Pannon Egyetem Georgikon Kar Festetics Doktori Iskola. Agrokemikáliák irritatív hatásainak toxikológiai vizsgálata in vitro rendszerekben

Átírás

1 Pannon Egyetem Georgikon Kar Festetics Doktori Iskola Iskolavezető: Dr. habil. Anda Angéla egyetemi tanár, az MTA doktora Témavezető: Dr. Budai Péter egyetemi docens Agrokemikáliák irritatív hatásainak toxikológiai vizsgálata in vitro rendszerekben Doktori (PhD) értekezés tézisei Készítette: Kormos Éva Keszthely 2017

2 1. A KUTATÁS ELŐZMÉNYEI, CÉLKITŰZÉSE A megfelelő mennyiségű és minőségű élelmiszerek előállításában - a világ rohamosan növekvő népességének egyre nagyobb élelmiszerigénye mellett a növényvédő szerek okszerű felhasználásának jelentős szerepe van. A kémiai növényvédelem mellett egyre kiemeltebb szerepet kap a biológiai és fizikai növényvédelem, mert a termésveszteséget okozó károsítók ellen a környezet kímélése érdekében lépünk fel. A növényvédő szerek, bár szükséges anyagok, potenciális mérgek, ezért kedvező hatásaik mellett esetleges káros hatásokkal is számolnunk kell. Ezek a káros hatások az élő szervezetekre sokféleképpen érvényesülhetnek. Mivel a környezetbe juttatjuk ki a peszticideket, mérgeződhet a környezet (talaj, víz, levegő), illetve az itt élő nem-célszervezetek (méh, hal, vad, rovar, háziállat), valamint a táplálékláncban feldúsulva végső fogyasztóként az ember is. Felhasználás során szintén mérgeződhet az ember, mint aki kijuttatja, alkalmazza a szereket. A kijuttatást végző személy testfelszínére kerülve helyi, illetve általános mérgezés alakulhat ki. A szerek különböző mértékű szem- és bőrkárosodást okozhatnak irritatív hatásuktól függően. A szembe jutott mérgező anyagok az enyhe, reverzibilis kötőhártya gyulladástól kezdve súlyos és maradandó szemkárosodást, szaruhártyahomályt, végső esetben vakságot és egyéb életveszélyes károsodást is okozhatnak. A növényvédő szerek engedélyezési eljárása során rendkívül fontos szerepet töltenek be az állatkísérleti vizsgálatok. Ezek segítségével van mód arra, hogy megismerjük egy-egy készítmény vagy hatóanyag toxikológiai tulajdonságait, valamint így nyílik lehetőség az agrokemikáliák felhasználási feltételeinek pontos meghatározására és a humán-egészségügyi kockázatok csökkentésére. A vegyi anyagok szemre gyakorolt hatásának vizsgálata további segítséget nyújt a felhasználáshoz előírt védőeszközök ki- és továbbfejlesztéséhez is. Az állatkísérletek során leggyakrabban alkalmazott eljárások az in vivo metodikák közé tartoznak. A szemirritáció vizsgálata a nyúlon végzett in vivo szemirritációs teszttel történik. Ennek segítségével van mód megbecsülni az emberi felhasználás során esetlegesen előforduló expozíció következményeit. A vizsgálat során a nyulak kötőhártyazsákjába cseppentik a vizsgálni kívánt vegyi anyagot, majd megfigyelik annak esetleges károsító hatásait. Ez az eljárás igen fájdalmas lehet a kísérleti állatra nézve, etikailag erősen megkérdőjelezett az állatvédelmi szervezetek által, így már különböző alternatív módszerek vannak az engedélyeztetés folyamatában. Ilyen alternatív módszerek az in vitro technikák, melyek közé tartoznak a tyúktojás chorioallantois membránját (CAM) felhasználó tesztek, az izolált szemet alkalmazó eljárások - a vágóhídról származó izolált csirkeszemet felhasználó (ICE) teszt -,

3 valamint a citotoxicitási vizsgálatok. Jelenleg az in vivo szemirritációs teszttel kapott eredmények az általánosan elfogadottak a növényvédő szerek engedélyezési folyamata során. A háztartási és ipari vegyszerekkel végzett alternatív kísérletek megfelelő eredményt nyújtottak, így a fent említett alternatívák mentén érdemes kísérleteket folytatni a növényvédő szerekkel is, hiszen az ICE tesztet az OECD is elfogadja már azonosítási célra erősen irritatív és nem irritatív besorolás szerint, valamint a HET-CAM tesztet erősen irritatív besorolás szerint. Célom az volt a vizsgálataim során, hogy újabb növényvédő szerekkel és perspektivikus módszerekkel bővítsem ki a különböző in vitro vizsgálatok összehasonlítását a primer szemirritációban elismert in vivo szemirritációs teszttel, valamint, hogy megállapíthassam az alternatív módszerek együttes vagy külön-külön való alkalmazhatóságát elővizsgálati vagy kiváltási módszerként. Célom elérése érdekében 25 (MTT-nél 15) növényvédő szer irritációs potenciálját határoztam meg a HET-CAM, az MTT és az ICE teszttel, majd vetettem azokat össze az in vivo szemirritációs teszt irodalomból származó adataival.

4 2. VIZSGÁLATI MÓDSZEREK A kísérletek során különböző irritációs potenciálú gyomirtó, gombaölő és rovarölő növényvédő szerek kerültek felhasználásra, melyeken a HET-CAM (Hen s Egg Test Chorioallantois Membrane) tesztet, az ICE (Isolated Chicken Eye) tesztet és az MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid) vizsgálatot végeztem el. HET-CAM teszt A HET-CAM tesztet az Invittox Protocol 47. száma (1990) alapján végeztem el. A vizsgálati anyagokat 100%-os töménységben alkalmaztam. A vizsgálathoz magas termékenységi mutatóval rendelkező (White Leghorn) tyúktojásokat használtam, amelyeket lámpázás után 10 napig keltettem 37 C-on, %-os páratartalomnál. A 10. napon a tojáshéj felnyitásával szabaddá váló chorioallantois membránra cseppentettem a vizsgálati anyagot, melyet 5 percig figyeltem meg. A membránon vérzés, véredény lízis vagy koaguláció jelentkezhet, melyek jelentkezésének idejét másodperc pontossággal rögzítettem, majd ezekből irritációs indexet számoltam. Vizsgálati anyagonként 6 db tojást alkalmaztam 4 ismétlésben. ICE teszt Az ICE tesztet az OECD 438 irányelv alapján végeztem el. A vizsgálathoz használt csirkeszemek a vágástól számított két órán belül az izolált körülményeket biztosító szuperfúziós készülékbe kerültek. A vizsgálókamrákba helyezett szemek alkalmasságát a szaruhártyahomály és a 2 v/v%-os fluoreszein-oldat megtartásának mértékével ellenőriztem. A nem megfelelő szemek kicserélésre kerültek, majd megmértem a szaruhártya-vastagságot minden szem esetében perces akklimatizációt követően, de még a kezelés előtt szintén meghatároztam a szaruhártya-vastagságot, a szaruhártyahomályt és a fluoreszein-megtartást mindegyik szemnél (referencia értékek). A kezelést követő mosás utáni 30., 75., 120., 180., 240. percben végzett megfigyelések során rögzített paramétereket a referenciaértékekkel összehasonlítva meghatározható volt a vizsgált vegyi anyag szaruhártyára gyakorolt károsító hatása az adott időpontban. A kezelési térfogat 30 µl, az expozíciós idő pedig 10 másodperc volt minden egyes szem esetében, amelynek lejárta után a tesztanyagot szobahőmérsékletű fiziológiás sóoldat segítségével távolítottam el a szaruhártya felszínéről (kb. 20 ml/szem). A csirkeszemek elváltozásainak mértékét százalékban fejeztem ki, majd a három mérésből származó végpontból határoztam meg a vizsgálati anyag szemirritációs potenciálját. Vizsgált anyagonként három szemet vontam kísérletbe.

5 MTT vizsgálat Az MTT vizsgálatot patkányból kinyert epithelsejteken végeztem, amelyeket 24 órával a vizsgálat megkezdése előtt az előzőleg elkészített szuszpenzióban (Hank-oldat), megfelelő hígításban 96 lyukú lemezre vittem fel. Másnap a tápoldatot kiöntöttem, és friss tápoldatra cseréltem, amely a vizsgálati anyag különböző mértékben hígított oldatát tartalmazta. 24 órás expozíció után 2 órán át 1 mg/ml MTT oldattal inkubáltam a sejteket, majd a keletkezett formazán kristályokat DMSO-val oldottam. Az oldat fényelnyelését 540 nm hullámhosszon mértem. Az azonos hígítások fényelnyelési adataiból (3 mérés) átlagot számoltam, majd ezt a kezeletlen sejtek (24 mérés) átlagához viszonyítva kiszámítottam a %-os sejtpusztulást. A kezelt oldat fényelnyelését a kezeletlenhez viszonyítva határoztam meg az élő sejtek %-os arányát. A vizsgálati minták minden hígításával három párhuzamos mérést végeztem. Kontrollként kezeletlen sejteket használtam. Statisztikai módszerek Az egyes vizsgált módszerek összehasonlításában rangkorrelációt alkalmaztam (Kendallféle gamma). A módszerek közötti eltérés mértékét Cohen-féle kappával állapítottam meg.

6 3. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Elsőként végeztem el az alábbi növényvédő szerek szemirritációs potenciáljának meghatározását in vitro HET-CAM teszttel: - BUMPER 25 EC: irritatív, - COMMAND 48 EC: irritatív, - CYPERKILL 25 EC: irritatív, - DOMARK 10 EC: súlyosan irritatív, - DUAL GOLD 960 EC: nem irritatív, - GLIALKA STAR: irritatív, - GLYPHOGAN 480 SL: irritatív, - K-OBIOL 25 EC: súlyosan irritatív, - LEOPARD 5 EC: irritatív, - MECOMORN 750 SL: súlyosan irritatív, - MIRAGE 45 EC: irritatív, - MYSTIC 250 EC: irritatív, - NIMROD 25 EC: irritatív, - ORIUS 20 EW: súlyosan irritatív, - PROPLANT: irritatív, - PULSAR 40 SL: irritatív, - RACER: irritatív, - RELDAN 22 EC: irritatív, - SCORE 250 EC: irritatív, - SEKATOR: súlyosan irritatív, - SYSTHANE DUPLO: súlyosan irritatív, - TANDUS 200 EC: nem irritatív, - TOPAS 100 EC: súlyosan irritatív, - VERTIMEC 1,8 EC: irritatív, - WARRANT 200 SL: súlyosan irritatív. 2. Elsőként végeztem el az alábbi növényvédő szerek szemirritációs potenciáljának meghatározását in vitro ICE teszttel: - BUMPER 25 EC: irritatív, - COMMAND 48 EC: irritatív,

7 - CYPERKILL 25 EC: irritatív, - DOMARK 10 EC: nem irritatív, - DUAL GOLD 960 EC: irritatív, - GLIALKA STAR: irritatív, - GLYPHOGAN 480 SL: súlyosan irritatív, - K-OBIOL 25 EC: irritatív, - LEOPARD 5 EC: irritatív, - MECOMORN 750 SL: súlyosan irritatív, - MIRAGE 45 EC: irritatív, - MYSTIC 250 EC: irritatív, - NIMROD 25 EC: irritatív, - ORIUS 20 EW: irritatív, - PROPLANT: nem irritatív, - PULSAR 40 SL: nem irritatív, - RACER: irritatív, - RELDAN 22 EC: nem irritatív, - SCORE 250 EC: nem irritatív, - SEKATOR: súlyosan irritatív, - SYSTHANE DUPLO: irritatív, - TANDUS 200 EC: irritatív, - TOPAS 100 EC: irritatív, - VERTIMEC 1,8 EC: irritatív, - WARRANT 200 SL: irritatív. 3. Elsőként végeztem el az alábbi növényvédő szerek szemirritációs potenciáljának meghatározását MTT vizsgálattal: - COMMAND 48 EC: irritatív, - CYPERKILL 25 EC: irritatív, - K-OBIOL 25 EC: irritatív, - LEOPARD 5 EC: irritatív, - MIRAGE 45 EC: súlyosan irritatív, - MYSTIC 250 EC: súlyosan irritatív, - NIMROD 25 EC: irritatív, - PROPLANT: irritatív,

8 - PULSAR 40 SL: nem irritatív, - RACER: irritatív, - RELDAN 22 EC: súlyosan irritatív, - SYSTHANE DUPLO: irritatív, - TANDUS 200 EC: irritatív, - TOPAS 100 EC: irritatív, - WARRANT 200 SL: irritatív. 4. Az in vitro tesztekből származó eredmények in vivo adatokkal történő összehasonlítása során az in vitro tesztek (HET-CAM, ICE, MTT) jelenlegi formájukban nem alkalmasak valamennyi irritációs kategória esetében az in vivo eredmények helyett a növényvédő szerek engedélyezési célú felhasználására. 5. Az általam végzett in vitro tesztek (HET-CAM, ICE, MTT) a növényvédő szerek szemirritációs potenciáljának meghatározásában többlépcsős megközelítésben használhatóak, de növényvédő szerek esetében a HET-CAM teszt és az ICE teszt ajánlható leginkább a szemirritációs kategóriák megállapítására. 6. A növényvédő szerek szemirritációs potenciáljának meghatározása során az OECD 405-ös szabvány szerinti in vivo szemirritációs vizsgálat teljes kiváltásához egy in vitro tesztrendszer kidolgozása szükséges, melynek összeállításában a HET-CAM teszt és az ICE teszt alkalmazása javasolt.

9 4. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Külföldön megjelent idegen nyelvű folyóirat cikk 1. É. Kormos, J. Tavaszi, P. Budai, A. Pongrácz, J. Lehel Eye irritation study of some pesticides on chorioallantoic membrane of the egg. Comm. Agr. Appl. Biol. Sci. Ghent University Magyarországon megjelent idegen nyelvű folyóirat cikk 1. P. Budai, J. Lehel, J. Tavaszi, É. Kormos HET-CAM test for determining the possible eye irritancy of pesticides. Acta Veterinaria Hungarica É. Kormos, J. Lehel, K. Haszon Comparative study with a set of pesticides to establish eye irritancy with HET-CAM and Draize test. Georgikon for Agriculture J. Tavaszi, É. Kormos, Á. Pálovics Examination of eye irritancy by using two alternative methods. Georgikon for Agriculture Magyar nyelvű folyóirat cikk 1. Somody G., Lehel J., Buda I., Várnagy L., Szabó R., Antal D., Kormos É., Budai P Biocid termékek in vitro szemirritációs vizsgálata izolált csirkeszemen. Georgikon for Agriculture Kormos É., Somody G., Szabó R., Lehel J., Buda I In vitro HET-CAM és ICE teszttel végzett szemirritációs összehasonlító vizsgálat növényvédő szerekkel. Georgikon for Agriculture Kormos É., Buda I., Szabó R., Lehel J., Budai P Növényvédő szerek in vitro szemirritációs vizsgálata izolált csirkeszemen. Georgikon for Agriculture Nemzetközi konferencia-kiadványban megjelent idegen nyelvű előadás (idegen nyelvű konferencia előadás teljes terjedelemben) 1. P. Budai, J. Tavaszi, É. Kormos, R. Szabó, D. Antal, J. Lehel In vitro ocular irritation study of some agrochemicals by using two alternative methods (HET-CAM test and MTT assay). II. Közép- és kelet-európai Laborállat-tudományi Konferencia (CEELA-2012 Triannual Conference), Budapest, június 02. Proceedings, p ISBN:

10 Magyar nyelvű konferencia-előadás (teljes terjedelemben) 1. Tavaszi J., Budai P., Kormos É A HET-CAM teszt alkalmazása mezőgazdasági vegyi anyagok irritációs tulajdonságainak meghatározásában. Tavaszi Szél 2008, Budapest május Kormos É., Budai P., Horváth E A HET-CAM teszt alkalmazása a mezőgazdasági vegyi anyagok in vitro toxikológiai vizsgálatában. XX. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely, január Konferencia kiadvány Kormos É., Szabó R., Antal D., Tavaszi J., Somody G., Lehel J., Budai P Peszticidek szemirritációs hatásainak vizsgálata in vitro rendszerben. XXIII. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely, január Georgikon for Agriculture Somody G., Kormos É., Szabó R., Antal D., Lehel J., Budai P A HET-CAM teszt alkalmazása biocid készítmények irritatív hatásainak vizsgálatában. XXIII. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely, január Georgikon for Agriculture Csak kivonatban megjelent konferencia-előadás 1. Tavaszi J., Budai P., Kormos É Mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív hatásainak vizsgálata alternatív módszerekkel. XVIII. Növényvédelmi Fórum, Keszthely, Konferencia kiadvány J. Tavaszi, P. Budai, É. Kormos Evaluation of eye irritancy by using the chorioallantois membrane. Eurotox 2008, Rhodes, oct Toxicology Letters, Abstracts of the 45th Congress of the European Societies Toxicology 3. É. Kormos, P. Budai,, J. Tavaszi, A. Pongrácz, J. Lehel Eye irritation study of some pesticides on chorioallantoic membrane of the egg. 61. International Symposium on Crop Protection, Ghent, May 19, Abstracts Kormos É., Budai P Mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív hatásainak vizsgálata in vitro módszerrel. TOX Galyatető, október Kivonatok Kormos É., Budai P A HET-CAM teszt alkalmazása a mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív hatásainak vizsgálatában.. TOX Galyatető, október Kivonatok 78.

11 6. Kormos É., Budai P., Lehel J., Szabó R A chorioallantois membrán alkalmazása a növényvédő szerek szemirritációs toxikológiai vizsgálatában. XXI. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely, január Konferencia kiadvány Tavaszi J., Pálovics Á., Kormos É., Szabó R., Lehel J., Budai P Alternatív tesztrendszer alkalmazása mezőgazdasági vegyi anyagok irritatív hatásának meghatározásában. TOX Hévíz, október Kivonatok Buda I., Lehel J., Kormos É., Somody G., Szabó R., Várnagy L., Budai P Növényvédő szerek in vitro szemkorróziós vizsgálata izolált csirkeszemen. TOX Velence, október Kivonatok 60.