Ellenanyag reagensek előállítása 2015.02.23. Sándor Noémi noemi.sandor@ttk.elte.hu

Ellenanyag reagensek előállítása 2015.02.23. Sándor Noémi noemi.sandor@ttk.elte.hu

2. Antigének, immunizálás fejezet (29-31.oldal, 38-41. oldal) 3. Ellenanyagok fejezet (43-45. oldal, 47-50. oldal, 56-65. oldal, 73-75. oldal, 87. oldal) 2. Patogének, antigének, haptének (41-46. oldal) 11. A limfociták antigén-felismerő receptorának kialakulása (276-284. oldal) 14. A humorális immunválasz

Mire használjuk az ellenanyagokat? Ugyanarra, amire a természet specifikusan kapcsolódjon a célponthoz (antigénhez) Az ellenanyag jelen esetben eszköz (de van hogy az ellenanyagot detektáljuk, pl. diagnosztika, oltás sikerességének ellenőrzése!) A számunkra érdekes molekula (=antigén) kimutatása, tisztítása, jelölése stb. specifikusan Antigén-ellenanyag kapcsolat nagyon erős (=nagy affinitású) Nagyon kevés vizsgálandó anyag is kimutatható, azonosítható a mintában.

Hogyan is néz ki egy ellenanyag? Antigén felismerés (variábilis részek által) Nehéz lánc Könnyű lánc Fab V=variábilis C=konstans Fc Effektor funckiók (Fc receptorhoz kötődés, komplement aktiválás)

Az antigén felismerés Antigénen felismert szakaszok = antigén determinánsok vagy epitópok Erdei, Immunológia

Hogyan alakul ki az ellenanyag válasz? 3. 1. 10 7-10 9 féle 2. Erdei, Immunológia 1. Az antigén felismerése az arra specifikus B-sejt receptort (BCR) hordozó limfociták által 2. A specifikus, kiválasztott sejtek aktiválódnak és osztódnak (klonális= az utód sejtek az eredetileg aktiválódó sejttel megegyezőek) 3. Ellenanyag termelés

Hogyan alakul ki a BCR repertoár? RAG és TdT enzimek végzik Erdei, Immunológia

Hogyan alakul ki a BCR repertoár? A sokféleségért (felismerés) felelős tényezők Az B-sejtek érése során - a V, a D és a J génszegmensek száma - a kapcsolódási kombinációk - pontatlan átrendeződések - extra nukleotid beépülések - H L kapcsolódás

Hogyan alakul ki az ellenanyag válasz? 3. 1. 10 7-10 9 féle 2. Erdei, Immunológia 1. Az antigén felismerése az arra specifikus B-sejt receptort (BCR) hordozó limfociták által 2. A specifikus, kiválasztott sejtek aktiválódnak és osztódnak (klonális= az utód sejtek az eredetileg aktiválódó sejttel megegyezőek) 3. Ellenanyag termelés

Hogyan változik az ellenanyag az immunválasz során? Az B-sejtek aktivációja során - a szomatikus hipermutációk (antigén kötő képesség változik) -Izotípus váltás (effektor funkciók változnak) IgM IgG/E/A Abbas, 2012

Az antigén-ellenanyag kapcsolódás jellemzői - alapfogalmak Az ellenanyag affinitása: (disszociációs konstans, Kd): ag koncentráció, ami az agkötőhelyek felét telíti: 10-7 10-11 M/liter Az ellenanyag aviditása: A kötések affinitásának összege több ellenanyag affinitásának összessége Az ellenanyag valenciája: egy ellenanyaghoz kapcsolódó univalens ligandumok száma (monovalens, bivalens, pentavalens) valencia aviditás Abbas, Immunology, 7 th edition

Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyag (készítmények)* http://absoluteantibody.com/antibody-resources/antibody-overview/antibodies-as-tools/ Egy antigénen általában több, a B-sejtek számára felismerhető antigén determináns (epitóp) található *sok db ellenanyag mindig

Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyagok

Alapfogalmak - monoklonális és poliklonális ellenanyagok immunizálás Poliklonális (=többféle B-sejt klón terméke) ellenanyagok Egyedi B-sejtek izolálása és in vitro monoklonális (=egyetlen B-sejt klón terméke) ellenanyag termeltetése Egy antigén több epitópjára specifikus ellenanyagok keveréke Egy antigén egy epitópjára specifikus ellenanyag

Hogyan állítjuk elő a gyakorlatban az ellenanyagokat? IMMUNIZÁLÁS (oltás) sig * ANTIGÉN felismerés aktiváció osztódás differenciáció szekretált ellenanyag B plazmasejt -az adott antigén és az immunizálandó egyed viszonya (filogenetikai távolság) -az antigén kémiai természete -az antigén biológiai sajátságai (mennyire immunogén?) -az antigén bejuttatásának helye -az antigén mennyisége (alacsony és magas dózis tolerancia) -az antigén bejuttatásának módja (oltás, orális, kontakt szenzibilizálás, bőrátültetés) * sig vagy mig = surface vagy membrane Ig, ez maga a B-sejt receptor

Az immunizálás hatásfokának növelése ADJUVÁNSOK antigén depót képeznek (lassítják az antigén felszívódását) gyulladást idéznek elő az antigén behatolás helyén (veszély szignál a szervezet számára) Leggyakoribb típusok: Freund-adjuváns (+ /- Mycobacterium tuberculosis) IgG2a) aluminium-hidroxid (+/- Bordetella pertussis) IgG1) Nippostrongylus brasiliensis IgE; Salmonella typhimurium IgA) szaponin ISCOM (immun stimuláló komplex) TiterMax, RAS (Ribi Adjuvant System)

Az immunizálás menete Emlékeztető: Elsődleges és memória válasz A specifikus ellenanyagok szintjének emelkedése gyorsabb Izotípus megoszlás IgM IgG/A/E Specifikus ellenanyag mennyiség magasabb A specifikus ellenanyagok átlag affinitása magasabb Ráoltás/Újraoltás/ Booster oltás ugyanazzal az antigénnel oltunk (általában többször, oltási sémák) Sikeresség ellenőrzése vérvétellel

Poliklonális ellenanyagok előállítása Főleg rágcsálókból (patkány, egér, nyúl, hörcsög) és kecskéből, marhából, lóból Menete Adott antigén tiszta formában történő előállítása Ezzel immunizáljuk az állatot vérvétel (sok) szérumból (ezt immunszérumnak nevezzük) ellenanyagok kitisztítása felhasználás

Poliklonális ellenanyagok előállítása immunizálások Nagy mennyiségű vérvétel ( immunszérum, benne a specifikus ellenanyagok), és további tisztítás/felhasználás 0 21 42 Idő (napok) Oltás sikerességének (=termelődött specifikus ellenanyag mennyiségének) ellenőrzése vérből

Az immunizálás menete (monoklonális) Lépsejtek (nem szérum!) izolálása, fúzió, stb immunizálások 0 21 42 Idő (napok) Oltás sikerességének (=termelődött specifikus ellenanyag mennyiségének) ellenőrzése vérből

Monoklonális ellenanyagok előállítása relatív hosszú idő (2 hónap + tesztelés) felszerelés igényes (steril sejtes munka) Lépések: 1. Immunizálás az antigénnel 2. Lépből B-sejtek izolálása 3. B-sejtek hibridizációja mielómasejtekkel (immortalizáció) 4. A sikeresen fúzionált sejtek szelektálása 5. A megfelelő ellenanyagot termelő klónok szelekciója, felszaporítása, fagyasztása (hosszú távú tárolás)

Monoklonális ellenanyagok előállítása 1. Immunizálás megfelelő faj kiválasztása fontos, legtöbbször egér. A cél határozza meg (pl. egér fehérje ellen patkány, humán fehérje ellen egér, stb...) 2. Lép izolálása, ebből B-sejtek tisztítása 3. Hibridizáció = B-sejtek + mielómasejtek + PEG B-sejtek: primer sejtek az állatból, képesek alternatív úton DNS-t szintetizálni, korlátozott életképességűek, de tudnak ellenanyagot termelni mielomasejtek: B-sejt eredetű tumorsejt vonalak, nem képesek ellenanyagot termelni, nem képesek alternatív úton DNS-t szintetizálni, de korlátlan életképességűek Legtöbbször használt: Sp2 PEG: polietilén glikol, vízelvonó szer Sp2 + PEG fúzió B-sejtek Ezeket az Sp2-B-sejt fúzióból létrejött hibridómákat kell szelektálni

Monoklonális ellenanyagok előállítása 4. A hibridómák szelekciója: HAT szelekciós médiumban H hipoxantin: az alternativ DNS szintézis út szubsztrátja A aminopterin: a klasszikus DNS szintézis út gátlószere T timidin: az alternatív DNS szintézis út szubsztrátja Ellenanyag termelő képesség Életképesség Alternatív DNS szintézis út HAT médiumban Mielóma (Sp2) B-sejt Hibridóma Nem Korlátlan Nincs mert nem tud alternatívan DNS-t szintetizálni Igen Korlátozott (1 hét) Van Mert nem korlátlan életképességű Igen Korlátlan Van

Monoklonális ellenanyagok előállítása 5. A megfelelő ellenanyagot termelő hibridómák klónozása (=egy sejtből eredő klonális tenyészet készítése, ahol minden sejt egyforma) A HAT szelekciót túlélt sejteket nagyon nagy hígitásban (hogy kevés sejt kerüljön egy lyukba) szétosztjuk mikorkultúrákba Kiválasztjuk azokat a kultúrákat, melyek termelik az adott antigénre specifikus ellenanyagot (ez még oligoklonális!), és szétosztjuk úgy, hogy 1-1 klón jusson egy lyukba Újra teszteljük, hogy mely lyukakban vannak pozitív (a megfelelő specificitású ellenanyagot termelő) sejtek

Monoklonális ellenanyagok előállítása A pozitív klónokat felszaporítjuk Fagyasztva (folyékony nitrogén) tárolás Ellenanyag tisztítása a sejttenyészet felülúszójából Klón beoltása egér (azonos MHC hátterű/nude/scid) hasüregébe nagy mennyiségű ellenanyag termelése aszciteszbe

Monoklonális és poliklonális ellenanyagok poliklonális ellenanyagok monoklonális ellenanyagok specificitás heterogén homogén affinitás heterogén homogén izotípus heterogén homogén keresztreakciók gyakori nincs előállítás olcsó, egyszerű drága, speciális felszerelést igényel immunizálás tisztított antigénnel szennyeződés nem zavar mennyisége korlátozott korlátlan jellemzés ajánlott módszerek specificitás/keresztreagáló képesség izotípus összetétel átlag affinitás elsősorban az Ag-EA kötődést követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló precipitáció agglutináció komplement aktiválás finom specificitás izotípus affinitás kis különbségek megkülönböztetésére alkalmas, jelöléses FACS / MACS blot - ELISA/RIA George Köhler és Cesar Milstein 1984

Monoklonális és poliklonális ellenanyagok specificitás mennyiség poliklonális Heterogén minden ellenanyag molekula az adott antigénre specifikus, de mindegyik egy másik részletére (epitópjára) Korlátozott az adott állatból az oltás után kinyerhető savó/aszcitesz mennyisége határozza meg, új állat oltása nem ugyanolyan összetételű poliklonális készítményt ad monoklonális Homogén minden ellenanyag molekula teljesen egyforma, nemcsak azonos antigén, de azonos epitóp specificitás is Korlátlan halhatatlan B-sejt klón in vitro teremeli ag ag

Ellenanyagok tisztítása 1. Biokémiai tisztítási módszerek Az immunglobulinok fiziko-kémiai (töltés, mólsúly) tulajdonságai alapján szeparálunk A választott szeparálási mód és anyag attól függ, hogy milyen tulajdonságú ellenanyagot (pl. IgM vagy IgG) milyen egyéb fehérjéktől szeretnénk elválasztani kisózás (pl. Na-szulfát, ammónium szulfát) ioncserélő kromatográfia (pl. DEAE és CM cellulóz oszlopok) gélszűrés (pl. Sephadex, Sepharose) 2. Affinitás kromatográfia A: Az ellenanyag konstans részén keresztüli tisztítás Protein G IgG nehéz lánc Protein A IgG nehéz lánc Protein L κ könnyű lánc Jacalin IgA MBL IgM Alosztályokra, fajokra eltérő lehet a kötődés erőssége

Affinitás kromatográfia a konstans részen keresztül Fehérjekeverék (pl. immunszérum) Elúciós oldat ami megbontja az ellenanyag és a Protein G közti másodlagos kötőerőket (általában ph változtatással) Protein G Sepharose gyöngyökön (IgG hozzákötődik) Minden átfolyik ami nem képes Portein G- hez kapcsolódni

Affinitás kromatográfia az antigén felismerő részen keresztül B: Az ellenanyag felismerő részén keresztüli tisztítás A megfelelő specificitású ellenanyagok elválaszthatóak nemcsak a többi fehérjétől, hanem a nagyon hasonló, de más specificitású ellenanyagoktól is Fehérjekeverék (pl. immunszérum) Protein G-s tisztítás Elúció ugyanúgy mint Protein G-nél Sepahrose gyöngyökre kapcsolt antigén (=antigén szorbens) Megjegyzés: Ez a módszer antigén tisztítására is jó, csak ekkor az ellenanyagot kell a gyöngyökhöz kapcsolni, majd ezen átfolyatni az antigént is tartalmazó fehérje keveréket

Ellenanyagok tisztítása - összefoglalás Biokémiai módszerek, affinitás kromatográfia immunszérum (poliklonális) lépsejtek kivétele monoklonális készítés kisózás globulinok (minden Ig izotípus, antigén specifitástól függetlenül) ioncserélő kromatográfia IgG (minden IgG alosztály, antigén specifitástól függetlenül) Protein A / G / (L) IgG (κ) (IgG alosztály különbségek, ill. a κ könnyűláncú ellenanyagok antigén specifitástól függetlenül ) antigén szorbens antigén specifikus ellenanyagok, Ig izotípustól függetlenül Sejttenyészet felülúszó (monoklonális) Hibridóma beoltása hasüregbe a nagyobb ellenanyag hozamért Protein A / G / (L) tiszta monoklonális ellenanyag antigén szorbens antigén specifikus ellenanyagok, Ig izotípustól függetlenül (ha pl. Olyan izotípusú a monoklonálisunk ami nem kötődik Protein G/A/L-hez aszcitesz folyadék kisózás globulinok (főleg a monklonális Ig, de az állat saját ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) ioncserélő kromatográfia IgG (főleg a monklonális Ig, de az állat saját ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) Protein A / G / (L) IgG (κ) (főleg a monklonális Ig, de az állat saját ellenanyaginak egy része is bekerül az aszciteszbe!) antigén szorbens antigén specifikus monoklonális, Ig izotípustól függetlenül

Ellenanyagok módosítása Mit és miért lehet érdemes megváltoztatni egy ellenanyagon? specificitás és affinitás valencia méret effektor funkciók könnyű konjugálhatóság (gyógyszerek, festékek, enzimek, stb.) in vivo immunogenitás a lebomlás sebessége Ellenanyag terápiák (vakcináció, tumorterápia, gyógyszer irányítás) faj idegen fehérje (pl. Egér monoklonális ellenanyag) immunválasz ennek elkerülésére ellenanyag módosítás (humanizálás, stb...) az ellenanyag specificitása jó, de módosítani kívánjuk az effektor funckiót (komplement aktiváció, FcR kötés, stb..)

Ellenanyagok módosítása 1. Kémiai módosítás Részleges redukció láncok közötti diszulfid hidak megszűnnek, szabad SH csoportok jönnek létre Limitált proteolízis papain, pepszin Konjugálás (JELÖLÉS) Az ellenanyagot vagy a létrehozott fragmentumokat összekapcsoljuk más molekulákkal 2. Molekuláris biológiai módosítás jövő óra... (Prechl József) http://www.genovis.com/ms-analysis-of-mabs

Ellenanyagok fragmentálása IgG IgG 2x Fab Fc F(ab ) 2 pfc Fajtól, izotípustól, glikoziláltságtól függ az emészthetőség (van, amit nem lehet) Az emésztett termékeket a már ismert kromatográfiás módszerkkel lehet elválastztani egymástól leggyakoribb enzimek: pepszin, papain egyéb enzimek: tripszin, plazmin

Ellenanyagok tisztítása A termékek ellenőrzése SDS-PAGE-val Ms /kda Ms /redukált Ext.koeff. /280nm IgG 150-160 50/25 14,3 IgA 170 10,6 IgM 900-1100 78/25 11,86 H 50-55 13,7 L 25 11,8 Fab 50 25 15,3 F(ab )2 104-110 25 14,8 Fc 50 25 12,2 pfc 26 13,8

Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) + Ellenanyag Jelölő anyag toxin/gyógyszer Jelölt ellenanyag

Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) Mivel jelöljük az ellenanyagot Példa Mit detektálunk Milyen módszerben használjuk Enzim HRPO, AP Enzimreakciót (szubsztrát elhasítva világít/színt vált) ELISA, Western blot, immunhisztokémia Fluoreszcens festék FITC, PE, Alexa fetsékek, stb... Fluoreszcenciát (fényt) FACS, fluoreszcens mikroszkópia Fémkolloid arany, vas A fém tulajdonságait MACS, elektronmikroszkóp Radioaktív izotóp pl. 125 I Radioaktiv sugárzást RIA

Ellenanyagok jelölése (=konjugálása) +1 sokoldalú jelölés: biotin b b b b b b avidin avidin avidin b b b b b HRPO/ fluo festék/ fémkolloid/ izotóp b Avidin, Streptavidin, Extravidin, Neutravidin

Ellenanyagok felhasználási területei antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló módszerek (pl. ELISA, Western blot, immunhisztokémia) minőségi/mennyiségi meghatározások (pl. veszélyes anyagok kimutatása, finom különbségek kimutatása anyagok között) sejtpopulációk kimutatása/szeparálása/aktiválása/aktiváció vizsgálata anyagok tisztítása diagnosztika terápia

Miért jó ellenanyagokat használni ezekre a funkciókra? hagyományos és affinitás kromatográfián alapuló fehérje tisztítási módszerekkel kinyerhető specifikus felismerő képessége kis molekuláris különbségek meghatározására alkalmas mindenféle kémiai természetű anyag ellen termeltethető a specifitásának megfelelő antigénhez megfelelő erősséggel, de nem kovalens módon kötődik (megfelelő körülmények között szétválasztható az antigén-ellenanyag komplex) festékeket, izotópokat, enzimeket, drogokat, stb., lehet egyszerű módszerekkel hozzákonjugálni multivalens formában keresztkötni képes effektor rendszerek aktiválására in vivo és in vitro képes

Ellenanyagok felhasználása Antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek 1. Antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló technikák Az ellenanyag tulajdonságai (valencia, flexibilitás, affinitás) határozzák meg a másodlagos reakciót, ami pl. kicsapódás, agglutináció (térhálóképzés), stb... 2. Jelöléses technikák Közvetlenül az ellenanyagnak az antigénhez való kapcsolódását mutatjuk ki azáltal, hogy valamilyen módon detektálni tudjuk magát az ellenanyagot

Izotípus váltás és az antigén természetének összefüggése Az izotípus váltáshoz elengedhetetlen a T h sejtekkel való antigén specifikus kapcsolat A T-sejtek csak peptideket (tehát fehérje eredetű antigéneket) ismernek fel IgM-től eltérő izotípusú ellenanyagokat elsősorban fehérjék ellen lehet előállítani T independens (TID) immunválasz (lipid, szénhidrát antigének) esetén főleg IgM, de! A citokin környezet hatására történhet izotípusváltás Immunológiai módszerek 2.1. ábra, Immunológia 14.3. ábra