DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TAVASZI JUDIT KESZTHELY 2012 1
PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR ÁLLAT- ÉS AGRÁRKÖRNYEZET-TUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA Iskolavezető: Dr. habil. Anda Angéla az MTA doktora Témavezető: Dr. Budai Péter MEZŐGAZDASÁGI VEGYI ANYAGOK IRRITATÍV HATÁSAINAK IN VITRO TOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS Készítette: Tavaszi Judit KESZTHELY 2012 2
MEZŐGAZDASÁGI VEGYI ANYAGOK IRRITATÍV HATÁSAINAK IN VITRO TOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATA Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Tavaszi Judit Készült a Pannon Egyetem Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Budai Péter Elfogadásra javaslom (igen / nem)... aláírás A jelölt a doktori szigorlaton... %-ot ért el Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve:...... igen / nem Bíráló neve:...... igen / nem. aláírás. aláírás A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...%-ot ért el Veszprém/Keszthely,.. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése... az EDT elnöke 3
TARTALOMJEGYZÉK 1. KIVONATOK... 6 1.1. MAGYAR NYELVŰ KIVONAT...6 1.2. ANGOL NYELVŰ KIVONAT...8 1.3. NÉMET NYELVŰ KIVONAT...8 2. BEVEZETÉS... 9 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 12 3.1. ALTERNATÍV MÓDSZEREK...12 3.1.1. In vitro módszerek... 13 3.1.2. Alacsonyabb rendű szervezetek felhasználása... 13 3.1.3. Immunológiai technikák... 13 3.1.4. Mennyiségi szerkezet-aktivitás összefüggés analízis... 14 3.1.5. Élettani folyamatok matematikai modellezése... 14 3.1.6. Emberi modellek... 14 3.1.7. Más alternatív módszerek... 14 3.2. A SZEMIRRITÁCIÓ VIZSGÁLATA ALTERNATÍV MÓDSZEREKKEL...15 3.2.1. Embrionált tojás felhasználása... 15 3.2.1.1. A madarak embrionális fejlődése... 15 3.2.1.1.1. A chorioallantois membrán... 18 3.2.1.2. A tojások előkészítése... 23 3.2.1.2.1. A légkamrán keresztüli behatolás... 23 3.2.1.2.2. Behatolás a tojás egyenlítőjén át... 25 3.2.1.3. A chorioallantois membrán felhasználása... 27 3.2.2. A chorioallantois membránt felhasználó tesztek... 28 3.2.2.1. Chorioallantoic Membrane Vascular Assay (CAMVA)... 28 3.2.2.2. Chorioallantoic Membrane Trypan blue festés (CAM-TB)... 29 3.2.2.3. Hen s Egg Test - Chorioallantoic Membrane (HET-CAM)... 29 3.2.3. A citotoxicitási vizsgálatok alkalmazása... 29 3.3. A SZEM FELÉPÍTÉSE...30 4. ANYAG ÉS MÓDSZER... 34 4.1. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK...34 4.1.1. HET-CAM teszt... 34 4.1.2. MTT-Assay... 37 4.1.3. A Draize-féle primer szemirritációs teszt... 39 4.2. VIZSGÁLATI ANYAGOK...46 4.2.1. A vizsgálatban felhasznált növényvédő szerek... 46 4.2.1.1. Inszekticidek... 46 4.2.1.2. Herbicidek... 47 4.2.1.3. Fungicidek... 48 4.2.1.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények... 48 5.1. A HET-CAM TESZTBŐL SZÁRMAZÓ EREDMÉNYEK...49 5.1.1. Inszekticidek... 49 5.1.2. Herbicidek... 51 5.1.3. Fungicidek... 53 5.1.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények... 54 5.2. A CITOTOXICITÁSI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEI...56 4
5.2.1. Inszekticidek... 56 5.2.2. Herbicidek... 56 5.2.3. Fungicidek... 57 5.2.4. Tápanyag-visszapótlásra alkalmazható készítmények... 58 5.3. A DRAIZE-TESZTBŐL SZÁRMAZÓ EREDMÉNYEK...58 5.3.1. Inszekticidek... 58 6. MEGBESZÉLÉS... 68 6.1. AZ INSZEKTICIDEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA...68 6.2. A HERBICIDEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA...69 6.3. A FUNGICIDEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA...70 6.4. A TÁPANYAG-VISSZAPÓTLÁSRA ALKALMAZHATÓ KÉSZÍTMÉNYEK EREDMÉNYEINEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA...71 6.5. A CITOTOXICITÁSI VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI...72 6.6. A HET-CAM TESZT ÉS A DRAIZE-FÉLE TESZT EREDMÉNYEINEK STATISZTIKAI VIZSGÁLATA...73 6.7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK...74 7. ÖSSZEFOGLALÁS... 77 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 82 9. IRODALOMJEGYZÉK... 83 10. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK... 92 5
1. KIVONATOK 1.1. Magyar nyelvű kivonat A szerző a kísérletei során a mezőgazdaságban használt vegyi anyagok irritációs potenciálját vizsgálta az in vitro HET-CAM (Hen s Egg Test Chorioallantoic Membrane) teszttel, valamint a Draize-féle in vivo módszerrel. A vegyi anyagokat a vizsgálatok eredményei alapján irritációs kategóriákba sorolta, és a különböző vizsgálattípusokkal kapott eredményeket összevetette. A kísérletek során a HET-CAM teszt mellett az anyagok irritációs potenciálját in vitro citotoxicitási teszttel is mérte (MTT Assay), melynek eredményeit szintén összehasonlította a HET-CAM és a Draize tesztből származó adatokkal. Az in vitro HET-CAM teszt a nemzetközi szakirodalmak alapján eddig korlátozott mértékben került alkalmazásra; elfogadása, engedélyezése jelenleg folyamatban van. Az in vitro és in vivo eredmények összevetése alapján próbált további adatokat szolgáltatni arra, hogy a HET-CAM teszt mennyiben tükrözi a jelenleg elfogadott in vivo Draize-féle módszer eredményeit, ezáltal alkalmas lehet-e az élő állaton végzett kísérletek kiváltására. Az in vitro HET-CAM tesztet az Invittox Protocol 47. száma alapján végezte el. A tyúktojások 10 napi keltetése után a mészhéj és héjmembrán óvatos eltávolítása után a kísérleti anyagokat a megfelelő fejlettségi állapotú chorioallantois membránra cseppentette, és meghatározott ideig figyelemmel követte a membránon bekövetkező elváltozásokat. A megfigyelt változások feljegyzése után a kiértékelést egy számítógépes program alapján végezte el, majd az így kapott irritációs indexeket irritációs kategóriákba sorolta, ami az összehasonlítás alapjául szolgált. A Draize-féle primer szemirritációs tesztet az OECD 405 guideline irányelvei alapján végezte. A tesztelendő anyagot az állat egyik szemének kötőhártya zsákjába helyezte, a szemeket pár másodpercig óvatosan zárva tartotta, ezután 1, 24, 48, 72 órával, majd 1, ill. 2 héttel a kezelés után a tünetek erősségét feljegyezte. A kiértékelés a módszer által előírt pontozási és klasszifikációs rendszer alapján történt. 6
A vizsgálatokban alkalmazott agrokemikáliák in vitro HET-CAM tesztből származó eredményei jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal. A citotoxicitási vizsgálatokból származó eredményeket az Draize féle primer módszer eredményeivel összevetve szintén jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal. A kísérletben alkalmazott mezőgazdasági vegyi anyagok in vivo és in vitro eredményeinek összehasonlításából és a szakirodalomban fellelhető eredményekből a szerző megállapította, hogy a HET-CAM teszt az in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálat elővizsgálataként (pre-screen) alkalmazható, teljes egészében történő kiváltására azonban jelenlegi formában nem alkalmas. Az in vitro HET-CAM teszt fontos eleme lehet azon in vitro tesztrendszernek, amely a jövőben képes lesz az in vivo Draize-féle szemirritációs vizsgálat kiváltására. 7
1.2. Angol nyelvű kivonat The author examined the irritation potential of 45 different agrochemicals following the worldwide accepted in vivo Draize method (described in OECD 405) and two in vitro methods, the HET-CAM test (Hen s Egg Test Chorioallantois Membrane) and the MTT- Assay. A comparative screening was performed with the 45 agrochemicals to establish parallel data on the in vitro (HET-CAM test, MTT-Assay) and in vivo (Draize) results. The thesis provides new data from the in vitro methods used during the experiments, in comparison to the in vivo data. Based on the results, the HET-CAM test or the MTT-Assay as single methods can not replace the Draize rabbit eye test but can be useful components of an in vitro system. 1.3. Német nyelvű kivonat Die Verfasserin hat im Laufe ihrer Versuche die Irritation von 45 verschiedenen Pflanzenschutz-Mitteln mit 2 in vitro Methoden untersucht. Eine von den meist studiertesten alternativ Methode, der Hühner Ei Test Chorioallanoic Membrane (HET-CAM), und ein Zell-Giftwirkungs Test, das MTT-Assay waren dabei verwendet worden. Wegen der parallel Ergebnisse von in vitro (HET-CAM, MTT-Assay) und in vivo Untersuchungen. Der Draize Hasen Augen Irritation Test ist auch verrichtet geworden. Die Experimente lieferten neue Daten von den verwendeten alternativ Methoden verglichen mit den in vivo Ergebnissen. Auf Grund dieser Daten, des HET-CAM Test und dem des MTT-Assay sind wertvolle voruntersuchungs- Methoden in verzeichnen von Augen Irritation. Die toxikologischen Tests für Registration von Agrochemikalien, der in vitro HET- CAM Test oder MTT-Assay können den in vivo Draize Test nicht ersetzen aber beide können praktische Teile von einem in vitro System sein. 8
2. BEVEZETÉS A Föld növekvő lakossága és a növekvő élelmiszer igények egyre magasabb szintű követelményeket támasztanak a mezőgazdasággal szemben. Az ipar, a települések és a közlekedés térhódítása, valamint a természetvédelem erősödése a rendelkezésre álló területen elérhető hozam növelését követeli meg a mezőgazdaságtól. A fenntartható fejlődés azonban csak az integrált növényvédelem céltudatos alkalmazásával valósítható meg. Ezt az elvet követve a kémiai növényvédelem mellett a fizikai és biológiai védekezés is megjelenik, amely bizonyos mértékben visszaszorítja ugyan, de teljes mértékben nem pótolhatja a vegyszeres beavatkozásokat; a kémiai növényvédelem továbbra is az egyik legfontosabb védekezési eljárás a mezőgazdasági termelésben. Felmérések szerint a kultúrnövényeket károsító élő szervezetek (gombák, baktériumok, rovarok stb.) napjainkban világszerte átlagosan mintegy 35%-kal csökkentik a mezőgazdasági terméshozamokat. Ebből az állati kártevők, elsősorban a rovarok 14%, a mikroorganizmusok, főleg a gombák 12%, a gyomnövények 9% termésveszteséget okoznak. A növényvédelem feladata, hogy kiküszöbölje ezeket a káros hatásokat és biztonságossá tegye a termelést (Gáborjányi és mtsai, 1995). A növényvédő szerek azonban a gyakorlati alkalmazás során a nem-célszervezetekre is hatást gyakorolnak, közvetlenül vagy közvetve károsíthatják az élővilágot. A talajba kerülve az ott élő ökoszisztémát, a talajvízbe, felszíni vizekbe jutva a vízi szervezeteket károsíthatják; a táplálékláncban való feldúsulás esetén a végső fogyasztó, az ember is érintetté válhat. A növényvédő szerekkel foglalkozó ember a munkája során (napi gyakorisággal) kerülhet érintkezésbe a vegyi anyagokkal. A kijuttatás alkalmával a helyi elváltozás (károsodás), az érintett területről való felszívódás után a szisztémás mérgezés esélye is számottevő. A testfelszín vonatkozásában helyi mérgezés során különböző mértékű szem- és bőrkárosodással kell számolnunk. A szembe jutott mérgező anyagok az enyhe, reverzibilis kötőhártya gyulladástól kezdve súlyos és maradandó szemkárosodást, szaruhártyahomályt, sőt vakságot és egyéb életveszélyes károsodást okozhatnak (Bordás, 1971). 9
A mezőgazdasági vegyi anyagok forgalomba hozatalát napjainkban számos toxikológiai vizsgálat előzi meg. Ezek, a készítmények olyan tulajdonságait tárják fel, amelyek a humán egészségkockázat és a természetkárosodás kockázatának jellemzéséhez szükségesek. A szemirritáció mértékének meghatározására jelenleg a Draize-féle, nyúlon végzett tesztből származó eredményeket fogadják el, ezen teszt alapján becsülik az esetleges emberi expozíció során várható szemkárosodást. Mivel a kísérlet az állatra nézve jelentős fájdalommal járhat, több olyan alternatív módszer áll fejlesztés alatt, ami később az in vivo tesztet felválthatja. A primer szemirritáció területén az OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) 1987-ben beleegyezett abba, hogy a jól érvényesített in vitro tesztekből származó adatokat elfogadják az in vivo adatok helyett. A perspektivikus alternatív módszerek közé tartoznak a tyúktojás chorioallantois membránját (CAM) használó in vitro vizsgálati módszerek is (Walum és mtsai, 1992). Mivel a vizsgálat a tesztszervezetre nézve fájdalommal jár, így az erősödő állatvédelmi mozgalmak hatására több olyan alternatív eljárást fejlesztettek ki, amelyek alkalmazásával az in vivo tesztekben használt állatok száma csökkenthető. Az experimentális toxikológia valamennyi szakterületén megjelentek a különböző in vitro, ill. alternatív módszerek, de általánosan elmondható, hogy jelenleg még az in vitro módszerek nem válthatják ki teljes egészében az in vivo kísérleteket. A HET-CAM (Hen s Egg Test Chorioallantois Membrane) teszttel az embrionálódott tyúktojás chorioallantois membránjának (CAM) reakciója alapján jelezhetjük előre a vegyi anyag irritációs potenciálját (Walum és mtsai., 1992). Az aktív vérkeringéssel rendelkező CAM a szemhez hasonlóan reagál a különböző anyagok kémiai károsító hatásaira (Leighton és mtsai., 1985). A HET-CAM tesztet ez idáig elsősorban kozmetikumok, ipari és háztartási vegyi anyagok irritatív potenciáljának meghatározására használták, mezőgazdasági vegyi anyagok tesztelésére kevésbé, így az általam elvégzett vizsgálatok a vegyi anyag típusát illetően hiánypótló jellegűek. Vizsgálataim során célul tűztem ki a különböző mezőgazdasági vegyi anyagok, növényvédő szerek és tápanyag-visszapótlásra használható készítmények in vitro vizsgálattal történő irritációs potenciáljának meghatározását. A vizsgálati anyagként alkalmazott készítmények kiválasztásánál figyelembe vettem az irodalmi irritációs adatokat, és a nem irritatív vegyületektől az erősen irritatív vegyületekig az irritációs skálának megfelelően vontam be a mezőgazdasági vegyi anyagokat a kísérletekbe. 10
Vizsgálataim során összesen 50, a nem irritatív és irritatív kategóriákba eső mezőgazdasági vegyi anyag irritációs potenciálját vizsgáltam in vitro HET-CAM teszttel és in vivo Draize-féle primer szemirritációs vizsgálattal. 12 vizsgálati anyag esetében in vitro citotoxikológiai vizsgálatot is végeztem, az eredményeket pedig az in vivo módszerrel és a HET-CAM teszttel kapott eredményekhez hasonlítottam. A kiértékelés során arra a kérdésre próbáltam választ adni, hogy az in vitro technikák (HET-CAM teszt és az MTT-Assay) önmagukban vagy tesztrendszer formájában alkalmasak lehetnek-e az in vivo Draize-teszt jövőbeni kiváltására. 11
3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1. Alternatív módszerek A mezőgazdasági vegyi anyagok forgalomba hozatalát megelőző toxikológiai vizsgálatokban a szemirritáció meghatározására jelenleg az élő nyulakon elvégzett vizsgálatok eredményeit fogadják el. Az erősödő állatvédő mozgalmak hatására több olyan alternatív módszert is kidolgoztak, amely nem csak csökkentheti az emlős kísérleti állatok számát, hanem esetleg teljes mértékben ki is válthatja ezek felhasználását. Az állatkísérletek kiváltására, ill. a kísérletben felhasznált állatok számának, szenvedéseinek csökkentésére irányuló törekvések Russel és Burch 1959-es ún 3R szabályánál gyökereznek. A 3R a szabály alapjául szolgáló helyettesítés (Replacement), finomítás (Refinement) és létszámcsökkentés (Reduction) szavak kezdőbetűiből áll. A 3R szabály megjelenése után egyre több olyan módszert próbáltak bevezetni, mely állatvédelmi szempontból pozitívabb megítélésben tüntette fel az engedélyezés folyamán megkövetelt vizsgálatokat. Alternatív módszernek tekintünk minden olyan kísérleti módszert és eljárást, amely képes az állatkísérleteket helyettesíteni vagy a kísérletben felhasznált állatok számát csökkenteni, illetve a kísérleti körülményeket finomítva a kísérleti állatok szenvedéseit mérsékelni (Nab és mtsai, 1993). Bár az alternatív módszerek alkalmazása főként állatvédelmi okokra vezethető vissza, ezen módszerek számos előnnyel bírnak a hagyományos in vivo tesztekkel szemben. Elterjedésükben az etikai szempontokon felül szerepet játszott a gazdaságos és időtakarékos kivitelezhetőség, de a jó standardizálhatóság is nagy előnyként említhető. Alkalmazásuk általában gyorsabb eredményt ad, a költségeik alacsonyabbak, a kivitelezés egyszerűbb, a körülmények jobban befolyásolhatóak, mint élő állat esetén, ami bizonyos fokú szabványosítást tesz lehetővé. Nem alkalmas azonban hosszabb távú hatás kimutatására; a modellrendszer reakciója nem azonos egy élő szervezet reakciójával (Nab és mtsai, 1993), az élő szervezet komplexitását nem tükrözi. A FRAME (Fund for the Replacement of Animal in Medical Experiments) brit szervezet osztályozása alapján az alternatív módszerek 7 kategóriába sorolhatók: 12
3.1.1. In vitro módszerek A kísérleti állatok helyettesítésére, számának csökkentésére irányulnak az in vitro technikák, ahol a kísérleti anyag toxikológiai jellemzőinek meghatározása nem élő állaton, hanem szerven, szervrendszeren, szöveten stb. történik. Leggyakrabban a sejt- és szövetkultúrákat alkalmazzák. Az élő sejteket, szöveteket laboratóriumi körülmények között, de az élő szervezeten kívüli tenyészközegben tartják életben. A szervek esetén a sejtek és a szerven belüli szövetek közötti kapcsolat megmarad, míg a sejtkultúrákban (sejtszuszpenzió) nincs kapcsolat az egyes sejtek között. Egyszerűsége és gyorsasága miatt az in vitro tesztekben nem követhető nyomon az élő állat szervezetének immunválasza és regenerációja sem, ami egy valós expozíció esetén bekövetkezhetne. 3.1.2. Alacsonyabb rendű szervezetek felhasználása Az alacsonyabb rendű szervezeteket felhasználó tesztekben gyakran alkalmaznak baktériumokat, gombákat vagy rovarokat. Mutagén hatás megítélésére jelenleg az Escherichia coli triptofán negatív és a Salmonella typhimurinum hisztidin negatív törzseit (Maron és Ames, 1983) használó AMES teszt a legelterjedtebb. Ezen törzsek szervetlen sókat és glükózt tartalmazó táptalajon képtelenek a növekedésre, és így telepek képzésére. Amennyiben a tesztanyag hatására a genetikai állományukban mutáció történik, a táptalajon telepek kifejlődése figyelhető meg (Ames és mtsai., 1975). Egyszerű és gyors kivitelezhetősége miatt széles körben alkalmazzák vegyi anyagok mutagén hatásainak becslésére. 3.1.3. Immunológiai technikák Immunológiai technikák képezik az alapját több in vitro módszernek. Alkalmazásuk főleg diagnosztikumok tesztelésében, vakcinák kipróbálásában terjedt el. E terület olyan jól ismert technikákat foglal magába, mint a Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), a Hemagglutination Assay (HA) és a Radioimmunassay (RIA). Ezek az in vitro módszerek nagyon érzékenyek, de néhány esetben a specificitás hiánya az antigének vagy az antitestek szétválasztásakor megköveteli az állatkísérletek elvégzését (Nab és mtsai, 1993). 13
3.1.4. Mennyiségi szerkezet-aktivitás összefüggés analízis Bizonyított, hogy a vegyi anyagok molekuláris szerkezete és biológiai aktivitásuk között összefüggés áll fent. Számítógépes program segítségével a biológiai hatás megbecsülhető, de bizonyos paraméterek ismeretében akár új molekulák is tervezhetők. Ezen eljárás alapján csökkenthető az állatokon tesztelt kísérleti anyagok száma (Nab és mtsai, 1993) és felgyorsítható a fejlesztés fázisa. 3.1.5. Élettani folyamatok matematikai modellezése A matematikai egyenletek képesek leírni számos élettani, toxikológiai és biokémiai folyamatot. A számítógépes szimuláció tapasztalati adatokon alapul, így képes lehet az ismert hatások összegzésére, összehasonlításra, és bár a módszer reális kísérleti eredményt adhat, ezek a vizsgálatok csak közelítik a valóságot, így eredményeik csak egyéb (általában in vivo) tesztekből származó adatokkal alátámasztva fogadhatók el (Carson, 1986). 3.1.6. Emberi modellek Bár a toxikológiai vizsgálatok nagyrészt a humán expozíció esetén bekövetkező hatást hivatottak előjelezni így a legalkalmasabb modell ezen tesztekben az ember lenne, azonban a humán alanyok kísérletben való alkalmazása jogi és etikai kérdéseket vet fel. A gyógyszerkutatás területén azonban jogszabályok írják elő a humán tesztek elvégzését. A humán tesztek szigorúan ellenőrzött körülmények között, meghatározott kritériumoknak megfelelő önkénteseken zajlanak és az állatkísérletekből nyert adatok értékelése után kezdhetők meg, a minimális kockázat elérése érdekében. Mivel a tesztek eredményeit eleve a célszervezetből nyerik, az extrapoláció kikerülhető (Nab és mtsai, 1993). 3.1.7. Más alternatív módszerek A laboratóriumi állatokon végzett teszteket bizonyos esetekben vágóhídról származó szervek felhasználásával is pótolhatjuk; pl. a Draize-féle primer szemirritációban előírt nyúl helyett használható az izolált marha- (Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants; OECD no. 437) vagy csirkeszem (Isolated 14
Chicken Eye Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants; OECD no. 438). Biokinetikai folyamatok modellezésében alkalmazzák az NMR (Nuclear Magnetic Resonance) eljárást. 3.2. A szemirritáció vizsgálata alternatív módszerekkel A csirkeembrió gyakran szerepel tesztobjektumként a különböző vegyi anyagok toxikus és/vagy teratogén hatásainak in vitro vizsgálataiban. A chorioallantois membrán (CAM) felhasználása a szemirritáció becslésében az 1980-as évekig nyúlik vissza (Leighton és mtsai., 1983, 1985; Luepke, 1985; Parish, 1985). Mivel a membrán egy vérerekkel gazdagon átszőtt szövet, jó modellként szolgálhat az irritáció becslésére: a szemhez hasonlóan reagál a különböző vegyi anyagok károsító hatásaira. Felhasználását könnyíti, hogy a membrán egyszerűen és gyorsan hozzáférhető. A szemirritáció becslésére két módszer használatos: A tesztanyag érintkezési ideje a CAM-mal meghosszabbított, és ennek megfelelően a megfigyelés is hosszabb idejű (Leighton és mtsai., 1983; 1985). A tesztanyag nagyon rövid ideig érintkezik a CAM-mal, és a véredényrendszerben bekövetkező változásokat közvetlenül a kezelés után értékelik (Luepke, 1985). A kezelés minden esetben a CAM és a tesztanyag érintkezésével zajlik. Az előkészítés, tehát a CAM feltárása a tojáshéjon át történik, általában a légkamrán keresztül, de történhet a tojás egyenlítőjén keresztül is. 3.2.1. Embrionált tojás felhasználása 3.2.1.1. A madarak embrionális fejlődése A házityúk kelési ideje 21 nap. Az inkubáció alatt, főleg a kezdeti periódusban rendkívül érzékenyen reagál a külső környezeti hatásokra. A keltetés első 9 napján minőségi változások 15
mennek végbe, azaz kialakulnak a szervkezdemények, végtagok. A magzati fejlődés második felét a mennyiségi fejlődés jellemzi, ekkor alakul ki az embrió végleges formája (Bogenfürst, 2004). A keltetés első három napjában az intenzív növekedés figyelhető meg. Az első napon kialakulnak a csíralemezek, a mesoderma és a gerinchúr. A második napon megindul a véredények, a hajszálerek, a szem, az ősvese és a szaglószervek kezdeményeinek fejlődése. A szívkezdemény két része kezd összenőni (Hamilton, 1952). A szívverés a keltetés 30. órájában kezdődik. A harmadik napon az allantois belenő az extraembrionális testüregbe (Zboray, 1991). Fejlődésnek indul az emésztőkészülék és az érzékszervek. Megjelennek a végtagbimbók (a hátsó végtagok és a szárnyak kezdeményei) és a csőr (1. ábra). A negyedik napon alakulnak ki az ivarmirigyek és a vese kezdeményei, a testrészek elkülönülnek. Az amnion körbeveszi az embriót. Az embrió feje az agyvelő gyors fejlődése következtében jelentősen megnő. Az ötödik napon az amnion megtelik folyadékkal, ami az embrió mechanikai védelmét szolgálja. Differenciálódik az első és a hátsó végtag, az ujjak és az agyvelő. A máj fejlődése megindul. A hatodik és a tizedik nap között kialakul az embrió végleges formája. A hetedik naptól megindul az allantoislégzés. A nyolcadik naptól láthatóak a tollkezdemények, és a kilencedik naptól az embrió csibeformát vesz fel. A szív a testüregbe záródik, az embrió a továbbiakban a szik állományával a köldökön keresztül, a vérkeringés útján tart kapcsolatot (Kovács és Fehér, 1966). 16
1. ábra A házityúk embrionális fejlődése A) a keltetés 1. napja, B) a keltetés 3. napja (1. csírapajzs, 2. őscsík, 3. érudvar, 4. jégzsinórok, 5. tojásfehérje, 6. héjhártya, 7. mészhéj, 8. légkamra, 9. embrió, 10. szikvérkeringés, 11. sinus terminalis) (Kovács és Fehér, 1966) A tizenegyedik és tizenkettedik napon az izmok és a törzs erőteljes növekedése jellemző. A chorioallantois membrán (CAM) képessé válik a kalcium szállítására a tojáshéj és az embrió között és így biztosítja a megfelelő növekedést (Dieckert és mtsai, 1992). A tizenharmadik napra az embrióban kifejlődnek a szervek. A tizennegyedik napon a szemhéjak fejlődése befejeződik. A tizenötödik napon a szájszöglet elszarusodott pereme jelenik meg (2. ábra). A tizenhatodik naptól már a szarukezdemények is felismerhetőek. A tizenhetedik-tizennyolcadik napig az embrionális növekedés dominál, a tizenkilencedik napon a sziktömlő megkezdi a behúzódást a hasüregbe, ami a 20 napon fejeződik be. Ekkor kezdődik meg a köldökzáródás. A huszonegyedik napra a tojáshéj törékenyebbé válik, mert a mész egy része felszívódott és a csontokban rakódott le. A huszadik vagy huszonegyedik napon a fiókák kikelnek a tojásból (Bogenfürst, 2004). 17
2. ábra A tyúk embrionális fejlődése A) a keltetés 9. napján B) a keltetés 15. napján (1. magzat, 2. sziktömlő, szikvérkeringés, 3. allantois, magzati vérkeringés, 4. amnion, 5. tojásfehérje, 6. héjhártya, 7. mészhéj, 8. légkamra) (Kovács és Fehér, 1966) 3.2.1.1.1. A chorioallantois membrán A szemirritáció mértékének meghatározására jelenleg a Draize-féle primer szemirritációs tesztből származó adatokat fogadják el. Az 1980-as évektől azonban az állatvédő szervezetek egyre inkább megerősödtek és szót emeltek a Draize-féle tesztben alkalmazott kísérleti nyulak szenvedései ellen. Az erősödő állatvédelmi mozgalmak hatására egyre szélesebb körökben támogatták a Draize-féle szemirritációs vizsgálat új, alternatív módszereinek kifejlesztését (Christian és Diener, 1996). Talsma és mtsai (1988) írták le, hogy a Draize-féle teszt által megkövetelt 6 nyúl állatlétszámának 3-ra csökkentése nem eredményezi az in vivo teszt megbízhatóságának csökkenését. Seabaugh és mtsai (1993) a szemen helyi anesztetikumok felhasználását javasolták a kísérleti nyulak fájdalmainak csökkentésére. 18
1993-ban Lambert és mtsai a Draize-féle teszt által előírt kezelési koncentrációk tized részét alkalmazták a vegyi anyagok szemirritációs potenciáljának meghatározására; ez volt a Low Volume Eye Test, LVET. A kapott eredmények nagyon jó korrelációt mutattak a primer teszt eredményeivel. A kutatások főirányát azonban olyan in vitro tesztek kifejlesztése jelentette, amelyek alkalmasak lehetnek az in vivo Draize-féle teszt kiváltására. A perspektivikus alternatív módszerek a következő csoportokba sorolhatók: nyúl és szarvasmarha szemmel vagy szemrészekkel végzett vizsgálatok, citotoxicitási vizsgálatok, chorioallantois membránt felhasználó vizsgálatok, biokémiai vizsgálatok (Walum és mtsai, 1992). A chorioallantois membránt már hosszabb ideje alkalmazzák a biológiai kutatások különböző területein, a virológiai-, bakteriológiai- és tumorkutatásban (Beveridge és Burnet, 1946) is. A csirkeembriót, mint tesztobjektumot gyakran alkalmazzák a különböző vegyi anyagok toxikus és teratogén hatásának becslésére (Verrett és mtsai, 1980; Fisher és Schoenwolf, 1983). A vegyi anyagok által okozott elváltozások kimutatására Leighton és mtsai (1985) a tyúktojás chorioallantois membránját használták. A CAM-ot a keltetés 14. napján kezelték különböző háztartási vegyi anyagokkal (Zwilling-technika), amit egy 10 mm átmérőjű teflon gyűrűbe helyeztek. A makroszkopikus reakciókat a keltetés 17. napján értékelték, majd szövettani vizsgálathoz mintát vettek a CAM kezelt területéről. A szövettani vizsgálat eredményei jó korrelációt mutattak a makroszkópos elváltozásokkal. Az in vitro vizsgálatból és a Draize-féle primer szemirritációs tesztből származó eredményeiket összehasonlították; a chorioallantois membránt használó in vitro teszt eredményei jó korrelációt mutattak az in vivo adatokkal. Luepke és Kemper 1986-ban fejlesztették ki a HET-CAM (Hen s Egg Test Chorioallantoic Membrane) tesztet. A módszerrel 190 különböző vegyi anyagot és készítményt vizsgáltak. Az in vitro tesztből származó eredmények jól korreláltak az in vivo Draize tesztből származó eredményekkel. A vizsgálatokat 1987-ben elektronmikroszkópos kiértékeléssel is kiegészítették. A szerzők a HET-CAM tesztet alkalmasnak találták arra, hogy a kísérletekben 19
felhasznált állatok számát csökkentsék, azonban említik, hogy a módszer teljes egészében nem képes az emlős tesztek felváltására, alkalmas lehet viszont ismert irritációs potenciálú referencia anyagok használatát, és a válaszreakciók értékelését segítő leíró jellegű standard reakciókat bemutató fotóatlaszok alkalmazását. Lawrence és mtsai (1990) 34, ipari és kozmetikai vegyi anyag irritációs potenciálját vizsgálták a Luepke által kifejlesztett HET-CAM teszttel. A tesztekhez 10 napos embrionálódott tyúktojás chorioallantois membránját használták fel, és 20 másodperces expozíciót követően kiöblítették a vizsgálati anyagokat. A kezelést követően a membránt 5 percig figyelték meg és értékelték a lízis és a vérzések kialakulását. Az in vitro és in vivo eredmények összehasonlításakor a különböző kémiai karakterű anyagokat együttesen értékelve korlátozott mértékű korrelációt állapítottak meg. Van Erp és Weterings (1990) elővizsgálati módszerként egy in vitro tesztrendszert dolgoztak ki, mely a szaruhártya károsodásainak vizsgálatára az izolált szarvasmarha szemet (BE) használja a szaruhártyahomály mértékének megállapítására. A kötőhártya károsodások vizsgálata a tyúktojás chorioallantois membránján (CAM) történik. A két in vitro tesztből álló tesztrendszer a BECAM módszer. Közel 150 vizsgált vegyi anyag eredményeit figyelembe véve, az in vitro és in vivo eredmények 95%-ban egyeztek. A szerzők megállapították, hogy a BECAM vizsgálati módszerrel nem vagy enyhén irritatívnak minősített anyagokat nem kell veszélyt jelző címkékkel ellátni, míg irritatívabb anyagoknál csökkentett állatlétszámú emlős tesztek elvégzésével nyerhetőek további irritációs adatok az EGK (Európai Gazdasági Közösség) által megkövetelt címkézéshez. Blein és mtsai (1991) 40, különböző természtű vegyi anyag vizsgálatát végezték el a HET- CAM teszttel. Megállapították, hogy bizonyos, általában színes és zavaros vizsgálati anyagok esetében az in vitro HET-CAM teszttel az irritáció nem határozható meg. Bruner és mtsai (1991) 17 háztartási vegyi anyag irritációs vizsgálatát végezték el az in vitro BECAM tesztrendszerrel. Az in vitro és az in vivo eredmények összehasonlítása során gyenge korrelációt figyeltek meg. Rougier és mtsai (1992) nedvesítő szerek és kozmetikai termékek irritációs potenciálját határozták meg HET-CAM teszttel. Az eredmények összehasonlítása alapján az in vitro 20