!HU000004295T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 295 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 761516 (22) A bejelentés napja: 2003. 06. 26. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030761516 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1565547 A1 2004. 01. 08. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1565547 B1 2008. 07. 30. (51) Int. Cl.: C12N 1/20 (2006.01) A23L 1/03 (2006.01) C12R 1/25 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01) A23C 9/12 (2006.01) C12Q 1/24 (2006.01) C12R 1/225 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 04003235 PCT/EP 03/006752 (30) Elsõbbségi adatok: PCT/EP02/07169 2002. 06. 28. WO (72) Feltalálók: XAUS PEY, Jordi, E-18006 Granada (ES); MARTIN JIMENEZ, Rocio, E-18005 Granada (ES); RODRIGUEZ GOMEZ, Juan, Miguel, E-28770 Colmenar Viejo (Madrid) (ES); BOZA PUERTA, Julio, E-18008 Granada (ES); JIMENEZ LOPEZ, Jesús, E-18004 Santa Fe (Granada) (ES) (73) Jogosult: PULEVA BIOTECH, S. A., E-18004 Granada (ES) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (54) Probiotikus törzsek, szelektálásukra szolgáló eljárás, készítményeik és alkalmazásuk. (57) Kivonat A találmány tárgyát képezi új eljárás új probiotikus törzsek szelektálására, amely az alábbi lépésekbõl áll: a) olyan nem kórokozó törzsek szelektálása, amelyek képesek az anyatejben és/vagy a magzatvízben való túlélésre, és b) olyan nem kórokozó törzsek szelektálása, amelyek egészséges egyénekben anélkül képesek szájon át történõ bevételt követõen az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe átkerülni, hogy a nyálkahártyákon kívül egyéb belsõ szerveket kolonizálnának. A találmány tárgyát képezik továbbá új Lactobacillustörzsek, amelyek a következõk: CECT5711 (Lactobacillus coryniformis), CECT5713 (Lactobacillus salivarius subsp. salivarius), CECT5714: (Lactobacillus gasseri, korábbi nevén L. acidophilus), CETC5715: (Lactobacillus gasseri), és CECT5716: (Lactobacillus fermentum); valamint az emésztõszervi, fertõzõ, neurodegeneratív és immunrendszerrel összefüggõ betegségek, így például allergiák vagy gyulladásos betegségek megelõzésére vagy kezelésére történõ alkalmazásuk. HU 004 295 T2 A leírás terjedelme 40 oldal (ezen belül 12 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
A találmány tárgyát képezik új eljárás új probiotikus törzsek szelektálására, valamint az ezen eljárás szerint szelektált, Lactobacillus nemzetséghez tartozó új probiotikus mikroorganizmusok és ilyen mikroorganizmust tartalmazó készítmények; továbbá emésztõszervi, fertõzõ, neurodegeneratív és immunrendszerrel összefüggõ betegségek, például allergiás és gyulladásos betegségek megelõzésére és kezelésére történõ alkalmazásuk, és ilyen mikroorganizmusok elõállítására szolgáló új forrás. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A technika állása A tejsavbaktériumokat sok éve használják fermentálóágensként élelmiszerek tartósítására, kihasználva azt, hogy az alacsony ph és a tejsavbaktériumok fermentálótevékenysége során keletkezõ fermentációs termékek hatására gátlódik a romlást eredményezõ baktériumok növekedése. E célra kevéssé jól jellemzett tejsavbaktériumokat vagy fermentum -okat használtak különféle élelmiszerek, így például száraz fermentált hústermékek, valamint tejbõl sajtok és más fermentált tejtermékek elõállítására. A tejsavbaktériumok a közelmúltban nagy érdeklõdést váltottak ki, mivel egyes törzsekrõl kiderült, hogy lenyelés után értékes tulajdonságokkal rendelkeznek az ember és az állatok számára. Különösen a Lactobacillus vagy a Bifidobacterium nemzetségbe tartozó egyes törzsekrõl derült ki, hogy képesek megtelepedni a bélnyálkahártyában és segíteni az ember és az állatok jó egészségének fenntartásában ezeket nevezték el probiotikumoknak. A probiotikumok életképes mikrobakészítmények, amelyek azáltal mozdítják elõ az egyén egészségét, hogy megõrzik az egészségesebb mikroflórát a bélben. Egy mikrobakészítmény általánosan akkor fogadható el probiotikumnak, ha ismertek a hatásai és a hatásmechanizmusa. A probiotikumok feltehetõleg a bélnyálkahártyán tapadnak meg, a béltraktusban telepednek meg és emellett akadályozzák a káros mikroorganizmusok megtapadását. Hatásuk szempontjából lényeges elõfeltétel, hogy megfelelõ és életképes állapotban kell elérniük a bélnyálkahártyát, anélkül hogy a gyomor-bél rendszer felsõbb szakaszaiban elpusztulnának, különösen a gyomorban uralkodó alacsony ph hatására. Az új probiotikus törzseket eredményezõ intenzív kutatások során korábbi szabadalmi leírásokban (JP04320642, JP05227946) sok különféle baktériumtörzs csecsemõszékletbõl történõ izolálását ismertették. Az eddig elõállított probiotikus törzseket emellett általában in vitro kísérletekkel annak alapján szelektálták, hogy képesek¹e a bélnyálkahártyán megtapadni. Nem mindig történt további szelekció, és ha igen, az fõleg az adott törzs egyedi tulajdonságain alapult. Végül, és néha a törzs kereskedelmi forgalombahozatalát követõen a szelektált törzs elõnyös hatásait in vivo is igazolták. E tekintetben számos szabadalmi leírás, így pl. az EP07638375, a WO 97/00078, az EPO577903 és a WO00/53200 számú leírás ismertet specifikus Bifidobacterium- és Lactobacillus-törzseket a hasmenésre, immunmodulációra, túlérzékenységi reakciókra vagy kórokozó mikroorganizmusokra gyakorolt elõnyös hatásaikkal együtt. Sok közlemény született arról is, hogy összehasonlították az emberi anyatej csecsemõk jó egészségére gyakorolt elõnyös hatásait a tejalapú készítményekkel táplált csecsemõkkel. Ebben a tekintetben a fertõzések, az allergia, az asztma és a kapcsolódó bántalmak kockázatának csökkenésérõl, valamint a bélrendszer érésének és mûködésének javulásáról számoltak be. Azt is leírták, hogy más a bélflóra összetétele az emberi tejjel táplált csecsemõkben, mint a tejalapú készítményekkel tápláltakban. Az emberi anyatej elõnyös hatásait és bélflóra-moduláló szerepét a csecsemõtápszerekkel összehasonlított jellegzetes összetételének tulajdonítják. Így az anyatejben lévõ fehérjék, például a laktoferrin vagy az anyai immunglobulinok, valamint a prebiotikumként is mûködni képes oligoszacharidokban való gazdagság jótékony hatásait is leírták a bélflóra szabályozása és a bél mûködése szempontjából. Tudomásunk szerint nem született azonban olyan közlemény vagy munka, ami mikrobatörzsek jelenlétét ismertetné a normál emberi anyatejben. Nem írták le továbbá eddig azt sem, hogy az ilyen mikrobatörzsek elõnyösek lehetnek az anyatejjel táplált csecsemõ számára és ily módon probiotikumként funkcionálva modulálják az anyatejjel táplált csecsemõ bélflóráját. Munkánk arra enged következtetni, hogy az emberi anyatejjel való táplálás jó egészségre gyakorolt hatásait a bennük lévõ mikrobatörzsek is közvetíthetik. Sok munka szerint az újszülöttekben a kezdeti kolonizáció a szülés során jelentkezõ, hüvelyi mikroflórával való keresztszennyezõdés eredménye. Számos olyan vizsgálat is van azonban, amelyben a szülés módjától (császármetszés vagy természetes szülés) függetlenül hasonló kezdeti mikrobiális kolonizációt mutattak ki újszülöttekben. Emellett tény, hogy nem lehet csíramentes állatokat elõállítani konvencionális vemhes egerekbõl, de császármetszéssel mégis elõállítottak és hogy ezeket az állatokat úgy is elõ lehetett állítani, ha embriót ültettek át steril befogadó egerekbe [Okamoto, M. és Matsumoto, T., Exp. Anim. 48:59 62 (1999)]. Ez arra enged következtetni, hogy a hüvelyi szennyezéstõl eltérõ mechanizmus kell hogy legyen az, amelyik befolyással van az újszülött kezdeti kolonizációjára és hogy ez a mechanizmus már a szülés elõtt el kell hogy kezdõdjön. E tekintetben tudomásunk szerint nem született olyan közlemény vagy munka, amely tejsavbaktériumok jelenlétét ismertetné a normál emberi magzatvízben. Nem írták le továbbá eddig azt sem, hogy az ilyen nem kórokozó mikrobatörzsek elõnyösek lehetnek a születõ csecsemõ számára és ezért ily módon kondicionálnák a terhesség alatt a magzat beleit kolonizálni képes kezdeti mikrobapopulációkat. A tejsavbaktériumok egyes törzsei által biztosított értékes tulajdonságok megértésével, a technika állása 2
szerint megfogalmazódott egy igény olyan további tejsavbaktérium-törzsek iránt, amelyek elõnyösek az ember és/vagy állatok jó egészsége szempontjából. A technika jelenlegi állásában ebbõl következõen problémaként jelentkezett a további új baktériumtörzsek szelektálására alkalmazható olyan racionális eljárások és a szelektálásukhoz alkalmazható olyan új források biztosítása, amelyek lehetõvé teszik az ember és/vagy az állatok számára egyedileg sok elõnyös tulajdonsággal rendelkezõ baktériumtörzsek elõállítását. A fenti problémát új mikroorganizmusok, nevezetesen a Lactobacillus nemzetségbe tartozó tejsavbaktériumok biztosításával oldottuk meg. Ezeket az új törzseket nem székletbõl, hanem különféle más forrásokból nyertük, így például kecskesajtból, emberi anyatejbõl és magzatvízbõl, és olyan eljárással választottuk ki õket, amely a törzsek anyatejben és/vagy magzatvízben való túlélési képességére, valamint azon képességére alapul, hogy szájon át történõ bevételt követõen bekerülnek az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe. A szelektálási eljárás biztosítja, hogy az elõállított baktériumtörzsek következésképp rendelkeznek a potenciálisan probiotikus törzseknek tulajdonított jellemzõk többségével, nevezetesen az emésztési folyamattal szembeni megfelelõ rezisztenciával és a bél kolonizálására való képességgel, valamint a természetesebb emberi forrással, a biztonságossági aspektusokkal és a béltõl eltérõ más humán niche¹ek kolonizálására és szabályozására való képességgel. És végül, a szelektált törzseket emellett nemcsak megtapadási képességük alapján vizsgáltuk, hanem aszerint is, hogy rendelkeznek¹e nagymértékben hasznos tulajdonsággal. Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábrákat. 1. ábra. Szûrési eljárás: A baktériumok túlélése anyatejben és magzatvízben Ez az ábra a találmány szerinti, szelektált probiotikus törzsek anyatejben és magzatvízben való túlélésének arányait mutatja be. E szelektálási eljárás szerint a potenciális probiotikus törzsek túlélésének mérése emberi anyatej (szürke oszlopok) és magzatvíz (fekete oszlopok) alkalmazásával történt. A vizsgált baktériumtörzsek bármelyikébõl 10 8 cfu¹t 1 ml MRS-ben vagy anyatejben vagy magzatvízben reszuszpendáltunk, majd anaerob körülmények között 1 órán át, 37 C¹on inkubáltuk. A tenyészet túlélését úgy mértük, hogy MRS agarlemezeken hígítási sorozatokat tenyésztettünk. Az eredményeket három független kísérlet átlaga ±SD formában jelenítettük meg. Elsõ lépésben azokat a baktériumokat szelektáltuk ki, amelyek legalább az egyik emberi testfolyadékban 75% feletti arányban éltek túl. 2. ábra. Szûrési eljárás: A baktériumok átkerülése az anyatejbe Ez az ábra a szelektált baktériumok anyatejbe való átkerülését mutatja be szájon át történõ bevételt követõen. A) A törzsek jelölése. Az anyatejben és/vagy magzatvízben túlélõ törzseket genetikailag jelöltük, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 egy PCR-rel detektálható konstrukció alkalmazásával. A különféle törzseket különféle méretû (159 bp: F159, 189 bp: F189 és 228 bp: F228) DNS-fragmensekkel jelöltük. A PCR-szignál csak a genetikailag jelölt törzsekben detektálható. Az ábra példaként a CECT5711, a CECT5713 és a CECT5714 baktériumtörzset mutatja be. B) A szelektált baktériumok átkerülése az anyatejbe. A jelölt törzsek anyatejbe és/vagy magzatvízbe történõ átkerülési képességét állatmodellként vemhes egerek alkalmazásával értékeltük. Vemhes egereket a szülést megelõzõ két hétben kétnaponta, egerenként 10 8 cfu-val (ezen az ábrán az L. salivarius CECT5713 eredményei láthatók) oltottuk. A baktériumok jelenlétét a tejben közvetett módon detektáltuk úgy, hogy összehasonlítottuk az újszülöttek belében PCR-rel detektálható baktériumok számát közvetlenül az elsõ szoptatás elõtt és után. Az egyes paneleken az 1. sáv a molekulatömeg-markernek felel meg. 3. ábra. A szelektált baktériumok RAPD-profilja Ez az ábra a találmány szerinti öt szelektált probiotikus törzs RAPD-profilját mutatja be két különbözõ láncindító (Argdei és OPL5) alkalmazásával. Az 1., 8. és 15. sáv a molekulatömeg-markernek felel meg, a 7. és 14. sáv pedig a negatív kontrollok. 4. ábra. A szelektált baktériumok RAPD-profiljának azonos fajhoz tartozó más baktériumokéval történõ összehasonlítása Ez az ábra a találmány szerinti, szelektált probiotikus törzsek és azonos fajhoz tartozó más baktériumtörzsek RAPD-profiljai között észlelt különbségeket mutatja be. Mindegyik faj szerepel a panelek egyikén: L. coryniformis (A), L. salivarius (B), L. gasseri (C), és L. fermentum (D). Az alkalmazott törzseket a III. táblázatban mutatjuk be. 5. ábra. A probiotikus törzsek megtapadása a bélsejteken Ez az ábra a probiotikus törzsek bélsejteken való megtapadását mutatja be. A találmány szerinti probiotikus törzseket Caco 2 (szürke oszlopok) vagy HT 29 (fekete oszlopok) bélsejtvonalak alkalmazásával vizsgáltuk és kereskedelmi forgalomban kapható probiotikus törzsekkel hasonlítottuk össze. Húsz randomizált mezõben végeztünk számlálást, és az eredményeket az egyes mezõkben a sejtekhez tapadt baktériumok számának átlaga ±SD formában fejeztük ki. Egy probiotikus törzsnek az egyes bélsejtvonalakhoz való tapadási kapacitását akkor tekintettük magasnak, ha a kitapadt baktériumok száma 250 felett volt, akkor közepesnek, ha 100 és 250 között volt, és akkor alacsonynak, ha 100 alatt volt. 6. ábra. A probiotikus törzsek túlélése az emésztés körülményei között Ez az ábra a probiotikus törzsek túlélését mutatja be az emésztés körülményei között. A találmány szerinti probiotikus törzsek savakkal (szürke oszlopok) és magas epesótartalommal (fekete oszlopok) szembeni rezisztenciáját in vitro, a baktériumok 3,0¹es ph¹jú vagy 4,15%¹os epesótartalmú MRS¹en történõ 90 perces tenyésztésével vizsgáltuk. Az eredményeket három füg- 3
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 getlen kísérlet átlaga ±SD formában jelenítettük meg. Egy probiotikus törzs rezisztenciáját akkor tekintettük magasnak, ha a túlélés 80% felett volt, akkor közepesnek, ha 60% és 80% között volt, és akkor alacsonynak, ha 60% alatt volt. 7. ábra. A probiotikus törzsek generációs ideje Ez az ábra a probiotikus törzsek generációs idejét mutatja be. A találmány szerinti probiotikus törzsek generációs idejét in vitro, a baktériumok 0,2% glükózt tartalmazó MRS¹en történõ 120 perces tenyésztésével vizsgáltuk. Az eredményeket három független kísérlet átlaga ±SD formában, percekben kifejezve jelenítettük meg. Egy probiotikus törzs generációs idejét akkor tekintettük gyorsnak, ha 60 perc alatt volt, akkor közepesnek, ha 60 és 120 perc között volt, és akkor lassúnak, ha 120 perc felett volt. 8. ábra. A probiotikus törzsek fermentációs kapacitása Ez az ábra a probiotikus törzsek komplex szénhidrátfermentáló képességét mutatja be. A találmány szerinti probiotikus törzsek egyedüli szénhidrátforrásként komplex szénhidrátokat felhasználó fermentációs kapacitását in vitro, a baktériumoknak a megadott szénhidrátból 2%¹ot tartalmazó, glükózmentes MRS¹en történõ 24 és 48 órás tenyésztésével vizsgáltuk. A ph csökkenését brómkrezol-lila alkalmazásával vizsgáltuk. Az eredményeket a következõ formákban jelenítettük meg: az abszorbancia 24 óra utáni x¹szeres indukciója egy szénhidrátforrás nélküli kontroll tenyészettel összehasonlítva (A) és az összes független x¹szeres indukcióérték összege (B). Egy probiotikus törzs fermentációs kapacitását akkor tekintettük magasnak, ha az összeg 30 felett volt, akkor közepesnek, ha 25 és 30 között volt, és akkor alacsonynak, ha 25 alatt volt. 9. ábra. A probiotikus törzsek antibiotikumokkal szembeni rezisztenciája Ez az ábra a probiotikus törzsek antibiotikumokkal szembeni rezisztenciáját mutatja be. A találmány szerinti probiotikus törzsek antibiotikumkezeléssel szembeni rezisztenciáját in vitro, Müeller Hinton lemezeken 24 48 órán át végzett agarlyuk-diffúziós vizsgálati eljárással vizsgáltuk. Az antibiotikus hatást a gátlási udvar átmérõje határozza meg. Az eredményeket a következõképpen jelenítettük meg: R (rezisztens), ha az udvar átmérõje 12 mm¹nél kisebb, I (átmeneti), ha az udvar átmérõje 12 és 15 mm közötti, és S (érzékeny), ha az udvar átmérõje 15 mm¹nél nagyobb. Ezt követõen minden egyes állapotnak megfeleltettünk egy numerikus kódot: R=3, I=2, és S=1. Egy probiotikus törzs rezisztenciakapacitását akkor tekintettük magasnak, ha az összeg 17 felett volt, akkor közepesnek, ha 15 és 17 között volt, és akkor alacsonynak, ha 15 alatt volt. 10. ábra. A probiotikus törzsek savtermelése Ez az ábra a probiotikus törzsek savtermelését mutatja be. A találmány szerinti probiotikus törzsek sav(tejsav¹, propionsav¹, ecetsav- és vajsav¹) termelését in vitro, a tejtenyészetek ph¹jának 24 (szürke oszlopok) és 48 (fekete oszlopok) óra után történõ mérésével vizsgáltuk. Egy probiotikus törzs savtermelését akkor tekintettük magasnak, ha a tej ph¹ja 48 óra után 4 alatt volt, akkor közepesnek, ha 4 és 4,5 között volt, és akkor alacsonynak, ha 4,5 felett volt. 11. ábra. Baktericid anyagcseretermékek termelése a probiotikus törzsek által Ez az ábra a probiotikus törzsek antimikrobiális anyagcseretermék-termelését mutatja be. Az antimikrobiális anyagcseretermékek találmány szerinti probiotikus törzsek általi termelését in vitro, S. typhimurium (fekete oszlopok) vagy Escherichia coli (szürke oszlopok) tenyészetet tartalmazó TSA lemezeken végzett agarlyuk-diffúziós vizsgálati eljárással vizsgáltuk. A baktericid hatást a baktérium-felülúszók által indukált gátlási udvar (mm-ben kifejezett) átmérõje határozza meg. Egy probiotikus törzs antimikrobiális kapacitását akkor tekintettük magasnak, ha az udvar 12 felett volt, akkor közepesnek, ha 8 és 12 között volt, és akkor alacsonynak, ha 8 alatt volt mindkét kórokozó törzs esetében. 12. ábra. Kórokozó baktériumok megtapadásának gátlása Ez az ábra a kórokozó baktériumok megtapadásának gátlását mutatja be. Az E. coli (szürke oszlopok) és S. typhimurium (fekete oszlopok) kórokozó törzsek Caco 2 sejtekhez való tapadását találmány szerinti probiotikus törzsek jelenlétében vizsgáltuk és kereskedelmi forgalomban kapható probiotikus törzsekkel hasonlítottuk össze. Tíz randomizált mezõben végeztünk számlálást, és az eredményeket a sejtekhez tapadt Gram-negatív baktériumoknak a probiotikumok távollétében kitapadt kórokozó baktériumok számával összehasonlított %¹os arányának az átlagában fejeztük ki. Egy probiotikus törzsnek a kórokozó baktériumok kitapadását gátló kapacitását akkor tekintettük magasnak, ha mindkét kitapadt kórokozó baktérium %¹os aránya 25 alatt volt, akkor közepesnek, ha 25 és 75 között volt, és akkor alacsonynak, ha 75 felett volt. 13. ábra. A bél L. salivarius CECT5713 általi kolonizációja Ez az ábra a bél L. salivarius CECT5713 általi kolonizációját mutatja be. A baktériumok szélesztésével megvizsgáltuk a székletben lévõ Lactobacillus, Bifidobacterium és koliform baktériumok számát olyan egerekben, akik 14 napon át naponta 10 8 cfu L. salivarius CECT5713¹at kaptak. A (körülbelül 200 g¹os) székletmintákat a probiotikumadagolás 0., 7. és 14. napján vettük, valamint egy és két héttel az adagolás befejezése után (21. és 28. nap). (* p< 0,05; ** p<0,01). 14. ábra. Az L fermentum CECT5716 Salmonellafertõzésre gyakorolt hatása Ez az ábra az L. fermentum CECT5716 Salmonella-fertõzésre gyakorolt hatását mutatja be. A) Az L. fermentum CECT5716 gátolja a Salmonella lépbe történõ transzlokációját. A Salmonella kolóniák számát L. fermentum CECT5716-tal kezelt, és 10 10 cfu Salmonellá-val való orális kísérleti megfertõzés után 24 órával 10 8 cfu inaktivált Salmonellá-val beoltott vagy be nem oltott egerek lépében mértük. B) Ugyanezeket az 4
egereket használtuk a széklet IgA-tartalmának méréséhez is. 15. ábra. A probiotikus törzsek citokinexpresszióra gyakorolt hatása Ez az ábra a probiotikus törzsek citokinexpresszióra gyakorolt hatását mutatja be. A TNF¹ (A) vagy IL 10 (B) citokintermelését 12 órán át vizsgáltuk LPSsel stimulált, csontvelõi eredetû makrofágokban és a megadott probiotikus törzsekben. A citokintermelést ELISA módszerrel detektáltuk. 16. ábra. A probiotikus törzsek IgG-expresszióra gyakorolt hatása Ez az ábra a probiotikus törzsek IgG-expresszióra gyakorolt hatását mutatja be. Az IgG-termelést 6 napig vizsgáltuk LPS-sel stimulált (6 8 hetes) Balb/c egerek lépébõl nyert limfocitákban és a megadott probiotikus törzsekben. Az immunglobulintermelést a Bethyl vállalat egyik ELISA módszerével detektáltuk. Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást. A találmány tárgyát képezi tehát eljárás probiotikus mikrobatörzsek szelektálására, amely az alábbi lépésekbõl áll: a. olyan nem kórokozó törzsek szelektálása, amelyek képesek az anyatejben és/vagy a magzatvízben való túlélésre, és b. olyan nem kórokozó törzsek szelektálása, amelyek egészséges egyénekben anélkül képesek szájon át történõ bevételt követõen az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe átkerülni, hogy a nyálkahártyákon kívül egyéb belsõ szerveket kolonizálnának. A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgyát képezik új Lactobacillus-törzsek, amelyek a következõk: CECT5711 (Lactobacillus coryniformis), CECT5713 (Lactobacillus salivarius subsp. salivarius), CECT5714: (Lactobacillus gasseri, korábbi nevén L. acidophilus), CECT5715: (Lactobacillus gasseri), és CECT5716: (Lactobacillus fermentum). A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi emlõstej és emlõs magzatvíz nem kórokozó probiotikus baktériumok forrásaként történõ alkalmazása. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezik a fent említett törzsek legalább egyikét tartalmazó készítmények és termékek. Végül, a találmány utolsó szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a fent említett törzsek, vagy az ilyen törzseket tartalmazó bármely tenyészet, készítmény vagy termék alkalmazása emberi és állatbetegségek terápiás vagy megelõzõ kezelésére szolgáló termék elõállítására. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást. Ahogy azt a fentiekben említettük, a találmány tárgyát képezi új baktériumtörzsek szelektálására szolgáló eljárás, amelynek alapja, hogy a törzsek képesek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 anyatejben és/vagy magzatvízben a túlélésre, valamint hogy szájon át történõ bevételt követõen képesek átkerülni az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe, ami biztosítja, hogy az így nyert szelektált törzsek rendelkeznek a speciális jellemzõkkel. A találmány fõ szempontja szerint tehát a találmány tárgyát képezi eljárás probiotikus mikrobatörzsek szelektálására, amely az alábbi lépésekbõl áll: a. olyan nem kórokozó törzsek szelektálása, amelyek képesek az anyatejben és/vagy magzatvízben való túlélésre, és b. olyan nem kórokozó törzsek szelektálása, amelyek egészséges egyénekben anélkül képesek szájon át történõ bevételt követõen az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe átkerülni, hogy a nyálkahártyákon kívül egyéb belsõ szerveket kolonizálnának. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint mind az anyatej, mind a magzatvíz emberi forrásból származik. A találmány szerinti eljárásban vizsgált probiotikus törzs többek között az alábbi nemzetségekbe tartozó bármilyen probiotikus baktérium lehet: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus és Bifidobacterium. E probiotikus törzsek elõállítása elõnyösen anyatejbõl, anyatejjel táplált csecsemõk székletébõl, vagy magzatvízbõl, legelõnyösebben emberi mintákból történik. A találmány szerinti eljárás további részletei az Eljárások és példák címû részben találhatók. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti eljárással szelektált bármely baktériumtörzs. Az új baktériumtörzsek némelyikét, amelyek számos olyan jellegzetességet mutatnak, ami az emberi egészség és különösen az emésztõszervi, fertõzõ, neurodegeneratív és egyéb immunrendszerrel összefüggõ betegségek, így például allergiák vagy gyulladásos betegségek megelõzése vagy kezelése tekintetében elõnyössé teszi õket, a Budapesti Egyezménnyel összhangban, 2002. június 11¹én letétbe helyeztük a CECT-nél (Colección Espanola de Cultivos Tipo), a spanyolországi Valenciában. E baktériumtörzsek és tulajdonságaik a következõk: CECT5711: (Lactobacillus coryniformis), ahol a baktériumokat kecskesajtból nyerjük, a javasolt eljárással szelektáljuk és a 3. ábrán bemutatott RAPD-profil, illetve az I., II. és VII. táblázatban ismertetett tulajdonságok alapján jellemezzük. CECT5713: (Lactobacillus salivarius subsp. salivarius), ahol a baktériumokat emberi anyatejjel táplált csecsemõk székletébõl nyerjük, a javasolt eljárással szelektáljuk és a 3. ábrán bemutatott RAPD-profil, illetve az I., II. és VII. táblázatban ismertetett tulajdonságok alapján jellemezzük. CECT5714: (Lactobacillus gasseri, korábbi nevén L. acidophilus), ahol a baktériumokat emberi anyatejbõl nyerjük, emberi magzatvízben is detektáljuk, a javasolt eljárással szelektáljuk és a 3. ábrán bemutatott RAPD-profil, illetve az I., II. 5
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 és VII. táblázatban ismertetett tulajdonságok alapján jellemezzük. CECT5715: (Lactobacillus gasseri), ahol a baktériumokat emberi anyatejbõl nyerjük, emberi magzatvízben is detektáljuk, a javasolt eljárással szelektáljuk és a 3. ábrán bemutatott RAPD-profil, illetve az I., II. és VII. táblázatban ismertetett tulajdonságok alapján jellemezzük. CECT5716: (Lactobacillus fermentum), ahol a baktériumokat emberi anyatejbõl nyerjük, a javasolt eljárással szelektáljuk és a 3. ábrán bemutatott RAPD-profil, illetve az I., II. és VII. táblázatban ismertetett tulajdonságok alapján jellemezzük. Emellett azt is megerõsítettük, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazásával új specifikus törzseket lehet szelektálni, ahogy azt a fentiekben említettük. Ebben az értelemben összehasonlítottuk a szelektált törzsek genetikai (RAPD-profil) és biokémiai aspektusait, így például fermentációs képességét (APIprofilok) és antibiotikumokkal szembeni rezisztenciáját azonos fajhoz tartozó, számos kultúragyûjteményben (nevezetesen a CECT-ben, az ATCC-ben, az LMG-ben, az NCFB-ben stb.) letétbe helyezett más törzsekével. Ennek megfelelõen megállapítottuk, hogy ezek az új törzsek különböznek a korábban leírtaktól. Tudomásunk szerint ez az elsõ alkalom, hogy egy kísérleti laboratórium megfigyelte, hogy kinyerhetõk a normál emlõs anyatejben vagy magzatvízben jelen lévõ nem kórokozó bakteriális mikroorganizmusok, hogy a nem kórokozó baktériumtörzsek szájon át történõ bevételt követõen átkerülnek az anyatejbe és a magzatvízbe, és hogy ezek a mikroorganizmusok nem kórokozó törzsek, amelyek probiotikus baktériumtörzsként mûködhetnek és ily módon elõnyösen befolyásolhatják nemcsak az ilyet lenyelõ egyéneket, hanem a magzatokat és a szoptatott csecsemõket is. Emiatt a találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi emlõs anyatej és magzatvíz probiotikus törzsként alkalmazható bakteriális mikroorganizmusok új forrásaként történõ alkalmazása, továbbá a belõlük nyert törzsek és ezek alkalmazása. Az anyatej és a magzatvíz elõnyösen emberi eredetû. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi bármely találmány szerinti baktériumtörzs legalább egy további baktériumtörzzsel együttesen. Ebben a tekintetben a találmány tárgyát képezik az egyes törzsek, illetve egymással vagy más baktériumtörzsekkel alkotott elegyeik biológiailag tiszta tenyészetei. A találmány említett szempontja szerint tehát találmány tárgyát képezi a találmány szerinti törzsek közül legalább egyet vagy valamilyen elegyüket tartalmazó különféle készítmények elõállítása. A találmány e szempontja szerint a találmány tárgyát képezi legalább egy találmány szerinti baktériumtörzset, azaz a fent említett törzsek egyikét vagy a találmány szerinti eljárással szelektált bármely baktériumtörzset tartalmazó készítmény, ahol a készítmény elõnyösen 2 6 törzset, még elõnyösebben 2 4 törzset, legelõnyösebben 2¹3 törzset tartalmaz, és ahol minden egyes törzs 0,1% és 99,9%, elõnyösen 1% és 99%, még elõnyösebben 10% és 90% közötti arányban van jelen a készítményben. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a készítmény legalább egy találmány szerinti baktériumtörzset és ezzel együtt egy további törzset vagy törzselegyet tartalmaz, ahol az elegy elõnyösen 2 6 törzset, még elõnyösebben 2 4 törzset, legelõnyösebben 2¹3 törzset tartalmaz, és ahol minden egyes törzs 0,1% és 99,9%, elõnyösen 1% és 99%, még elõnyösebben 10% és 90% közötti arányban van jelen a készítményben. A találmány szerinti készítmény elõnyösen liofilizált, fagyasztott vagy elölt formában van. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi egy találmány szerinti baktériumtörzs tenyészetének felülúszójából vagy bármely találmány szerinti készítménybõl nyerhetõ készítmény. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a készítmény a találmány szerinti bármely baktériumtörzs egy tenyészetének vagy a találmány szerinti készítménynek az extrakciójával nyerhetõ. Egy találmány szerinti Lactobacillus törzs tenyészetének felülúszója beadagolható hordozó elõállítására is alkalmazható. A felülúszó, mint olyan is felhasználható, vagy alaposan ki is lehet szárítani olyan körülmények között, amelyek nem teszik tönkre a mikroorganizmusok által a folyékony tápközegbe szekretált vagy termelt anyagcseretermékeket, így pl. fagyasztva szárítással. A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen probiotikus törzsekbõl nyert enzimek alkalmazása, és fehérjehidrolizátumok vagy anyagcseretermékek elõállítására történõ alkalmazásuk. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti törzsek készítményei liofilizált formában, fagyasztva szárítva vagy hagyományos eljárásokkal inaktiválva (elölt baktériumok). A találmány egy még további szempontja szerint tehát a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti törzsek bármelyikének, a találmány szerinti bármelyik törzs valamely tenyészetének vagy egy találmány szerinti készítménynek a metabolikus tevékenysége révén nyert termék, ahol a termék elõnyösen egy enzim. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi élelmiszertermék, amely hordozóanyagot és legalább egy találmány szerinti törzset, találmány szerinti tenyészetet, készítményt vagy terméket tartalmaz. A hordozóanyag elõnyösen az alábbiak közül választott élelmiszerkészítmény: tej, joghurt, túró, sajt, fermentált tej, tejalapú fermentált termékek, húsalapú fermentált termékek, fermentált gabonafélékbõl készült termékek, tejalapú porok, gabonaalapú porok, csecsemõtápszerek, klinikai tápszerek, fagylaltok, zöldség- vagy gyümölcslevek, lisztek, kenyérfélék, sütemények, cukorkák vagy rágógumik. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a hordozóanyag körülbelül 10 5 cfu/g és körülbelül 10 12 cfu/g hordozóanyag, elõnyösen körülbelül 10 6 cfu/g és körülbelül 6
10 11 cfu/g hordozóanyag, még elõnyösebben körülbelül 10 6 cfu/g és körülbelül 10 10 cfu/g hordozóanyag közötti mennyiségben tartalmazza a találmány szerinti mikrobatörzset. A találmány céljára a cfu rövidítés kolóniaképzõ egység ¹et jelent, ami az agarlemezeken történõ mikrobiológiai számlálással kapott baktériumsejtszámként van meghatározva. A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezik gyógyászati készítmények, amelyek legalább egy találmány szerinti törzset, találmány szerinti tenyészetet, készítményt vagy terméket és gyógyászatilag elfogadható excipienseket tartalmaznak. A fent ismertetett élelmiszerben vagy gyógyászati készítményben szükséges adag mennyisége a betegség jellegétõl vagy a készítmény javasolt terápiás vagy megelõzõ alkalmazásától, valamint az érintett szervezettõl függõen változik. A találmány szerinti élelmiszerkészítmények elõállításához legalább egy, találmány szerinti Lactobacillus törzset megfelelõ hordozóanyagra viszünk körülbelül 10 5 cfu/g és körülbelül 10 14 cfu/g hordozóanyag, elõnyösen körülbelül 10 8 cfu/g és körülbelül 10 13 cfu/g hordozóanyag, még elõnyösebben körülbelül 10 7 cfu/g és körülbelül 10 12 cfu/g hordozóanyag közötti mennyiségben. A gyógyászati készítmények tabletták, kapszulák, folyékony baktériumszuszpenziók, szárított orális táplálék-kiegészítõk, nedves orális táplálék-kiegészítõk, száraz szondatápok vagy nedves szondatápok. Az új mikroorganizmusok aktivitása az egyénben mindazonáltal természetesen dózisfüggõ. Azaz minél nagyobb a fenti élelmiszer anyag vagy gyógyászati készítmény lenyelése vagy beadagolása útján bevitt új mikroorganizmusok száma, annál nagyobb a mikroorganizmusok védõ és/vagy terápiás aktivitása. Mivel a találmány szerinti mikroorganizmusok nem károsak az emberre és az állatokra és végsõ soron csecsemõk székletébõl, élelmiszerekbõl vagy emberi anyatejbõl vagy magzatvízbõl izoláltuk õket, nagy mennyiségben beépíthetõk úgy, hogy az új mikroorganizmusok lényegében nagy arányban kolonizálják az egyén nyálkahártyáit. A kezelést igénylõ alany elõnyösen olyan egyének csoportjából kerül kiválasztásra, akik valamely betegségben, nevezetesen fertõzésben, allergiában, gyulladásban stb. szenvednek vagy ki vannak téve e betegségek kockázatának. Nyilvánvaló azonban, hogy a találmány szerinti kezelések bármely alanyban megfelelõen alkalmazhatók e betegségek megelõzésére. Emellett a szelektált törzsek azon képessége miatt, hogy átkerülhetnek az anyatejbe és/vagy magzatvízbe és ott túlélhetnek, a kezelést igénylõ alanyok nemcsak azok lehetnek, akik közvetlenül beveszik a szelektált törzseket, hanem a magzatok vagy a szoptatott csecsemõk is. A probiotikus vagy probiotikumot tartalmazó készítménynek elõnyösen a száj, a gyomor vagy a bél nyálkahártyája a célpontja, azonban az orrgarat, a légutak, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 az urogenitáliák vagy a mirigyek nyálkahártyája is lehet a célpontjuk, és szájon át, végbélen át, helyileg, húgycsövön át vagy hüvelyen át is beadagolható embereknek és állatoknak. A találmány szerinti probiotikumok emellett más kezelésekkel együtt is alkalmazhatók azok hatásosságának fokozása vagy elõsegítése céljából. Sok embernek zavart a bélmikroflórája, azaz felborult náluk a hasznos és káros bélbaktériumok egyensúlya. Számos tényezõ, többek között a stressz, az epesók jelenléte, és különösen az étrend befolyással van a baktériumflórára. Ezekben a szituációkban zavart szenvedhet a fermentálási folyamat és csökkenhet a hasznos baktériumok száma, amelynek következtében elfonnyadhat a vastagbél nyálkahártyája és megszûnhet mûködni ahogy a potenciálisan rosszindulatú baktériumok száma gyorsan növekszik. Emiatt a találmány egyik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi a probiotikumok krónikus vagy akut fertõzések, vagy valamely nyálkahártyafelszín nemkívánatos mikrobiális kolonizációjának megelõzõ vagy terápiás kezelésére történõ alkalmazása, amelynek során a probiotikum vagy a probiotikumot tartalmazó készítmény egy hatásos mennyiségét azt igénylõ alanynak adjuk be. A találmány szerinti készítmények hatásosan alkalmazhatók akut és krónikus vírusos fertõzések kezelésére is. Elõnyösen, a krónikus Epstein Barr vírus, citomegalovírus és más olyan herpesztípusú vírusos fertõzések kezelése, amelyek általánosan elõfordulnak a populációban és az immunológiai kontroll csökkenésével járnak. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi találmány szerinti probiotikus baktériumok alkalmazása hasmenés megelõzõ vagy terápiás kezelésére függetlenül attól, hogy parazitafertõzés és/vagy baktériumos vagy vírusos fertõzés, antibiotikumokkal történõ kezelés vagy kemo- vagy sugárterápia, vagy az étrend vagy fizikai komplikációk okozzák¹e a panaszokat. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti probiotikumok idõlegesen csökkent immunaktivitási szintek megelõzésére és kezelésére és a normálisnak tekintett immunaktivitási szintekhez képest például az öregedés miatt vagy az intenzív megerõltetésnek vagy általában nagy fiziológiás terhelésnek kitett egészséges egyénekben jelentkezõ lecsökkent szintek normalizálására történõ alkalmazása. Az immunválasz és a Th1 és Th2 citokinek közötti egyensúly modulálásán keresztül a találmány szerinti probiotikumok ezenkívül allergia és a lenyelt fehérjékkel szembeni tolerancia kialakulásával összefüggõ betegségek megelõzõ vagy terápiás kezelésére is alkalmazhatók. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti probiotikumok krónikus gyulladásos betegségek, így például többek között pikkelysömör (psoriasis), szarkoidózis, érelmeszesedés (atherosclerosis), vagy gyulladásos bélbetegség megelõzõ vagy terápiás kezelésére történõ alkalmazása egyes probiotikus törzsek azon képes- 7
sége alapján, hogy csökkenteni tudják az aktivált makrofágokban a gyulladáskeltõ citokinek termelõdését. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti törzsek bizonyos típusú rákbetegségek megelõzõ vagy terápiás kezelésére történõ alkalmazása. A törzsek ilyen alkalmazása egyes tejsavbaktériumok leírt rákellenes hatásain alapul, amely a bélben lévõ karcinogén méreganyagok, mint például a nitrózaminok gátlásában kifejtett hatásainak, illetve e probiotikumoknak a természetes immunvédelem modulálására gyakorolt hatásának köszönhetõ. Végül a találmány tárgyát képezi e probiotikus törzsek neurodegeneratív betegségek megelõzõ vagy terápiás kezelésére történõ alkalmazása egyes probiotikus törzsek hipokoleszterinémiás hatása és oxidatív stresszt moduláló hatása miatt. Mindkét szituációt kockázati tényezõnek tekintik a neurodegeneratív betegségek, így például a Parkinson-kór vagy az Alzheimerkór kialakulása szempontjából. Emellett azt is leírták, hogy a kommenzalista (más szervezetekkel együttélõ) baktériumok képesek az L¹triptofán dezaminálására, amelynek eredményeként egy erõteljes neuroprotektív anyag, indol-3-propionsav keletkezik. A találmány szerinti szelektálási eljárással szelektált törzsek potenciálját úgy is vizsgáltuk, hogy konvencionális kritériumok alkalmazásával elemeztük a szelektált törzsek probiotikus tulajdonságait. Ebben az értelemben az alábbi aspektusokat vizsgáltuk: a)sav- és epestabilitás, mivel a baktériumok fõleg lenyelessél kerülnek be és át kell jutniuk a gyomor savas környezetén és az epetartalmú vékonybélen is, és képesnek kell lenniük arra, hogy ilyen körülmények között is túléljenek; b) megtapadás a bélnyálkahártyákon, mivel ez a tulajdonság teszi lehetõvé, hogy a baktériumok kolonizálják a gyomor-bél rendszert és megtelepedjenek ott; c) fermentáló és magas proliferatív kapacitás a nyálkahártyán való megtelepedés fokozása érdekében; d) antibiotikumokkal szembeni rezisztencia, mivel bizonyos indikációk esetén szükség lehet rá; e) a ph csökkentése (tejsavtermelés) és antimikrobiális anyagcseretermékek termelése a találmány szerinti törzs által, mivel segíthet abban, hogy a gyomor-bél rendszerben kialakuljon egy védõgát a kórokozókkal szemben; f) immunmoduláló kapacitások. A találmányt az alábbi eljárásokkal és példákkal illusztráljuk. Eljárások és példák 1. példa: Új eljárás probiotikus törzsek szelektálására Kifejlesztettünk egy új eljárást új baktériumtörzsek szelektálására, amelynek alapja, hogy a törzsek képesek anyatejben és/vagy magzatvízben a túlélésre, valamint hogy szájon át történõ bevételt követõen képesek átkerülni az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe. A találmányban ismertetett új eljárásnak az az alapvetõ értelme, hogy biztosítja az így nyert szelektált baktériumtörzsek speciális jellemzõit, mivel az elõállított baktériumtörzsek következésképp rendelkeznek a potenciálisan 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 probiotikus törzseknek tulajdonított jellemzõk többségével, nevezetesen az emésztési folyamattal szembeni megfelelõ rezisztenciával és a bél kolonizálására való képességgel, valamint a természetesebb emberi forrással, a biztonságossági aspektusokkal és a béltõl eltérõ más humán niche¹ek kolonizálására és szabályozására való képességgel. Az új törzseket emellett széklettõl eltérõ különféle forrásokból, például kecskesajtból és emberi anyatejbõl és magzatvízbõl nyertük. 1a. példa: Emberi testfolyadékokkal szembeni rezisztencia Ellenõriztük, hogy a különféle forrásokból izolált kolóniák képesek¹e az emberi anyatejben és az emberi magzatvízben való túlélésre. A találmány szerinti probiotikus törzsek túlélési arányainak elemzéséhez az egyes baktériumokból 10 8 10 8 cfu¹t 37 C¹on, anaerob körülmények között, 1 ml emberi anyatejben vagy emberi magzatvízben 60 percig kultúráztunk. A túlélést a hígítások MRS agarlemezekre törzsek szélesztésével számoltuk és összehasonlítottuk a kontroll körülmények között (6,2¹es ph¹jú MRS táplevesben) nyert kolóniák számával. A lemezeket 16 18 órán át, anaerob körülmények között, 37 C¹on kultúráztuk. A kísérletet háromszor ismételtük meg. A törzseket akkor tekintettük rezisztensnek, ha legalább az egyik emberi testfolyadékban a kontrollal összehasonlítva 75% feletti volt a túlélési arány (1. ábra). 1b. példa: Emberi testfolyadékokba történõ átkerülés A találmányban ismertetett szelektálási eljárás második kritériuma az, hogy a baktériumoknak szájon át történõ bevételt követõen át kell tudniuk kerülni az anyatejbe és/vagy a magzatvízbe. E képesség tesztelésére a feltételezett törzseket a késõbbiekben leírtak szerint genetikailag megjelöltük és orálisan adagoltuk az állatmodellként alkalmazott vemhes egereknek. A baktériumok átkerülését magzatvízbõl és szoptatott egerek belébõl nyert kolóniák PCR-szûrésével vizsgáltuk. A baktériumok megjelölése A három különbözõ PCR-fragmens (F159:159 bp, F189:189 bp, és F228:228 bp) elõállításához három láncindítópárt alkalmaztunk. A három fragmens egy funkciót tartalmazott a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S rrns-ének promotere és az Agrobacterium tumefaciens 5¹enolpiruvilsikimát-3-foszfát-szintáz (EPSPS) génje között. A láncindítókat a Roundup Ready szójában (EMBL hozzáférési szám: AX033493) jelen lévõ mesterséges szekvencia alapján terveztük. A láncindítók 5 ¹farkaihoz BamHI-helyeket kapcsoltunk, hogy megkönnyítsük a PCR-fragmensek klónozását. A PCR-termékeket az elõállítást követõen QIAquick PCR-tisztító reagenskészlet (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk, BamHI-gyel emésztettük, és egy klór-amfenikollal (Cm) szembeni rezisztenciát biztosító plazmidba, ptg262¹be ligáltuk. A plazmidokat ezután hagyományos protokollok szerint végzett elektroforézissel, külön-külön bejuttattuk a szelektált törzsekbe. A transz- 8
formánsok azonosságát PCR-rel ellenõriztük (2A. ábra). A baktériumok átkerülése Négy vemhes Balb/c egérbe a szülés elõtt két hétig kétnaponta, szájon át, 200 l tejben bevive, 10 8 cfu genetikailag megjelölt törzset oltottunk. Közvetlenül a szülés elõtt két egérbõl aszeptikusan levettük a magzatvizet és MRS agarlemezeken kultúráztuk. A másik két vemhes egér befejezte a vemhességet. A genetikailag jelölt baktériumok anyatejbe történõ átkerülését úgy vizsgáltuk, hogy összehasonlítottuk az újszülöttek belébõl izolált baktériumokat közvetlenül az elsõ szoptatás elõtt és után. Minden lemezt 24 óráig, anaerob körülmények között, 37 C¹on inkubáltunk. Minden nyert minta esetén véletlenszerûen kiválasztottunk 52 kolóniát azok közül, amelyek kinõttek az MRS lemezeken és Cm¹MRS lemezeken szubkultúráztuk õket. Végül a Cm¹rezisztens kolóniákból származó DNS¹t templátként alkalmazva PCR-elemzéseket végeztünk a genetikailag megjelölt kolóniák Cm¹rezisztens kolóniák közötti detektálásához (2B. ábra). Az átkerülést akkor tekintettük pozitívnak, ha legalább az egyik mintában legalább két PCR-pozitív kolóniát detektáltunk. A találmányban ismertetett eljárással szelektált baktériumtörzseket tovább is vizsgáltuk annak érdekében, hogy meghatározzuk szingularitásukat és probiotikus tulajdonságaikat, ahogy azok a 3. és 4. példában szerepelnek. 1c. példa: Tejsavbaktériumok izolálása A találmányban ismertetett szelektálási eljárásnak alávetett baktériumtörzseket széklettõl eltérõ különféle forrásokból, például kecskesajtból és emberi anyatejbõl és magzatvízbõl nyertük. Ezt az izolálási eljárást az alábbiak szerint végeztük: Emberi anyatejbõl történõ izolálás Egy 35 éves nõtõl (a szülés után 15 nappal) aszeptikusan két milliliteres emberi anyatej mintákat vettünk. A baktériumtörzsek mintából történõ izolálása érdekében 0,1 ml peptonos vízzel hígítási sort készítettünk és (6,2¹es ph¹jú) MRS, (5,5¹es ph¹jú) MRS, APT, RCM, LM 17, GM 17 és Elliker agarlemezekre szélesztettük õket, majd 37 C¹on aerob vagy anaerob körülmények között 24 48 óráig inkubáltuk. Az összesen mintegy 740 kolóniából kiválasztottunk 74 kolóniát (10%), amelyek legalább kettõt magukban foglalták az értékelt különféle morfológiákkal rendelkezõ kolóniák közül, majd ezeket MRS agaron, anaerob körülmények között, 37 C¹on továbbkultúráztuk és a javasolt eljárás szerint teszteltük: Az e mintából származó kolóniák közül kettõ felelt meg a meghatározott kritériumoknak. Az anyatejbõl származó szelektált Lactobacillus gasseri CECT5714¹et és Lactobacillus fermentum CECT5716¹ot eredetileg anaerob körülmények között kultúrázott (6,2¹es ph¹jú) MRS agarlemezeken izoláltuk, míg a Lactobacillus gasseri CECT5715¹öt anaerob körülmények között kultúrázott APT agarlemezeken izoláltuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Emberi magzatvízbõl történõ izolálás A baktériumtörzsek emberi magzatvízbõl történõ izolálását klinikai személyzet által két önkéntestõl szülés során aszeptikusan nyert 2 ml emberi magzatvíz hígításával végeztük. 0,1 ml peptonos vízzel hígítási sort készítettünk és (6,2¹es ph¹jú) MRS, (5,5¹es ph¹jú) MRS, APT, RCM, LM17, GM17 és Elliker agarlemezekre szélesztettük õket, majd 37 C¹on aerob vagy anaerob körülmények között 24 48 óráig inkubáltuk. Az összesen mintegy 400 kolóniából kiválasztottunk 40 kolóniát (10%), amelyek legalább kettõt magukban foglalták az értékelt különféle morfológiákkal rendelkezõ kolóniák közül, majd ezeket MRS agaron, anaerob körülmények között, 37 C¹on továbbkultúráztuk és a javasolt eljárás szerint teszteltük. Az ebbõl a forrásból szelektált két törzs azonos volt az emberi anyatejbõl korábban szelektáltakkal, nevezetesen a Lactobacillus gasseri CECT5714-gyel és CECT5715-tel. Élelmiszertermékekbõl (kecskesajtból) történõ izolálás A baktériumtörzsek élelmiszertermékekbõl történõ izolálását az élelmiszertermék központi részébõl aszeptikusan vett 20 g¹os minta peptonos vízben történõ homogenizálásával végeztük. A 0,1 ml¹es hígításokat MRS agarlemezekre (Oxoid) és RCM agarlemezekre (Oxoid) szélesztettük, majd aerob vagy anaerob körülmények között, 48 óráig, 32 C¹on kultúráztuk. Az összesen több mint 500 kolóniából minden kísérleti körülménynél 5 kolóniát választottunk ki és MRS agaron, 37 C¹on, anaerob körülmények között továbbkultúráztuk. A kolóniákat a javasolt eljárás szerint teszteltük. Csak egy olyan kolónia volt, ami eleget tudott tenni a meghatározott kritériumoknak. A szelektált sajteredetû kolóniát, a Lactobacillus coryniformis CECT5711¹et, eredetileg aerob körülmények között kultúrázott MRS agarlemezeken izoláltuk. Emberi anyatejjel táplált csecsemõk székletébõl történõ izolálás A baktériumtörzsek emberi székletbõl történõ izolálását három független (15 45 napos) csecsemõtõl aszeptikusan vett 2 g¹os székletminták peptonos vízben történõ homogenizálásával végeztük. A hígításokból 0,1 0,1 ml¹t (6,2¹es ph¹jú) MRS, (5,5¹es ph¹jú) MRS, APT, RCM, LM17, GM17 és Elliker agarlemezekre szélesztettük, majd 37 C¹on aerob vagy anaerob körülmények között 24 48 óráig inkubáltuk. Az összesen mintegy 670 kolóniából kiválasztottunk 67 kolóniát (10%), amelyek legalább kettõt magukban foglalták az értékelt különféle morfológiákkal rendelkezõ kolóniák közül, majd ezeket MRS agaron, anaerob körülmények között, 37 C¹on továbbkultúráztuk és a javasolt eljárás szerint teszteltük. Csak egy olyan kolónia volt, ami eleget tudott tenni a meghatározott kritériumoknak. A szelektált csecsemõszéklet-eredetû kolóniát, a Lactobacillus salivarius subsp. salivarius CECT5713¹at, eredetileg aerob körülmények között kultúrázott (6,2¹es ph¹jú) MRS agarlemezeken izoláltuk. 9
2. példa: Fiziológiai és genetikai jellemzés Az MRS tápközegben (agarban vagy táplevesben), 37 C¹on, anaerob körülmények között növesztett, egyes szelektált baktériumtörzsek fenotípusa az I. táblázatban leírtaknak megfelelõ: I. táblázat A különféle találmány szerinti probiotikus törzsek fenotípusos jellemzõi A találmány szerinti különféle probiotikus törzsek fenotípusos jellemzõit összehasonlítottuk ismert, kereskedelmi forgalomban kapható probiotikus törzsekben (Lactobacillus rhamnosus LGG a Valio-tól. Lactobacillus johnsonii Lal a Nestlétõl és Lactobacillus casei immunitas a Danone-tól) megfigyeltekkel Teszt CECT571 1 CECT571 3 CECT571 4 CECT571 5 CECT571 6 LGG LA1 LC Origen sajt széklet anyatej anyatej anyatej széklet széklet széklet Gram + + + + + + + + Kataláz Oxidáz Morfológia pálcika pálcika pálcika pálcika pálcika pálcika pálcika kis méretû pálcika Méret (mm) 1 1,5 4 0,9 1,5 3 0,9 2 4 1 2 10 1 1,5 3 1 2 4 0,9 1,5 3, 0,9 1,5 2 5 Motilitás nincs motilitás nincs motilitás nincs motilitás nincs motilitás nincs motilitás nincs motilitás nincs motilitás nincs motilitás hosszú láncok Aggregálódás egyedülálló/páros egyedülálló/páros egyedülálló/páros egyedülálló/páros egyedülálló/páros egyedülálló/páros egyedülálló/páros A szelektált probiotikus törzsek azonosításához 37 C¹on, anaerob körülmények között, 24 és 48 órán át API 50CH (BioMerieux) elemzést végeztük a gyártó által speciálisan megadott utasítások követésével. 30 A 24 óra után kapott eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze. Pozitív fermentálható szubsztrát az, amelyiknél az érték nagyobb mint 3. II. táblázat A különféle találmány szerinti probiotikus törzsek fermentációs mintázatai Az API 50CH eljárás (BioMerieux) alkalmazásával összehasonlítottuk a találmány szerinti különféle probiotikus törzsek fermentáló kapacitását az egyes kereskedelmi forgalomban kapható probiotikus törzsekben (Lactobacillus rhamnosus LGG a Valio-tól, Lactobacillus johnsonii LA 1 a Nestlétõl és Lactobacillus casei immunitas a Danone-tól) megfigyeltekkel. A pozitív fermentálható szubsztrátokat szürke színnel jelöltük Teszt 5711 5713 5714 5715 5716 LGG LA1 L. casei Glicerin 0 0 0 0 0 0 0 0 Erithritol 0 0 0 0 0 0 0 0 D-arabinóz 0 0 0 0 0 3 0 0 L-arabinóz 0 3 0 4 4 0 0 5 Ribóz 0 4 0 4 4 0 0 5 D-xilóz 0 0 0 0 0 0 0 0 L-xilóz 0 0 0 0 0 0 0 0 Adonitol 0 0 0 0 0 0 0 0 -metil-xilozid 0 0 0 0 0 0 0 0 Galaktóz 4 5 4 5 5 5 4 5 D-glükóz 5 5 5 5 5 5 5 5 D-fruktóz 5 5 5 5 5 5 5 5 D-mannóz 5 5 5 5 3 5 3 5 10
II. táblázat (folytatás) Teszt 5711 5713 5714 5715 5716 LGG LA1 L. casei L-szorbóz 0 0 0 0 0 0 0 0 Ramnóz 0 0 0 0 0 0 0 3 Dulcitol 0 0 0 0 0 5 0 0 Inozitol 0 0 0 0 0 1 0 0 Mannitol 5 5 0 3 0 5 0 4 Szorbitol 0 5 0 0 0 5 0 1 -metil-d-mannóz 0 0 0 0 0 0 0 0 -metil-d-glükozid 0 0 0 0 0 0 0 0 N-acetil-glükózamin 5 5 4 5 0 5 4 5 Amigdalin 0 0 0 5 0 1 0 1 Arbulin 0 4 5 5 4 4 0 4 Eszkulin 0 5 5 5 0 5 5 5 Szalicin 0 3 5 5 0 5 1 4 Cellobióz 0 4 5 5 0 5 5 5 Maltóz 0 5 5 5 5 0 1 5 Laktóz 5 5 0 4 5 0 5 5 Melibióz 0 5 0 0 5 0 0 0 Szacharóz 5 5 5 5 5 1 5 5 Trehalóz 0 5 5 5 0 5 4 4 Inulin 0 0 0 0 0 0 0 0 Melezitóz 0 0 0 0 0 2 0 0 D-raffinóz 0 5 0 0 5 0 4 0 Amidon 0 0 3 5 0 0 0 1 Glikogén 0 0 0 0 0 0 0 0 Xilitol 0 0 0 0 0 0 0 0 -gentiobióz 0 2 5 5 0 2 5 4 D-turanóz 0 0 0 0 0 0 0 0 D-lixóz 0 0 0 0 0 0 0 0 D-tagatóz 0 0 5 5 0 5 3 3 D-fukóz 0 0 0 0 0 0 0 0 L-fukóz 0 0 0 0 0 4 0 0 D-arabitol 0 0 0 0 0 0 0 0 L-arabitol 0 0 0 0 0 0 0 0 Glükonát 0 1 0 1 1 3 0 3 2-ceto-glükonát 0 0 0 0 0 0 0 0 5-ceto-glükonát 0 0 0 0 0 1 0 0 A szelektált baktériumtörzseket a BCM/LMG (Belgium) és/vagy a NIZO Food Research (Hollandia) által meghatározott SDS-PAGE 1D fehérjeprofiljuk, illetve 60 16S rdns-szekvenciájuk alapján rendszertanilag kategorizáltuk. A tesztekben kapott eredmények a fentiek szerint a baktériumtörzsek rendszertani kategorizálá- 11
sához vezettek. A fenti besorolással a találmány szerinti baktériumtörzseket a Budapesti Egyezménnyel összhangban 2002. június 11¹én, a spanyolországi Valenciában az alábbi hozzáférési számok alatt helyeztük letétbe a CECT-nél (Colección Española de Culotivos Tipo): Lactobacillus coryniformis: CECT5711 Lactobacillus salivarius subsp. salivarius: CECT5713 Lactobacillus acidophilus: CECT5714 Lactobacillus gasseri: CECT5715 Lactobacillus fermentum: CECT5716 3. példa: A szelektált törzsek szingularitása. Bár az SDS-PAGE 1D fehérjeprofil és a 16S rdnsszekvencia elemzése, amelyet a 2. példában végeztünk, megfelelõ eljárások a baktérium fajának meghatározására, nem elég specifikusak ahhoz, hogy különbséget tudjanak tenni az azonos baktériumfajhoz tartozó különbözõ törzsek között. Emiatt két különbözõ Lactobacillus-specifikus láncindító (ArgDei és OPL5) alkalmazásával a törzseken RAPD-PCR elemzést végeztünk. A Random Módon Amplifikált Polimorf DNS (RAPD)-PCR elemzéshez 10 ml¹es egyéjszakás MRS tenyészetekbõl DNeasy szöveti reagenskészlet (Qiagen) alkalmazásával és a beszállító által a Gram-pozitív baktériumok genomiális DNS-ének izolálásához javasolt protokollt követve genomiális DNS¹t izoláltunk. Az ezt követõ, Techne DNS Termociklus-készülékben végzett PCR-amplifikálásokhoz a teljes DNS¹t használtuk. A PCR-amplifikálásokat vagy az OPL5 láncindító (5 -ACGCAGGCAC¹3 ), vagy az ArgDei láncindító (5 - ACCYTRGAAGGYGGYGATGTB¹3 ) alkalmazásával végeztük. A PCR-elegyekbõl öt¹öt l-nyit vizsgáltunk 1,2 vegyes%¹os agarózgélen (Sigma), etidium-bromid festéssel. Molekulatömeg-standardként egy 100 bp¹os létrát (Invitrogen) használtunk A géleket 100 V¹on, körülbelül 1 óráig futtattuk, majd a DNS¹t a Diversity Database szoftvercsomag (Bio-Rad) alkalmazásával egy géldokumentáló rendszerben (Gel Doc 2000. Bio-Rad) tettük láthatóvá és elemeztük. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. Emellett az új eljárással szelektált baktériumtörzsek szingularitásának tesztelése és a más szelektálási kritériumokkal nyert, de korábban azonos fajba sorolt törzsekkel történõ összehasonlítás érdekében. Ezeket a probiotikus törzseket számos kultúragyûjteménybõl, így például a CECT-bõl, az ATCC-bõl, az LMG-bõl vagy a DSM-bõl nyertük és a III. táblázatban ismertetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 III. táblázat A találmány szerinti probiotikumok szingularitásának tesztelésére alkalmazott probiotikus törzsek Lactobacillus coryniformis DSM 20005: Lactobacillus coryniformis subsp. torquens DSM 20007: Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis CECT 982: Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis CECT 4129: Lactobacillus coryniformis subsp. torquens Lactobacillus fermentum LMG 8900: Lactobacillus fermentum= ATCC 11976 LMG 17551: Lactobacillus fermentum= ATCC 23271, CECT 285: Lactobacillus fermentum= ATCC 9338 CECT 4007: Lactobacillus fermentum= ATCC 14931 Lactobacillus gasseri LMG 11413: Lactobacillus gasseri LMG 13047: Lactobacillus gasseri= ATCC 19992 LMG 13134: Lactobacillus gasseri= ATCC 9857 LMG 18176: Lactobacillus gasseri LMG 18194: Lactobacillus gasseri CECT 4479: Lactobacillus gasseri Lactobacillus salivarius DSM 20492: Lactobacillus salivarius CECT 4062: Lactobacillus salivarius CECT 4063: Lactobacillus salivarius Két különbözõ láncindító alkalmazásával a találmány szerinti összes szelektált törzset összehasonlítottuk a III. táblázatban ismertetett törzsekkel RAPD- PCR profiljuk tekintetében, és az elemzések eredményei (4. ábra) azt mutatják, hogy a találmány szerinti szelektált baktériumok különböznek a korábban leírtaktól. Emellett ki is terjesztettük eredményeinket és nemcsak a szelektált törzsek genetikai jellemzõit, hanem biokémiai aspektusait is összehasonlítottuk a III. táblázatban ismertetett törzsekével. Ebben az értelemben API elemzéseket (BioMerieux) (IV. táblázat), APIZYM elemzéseket (BioMerieux) (V. táblázat) és antibiotikum-rezisztencia vizsgálatokat végeztünk az 5g. példában leírtak szerint (VI. táblázat). A találmány szerinti törzsekben megfigyeltektõl eltérõ aktivitásokat szürke színnel jelöltük. 12
HU 004 295 T2 IV. táblázat A szelektált baktériumok API-profiljának azonos fajhoz tartozó más baktériumokéval történõ összehasonlítása a találmány szerinti eljárás alkalmazásával. L. coryniformis L. salivarius L. gasseri L. fermentum Teszt 5711 4129 982 2007 2005 5713 4063 4062 20492 5714 11413 18194 4479 18176 13047 5715 11413 18194 4479 18176 13047 5715 4007 285 17551 8900 Glicerin 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erithritol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 5 Ribóz 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 5 5 5 5 5 D-xilóz 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 5 L-xilóz 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Adonitol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Galaktóz 5 5 5 5 5 5 5 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 5 D-glükóz 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 0 4 3 3 D-arabinóz L-arabinóz -metilxilozid D-fruktóz D-mannóz L-szorbóz 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 Ramnóz 0 0 4 0 0 0 4 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Dulcitol 5 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 Inozitol 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mannitol 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 13
HU 004 295 T2 IV. táblázat (folytatás) L. coryniformis L. salivarius L. gasseri L. fermentum Teszt 5711 4129 982 2007 2005 5713 4063 4062 20492 5714 11413 18194 4479 18176 13047 5715 11413 18194 4479 18176 13047 5715 4007 285 17551 8900 Szorbitol 0 0 0 0 0 5 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 5 5 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 0 5 5 0 5 5 0 5 5 0 0 0 0 0 0 Arbulin 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 5 1 5 5 4 5 5 1 5 5 4 4 0 0 0 0 Eszkulin 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 Szalicin 0 0 4 0 0 0 0 5 0 5 5 5 5 5 3 5 5 5 5 5 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 Maltóz 4 5 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 Laktóz 5 5 0 0 5 5 5 5 5 0 1 5 5 5 0 4 1 5 5 5 0 5 5 5 5 5 Melibióz 0 0 0 0 0 5 5 5 5 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 5 5 5 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 5 0 Trehalóz 0 0 0 0 0 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 Inulin 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -metil- D-mannóz -metil- D-glükozid N-acetilglükózamin Amigdalin Cellobióz Szacharóz Melezitóz 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14
HU 004 295 T2 IV. táblázat (folytatás) L. coryniformis L. salivarius L. gasseri L. fermentum Teszt 5711 4129 982 2007 2005 5713 4063 4062 20492 5714 11413 18194 4479 18176 13047 5715 11413 18194 4479 18176 13047 5715 4007 285 17551 8900 0 0 0 0 0 5 5 5 5 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 5 0 5 2 4 0 3 Amidon 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 1 5 3 3 5 1 1 5 3 3 0 0 0 0 0 Glikogén 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Xilitol 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D-lixóz 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 5 3 5 5 5 5 5 3 5 5 5 0 0 0 0 0 D-fukóz 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 L-fukóz 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 2 3 2 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D-raffinóz -gentiobióz D-turanóz D-tagatóz D-arabitol L-arabitol Glükonát 2-cetoglükonát 5-cetoglükonát 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 15
Az alkalmazott probiotikus törzseket a III. táblázatban mutatjuk be. A találmány szerinti törzsekben megfigyeltektõl eltérõ aktivitásokat szürke színnel jelöltük. V. táblázat A szelektált baktériumok APIZYM-profiljának azonos fajhoz tartozó más baktériumokéval történõ összehasonlítása a találmány szerinti eljárás alkalmazásával L. coryniformis Enzim DSM 20005 CECT 4129 DSM 20007 CECT 982 CECT 5711 Kontroll Alkalikus foszfatáz 1 1 Észteráz (C4) Észteráz-lipáz (C8) Lipáz (C14) 1 Leucin-arilamidáz + + + + + Valin-arilamidáz + + + + + Cisztin-arilamidáz 2 2 1 1 1 Tripszin -kimotripszin Savas foszfatáz 1 3 1 1 1 Naftol-AS-B1-foszfohidroláz + + + + -galaktozidáz 1 1 -galaktozidáz + + + -glükuronidáz 1 1 -glükozidáz + + 3 3 + -glükozidáz N-acetil- -glükózaminidázok -mannozidáz -fruktozidáz L. salivarius Enzim DSM 20492 CECT 4062 CECT 4063 CECT 5713 Kontroll Alkalikus foszfatáz 2 2 + Észteráz (C4) 2 2 3 Észteráz lipáz (C8) 3 Lipáz (C14) Leucin-arilamidáz + + + + Valin-arilamidáz 2 1 Cisztin-arilamidáz 1 4 3 Tripszin -kimotripszin Savas foszfatáz + + + 4 Naftol-AS-B1-foszfohidroláz 1 3 + -galaktozidáz + 3 2 -galaktozidáz + 3 + -glükuronidáz -glükozidáz 16
HU 004 295 T2 V. táblázat (folytatás) Enzim DSM 20492 CECT 4062 CECT 4063 CECT 5713 -glükozidáz N-acetil- -glükózaminidázok -mannozidáz -fruktozidáz L. gasseri Enzim LMG 11413 LMG 13047 LMG 13134 LMG 18176 LMG 18194 CECT 4479 CECT 5714 CECT 5715 Kontroll Alkalikus foszfatáz Észteráz (C4) 2 1 1 1 1 1 1 1 Észteráz-lipáz (C8) Lipáz (C14) Leucin-arilamidáz + + + + + + + + Valin-arilamidáz 1 1 3 2 Cisztin-arilamidáz 1 1 4 2 3 4 1 1 Tripszin -kimotripszin 1 Savas foszfatáz 1 2 + 1 2 1 1 Naftol-AS-B1-foszfohidroláz 1 + + + + + + + -galaktozidáz + + + + + -galaktozidáz 4 1 3 -glükuronidáz + + -glükozidáz 1 + 1 2 1 1 -glükozidáz + 3 + 3 4 + N-acetil- -glükózaminidázok + 1 + 1 -mannozidáz -fruktozidáz L. fermentum Enzim CECT 285 CECT 4007 LMG 8900 LMG 17551 CECT 5716 Kontroll Alkalikus foszfatáz 2 Észteráz (C4) 3 4 3 4 2 Észteráz-lipáz (C8) 3 4 3 4 3 Lipáz (C14) Leucin-arilamidáz + + + + + Valin-arilamidáz 1 4 4 2 1 Cisztin-arilamidáz 1 4 3 1 1 Tripszin -kimotripszin Savas foszfatáz + + + 3 1 Naftol-AS-B1-foszfohidroláz + + 3 3 2 -galaktozidáz + 2 + 1 4 17
V. táblázat (folytatás) Enzim CECT 285 CECT 4007 LMG 8900 LMG 17551 CECT 5716 -galaktozidáz + + + + + -glükuronidáz 1 -glükozidáz + 4 + + 3 -glükozidáz N-acetil- -glükózaminidázok -mannozidáz -fruktozidáz Az alkalmazott probiotikus törzseket a III. táblázatban mutatjuk be. A találmány szerinti törzsekben 15 megfigyeltektõl eltérõ aktivitásokat szürke színnel jelöltük. VI. táblázat A szelektált baktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának azonos fajhoz tartozó más baktériumokéval történõ összehasonlítása a találmány szerinti eljárás alkalmazásával L. coryniformis Antibiotikum 20005 20007 4129 982 CECT 5711 P10 S S S S S E15 S S S S S KF30 S I S S S FOX30 S R S R R CIP5 R I R R R DA2 S S S S S AML25 S S S S S C30 S S S S S CN10 R R R R R TE30 S S S S S CLR15 S S S S S SXT25 I R R R I AMP10 S S S S S NA30 R R R R R VA30 R R R R R MTZ5 R R R R R L. salivarius Antibiotikum 20492 4063 4062 CECT 573 P10 S S S S E15 S S S S KF30 S S S S FOX30 S S S S CIP5 R I I S DA2 S S S S AML25 S S S S C30 S S S S CN10 R R R R 18
HU 004 295 T2 VI. táblázat (folytatás) Antibiotikum 20492 4063 4062 CECT 573 TE30 S S S S CLR15 S S S S SXT25 I R R R AMP10 S S S S NA30 R R R R VA30 R R R R MTZ5 R R S R L. gasseri Antibiotikum 11413 13047 13134 18176 18194 4479 CECT 5714 CECT 5715 P10 S S S S S S S S E15 S S S S S S S S KF30 S S S S S S S S FOX30 S S I S S S S S CIP5 R R R R R R R R DA2 S I S R R R S S AML25 S S S S S S S S C30 S S S S S S S S CN10 R R R R R R R R TE30 S S S S S S S S CLR15 S S S S S S S S SXT25 R R R R R R R R AMP10 S S S S S S S S NA30 R R R R R R R R VA30 S S S S S I I I MTZ5 R R R R R R R R L. fermentum Antibiotikum 285 4007 8900 17551 CECT 5716 P10 S S S S S E15 S S S S S KF30 S S S S S FOX30 R R S R I CIP5 R R R R R DA2 S S S S S AML25 S S S S S C30 S S S S S CN10 R R R R R TE30 S S S S S CLR15 S S S S S SXT25 R R R R R AMP10 S S S S S NA30 R R R R R VA30 R R R R R MTZ5 R R S R R 19
Az alkalmazott probiotikus törzseket a III. táblázatban mutatjuk be. Az alkalmazott antibiotikumokat és metodológiát a 4e. példában ismertetjük. R=rezisztens, I=átmeneti, S=érzékeny. A találmány szerinti törzsekben megfigyeltektõl eltérõ aktivitásokat szürke színnel jelöltük. 4. példa: A törzsek probiotikus jellemzõi A találmány szerinti probiotikus szelektálási eljárás megfelelõségét is megvizsgáltuk a kívánatos probiotikus jellemzõkkel rendelkezõ baktériumtörzsek szelektálására való képesség szempontjából. Ennek értékelése érdekében a szelektált törzseket számos különféle olyan jellemzõ szempontjából megvizsgáltuk, amelyek fokozhatják probiotikus törzsként történõ mûködésre való képességüket. Emellett (a megadottak szerint) önkényesen numerikus értékeket rendeltünk az egyes tesztekben kapott eredményekhez annak érdekében, hogy össze tudjuk hasonlítani a találmány szerinti probiotikus törzseket egyéb szelektálási kritériumok szerint nyertekkel. A kapott eredményeket a példa végén található VIII. táblázatban foglaltuk össze és az alábbi alpéldákban ismertetjük és hasonlítjuk össze egyes kereskedelmi forgalomban kapható törzsekkel. 4a. példa: Caco 2 és HT 29 sejtekhez történõ kitapadás vizsgálata Caco2 és HT 29 sejtek kultúrázása A kitapadási és gátlási vizsgálati eljárásokhoz a Caco 2 (ATCC HTB 37) és a HT 29 (ATCC HTB 38) sejtvonalat használtuk a bélsejtek modellezésére. Mindkét sejtvonal a bélsejtekre jellemzõ tulajdonságokat mutat, így például polarizáltak, bélenzimek expresszálódnak bennük és különleges szerkezeti polipeptideket és mucinokat termelnek. A sejteket (75 cm 2 ¹es, Nunc) mûanyag flaskákban, 10% inaktivált FCS-sel (borjú-magzatszérum, PAA laboratories), nem esszenciális aminosavakkal, 100 E/ml penicillinnel/sztreptomicinnel, és 1 g/ml amfoterinnel kiegészített DMEM (PAA laboratories) tápközegben növesztettük. A sejtkultúrázást 37 C¹on végeztük, 95% levegõt és 5% CO 2 ¹ot tartalmazó atmoszférában. A tápközeget kétnaponta cseréltük és a sejteket hetente osztottuk szét. A kitapadási vizsgálathoz a sejteket 35 mm¹es mûanyag edényekbe (Nunc) osztottuk szét, majd hasonló körülmények között, de a konfluenciát követõen antibiotikumok nélkül kultúráztuk. A kitapadási vizsgálatokat a konfluencia után 10 14 nappal végeztük. Baktériumok tenyésztése Probiotikus törzsek: A találmány szerinti probiotikus törzseket 0,1 térfogat%¹os glicerin-törzsoldattal történõ beoltást követõen (6,2¹es ph¹jú) MRS táplevesben, anaerob körülmények között, 16 18 órán át, 37 C¹on kultúráztuk. Ilyen körülmények között a tenyészet koncentrációja az MRS agaron történõ szélesztéssel megfigyeltek szerint 1 2 10 9 cfu/ml volt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Gram-negatív törzsek: Az Escherichia coli O157:H7 (nem kórokozó) (CECT4972), E. coli O157:H7 (enterális kórokozó) (CECT4783), E. coli O157:H7 (enterális kórokozó) (CECT4782), Salmonella cholerasuis typhi (CECT409) és S. cholerasuis typhimurium (CECT443) törzsek mindegyikét a CECT-bõl (Colección Española de Cultivos Tipo) nyertük. Minden Gram-negatív törzset 0,1 térfogat%¹os glicerin-törzsoldattal történõ beoltást követõen TBS táplevesben (AES Laboratories), anaerob körülmények között, 16 18 órán át, 37 C¹on kultúráztuk. Ilyen körülmények között a tenyészet koncentrációja a TBS agaron (AES Laboratories) történõ szélesztéssel megfigyeltek szerint 1¹2 10 9 cfu/ml volt. Tapadásmérés A Caco 2 és a HT 29 bélsejtvonalat 35 mm¹es mûanyag edényekben, 2 ml, antibiotikum nélküli tápközegben konfluenciáig kultúráztuk. A konfluencia után 10 14 nappal, 1 ml tápközeget 10 8 baktérium DMEMben készített 1 ml¹es szuszpenziójára cseréltünk. A tenyészeteket 1 órán át 37 C¹on inkubáltuk. A sejteket ezt követõen kétszer mostuk PBS-ben, majd jéghideg 70%¹os metanolban 30 percig fixáltuk. A lemezeket megszárítottuk, majd Gram-festettük. A kitapadt baktériumokat optikai Axiovert 200 mikroszkóppal (Zeiss), 1000-szeres nagyítással, olajimmerzióban tettük láthatóvá. Húsz randomizált mezõben számlálást végeztünk, és az eredményeket az egyes mezõkben a sejtekhez tapadt baktériumok számának átlaga ±SD formában fejeztük ki. Egy probiotikus törzs kapacitását akkor tekintettük magasnak, ha a kitapadt baktériumok száma 250 felett volt, akkor közepesnek, ha 100 és 250 között volt, és akkor alacsonynak, ha 100 alatt volt (5. ábra). 4b. példa: Savakkal és epesókkal szembeni rezisztencia A találmány szerinti probiotikus törzsek savakkal és magas epesótartalommal, azaz olyan körülményekkel szembeni rezisztenciájának elemzéséhez, amelyekkel e baktériumok az emésztõrendszeren történõ áthaladás során találkoznak, a baktériumokat vagy 3,0¹es ph¹n MRS táplevesben vagy 6,2¹es ph¹n 0,15% epesóval (Sigma) kiegészített MRS táplevesben 90 percig kultúráztuk. A túlélési arányokat a hígítások MRS agarlemezekre történõ szélesztésével számoltuk és összehasonlítottuk a kontroll körülmények (6,2¹es ph¹jú MRS tápleves) között nyert kolóniák számával. A lemezeket 16 18 órán át, anaerob körülmények között, 37 C¹on kultúráztuk. A kísérletet háromszor ismételtük meg. A törzseket rezisztenciáját akkor tekintettük magasnak, ha a túlélési arány a kontroll körülményekkel összehasonlítva 80% felett volt, akkor közepesnek, ha 80% és 60% között volt, és akkor alacsonynak, ha 60% alatt volt (6. ábra). 4c. példa: Generációs idõ A generációs idõ ami baktériumtenyészetekben a baktériumok koncentrációjának megduplázásához 20