A menü Ovuláció diagnosztika szukában DR. Szász Ferenc PhD. Dipl ECAR ANI-REP Állatorvosi Rendelő Budapest fszasz@animalrep.axelero.net +3--31- VET-MED-LABOR Webinar előadások 15 A szuka szaporodás endokrinológiája röviden Vaginoszkópia és a hüvelycitológia diagnosztikai jelentősége Kiegészítő vizsgálatok: progeszteron quantitatív és semi-quantitatív (P) tesztek és LH teszt Klinikai alkalmazás lehetőségei Ivarérés (Pubertás) 1. A szuka szaporodás endokrinológiája Reproduktív képesség kialakulásának folyamata Kezdete: hypothalamikus neuronok képesek elegendő GnRH-t termelni a gametogenezis beinditásához. (GnRH neuronok fejlődését meghatározza: testméret,-tömeg küszöbérték, környezeti hatás, genetikai háttér) Nőstény reprodukciós ciklikusság hím folyamatos nemi aktivitás Nő(stény) vagy Hím? Defeminizáció Alfa-foetoprot. GnRH surge E centrum Hypothalamus Oestradiol (E) ovarium GnRH tonic centrum Alfa-foetoprotein GnRH surge centre Hypothalamus T E GnRH tonic centrum T testis Testosteron (T) Endokrin különbség Hímben nincs LH csúcs, (GnRH surge center hiány!) - órás állandó apró hullámok (GnRH tonic centrum) (GnRH LH T állandó pulzáló ritmus) Nőstény: GnRH LH és oestradiol csúcsok kb. naponta (fajtól függ!!) 1
Reprodukciós hormonok 1. Amino-sav eredetűek; dopamine, catecholamin, thyroid hormonok. Kis molekulájú neuropeptidek; GnRH, TRH, somatostatin, vasopression 3. Nagy molekulájú fehérjék; LH, FSH, insulin, parathyroid hormon. Szteroid hormonok; oestrogen, progesterone, testosterone, cortisol 5. Vitamin derivátumok; retinoidok Hormonok funkciói -GnRH: gonadotrop hormon leadás serkentése -FSH: folliculogenezis (emelkedő frequencia -3 héttel előtte) -LH: ovuláció (indukció) -Ösztrogén: nemi szervek ivarzási tünetei, tűrési reflex (P-együtt), LH csúcs indukció, (ellés) -Progeszteron (CL): preovulációs P, méh előkészítése a vemhességre (proliferativ secretios, myometrium immotilitás, leukocyta migráció gátlása), cervix zárás, vemhesség fenntartása, emlőtelep fejlődése End krin szabályozás A szuka szaporodásbiológiája Hypothalamus GnRH + Hypophysis Elülső lebeny P - FSH+LH + E F F ovariumok CL CL E PGf Méh+endometrium P Cervix Vagina Mono-oestrusos faj, mérsékelt szezonalitás Ivarérés 7-1 hónap -1 (1) havonta ivari ciklusok Tüzelés 1-1 nap (9 nap prooe, 9 nap oe) Preovulációs P Spontán leváló petesejt(ovuláció)! Vemhes- nem vemhes szinte nincs hormonális különbség Oestrus Anoestrus Metoestrus Metoestrus Anoestrus Oestrus Tüzelés eleje (proestrus) FSH szint LH fokozott pulzáció Folliculogenezis E Oestrus tünetek: E + P poz. Feedback HT+HP FSH+LH P. Concannon nyomán Véres ivarzási nyák Tüszőérés hatás(péra, hüvely, méh) Vaginal cytológia (3- % cornificatio) Türési reflex indul az LH csúcs körüli időben (átlag: 1 nap post LH) (3 nap pre-lh vagy 5 nap post-lh) P. Concannon nyomán
Proestrus Oestrus eleje LH csúcs a nap Ösztrogén szint csúcson, majd csökken 9-11. napon LHcsúcs (h át) LH-teszt P-szint emelkedés, mérés P~ ng/ml ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 1 1 1 1 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 OVULÁCIÓ P LH Ovuláció Fertilizációs periódus 11-13. napon P~5ng/ml Ovuláció: LH csúcs után (3- h) Éretlen, primer petesejtek válnak le Érés 3- óra ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 1 1 1 1 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 OVULÁCIÓ P LH Érett petesejtek vannak 13-1. napos tüzelés P: 7-ng/ml (1ng/ml) Post LH:.-7. nap csúcs fertilitás) (post ov. Élettart. 7-9 nap) Gyors fertilitás csökkenés (cervixzár, ova degeneráció) Spermium élettartam -7 nap Uterinális mirigyekben tárolódnak (reservoar) Alomszám spermium szám (5-5M) ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 1 1 1 1 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 OVULÁCIÓ P LH Megtermékenyülésbarázdálódás Zigóta barázdálódása petevezetőben 3- sejtes blastocysták a méhbe érkeznek (~1. nap az LH csúcs után) P~-5ng/ml Cervix záródik (spermium nem juthat be) Metoestrus Cytológiai oestrus vége Kevés sejt (parabasalis, basalis, nyálkáskenet, fvs) Vemhes-nem vemhes: nincs jelentős endokrin különbség Vemhesség: CL dependens P-szint magas (15-5- 7ng/ml) P átmeneti csökken (5nap) Prolactin emelkedik Vemhesség: Relaxin naptól 3
Metoestrus Két szakasz (szövettani): progresszív (LHcsúcs- nap)és regresszív (P.- 7nap) Teljes hossza:9nap!! Endometrium desquamatio kezdődik 9. napon és 1 napig tart. Teljes endometrium regeneráció 15nap!!! ( rövid- interoestrus periodus infertilitás). Ovuláció diagnosztika Miért ajánlott a ciklus diagnosztika? Ovuláció diagnosztika Meddőségi ok lehet a rossz időpont (75%) A fogamzó képes periódus eltérhet - Egyedenként - Fajtánként - Egyednél is a ciklusok között - Hormonális változásra (pajzsmirigy, fogamzásgátlás) - AI: Hűtött-mélyhűtött spermával - Vemhesség-ellés ideje kiszámítható - Elektív császármetszés - Ellés indukció - ( Hypoluteoid vemhesség) Az első vizsgálat időpontját a kórelőzmény adja meg. 1. -kórelőzmény. -viselkedés megfigyelése 3. -hüvelykenet vizsgálata (cytológia). -hüvelytükrözés (vaginoszkopia) 5. -hormonszint mérés (progesteron, LH) (hüvelyellenállás mérés) Sorozatvizsgálat!!! -3 naponta ismételni! A tünetek, adatok szintézise vezet a diagnózishoz! Első vizit a tüzelés -5.napján! Kórelőzmény Viselkedési változások? Napja tüzel (hol fedeztet?) Utolsó tüzelés ideje, hossza, fedeztetés? Korábbi diagnosztika? Fedeztetés? AI? Vemhesség? Álvemhesség? UH a vemhesség alatt? Magzatfelszívódás vetélés? Ellési problémák? Gyakori, kevés vizeletürítés Kanok keresése (szökős) Farok, péra mozgatása Hüvelyvizsgálat tűrése (oestrus kezdete) Pozitív tűrés Kanok elutasítása (oestrus vége) (Ösztrogén, és P hatások)
Vaginoszkópia Vaginoscopia: proestrus Hüvelytükörrel (endoszkóp) a szuka hüvelynyálkahártya jellemzőinek vizsgálata 1. Tapadósság. Váladékkal fedettség(váladék minősége) 3. Redőzöttség Csúszós, könnyű bevezetni a tükröt Duzzadt, csillogó, ödémás nyálkahártya Sima, (nincs ránc) véres váladékkal fedett Jelentős mennyiségű véres ivarzási váladék (Ha nem engedi: nagyon korai stádium) (VIDEO) Proestrus Vaginoscopia: oestrus Engedi a tükrözést Tapadós, száraz, fénytelen nyálkahártya Kevés vizezett véres (vagy színtelen) ivarzási váladék Haránt irányú ráncok a nyh.-án. (video) Oestrus Vaginoscopia: metoestrus-anoestrus Ellenkezik a tükrözésnél Csúszós hüvely Hosszanti, jellegtelen redők Nem duzzadt, fénytelen, kevés víztiszta nyák (Video) 5
Metoestrus-anoestrus KÉP Hüvelycitológia Vizsgálni (3-x nagyítás): Sejtek száma Sejttípusok aránya Elrendeződésük Kornifikáció foka (3-%) Nyálkával való fedettség Natív, Harris-Shorr-, Diff-Quick-festés Hüvelycitológia A nyálkahártya felületéről leváló sejtek összetételének vizsgálata (ösztrogén hatás proliferátio) Sejttípusok: Basalis,(ritka) Parabasalis sejtek (proe, metoe) Intermedialis sejtek Részlegesen elszarusodott sejtek Teljesen elszarusodott Vörösvértestek (fehérvérsejtek) (baktériumok) Cytológiai proestrus Gyakran nyálkás-véres, vizes fényű kenet(makroszkópos) Kevés sejt, zömében parabasalis és intermediális sejtek, sok vvt, néhány részlegesen kornifikálódott sejt. Kornifikáció 3-5% Cytológiai oestrus Tapadós, grízes felületű kenet (makroszkópos) Sok sejt, gyakran csoportokban, rögökben, -9%-ban teljesen kornifikált sejtek, felpöndörödve, halpikkelyszerűen Száraz, nyálka nélküli kenet, vvt. kevés v. nincs
Metoestrus (cytologiai oestrus vége) Sejtszegény kenet, parabasalis és intermedialis sejtek arányának újbóli növekedése Kornifikálódott sejtek eltűnnek Metoestrális nyák a sejtcsoportok között Fehérvérsejtek előfordulása Metoestrus Natív-kenetek KÉP Harris-Shorr-festés menete Fixálás Fixálóspray (Merck) 7% alk. x be 5% alk. x be Desztvíz x be 1. Festés Harris-f hematoxilin min. Desztvíz x be Ammónia-alkohol (97 rész 7%alk+3 rész 5%ammonia oldat)1 perc Desztvíz 1x 7% alk. 1x 95% alk. 1x. Festés Shorr-festék oldat min. 95% alk. 1x be Abszolút alk (%) 1x be Xilol néhány perc Harris-Shorr-festés értékelése Differenciáló festés! Basofil-kék: nem kornifikálódott sejtek Acidofil-basofil (barna-kék) szegéllyel: részlegesen kornif. Acidofil (barna): teljesen kornifikálódott sejt 7
Harris-Shorr-féle festés Diff-Quick-festés Láng alatti kenet fixálás Diff-quick fixáló oldat (5sec.) Diff.quick eosinofil componens (5sec) Diff-quick basofil componens (3-5sec) Dest víz öblítés Kenet szárítása levegőn 1.. 3.. 5.. Diff-quick festés Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 1 1 1 ng/ml 1 P LH 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 OVULÁCIÓ Hormon vizsgálatok Quantitatív és semi-quantitatív progeszteron (P) tesztek és LH teszt Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 1 1 1 1 ng/ml Kiegészítő hormonvizsgálatok Vérszérum Pszintjének vizsgálata (BVT-teszt VIRBAC, Quanticheck SZIEÁOTK) LH-szint vizsgálata szérumból (Witness LH-teszt, PFIZER) P LH 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 OVULÁCIÓ
Quanticheck P teszt (SZIE-ÁOTK) Kompetitív ELISA-teszt Mindig felrakunk standard P-oldatot is (, 1,, 5,, és ng/ml) ul/ minta sorban P-antibody-val jelölt ELISA mikroplate Standard P-ek és minta P-ek versengése az ismert, jelölt P- vel (komplement) az inkubáció alatt ( ) szobahőn. Nem kötődött P lemosása Torma-peroxidáz enzim reakciója (komplement hasítása) kék szín ( ) Fordított arányosság a minta P-szintje és a kék szín intenzítása között (Leolvasás javasolt ha szemmel bíráljuk) Kénsavval leállítás ELISA reader-rel (fotométer) vizsgált 5nM-en. Extinkciokból (OD) PC- kalibrálja a P-szintet ng/ml-ben. Quanticheck értékelése (korr:,99) Progeszteron OD kutya, 3,5 3,,5, 1,5 1, ts rs,5 ms, rt t 5 15 Quantichek: előnyök-hátrányok BVT- teszt (VIRBAC) Előnyök Pontos adat (- ng/ml) Mindig aktuális standard sorhoz hasonlít Két párhuzamos sor átlagát számítjuk Gazdaságos (ha -3 minta/ teszt)huf - ng/ml között is használható (kórképek, gravid) Semiquantitativ tesztnek is jó Kevés mennyiségű vér is elég (1ml xul) Hátrányok Komolyabb beruházás (ELISA-reader, autom. Pipetta, hegy, softwear) Labortechnikai háttér és gyakorlat (pipettázás) Munka és időigényes Hőmérsékletre érzékeny Kevés mintánál nem gazdaságos Semiquantitatív teszt Vérplazmából és szérumból is lehet Szendvics-ELISA teszt Szobahőn, inkubációs idő kb. 15 Kék szín intenzítás elbírálása mellékelt színskála alapján (-1.5, 1.5-.5,.5-, <) 9
BVT-teszt:előnyök-hátrányok Előnyök Egyszerű és gyors teszt Kevés mintánál jól használható Nem igényel műszeres beruházást Átlagos praxis számára kielégítő LH-teszthez jól kombinálható (alacsony tartományban pontos) Hátrányok Az ovuláció időpontja nem prognosztizálható pontosan (.5-ng/ml!) Napi több minta esetén nem gazdaságos (75/teszt/minta) Magas P szintnél nem pontos (AI, gravidhypoluteoid, Meddőség, abnormális ciklusoknál nem elég pontos Nagyobb mennyiségű minta kell (3-ml vér) Witness LH-teszt (PFIZER) LH szint általában alacsony (1 ng/ml alatt) LH csúcs (7-5ng/ml) csak h át ovuláció nap múlva Fertilis periódus -7nap Ovuláció diagnosztikával együtt Szérumból (friss, a fagyasztott kétes) P: -.9ng/ml amikor várható Napi 1- minta 3 napon át Pozitiv és kétes vagy negatív WITNESS LH Eredmény értékelése Witness LH: semi-quantitative és tesztvonal színét kell hasonlítani a kontrollhoz NEGATIV ( LH < 1 ng/ml) POSITIV (LH 1 ng/ml) WITNESS LH Interpretation WITNESS LH használata ovuláció diagnosztikára ( túl a -5 proestrus napon vagy több mint 5% cornificatio kenet) Különösen jól használható, ha fogamzási zavar áll fenn Alapszint feletti LH LH és P teszt az első napon Ha LH teszt pozitív (i.e. LH 1 ng/ml) + - LH szint = alapszint + LH-teszt: előnyök és hátrányok Előnyök Kulcsfontosságú info Nagyon pontos ovulációdiagnosztika Egyszerű, gyors teszt Könnyű értékelés Meddőségi, mélyhűtőtt AI-nál extra jó lehet Hátrányok Gyakori mintavétel kell nem gyakorlatias Ovuláció diagnosztika is kell (P, cytológia) Sok mérés-drága Ovuláció diagnosztika haladóknak LH positív =LH surge (D) előkészíteni a fedeztetést kontroll P 7h múlva Folytatni az LH & P tesztet a positiv LH-ig
Mintavételi hibák és rossz módszerek Kenetvétel, : tűfogó+vatta, dorsalis hüvelyfal Kenetkészítés: hengergetése a tamponnak Ugyanolyan napszakban vegyünk vért Haemolízist kerüljük Éhgyomor,ha lehet (lipaémia nem jó) Egy ciklus-egy labor Csak vér-nem ér diagnózist Nem jó az üvegcső v. zselés alvadássegítő PP cső /fecsi, eppendorf, golyócskás alvadásserkentő cső Centrifugálj ha később vizsgálsz!! Hőhatás fontos (ELISA P eredmények nem korrelálnak a ciklussal!?) Klinikai alkalmazás lehetőségei Fedeztetés időpontjának meghatározása Tüzelés 1-1 nap (9 nap pro-oe, 9 nap oe) 9-11. napon LH-csúcs (h át) P~ ng/ml 1-13. napon Ovuláció: LH csúcs után (3-h) P~5ng/ml Éretlen, primer petesejtek válnak le 1-1. naposan: érett petesejtek (post ov. Élettart. 7-9 nap) P: 7-ng/ml (1ng/ml) 1 1 Spermium élettartam -7 nap 1 Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején Fedeztetés/AI optimális időpontja (P-szintek) P érték AI időpontja (>1 ng/ml(7. nap) azonnal (korán ovuláló) <5 ng/ml további minták 5- ng/ml 1.5-.5 nap belül -1 ng/ml másnap >1 ng/ml azonnal ng/ml 1 P LH 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 Termékenyítésre optimális időszak jellemzői Fertilitás csökkenés Tüzelés napjai Friss/ hűtött sperma (vagin) 11-1 nap Mélyhűtött sperma (uterinalis) 1-17 nap Fogamzás csökken: Ha vaginai/fedeztetés: Pre-LH -3 nap vagy Post-LH -9-.nap Hüvelytükrözés oestrus oestrus-oestrus vége Intrauterin AI!! Hüvelykenet vizsgálata Progeszteron-szint (ng/ml) Ultrahang vizsgálat oestrus elejeoestrus (cornif. 75-9%),5-9,-(1) Tüszők eltűnése után -5 nap Oestrus (cornif. 95%) 1-ng/ml Tüszők után - nap Spermium élettartam -7 nap Uterinális mirigyekben tárolódnak (reservoar) Alomszám spermium szám (5-5M) 11
Fertilizációs periódus határai Diagnosztikai hibák ng/ml Hormonszintek alakulása prooestrus és oestrus idején 1 1 1 1 P LH 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 OVULÁCIÓ Spermium élettartam Petesejt élettartam,cervix Csak vérvizsgálatot kérni! 9- nap körül az első vizsgálat Egy vizsgálat - nem vizsgálat Cikluson belül minden alkalommal más klinika/labor Mértékegység: ng/ml (nmol/ml=3.xng/ml) Legjobb minősítés a vemhesülés! Klinikai alkalmazás lehetőségei II. Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Pro-oestrus (BVT, LH) 1. Infertilitás: split / elhúzódó ciklusok 1.- Genitáliák vizsg. (vaginoszkópia, citológia) - intenzív véres váladék, vvt sok, gyenge kornifikáció, nincs ciklusdinamika.- P-szint (LH is) -ciklusbeli aszinkron (P~kenet) - késői ovulációs típus, anovulációs ciklus (ovulált:p>,5ng/ml) Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok, Oestrus (BVT,LH) Korai és késői ovulációs típus Különböző ovulációs típusú szukák progeszteron-szintjének alakulása a tüzelés alatt 1 1 1 P (ng/ml) 1 3 5 7 9 11 1 13 1 15 1 17 1 19 P/korai P/standard P/késői 1
Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok, Anoestrus (BVT) Hosszú interoestrus periódus vagy split tüzelések Vizsgálatok 1.-Genitáliák vizsg. (vaginoszkópia, citológia)?.-p: magas P-szint (> ng/ml) ovarium (lutein) cysták, neoplasma (granulosa thecasejt) luteolizis/ sebészi, hyperthyreosis? - P< ng/ml T vizsg. (TRH stimuláció) (+) Hypothyreoid (-)? Ivarzás indukció Meddőségi vizsgálatok Metoestrus (BVT) Hypoluteoidismus Alacsony vemhességi P szint, (reszorpció, abortusz) Ok: primer ovarialis probléma (CL-insuff.) Német juhász, rottweiler, Újfunlandi, berni pásztor Minimum P nem ismert (abortusz P<ng/ml h) Progeszteron adagolás,(mg/ttkg) ha P<ng/ml Abnormális ciklusok, meddőségi vizsgálatok Metoestrus 1. Vemhesség. hetétől gyakran alacsony P-szint véres hüvelyváladék abortusz (Ovarid tbl). Infertilis szukáknál: P mérés metoestrus. napján ( P<ng/ml, resorpció veszély) P adagolás, (Utrogestan tbl, Provera vagy Ovarid tbl.) UH vemhesség vizsgálat 1. napon 55. napig a fedeztetéstől folytatni a P kiegészítést Hypoluteoidismus (resorptio fetus) P: 7,7ng/ml gr:5 nap P:,31ng/ml gr:3 nap Klinikai alkalmazás lehetőségei III. Diagnosztika, indukciók Ivaros státusz vizsgálata nőstényben (LH-teszt) Hypothalamus GnRH Hypohysis FSH & LH Progesteron Növekvő LH koncentráció a vérben Ovaries Progesteron 13
Ellés indukció (BVT,LH,ALIZIN) Ellés indukció Indikációk: Elhúzódó vemhesség (>5nap) Fájásgyengeség kockázata (év<primipara) Óriás fajták single puppy syndrome Önmagában az aglepristone nem alkalmas, uterotonikum is kell! (PGF v. Oxytocin, % v. %) Ovuláció utáni 5-. nap (ovuláció diagnosztika kell!) Aglepristone 15mg/ttkg (egy kezelés SC.), majd óra múlva oxytocin inj. (,15IU/ttkg kétóránként) Magzatszám ismerete (Rtg vizsgálat!) Progeszteron-szint mérés (BVT), P ng/ml nem érdemes elkezdeni (spontán ellés indul) Kórházi körülmények, az indukció előtt pár nappal hospitalizálni a beteget (no stress) Közép és nagytestű egyedeknél ellés óra múlva, kistestű fajtáknál órán belül 1