunológiai kötése vagy a szubsztrát reakciótermékei miatt. Ezt okozhatja még pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm C) (28). 8. A festési eljárást szobahımérsékleten (20 25 C-on) végezze. Termékspecifikus korlátozások 1. Az MDA-175 jelő 1+ kontroll sejtvonalban jelen lévı antigén idıvel lebomlik. A kontroll lemez által adott eredményeket a kontroll lemez felhasználhatósági idejéhez viszonyítva értékelje. Az MDA-175 sejtek negatív festıdése jelentheti mindössze azt, hogy a kontroll lemez már nem használható. A kontroll lemezeket 2 8 C-on kel l tárolni. 2. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A mintákat a lemezen rögzítéstıl számított 4 6 héten belül meg kell festeni, ha szobahımérsékleten (20 25 C) tárolják ıket (29). (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 42/54

Gyomorrák 3. Az optimális és megismételhetı eredmények eléréséhez a HER2 fehérje olyan hıindukált epitópkinyerést igényel, amelyben a szövetek fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása rutinszerően zajlik. Ezt az elıkezelést a teljes festési eljárást megelızıen kell elvégezni. Lásd a Minta elıkészítése részben a A szövetek kezelése festés elıtt szakasz utasításait. 4. A HER2 fehérje hıindukált epitópkinyerését csak kalibrált vízfürdıvel végezze. Más melegítési módokat is teszteltek, de azok nem adtak reprodukálható eredményeket. 5. Ne helyettesítse a készlet reagenseit más sorozatszámú reagensekkel vagy más gyártótól származó reagensekkel. Az egyetlen kivétel a mosópuffer, amely az S3006 kódszámú Dako Wash Buffer termékkel helyettesíthetı. 6. A citoplazma festıdésének értékelése hamis eredményeket adhat. Az eredmények értékelésekor csak a sejtmembrán festési intenzitását tekintse. 7. A megfestett kontroll lemezeket csak a festési menet validálására használja, ne pontozza vele a szövetmetszetek festési reakcióját. 8. Idınként erıs helyi festıdés (3+), azaz forró pontok láthatók. Ez az egyenetlen fixálás és/vagy szövetfeldolgozás eredménye lehet. Ajánlott ugyanabból a mintából egy második szövetkocka immunfestése. 9. A HercepTest használatát nem semleges pufferelt formalinban fixált minták esetében nem validálták. 10. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy a normál mandula és a nyelıcsövi epitélium akár 2+ erısséggel is festıdhet. 11. Nem szabad szétesett gyomorkarcinóma-mintákat használni, és a biopsziás minta szélein arteficiális festıdést mutató mintákat elemezni. Teljesítményjellemzık gyomor Háttér A trasztuzumab (Herceptin ) biztonságosságát és hatékonyságát egy klinikai vizsgálatban (a ToGA vizsgálatban) bebizonyították (38, 39). A vizsgálat nyitott, randomizált, multicentrikus, III. fázisú vizsgálat inoperábilis, lokálisan elırehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomor- vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómában szenvedı HER2-pozitív betegek részére. A ToGA vizsgálatban a HER2-pozitivitást úgy definiálták, hogy vagy IHC-pozitív (3+) (HercepTest, Dako) és/vagy HER2 FISH módszerrel pozitív (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). A vizsgálatba történı bevonás után a pácienseket random módon csoportokba osztották, amelyek kemoterápiás (5-FU vagy capecitabin és ciszplatin) vagy kemoterápiát és trasztuzumabot magában foglaló, kombinált kezelésben részesültek. A vizsgálat elsıdleges végpontja az összesített túlélés (overall survival OS) volt. A vizsgálatban összesen 594 beteget randomizáltak, 584 beteg kapta meg a vizsgálati gyógyszert, és lett a teljes analízis halmazba (FAS) sorolva. Az elsıdleges végpont tekintetében a kemoterápiát és trasztuzumabot magában foglaló kombinált kezelés statisztikailag elınyösebbnek bizonyult, mint az önmagában alkalmazott kemoterápia.. Az OS mediánja 11,1 hónapról 13,8 hónapra emelkedett (p=0,0046) 0,74-es kockázati aránnyal (95%-os CI: 0,60 0,91). Az OS Kaplan-Meier görbéi az 1. ábrán láthatók. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 43/54

Gyomorrák A túlélés valószínősége 1,0 0,9 0,8 0,7 Logaritmikus rangsorolási teszt P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Idı (hónap) Megmaradt Sz. Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Kezelési csoport Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp 1. ábra. Az OS Kaplan-Meier görbéje (n=584). A HER2-státusz tekintetében az elıre meghatározott feltáró alcsoport-elemzéseket akkor végezték el, amikor az adatok rendelkezésre álltak. Post hoc két új HER2 alcsoportot határoztak meg az IHC pontozás alapján: 1. csoport ( alacsony HER2- expressziójú csoport ): 2. csoport ( magas HER2- expressziójú csoport ): IHC 0/FISH+ és IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ és IHC 3+ (FISH+ vagy FISH- vagy FISH nincs eredmény (n = 446) Amikor az OS primer analízisét post hoc megismételték, a magas HER2-expressziójú csoport (n = 446) esetében a kombinált kezelés jótékony hatása még nagyobb volt. A kemoterápia és trasztuzumab kombinált kezelésben részesülı betegek csoportjának medián OS-értéke 16,0 hónapra emelkedett, szemben a csak kemoterápiában részesülı betegek 11,8 hónapos értékével. Ezen analízis kockázati aránya 0,65-re csökkent (95%-os CI: 0,51 0,83). A magas HER2-expressziójú csoport OS-ének Kaplan-Meier görbéi a 2. ábrán láthatók. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 44/54

Gyomorrák A túlélés valószínősége 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Idı (hónap) Megmaradt Sz. Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Grupo de tratamiento Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp 2. ábra. A magas HER2-expressziójú csoport (n=446) OS-ének Kaplan-Meier görbéje. A ToGA vizsgálat kimutatta, hogy az IHC és a FISH tesztelés együttes alkalmazása prediktív értékő a kombinált, kemoterápiát és trasztuzumabot tartalmazó kezelés hatásának a meghatározásakor, a feltáró post hoc elemzések azonban arra utalnak, hogy a magasabb HER2 fehérje expresszióval (IHC2+/FISH+ és IHC3+) rendelkezı betegek elınye nagyobb. Ez azzal magyarázható, hogy a fehérje a trasztuzumab célpontja. Kérjük, a ToGA vizsgálattal kapcsolatos további információkat illetıen olvassa el a Herceptin terméktájékoztatóját. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 45/54

Gyomorrák Megismételhetıség Meneten belüli megismételhetıség: A meneten belüli megismételhetıséget egy laboratórium 11 különbözı IHC festési intenzitású mintán tesztelte. Minden mintát háromszor vizsgáltak meg. Ezt a protokollt a kézi festés során alkalmazták. Minden minta 100%-osan megismételhetı eredményt adott. A meneten belüli megismételhetıséget egy laboratórium 3 különbözı IHC festési intenzitású mintán tesztelte. Minden mintát háromszor vizsgáltak meg. Ezt a protokollt automatizált festés mellett alkalmaztuk. Minden minta 100%-osan megismételhetı eredményt adott. Menetek közötti és laboratóriumok közötti megismételhetıség: HercepTest elemzést végeztek 60 különbözı, gyomorrákból, ill. a gyomor-nyelıcsı átmenet rákjának területérıl származó mintán, sebészi rezekátumokon és biopsziákon öt nem egymást követı napon, három tanulmányi helyszínen. A tanulmányban szereplı 60 minta egyenlı eloszlást mutatott a HER2-státusz három kategóriájának szempontjából. Hat patológus összesen 2040 HER2-értékelést végzett el. A naponta értékelt véleményegyezések (negatív, bizonytalan, pozitív) aránya 83,1% és 98,3% közé esett. A lehetséges 60 összehasonlítás közül 47 esetben a véleményegyezés aránya 90,0%-os vagy annál magasabb volt. Az 11. táblázatban láthatók a naponta értékelt összehasonlítások jellemzı példái, ahol a véleményegyezés átlagos aránya a három helyszín között 91,2%, 92,5% és 92,5% volt. A különbözı helyszínek esetében a véleményegyezés aránya 82,7%, 75,0% és 88,0% volt, a helyszíneket páronként összehasonlítva (lásd 12. táblázat). A Fisher-féle teszt (khi-négyzet próba) alapján az egyes helyszínek eredményei nem különböztek egymástól. A vizsgálatot végzı patológusok közötti véleményegyezés a három tanulmányi helyszínen 88,0%, 83,6% és 81,0% volt (13. táblázat). Következésképpen a gyomorrákból vett minták három helyszínen végzett HercepTest elemzése jó egyezést mutatott a napok és a helyszínek vonatkozásában, ill. a vizsgálatot végzı személyek között. 11. táblázat. Naponta értékelt összesített százalékos véleményegyezés 60 összehasonlításból 12 esetben Vizsgálatot végzı személy (1. sz.) Vizsgálatot végzı személy (2. sz.) Átlag Véleményegyezés CI95 LL 1 Véleményegyezés CI95 LL 1 Véleményegyezés 1. sz. 1. nap, összehasonlítva a 2. nappal 85,0 74,4 93,3 84,9 helyszín 3. nap, összehasonlítva a 4. nappal 93,3 84,9 93,3 84,9 2. sz. 1. nap, összehasonlítva a 2. nappal 95,0 87,3 83,1 72,0 helyszín 3. nap, összehasonlítva a 4. nappal 96,7 89,7 95,0 87,3 3. sz. 1. nap, összehasonlítva a 2. nappal 90,0 80,5 91,7 82,7 helyszín 3. nap, összehasonlítva a 4. nappal 96,7 89,7 91,7 82,7 91,2 92,5 92,5 1 CI95 LL: a 95%-os konfidencia-intervallum alsó határa. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 46/54

Gyomorrák 12. táblázat. A helyszínek közötti összesített százalékos véleményegyezés Véleményegyezés CI95 LL 1 Átlagos véleményegyezési arány 1. sz. helyszín, összehasonlítv a a 2. sz. helyszínnel 1. sz. helyszín, összehasonlítv a a 3. sz. helyszínnel 2. sz. helyszín, összehasonlítv a a 3. sz. helyszínnel 1. nap, összehasonlítva a 1. nappal 83,3 72,4 2. nap, összehasonlítva a 2. nappal 85,0 74,4 3. nap, összehasonlítva a 3. nappal 85,0 74,4 4. nap, összehasonlítva a 4. nappal 81,7 70,5 5. nap, összehasonlítva a 5. nappal 78,3 66,7 1. nap, összehasonlítva a 1. nappal 80,0 68,6 2. nap, összehasonlítva a 2. nappal 73,3 61,2 3. nap, összehasonlítva a 3. nappal 78,3 66,7 4. nap, összehasonlítva a 4. nappal 68,3 55,9 5. nap, összehasonlítva a 5. nappal 75,0 63,0 1. nap, összehasonlítva a 1. nappal 88,3 78,5 2. nap, összehasonlítva a 2. nappal 86,7 76,4 3. nap, összehasonlítva a 3. nappal 90,0 80,5 4. nap, összehasonlítva a 4. nappal 86,7 76,4 5. nap, összehasonlítva a 5. nappal 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 1 CI95 LL: a 95%-os konfidencia-intervallum alsó határa. 13. táblázat. A vizsgálatot végzı személyek közötti százalékos véleményegyezés Véleményegyezés CI 95 LL 1 Átlagos véleményegyezési arány 1. sz. helyszín 2. sz. helyszín 3. sz. helyszín 1. nap 91,7 82,7 2. nap 91,7 82,7 3. nap 93,3 84,9 4. nap 83,3 72,4 5. nap 80,0 68,6 1. nap 86,4 76,0 2. nap 83,3 72,4 3. nap 83,3 72,4 4. nap 83,3 72,4 5. nap 81,7 70,5 1. nap 80,0 68,6 2. nap 78,3 66,7 3. nap 80,0 68,6 4. nap 78,3 66,7 5. nap 90,0 80,5 88,0 83,6 81,0 1 CI95 LL: a 95%-os konfidencia-intervallum alsó határa. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 47/54

Gyomorrák Immunreaktivitás A 14. táblázat összefoglalja a HercepTest immunreaktivitását a normál szövetek ajánlott panelével. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott és a tájékoztatóban leírt módon HercepTest -tel festett. 14. táblázat. A HercepTest normál szövetekre mutatott reaktivitásának összefoglalása. Szövettípus (Vizsgált mennyiség) Mellékvese (3) Csontvelı (3) Agy/Kisagy (3) Agy/Kisagy (3) Emlı (3) Méhnyak (3) Vastagbél (3) Nyelıcsı (3) Szív (3) Vese (3) Máj (3) Tüdı (3) Mesothelialis sejtek (3) Petefészek (3) Hasnyálmirigy (3) Mellékpajzsmirigy (3) Perifériás ideg (3) Agyalapi mirigy (3) Prosztata (3) Nyálmirigy (3) Vázizom (3) Bır (3) Vékonybél (3) Lép (3) Gyomor (3) Here (3) Csecsemımirigy (3) Pajzsmirigy (3) Mandula (3) Méh (3) Pozitív szövetelem-festıdés és festıdési minta Emlımirigy (1/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás) Vese velıállomány tubulusai (3/3 szövet, 1 2+ festıdési intenzitás, a sejtek 5 50%-a mutatja, citoplazmatikus) Prosztatamirigy/ductusok (3/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 50%-a mutatja, citoplazmatikus) Verejtékmirigyek (1/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 30%-a mutatja, citoplazmatikus) Hengerhám, felszín (1/3 szövet, 2+ festıdési intenzitás, a sejtek 25%- a mutatja) Epithelium (1/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 25%-a mutatja) Laphám (3/3 szövet, 1+ festıdési intenzitás, a sejtek 80%-a mutatja) A jelentett festıdés minden szövet esetében membránban történt, hacsak másképp nem jelezzük. Mindhárom minta minden szövettípusnál ugyanolyan festési intenzitást mutatott, hacsak másképp nem jelezzük. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 48/54

Gyomorrák Hibaelhárítás gyomor A teendıkért lapozza fel a Dako korábban hivatkozott kézikönyvének Hibakeresés címő részét (19), vagy hívja a Dako mőszaki szolgálatát, ha szokatlan festıdést kíván jelenteni. Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 1. A lemezek nem festıdnek 1a. A reagenseket nem a megfelelı sorrendben alkalmazta. 1a. Ellenırizze a reagensek használatát 2. A lemezek festése halvány 1b. Nátrium-azid van a mosóoldatban 1c. A felvitt metszeteket ért túlzott hıhatás a deparaffinálást megelızıen, és a hı indukálta antigén feltárás a látható HER2 immunreaktivitás elvesztéséhez vezethet. 2a. Az epitóp kinyerése nem megfelelı 2b. A reagens inkubálási ideje nem megfelelı 2c. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak 2d. A felvitt metszetek ért túlzott hıhatás a deparaffinálást megelızıen, és a hı indukálta antigén feltárás a látható HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését okozhatja. 2e. Az alkalmazott reagensmennyiség nem elegendı 1b. Használjon a készletben mellékelt mosópufferbıl frisset 1c. Szobahımérséklető levegın szárítsa a szövetmetszeteket legalább 12 órán át, illetve amíg meg nem száradnak. Alternatív módszerként a szárítás végezhetı 37 C-on egy éjszakán át, vagy 60 C-on, maximum egy órán át. A metszetek magasabb hımérsékleten történı szárítása csak kalibrált kemencében, egyenletes hıeloszlás mellett végezhetı (17). 2a. Ügyeljen arra, hogy az Epitópkinyerı oldat hımérséklete teljes 40 percen át tartsa a 95 99 C-ot, majd hagyja további 20 percig hőlni 2b. Nézze át a Festési eljárás címő rész utasításait 2c. Ügyeljen arra, hogy a páciens szövetmintája ne legyen túlfixálva, és ne használjon helyettesítı fixálószert 2d. Szobahımérséklető levegın szárítsa a szövetmetszeteket legalább 12 órán át, illetve amíg meg nem száradnak. Alternatív módszerként a szárítás végezhetı 37 C-on egy éjszakán át, vagy 60 C-on, maximum egy órán át. A metszetek magasabb hımérsékleten történı szárítása csak kalibrált kemencében, egyenletes hıeloszlás mellett végezhetı (17). 2e. Ellenırizze az alkalmazott reagensmennyiséget (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 49/54

Gyomorrák Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 3. A lemezek háttérfestése túl erıs 3a. A paraffin nincs teljesen eltávolítva 3a. Használjon friss tisztítóoldatot, és járjon el a B.1 szakaszban foglaltak szerint 4. A szövet leválik a lemezrıl 5. Túlságosan erıs specifikus festés 3b. Keményítıtartalmú adalékot használtak a metszetek tárgylemezekre rögzítéséhez 3c. A lemezek nem alaposan lettek leöblítve 3d. A metszetek megszáradtak a festési eljárás alatt 3e. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak 3f. A reagensek nem specifikus kötése a szövethez 4a. Nem megfelelı lemez használata 5a. Nem megfelelı fixálási módot alkalmaztak 5b. Nem megfelelı hıforrás használata epitópkinyeréshez, pl. gızölı, mikrohullámú sütı vagy autokláv 5c. A reagens inkubálási ideje túl hosszú 5d. Nem megfelelı mosóoldatot alkalmaztak 3b. A metszeteknek az üveg tárgylemezekhez való rögzítése során kerülje a keményítıtartalmú adalékok használatát. Sok adalék immunreaktív. 3c. Használjon friss oldatokat a pufferfürdıkben és mosópalackokban 3d. Használjon párakamrát. A reagens alkalmazása elıtt egyszerre csak három-négy lemezt kenjen be 3e. Ügyeljen arra, hogy a jóváhagyott fixálószert használja. Más fixálószer túl erıs háttérfestést okozhat 3f. Ellenırizze a minta fixálási módját és nekrózis jelenlétét 4a. Használjon szilanizált lemezeket, például S3003 kódszámú Dako Silanized Slides, SuperFrost Plus vagy poly-l-lysine bevonatú lemezeket 5a Ügyeljen arra, hogy csak jóváhagyott fixálószert és fixálási módot alkalmazzon 5b. Ügyeljen arra, hogy csak vízfürdıt használjon az epitóp kinyerésének lépésénél 5c. Nézze át a Festési eljárás címő rész utasításait 5d. Csak a készlethez ajánlott mosópuffert használja (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 50/54

Gyomorrák Probléma Valószínő ok Javasolt teendı 6. Az 1+ kontrollminta sejtvonalának halvány festése 6a. Helytelen epitópkinyerı protokoll alkalmazása 6a. Merítse a lemezeket az elımelegített epitópkinyerı oldatba. Az epitópkinyerı oldat hımérsékletét emelje ismét 95 99 C-ra, és végezzen elıkezelést teljes 40 percen át 7. Az epitópkinyerı oldat felmelegítéskor zavaros 8. Az epitópkinyerı oldat tárolás közben zavarossá válik (felmelegítés elıtt) 6b. reakció a szubsztrát kromogén oldattal (DAB) 6c. A kontrollminta bomlása 7. Felmelegítéskor az oldat zavarossá válik 8. Az oldatot nem megfelelıen tárolták vagy túllépték az oldat lejárati idejét 6b. Ügyeljen arra, hogy a teljes 10 perces inkubálási idıt kitöltse. Ügyeljen arra, hogy csak egy csepp DAB kromogént adjon a 1 ml DAB pufferelt szubsztráthoz 6c. Ellenırizze a csomagoláson feltüntetett lejárati dátumot és a készlet tárolási körülményeit 7. Ez normális jelenség és nem befolyásolja a festést 8. Ellenırizze a csomagoláson feltüntetett lejárati dátumot és a készlet tárolási körülményeit. Dobja ki az epitópkinyerı oldatot. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma a fenti okok egyikének sem tulajdonítható, vagy ha az ajánlott korrekciós lépés nem oldja meg a problémát, további segítségért hívja a Dako technikai szolgálatát. A festési technikákkal és a minta elıkészítésével kapcsolatos további tudnivalókat a Dako korábban hivatkozott kézikönyvében találja (19) (kapható a Dako-nál), Atlas of Immunohistology (30) and Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 51/54

Irodalomjegyzék 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230:1132-9. 2. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229:974-6. 3. Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:6497-501. 4. Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319:230-4. 5. Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229:976-8. 6. Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319:226-30. 7. Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45:457-61. 8. Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5:953-62. 9. Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2:992-1003. 10. Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an antip185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:4285-9. 11. Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9:1165-72. 12. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37:255-63. 13. Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58:2825-31. 14. a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, 1992. 15. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; 1980. 16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; 1981. 17. Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6,119-22. 18. DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2009. 20. Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4:201-7. 21. Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides, Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, 1976. 22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, 1976. 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005. 24. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 52/54

25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92:836-43. 26. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14:767-71. 27. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73:626-32. 28. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194-9. 29. Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54:2771-7. 30. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986:16-27. 31. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986. 32. Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press). 33. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: 273-278. 34. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: 681-685. 35. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: 795-805. 36. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: 89-95. 37. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet 2010 38. Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52:797-805. 41. Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012;43:11:2070-2079. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 53/54

Jelmagyarázat Katalógus szám Hımérsékleti korlátozások Tétel kód GHS piktogram (lásd az óvintézkedések címő részt) In vitro diagnosztizáló orvosi készülék Törékeny, óvatosan kezelendı Felhasználó GHS piktogram (lásd az óvintézkedések címő részt) Lásd a használati utasítást n számú vizsgálat elvégzéséhez elegendı Gyártó Gyártja: Az Egyesült Államokban forgalmazza: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánia Tel.: +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 Dako North America, Inc. 6392 Via Real Carpinteria, California 93013, USA Tel.: 805/566-6655, Díjmentesen hívható: 800/235-5743 Rendelési információ: Tel.: 800/235-5763 Fax 805/566-6688 Mőszaki szolgálat: Tel.: 800/424-0021 A HercepTest és a Herceptin a Genentech, Inc. védjegye, amelyekre a Dako Denmark A/S és az F. Hoffmann-La Roche Ltd. licencei érvényesek. (127546-001) P04085HU_01_K520421-2/2015.05 old. 54/54