Genetikai polimorfizmusok szerepe a bronchopulmonális dysplasia és a perinatális tüdőkárosodás kialakulásában Doktori értekezés Dr. Bokodi Géza Miklós Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Hivatalos bírálók: Dr. Vásárhelyi Barna, tudományos főmunkatárs, Ph.D. Dr. Hídvégi Edit, Ph.D. Dr. Klausz Gergely, Ph.D Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szalai Csaba, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Hermann Róbert, tudományos főmunkatárs, Ph.D. Dr. Pós Zoltán, tudományos munkatárs, Ph.D. Budapest 2007.
1. Tartalomjegyzék 1. Tartalomjegyzék 2 2. Rövidítések jegyzéke 5 3. Bevezetés 8 3.1. A bronchopulmonális dysplasia 8 3.2. A bronchopulmonális dysplasia definíciója 8 3.3. A bronchopulmonális dysplasia története, incidenciája, mortalitása 10 3.4. A bronchopulmonális dysplasia klinikai tünetei 11 3.5. A bronchopulmonális dysplasia radiológiai tünetei 11 3.6. A bronchopulmonális dysplasia szövettani jellemzői 14 3.7 A bronchopulmonális dysplasia típusai 16 3.8. A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői és patomechanizmusa 17 3.8.1. Oxigénterápia és gépi lélegeztetés 19 3.8.2. A tüdőfejlődés és szabályozó tényezői. 21 3.8.3. A perinatális gyulladás 22 3.8.3.1. A gyulladás sejtes elemei 23 3.8.3.2. A gyulladás és az oxidatív stressz 23 3.8.3.3. A gyulladás szerepe a koraszülésben 23 3.8.3.4. A chorioamnionitis 24 3.8.3.5. A gyulladás szerepe a perinatális adaptáció zavaraiban 25 3.8.3.6. A perinatális gyulladásos reakció fázisai 25 3.8.4. A gyulladással kapcsolatos vizsgálataink 26 3.8.4.1. Az immunrendszer részei 26 3.8.4.2. Az újszülött immunrendszere 27 3.8.4,3. A neutrophil granulocyták, makrofágok és természetes ölősejtek 27 3.8.4.4. A citokinek általános jellemzői 29 3.8.4.5. Az általunk vizsgált citokinek 30 2
3.8.4.6. A renin angiotenzin aldosteron rendszer szerepe a gyulladásban 33 3.8.5. Táplálási ápolási tényezők 33 3.8.6. Örökletes, genetikai tényezők 34 3.8.6.1. Általános genetikai jellemzők 34 3.8.6.2. A genetikai polimorfizmusok 35 3.8.6.3. A bronchopulmonális dysplasia és a lélegeztetés iránti igény genetikai háttere közötti kapcsolat 36 3.8.6.4. A koraszülés és a chorioamnionitis genetikai háttere 38 3.8.6.5. A tüdőfejlődés genetikai háttere 41 3.8.6.6. A perinatális gyulladásos reakció genetikai háttere 44 3.8.6.7. Az általunk vizsgált gén polimorfizmusok 49 4. Célkitűzések 52 5. Betegek és módszerek 54 5.1 Betegek 54 5.2 Módszerek 57 5.2.1 DNS izolálás szűrőpapíros mintából 57 5.2.2 Molekuláris biológiai vizsgálatok 58 5.2.3. Statisztikai elemzés 67 6. Eredmények 72 6.1 A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés 72 6.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés 73 6.3. Az ACE I/D és AT1R és lélegeztetés 76 7. Megbeszélés 78 7.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés 78 7.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés 79 7.3. Az ACE I/D és AT1R génpolimorfizmusok és lélegeztetés 82 7.4. Az általunk feltárt új összefüggések a perinatális lélegeztetési igény és a BPD genetikájában 82 8. Tézisek 85 3
9. Összefoglalás 86 10. Summary 87 11. Táblázatok és ábrák jegyzéke 88 12. Irodalomjegyzék 89 13. Saját publikációk jegyzéke 104 14. Köszönetnyilvánítás 106 15. Saját publikációk különlenyomata 108 4
2. Rövidítések jegyzéke ACE APC ARF AT AT1R bp BPD BMP-4 CD CF CI CLD COX CO 2 CPAP CRP CRT DNS dntp ER FGF FIRS FRC GATA-6 HLA HSP HW I/D IFN IFNγ angiotenzin konvertáló enzim antigén prezentáló sejt akut veseelégtelenség angiotenzin 1-es típusú angiotenzin receptor bázispár bronchopulmonális dysplasia bone morphogenetic protein-4 klaszter differentációs antigén keringési elégtelenség konfidencia intervallum krónikus tüdőbetegség ciklooxigenáz széndioxid folyamatos pozitív légúti nyomás C-reaktív protein kapilláris újratelődési idő dezoxiribonukleinsav dezoxi nukleotid-trifoszfát ösztrogénreceptor fibroblast növekedésifaktor magzati gyulladásos válaszreakció szindróma funkcionális reziduális kapacitás transzkripciós faktor (GATA szekvenciához kötődik) humán leukocyta antigén hősokkfehérje Hardy-Weinberg inzerció/deléció interferon interferon gamma 5
IL IL-1β Il-1ra IL-4RA IL-6 IL-10 IL-12 inos IRDS IUGR IVH JAK kb kd LAK LBW LPS LT M MAP MAS MBL MHC MMP mrns mtsai. NCPAP NEC NF-κB NICU NK NO interleukin interleukin-1-béta interleukin-1 receptor agonista interleukin-4 receptor alfa lánc interleukin-6 interleukin-10 interleukin-12 indukálható nitrogénmonoxid szintáz idiopathiás respirációs distressz-szidróma intrauterin növekedési retardáció kamrai vérzés Janus kináz kilobázis kilodalton limfokin aktivált ölősejt kis születési súlyú lipopoliszacharid limfotoxin mol/dm3 artériás középnyomás mekónium-aspirációs szindróma mannózkötő lektin fő hisztokompatibilitási komplex mátrix metalloproteináz messenger RNS munkatársai nazális CPAP nekrotizáló enterocolitis nukleáris faktor-kappa-b újszülött intenzív osztály természetes ölősejt nitrogén monoxid 6
NOD NOS OR PCR PDA PE PPHN PPV RAAS RFLP RDS rpm RSV SNP SPA SPB SPC SPD TGFβ Th TLC TLR TNFα TV U UTR UV VEGF VEGFR VLBW v/v% nukleáris oligomerizációs domén nitrogénmonoxid szintáz esélyhányados polimeráz láncreakció nyitott Botallo-vezeték praeeclampsia újszülöttek perzisztáló pulmonáris hipertóniája pozitív nyomású lélegeztetés renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer restrikciós fragment hossz polimorfizmus respirációs distressz-szindróma fordulat másodpercenként respiratory syncytial vírus egy nukleotidot érintő polimorfizmus surfactant protein A surfactant protein B surfactant protein C surfactant protein D transzformáló növekedésifaktor-béta T helper lymphocyta teljes tüdőkapacitás toll-like receptor tumor nekrózis faktor-alfa légzéstérfogat egység nem átíródó régió ultraibolya vaszkuláris endotheliális növekedési faktor vaszkuláris endotheliális növekedési faktor receptor igen kis születési súlyú térfogatszázalék 7
3. Bevezetés 3.1. A bronchopulmonális dysplasia A Bronchopulmonális dysplasia (BPD), a koraszülöttek krónikus tüdőbetegsége (CLD) jelentősen hozzájárul a koraszülött populáció morbiditásához és mortalitásához (1,2). A neonatológiai terápiás eljárások fejlődésével egyre éretlenebb újszülöttek maradnak életben, ezzel párhuzamosan emelkedett a BPD előfordulása a nagyon éretlen koraszülött populációban (1-4). A BPD krónikus betegség, egész életük során végigkíséri az érintett koraszülötteket. A csökkent légzésfunkció, perzisztáló légúti tünetek, gyakori és súlyos légúti infekciók miatt jelentősen romlik a betegek életminősége. A gyakran szükségessé váló kórházi kezelések illetve az egész életet végigkísérő gyógyszerfogyasztás súlyos terhet jelent az egészségügyi rendszer számára (1,5,6). Ezért nagy jelentőségű a betegség megelőzése, a BPD kialakulása szempontjából fokozott kockázatú betegek kiszűrése és célzott kezelése. Bár számos tényezőről igazolták, hogy hozzájárul a BPD kialakulásához, a veszélyeztetett betegek azonosítása egyelőre nem megoldott. Egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak az örökletes hajlamnak a betegség kialakulásában (4-10). Bár a BPD kockázatát fokozó genetikai polimorfizmusoknak önmagukban csekély a prediktív értékük, kombinált alkalmazásuk, pl. DNS chip technika segítségével, lehetőséget teremthet a veszélyeztetett betegek azonosítására és személyre szabott kezelésére. 3.2. A bronchopulmonális dysplasia definíciója A BPD definíciója többször változott az elmúlt években. Kezdetben a diagnózis a posztmenstruációs kor és az oxigénfüggőség mellett a betegségre jellemző klinikai és radiológiai jeleken alapult (1-4,12). Utóbbiak azonban a betegség karakterisztikájának a változásával együtt változtak, objektív meghatározásuk körülményes. A BPD jelenlegi definíciója több konszenzus-konferencia, illetve klinikai vizsgálat eredményén alapul. A koraszülötteket két csoportra osztják gesztációs kor szerint és ezekben más-más kritériumok alapján döntik el azt, hogy fennáll-e BPD (1. táblázat) (1-3). A 32. gesztációs hét előtt született gyermekek esetén BPD-ről akkor beszélünk, ha a 36. posztmenstruációs héten, vagy a gyermek otthonába bocsátásakor (attól függően, hogy 8
melyik következik be előbb) még mindig oxigéntámogatásra szorul a gyermek. A 32. vagy nagyobb gesztációs hétre születettek esetén akkor beszélünk BPD-ről, ha a gyermek az 56. életnapon, vagy otthonába bocsátásakor, (attól függően, hogy melyik következik be előbb) még mindig oxigén adására szorul. Mindkét csoportban a betegség megállapításának feltétele a legalább 28 napig tartó, 21 %-nál magasabb oxigénkoncentrációval történő kezelés. (A BPD feltétele a parenchymás tüdőkárosodás, illetve az emiatt fokozott légzéstámogatás iránti igény. Akut légzési elégtelenség miatt, vagy más okból (pl.centrális apnoe, diafragma paralízis) kialakuló légzéstámogatási igény a definícióban szereplő időpontban nem jelent BPD-t.) Az oxigénfüggés mértéke alapján a betegséget 3 súlyossági csoportra osztják: Enyhe BPD esetén a definícióban meghatározott időpontban a beteg 21% oxigéntartalmú levegőt igényel. Középsúlyos BPD esetén a levegőben a szükséges oxigéntartalom 22-29%. Súlyos BPD esetén a beteg szaturációja csak akkor kielégítő, ha az oxigénkoncentráció 30% vagy a megfelelő oxigenizáció biztosításához pozitív nyomás (pozitív nyomású lélegeztetés (PPV) vagy nazális folyamatos pozitív légúti nyomás (NCPAP)) szükséges. (Az, hogy mi tekinthető megfelelő oxigénszaturációnak, jelenleg még vita tárgyát képezi.). Bár a definíció nem tartalmazza a betegségre jellemző klinikai, illetve radiológiai jeleket, ezek segítik a BPD diagnózisának biztos felállítását (1-3,16). 9
1. táblázat: a bronchopulmonális dysplasia definíciója (1) A BPD definíciója Legalább 28 napig tartó 21%-nál magasabb oxigénkoncentrációval történő kezelés krónikus tüdőkárosodás Gesztációs kor születéskor <32 hét 32 hét BPD meghatározás ideje 36. posztmenstruációs hét 56. életnap vagy otthonába bocsátás Enyhe BPD 21% oxigén koncentráció Középsúlyos BPD 22-29% oxigén koncentráció Súlyos BPD 30% oxigén koncentráció vagy PPV/NCPAP 3.3. A bronchopulmonális dysplasia története, incidenciája, mortalitása A bronchopulmonális dysplasiát először Northway és munkatársai írták le 1967-ben (11). A betegséget olyan koraszülöttekben figyelték meg, akiket valamilyen tüdőt érintő betegség, legtöbbször idiopátiás respirációs distressz-szindróma (IRDS) miatt hosszú ideig lélegeztettek géppel, vagy kezeltek oxigénnel, és akikben emiatt krónikus tüdőkárosodás alakult ki (1-3). A neonatológiai terápiás eljárások korszerűsödése: az antenatális szteroidprofilaxis bevezetése, a surfactant kezelés, az új, kíméletesebb lélegeztetési stratégiák, a nyitott Botallo-vezeték (PDA) korai és hatékony kezelése, a korszerű táplálás és egyéb terápiás eljárások megjelenése miatt az IRDS-ben szenvedő újszülöttek életminősége és esélyei jelentősen javultak az elmúlt 40 évben (1). Ugyanakkor a BPD incidenciája nem változott (1). Ennek magyarázata az lehet, hogy bár a neonatológia fejlődésével a hagyományosan a BPD hátterében álló, tüdőt érintő perinatális betegségek prevalenciája csökkent, ugyanakkor egyre kisebb súlyú, egyre 10
éretlenebb újszülöttek tarthatók életben, akik között egy új-típusú BPD jelent meg, amit nem előz meg más tüdőbetegség (1-4). A betegséget kísérő szövettani elváltozások sokkal enyhébbek, illetve a kialakulásában a tüdőfejlődési zavar dominál. Ezért a BPD továbbra is az igen kis születési súlyú (VLBW) koraszülött populáció jelentős hányadát 20-30%-át fenyegeti. Mortalitása is magas, a BPD súlyosságától és a gesztációs kortól függ, súlyos BPD-ben 20-40% (1,2). 3.4. A bronchopulmonális dysplasia klinikai tünetei A BPD-t klinikailag az elhúzódó légzéstámogatási igény, elsősorban oxigén dependencia jellemzi. Az állapot súlyossága széles határok között mozoghat, a látszólagosan tünetmentes betegektől a tartós gépi lélegeztetést igénylőkig. A krónikus hypoxia miatt a fejlődés elmarad, perifériás cianózis, dobverőujj alakulhat ki. A növekedés és fejlődés elmaradásához hozzájárul a fokozott légzési munka miatt megnövekedett energiaigény is. Mivel minden energiáját légzésre fordítja a gyermek, másra nem marad ereje. (5,6) Ezzel magyarázható a táplálási nehezítettség is, ami tovább súlyosbítja a retardációt. A szomatikus elmaradások mellett idővel mentális visszamaradás is kialakul. Ebben nagy szerepe van a gyakori, elhúzódó hospitalizációnak is. A betegek a legyengült szervezet és a károsodott tüdő miatt fokozottan érzékenyek a fertőzésekre, hajlamosak a tüdőgyulladásra. A légzészavart a fertőzések és a szervezetet érő egyéb stresszhatások jelentősen fokozhatják. Ilyenkor még a látszólag panaszmentes gyermekek is rövid időn belül légzéstámogatásra, gyakran gépi lélegeztetésre szorulhatnak. Ezáltal egy önrontó kör alakulhat ki. Az állandó gyulladás tovább roncsolja a tüdőállományt, a beteg ezért egyre rosszabb állapotba kerül, miközben egyre fogékonyabb lesz a fertőzésekre. A betegek halálát is legtöbbször egy pneumoniás epizód okozza. A betegség előrehaladtával a tüdőkárosodás kihat a szívre is, pulmonális hipertónia alakul ki, ami végül akár jobb szívfél elégtelenségig (cor pulmonale) is fokozódhat (1-3). 3.5. A bronchopulmonális dysplasia radiológiai tünetei A mellkasröntgenen a BPD nagyon változatos eltérések formájában jelenhet meg. A BPD radiológiai diagnózisa nehéz, a klinikum ismerete nélkül nem is lehetséges, mivel 11
a BPD számos más betegség radiológiai tüneteit képes utánozni. Mégis a mellkasröntgen az egyetlen, BPD kimutatására alkalmas, széles körben elterjedt vizsgálati módszer (1-3). A tüdőgyógyászatban alkalmazott egyéb vizsgálatok, például a légzésfunkciós tesztek, csecsemőkorban nem kivitelezhetőek a beteg rossz kooperációja miatt. Radiológiailag a legtöbb betegséghez hasonlóan, a BPD-nek is négy stádiumát lehet elkülöníteni. A betegség kezdeti stádiumában csak diffúz mikroatelectasiák láthatók. A kép nagyon hasonlít az IRDS-re. A második stádiumban a lélegeztetési trauma miatt károsodnak az alveolusok, a növekvő atelectasiás területek mellett megjelennek a túllélegeztetett régiók, illetve a levegőszökési szindrómák jelei. Gyakoriak a pulmonális intersticiális emphysemák (PIE). A harmadik stádiumban tovább súlyosbodik a helyzet. Egyszerre találunk atelectasiás területeket és nagy cysticus emphysemás régiókat. Az elpusztult tüdőállomány helyén megjelennek a fibrotikus kötegek is. A negyedik stádiumban a tüdő jelentős része elpusztul. A roncstüdőre jellemző szabálytalan képet látunk volumenveszteséget okozó fibrotikus kötegekkel. A maradék tüdő túlfeszített, emphysemás jellegű. A hegesedések miatt nagy légtelen területek is láthatók. Ebben a stádiumban már az állandósult pulmonális hypertonia miatt a szív is károsodik, cardiomegalia alakul ki (1-3). I: Fátyolozott tüdő, diffúz retikulogranuláris rajzolat, elkülöníthetetlen az IRDS-től II: Fokozódó tejszerű fátyolozottság, elmosódott szívkontúr, atelectasias területek jelennek meg, interstitialis folyadékakkumuláció, levegő bronchogram, PIE III: Cysticus tüdőkép atelectasiákkal és emphysemás területekkel IV: súlyos tüdőfibrosis, kiterjedt emphysema, szálagos atelectasiás területek, inhomogén tüdő, durva kötegek, cardiomegalia 12
1. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia röntgen képe Az ábrán a BPD radiológiai stádiumait szemlélteti. Az első képen egy 30 napos gyermek kezdődő BPD-je látszik diffúz fátyolozottsággal. A második képen egy, két hónapos BPD-s gyermek röntgenképén már durvább dystelectasia látható. A harmadik képen egy négy hónapos BPD-s csecsemő mellkasröntgen felvétele látható, kifejezett emphysemas területekkel. A negyedik képen egy fél éves BPD-s gyermek mellkas röntgen felvételén durva fibrotikus kötegek, cardiomegália látható. 13
3.6. A bronchopulmonális dysplasia szövettani jellemzői A BPD szövettani tünetei sem specifikusak. Kezdetben intersticiális és alveoláris ödéma, hialinmembrán képződés, atelectasia, nyálkahártya nekrózis figyelhető meg. Ezt követően a szubakut stádiumban kialakul a diffúz gyulladásos infiltráció. Ebben a polymorphonuclearis sejtek mellett a makrofágoknak van fontos szerepe. A gyulladásos sejtek által termelt szövetkárosító anyagok hatására az alveolusok destrukciója következik be. Krónikus stádiumban az elpusztult alveolusok helyén megindul a regeneráció. Ez fibroblast és simaizom proliferációval jár, az alveolusok helyén kötőszövetes rostokat találunk. A bronchusok, bronchiolusok hámja metaplasiás, hyperplasiás. Jellemző a fokozott váladékképződés. Végstádiumban a kapillárisok és arteriolák száma csökken, az erek médiája hypertrophizál (1-3). 14
2. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia szövettani képe Alveolus Bronchiolus Hyalinmembrán A képeken BPD-s tüdő szövettani képe látható hematoxilin-eosin festéssel, 100x illetve 300x-os nagyítással. Az alsó képen gyulladásos infiltráció és az RDS-re jellemző hyalinmembrán is látható. 15
3.7 A bronchopulmonális dysplasia típusai A korszerű neonatológia eljárások megjelenése előtt a BPD olyan újszülöttekben alakult ki, akiket valamilyen tüdőt érintő betegség, adaptációs zavar miatt hosszú ideig kellett géppel lélegeztetni, illetve oxigénnel kezelni. A lélegeztetési igény hátterében leggyakrabban IRDS állt, de ide sorolható a mekónium aspirációs szindróma (MAS), kongenitális diafragma hernia, tüdő hipoplázia, nyitott Botallo-vezeték is (4). A tüdőkárosodás hátterében több vizsgálat is igazolta a magas oxigénkoncentrációk és a gépi lélegeztetés fiziológiástól eltérő nyomásparamétereinek vezető szerepét (3,4,12-15). Manapság ez a klasszikus, régi-típusú BPD ritkább, a BPD-s esetek kb. 30%-át teszi ki. A BPD-s betegek többsége az új típusú BPD-ben szenved. Ez olyan koraszülöttekre jellemző, akik 1000 gramm alatti súllyal születtek és nincs más tüdőbetegségük. A betegség klinikai tünetei sokkal enyhébbek, alacsonyabb oxigénkoncentrációk és nyomásértékek elegendőek a megfelelő oxigenizáció biztosításához. Idővel ez az oxigénigény tovább csökken. A röntgenképen inkább diffúz fátyolozottság látható nagyobb ciszták illetve atelectasiás területek helyett. A szövettani képen sokkal enyhébbek a gyulladásos jelek illetve kevésbé meghatározó az epitheliális metaplasia, simaizom hypertrophia és a fibrózis. Az alveolusok száma és komplexitása illetve a kapilláris hálózat sűrűsége elmarad a normálistól (2. táblázat) (1-4). Ez alapján az új típusú BPD inkább tekinthető tüdőfejlődési rendellenességnek, míg a régi típusú BPD kialakulásában a külső hatások által kiváltott szövetkárosodás illetve regeneráció dominált. 16
2. táblázat: A régi és új típusú bronchopulmonális dysplasia összehasonlítása (1) A régi és új típusú BPD összehasonlítása Régi típusú BPD Alternáló atelectasia és hyperinfláció Súlyos légúti epitheliális léziók (hyperplasia, metaplasia) Légúti simaizom hyperplasia Új típusú BPD Kevesebb regionális különbség a tüdőben Ritka légúti epitheliális léziók Enyhe légúti simaizom hyperplasia Súlyos, diffúz fibroproliferatio Pulmonális artériák hypertoniás remodellációja Csökkent alveolarizáció és légzőfelület Kevés fibrózis Kevesebb, diszmorf artéria Kevesebb, nagyobb alveolus, egyszerűbb szerkezet 3.8. A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői és patomechanizmusa A BPD a perinatális morbiditás és mortalitás szempontjából meghatározó jelentőségű kórkép. Pontos patomechanizmusának feltárása érdekében az elmúlt 40 évben számos vizsgálatot végeztek. Jelenleg a BPD-t multifaktoriális kórképnek tartják, ahol együtt játszanak szerepet a betegség kialakulásában a külső környezet tüdőkárosító tényezői és az egyén genetikai hajlama. (3. táblázat) 17
3. táblázat: A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői A BPD kockázati tényezői Általános, genetikai tényezők Éretlenség Lélegeztetés káros hatásai Elhúzódó lélegeztetéssel járó betegségek Gyulladás, infekció Táplálási, ápolási tényezők Férfi nem Koraszülés Barotrauma IRDS Anyai infekció Energia és esszenciális tápanyaghiány Kaukázusi rassz Intrauterin retardáció Volutrauma MAS Chorioamnionitis Immunglobulin hiány HLA-A2 Alacsony születési súly Túlfeszítés PPHN Magzati infekció Antioxidáns hiány (Cu, Zn, Se, vit-a, vit- E) Atopiás, asthmás családi anamnézis Alacsony gesztációs kor Oxigéntoxicitás Diaphragma hernia Újszülöttkori nosocomialis fertőzés Folyadék túlterhelés Éretlen tüdő (IRDS) Elhúzódó lélegeztetés Citokin gén polimorfizmusok? Cardiopulmonalis betegségek Pneumonia (Ureaplasma urealyticum) Ápolási faktor Szteroid profilaxis hiánya (Pneumonia) Túlélést javító kezelések Vastag betűvel emeltem ki a citokin génpolimorfizmusokat, amiknek a BPD kockázatára gyakorolt hatását a disszertációban vizsgáltam. 18
3.8.1. Oxigénterápia és gépi lélegeztetés Első leírásakor a BPD-t az afiziológiás lélegeztetés, magas nyomások, illetve magas oxigénkoncentrációk következtében kialakuló tüdőkárosodásnak tartották. A magas oxigénkoncentrációról illetve a magas lélegeztetési nyomásról több vizsgálat is kimutatta, hogy közvetlenül, (gyulladásos mechanizmussal) károsítják a tüdőt, illetve megzavarják a tüdőfejlődést. Magas oxigénkoncentráció jelenlétében fokozódik a citotoxikus szabad gyökök képződése, ami meghaladhatja a koraszülött szervezet csökkent antioxidáns védelme által közönbösíthető mennyiséget, így közvetlenül tüdőkárosodás alakulhat ki. Az oxigén önmagában képes a szakkuláris fázisban lévő tüdő szeptációjának leállítására (3). Azokban a betegekben, akiknél magasabb oxigénszaturáció elérésére törekedtek, ezért magasabb oxigénkoncentrációt alkalmaztak súlyosabb tüdőkárosodás alakult ki. Magas oxigénkoncentráció jelenlétében csökkent az alveolusok száma, illetve az alveolusok körüli kapilláris hálózat sűrűsége (3,17). Az oxigénkoncentráció mellett erős korrelációt találtak a BPD kockázata és a lélegeztetésre jellemző nyomásértékek között, illetve fordított arányosságot figyeltek meg a BPD kialakulásának kockázata és a lélegeztetés intenzitására jellemző vérgázértékek között (1,4). A gépi lélegeztetés térfogat- és nyomásterheléssel járhat. Ez közvetlenül károsítja az alveolusokat, illetve a szövetkárosodást kísérő gyulladásos reakció révén közvetve is hozzájárul a tüdőkárosodáshoz (4,18). Dreyfuss és Saumon összefoglalták a rendelkezésre álló adatokat, és kimutatták, hogy a tüdőt károsítja, ha a teljes tüdőkapacitást (TLC)-t meghaladó térfogatokra fújják fel (14). A regionális vagy egyenletes túlfúvás a leukociták tüdőbe vándorlását, fokozott permeabilitást, illetve intersticiális és alveoláris ödémát eredményez. A funkcionális reziduális kapacitás (FRC) és tidal volume (TV) különböző kombinációi szintén károsak, ha összegük meghaladja a TLC-t. Ha a mellkas tágulását korlátozzuk kötözéssel vagy öntvénnyel, akkor a nagy nyomások sem eredményeznek tüdőkárosodást (14). A tüdő túlfeszítése strukturális elemeket tehet tönkre a tüdőszövetben, illetve többféle mediátor felszabadulását válthatja ki, amik beindítják a gyulladásos kaszkádot. Ezeket, a faktorokat kezdetben valószínűleg nem a perifériás leukociták termelik, mivel az 19
izolált és perfundált tüdőben is TNFα, IL-1β és IL-6 szabadul fel, illetve két órán belül megemelkedik ezen a citokinek mrns-ének szintje is. Ugyanezeket a citokineket/kemokineket azonosították a fokozott BPD kockázatú gyermekek amnionfolyadékában. A légúti minták nagy mennyiségben tartalmaznak más faktorokat is, amik elősegíthetik a fehérvérsejtek kivándorlását a tüdőbe, illetve más tüdőkárosító anyagok felszabadulását (laminin, fibronectin, elasztáz, komplement). A gyulladás ellenes citokinek, mint az IL-10, szintje alacsony, ugyanakkor a proinflammatorikus citokinek szintje magas. Az effektor molekula keverék egyes komponenseinek szerepe a folyamatban még nem ismert. A túlfúvott tüdőben extracelluláris mátrix elemek és növekedési faktorok is szintetizálódnak. A tüdő által termelt citokinek és kemokinek felerősítik a közvetlen károsodásra adott választ, azáltal, hogy odavonzzák a perifériás leukocitákat a tüdőbe (14). Egy érett tüdőn végzett vizsgálat azt is kimutatta, hogy a tüdő normális FRC alatti lélegeztetése szintén a tüdő károsodását eredményezi, a tüdőegységek ciklikus nyitásán és zárásán keresztül. A mosással surfactant hiányossá tett tüdők alacsony tüdőtérfogat melletti lélegeztetése in vivo és izolált perfundált tüdőben citokinek felszabadulását eredményezte. A túlfúváshoz hasonlóan, az alacsony tüdőtérfogatok melletti lélegeztetés is elősegíti a perifériás leukociták felhalmozódását és aktivációját a tüdőben. Az optimális FRC és TLC közé eső lélegeztetési térfogatok, amik VLBW gyermekekben valószínűleg 7-10 ml/kg közé esnek, nagyon kevés manőverezési helyet hagynak a klinikusoknak, hogy elkerüljék az alacsony és magas térfogatú tüdőkárosodási zónákban végzett lélegeztetést. Nincsenek elérhető technikák, amikkel rutinszerűen mérhetnénk az FRC-t és TLC-t lélegeztetett koraszülöttekben. Ezért a súlyos IRDS-ben szenvedő VLBW gyermekekben elkerülhetetlen lehet az éretlen tüdő sérülési zónákban történő lélegeztetése, ami gyulladásos citokinek felszabadulásához és tüdőkárosodáshoz vezet (4). Kraybill és munkatársai 10 neonatológiai egység 1000g alatti újszülötteiben elemezték a BPD-vel összefüggő klinikai paramétereket, és azt találták, hogy a géppel lélegeztetett újszülöttekben 48 és 96 órás korban a BPD gyakorisága fordítottan arányos a PCO 2 szintekkel (13). Ez az eredmény megkérdőjelezhető, mivel a kevésbé súlyos tüdőbetegségekben szenvedő újszülötteknél általában alacsonyabbak a PCO 2 értékek. A legalacsonyabb PCO 2 értékeket azoknál a neonatológiai egységeknél találták, ahol 20
legnagyobb arányú volt a BPD előfordulása. A PCO 2 hatékonyabban jelezte előre a BPD kialakulását, mint a kezdeti tüdőbetegség súlyossága. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hyperventilatio hozzájárulhat a BPD kialakulásához. A BPD és a lélegeztetés kapcsolatának hosszú történetét ismerve nem kétséges, hogy az oxigén káros hatásai és az afiziológiás, túlzott gépi lélegeztetés hozzájárulnak a BPD kialakulásához. Az alacsony PCO 2 értékek pedig a túlzott lélegeztetés indikátorai (4). 3.8.2. A tüdőfejlődés és szabályozó tényezői Az új típusú BPD inkább tüdőfejlődési zavarnak tekinthető, mint közvetlen tüdőkárosodásnak. A tüdőfejlődés alveoláris szakasza emberben a 24. gesztációs hét és a 18. születés utáni hónap közé esik. Az alveolarizáció legnagyobb része 5-6 hónapos korban következik be, ezért a születés utáni infekciók, gyulladásos reakciók is tüdőkárosodáshoz vezethetnek (3). A tüdőfejlődés két szakaszból áll, ami nem különül el élesen egymástól: az elsődleges szeptációval sacculusok képződnek, amit a másodlagos szeptáció követ. Ennek kapcsán alakulnak ki az alveolusok és a kapilláris hálózat (17,19). A kapilláris hálózat fejlődése az alveolarizáció után is intenzív marad. A tüdőfejlődés során a serkentő és gátló tényezők közötti finom egyensúly szükséges az egyes részfolyamatok megfelelő, térben és időben összehangolt lezajlásához. A tüdőfejlődés legfontosabb mediátorai a TGFβ illetve a glükokortikoidok (3). A glükokortikoidok gyorsítják a parenchyma érését, fokozzák a surfactant termelést és a compliancet, csökkentik az erek permeabilitását és fokozzák tüdőfolyadék clearance-ét. Összességében tehát javítják a tüdőfunkciót (3,19). A TGFβ ezzel szemben gátolja a tüdőfejlődést. A korai embrionális életben izoformáit és receptorát a tüdő fibroblastok és epitél sejtjei termelik. Gátolja a fejlődő hörgőrendszerben az elágazódások képződését és a II-es típusú pneumocyták surfactant termelését. Azoknál, akikben később BPD alakult ki, megemelkedett TGFβ szinteket találtak a tüdőaspirátumban, ami valószínűsíti, hogy a TGFβ szerepet játszik a tüdőkárosodás kialakulásában (3,17). Feltételezhető, hogy azok a VLBW koraszülöttek, akikben később BPD alakul ki, még túl éretlenek ahhoz, hogy a külső stresszhatásokra elegendő kortizolt termeljenek, így 21
náluk az éretlen neuroendokrin rendszeren keresztül a legtöbb környezeti stressz-faktor is hozzájárulhat a BPD kialakulásához (3). A tüdőfejlődés fontos része az érfejlődés, az alveolusok körüli kapilláris hálózat kialakulása, ami a másodlagos szeptáció során következik be (3,17). Ebben a folyamatban jelentős szerepe van a megfelelő angiogenetikus faktorok pontosan szabályozott térbeli és időbeli megjelenésének. Legfőképpen a vascularis endotheliális növekedési faktor (VEGF) szerepét vizsgálták a tüdőfejlődésben. A BPD állatmodelljeiben alacsony VEGF és VEGF-receptor-1 (VEGF-R1) szinteket mutattak ki (12,17). Ugyancsak alacsonyabbnak találták az endotheliális és az indukálható nitrogénoxid szintáz (NOS) aktivitást ezekben az állatokban. Ez valószínűsíti, hogy a nitrogénoxid (NO) rendszer, ami szintén szerepet játszik az érképződésben, fontos lehet a BPD kialakulásában is (17). A tüdőfejlődés egyik legjellemzőbb markere az elasztin, ami elengedhetetlen a tüdő és az erek falának rugalmassága, compliance-e szempontjából. BPD-ben elhunytak boncolási anyagaiban és állatkísérletekben az alveolusok és kapillárisok fejlődészavara mellett károsodott szerkezetű elasztin felhalmozódását figyelték meg (12). A tüdőfejlődés és a gyulladásos reakció szabályzásáért felelős mediátorok egy része például növekedési faktorok és arachidonsav származékok a két folyamatban megegyezik. Ezért a fejlődési folyamat megzavarásában az intrauterin életben és születés utáni időszakban központi szerepet tulajdonítanak a gyulladásnak, illetve a gyulladásos reakció során felszabaduló mediátoroknak (4). Különösen igaz ez az egyre éretlenebb koraszülöttekre, akiknél a tüdő még fejletlenebb állapotban található, ugyanakkor az éretlen immunrendszer miatt a gyulladásos reakciók inadekvát módon, kontrollálatlanul zajlanak (20-23). 3.8.3. A perinatális gyulladás A gyulladásos folyamat elkezdődhet már a születés előtt az intrauterin életben, hiszen például a koraszülés egyik legfontosabb okának a chorioamnionitist, és a magzatfüggelékek gyulladását tartják (23,24). A gyulladás, születés után is kialakulhat infekciók, illetve szövetkárosodást okozó ártalmak hatására. A gyulladásos reakcióról 22
kiváltó októl függetlenül több szinten is kimutatták, hogy hatással lehet a BPD illetve a tüdőkárosodás kialakulására (21-23). 3.8.3.1. A gyulladás sejtes elemei A koraszülöttek tüdejében közvetlenül születés után nagyon alacsony az érett neutrofil granulocyták és makrofágok száma. Ugyanakkor állatkísérletek alapján számuk gyorsan emelkedik a gépi lélegeztetés megkezdése után (20-21). A tüdőmosó folyadékban lévő granulocyták száma szoros összefüggést mutat a tüdőödémával és a tüdőkárosodással (21). A gyulladásos reakció kezdetét a vérben lévő neutrofil granulocyták és makrofágok kivándorlása jelzi a szövetkárosodás helyére. Ezzel magyarázzák azt a megfigyelést, hogy azoknál a koraszülötteknél, akiknél egy órás korban a keringő neutrofil szám jelentősen csökkent, gyakrabban alakult ki BPD (21). Az aktivált neutrofil granulocyták által termelt proteolitikus enzimek később aztán további szövetkárosodáshoz vezetnek (21). Állatkísérletekben a BPD kialakulását a hízósejtek, eozinofilek és neuroendokrin sejtek felhalmozódása is kísérte a tüdőben (3). 3.8.3.2. A gyulladás és az oxidatív stressz A gyulladásos folyamat az oxidatív stresszel szemben is érzékenyebbé teszi a tüdőt. A gyulladásos reakció következtében a légutakba kerülő szabad vas elősegíti a szabadgyökképződést, ami TGFβ képződésén keresztül fibrózishoz vezet (3,25). Az általános alultápláltság és elégtelen protein bevitel miatt a koraszülöttekben alacsony a glutation szint, ami tovább fokozhatja a koraszülöttek érzékenységét a szabadgyökök által okozott tüdőkárosodással szemben (3,25). Állatkísérletekben az antioxidánsok hatékonyan megelőzték a BPD kialakulását (1,2,12). Emberben csupán az A-vitamin mutatott valamelyes védő hatást a tüdőkárosodással szemben (2,12). 3.8.3.3. A gyulladás szerepe a koraszülésben A BPD legfontosabb kockázati tényezője a koraszülöttség (1-3). A koraszülések 70-80%-a ismeretlen okból bekövetkező úgynevezett idiopathiás koraszülés. Az esetek 20-23
30%-ában valamilyen ismert anyai eltérés (méh- és/vagy placenta-rendellenesség) áll a hátterében (19,20,24). Az idiopathiás koraszülések pathomechanizmusa vitatott, a legáltalánosabban elfogadott elmélet szerint hátterüken többnyire chorioamnionitis áll. A 30. gesztációs hét előtt spontán koraszülő nők között a chorioamnion tenyészetekben közel 75%-os fertőzöttségett írtak le (26,27). 3.8.3.4. A chorioamnionitis A chorioamnionitis (CA) hátterében legtöbbször Ureaplasma urealyticum-mal történt fertőződés áll. A kórokozó többnyire látens infekciót okoz enyhe, sokszor észrevehetetlen tünetekkel. Ugyanakkor a háttérben folyamatos immunreakció zajlik. A szervezet nem képes a kórokozó eliminálására, a gyulladás a hüvelyből felfele terjedve eléri a méhet és a magzatfüggelékeket is (4,19,20). A CA-re jellemző intrauterin proinflammatorikus citokin emelkedésnek számos anyai és magzati következménye van (28-31). A magzati szervezetben aktiválódnak a fagociták, amik különböző szervekben, így a tüdőben is, szövetkárosdást okozhatnak (32). A CA-ben jellemző magas citokin szintek (elsősorban IL-1β és IL-6) megzavarhatják a magzat normális fejlődését és meghatározhatják az újszülöttkori morbiditást (28,30). Terminusra bekövetkező szülésnél az amnion folyadékban és a placentában megemelkedett citokin (IL-1β, IL-6, IL-8) szinteket figyeltek meg (33,34). Azokban a nőkben, akiknél koraszülés következett be ezek a citokinszintek még tovább emelkedtek, az aktuális fertőzöttségi állapottól függetlenül (35). Ez alátámasztja azt az elméletet, miszerint a gyulladásos mediátorok meghatározó szerepet játszanak mind a szülés mind a koraszülés beindításában (36). A méhnyak érésében és felpuhulásában például, a cervicalis stromában felhalmozódó fehérvérsejtek játszanak központi szerepet (37). Továbbá az IL-1β és TNFα szintek erősen korrelálnak a prosztaglandinok termelődésével, amik a méhösszehúzódásokért felelősek (38). Egy antiinflammatorikus citokinről, az IL-1β receptor antagonistáról kimutatták, hogy képes az IL-1β szüléstelősegítő hatásait ellensúlyozni (39). A magzati oldalon termelődött citokinek szintén hozzájárulhatnak a koraszülés beindulásához (40). 24
3.8.3.5. A gyulladás szerepe a perinatális adaptáció zavaraiban A koraszülötteknél a perinatális adaptáció során fokozott a légzési elégtelenség kockázata. Különösen érzékenyek azok a koraszülöttek, akiknél a tüdőfejlődés már az intrauterin élet során zavar szenvedett, és ezért még kevésbé képesek a környezeti változások kompenzálására (17). A légzési elégtelenség kezeléséhez gyakran magas oxigénkoncentrációk alkalmazására és gépi lélegeztetésre van szükség. A lokális iritáció gyulladásos reakciót, közvetlen és közvetett tüdőkárosodást okozhat (3,17). Az adaptációs zavar során más perinatális szövődmények is kialakulhatnak (41-43). A legtöbb perinatális szövődmény patomechanizmusában szerepe van a gyulladásos reakciónak (42,43). A posztnatális korban jelentkező gyulladás lehet szisztémás (szepszis), illetve szervrendszerre lokalizálódó (nekrotizáló enterocolitis (NEC)). A kontrollálatlan gyulladásos reakció során felszabaduló mediátorok közvetlenül károsítják a tüdőt, illetve a gyakran kialakuló légzési elégtelenség kezelése szintén tüdőkárosodást okozhat. A perinatális infekciók gyakran járnak generalizált szepszis kialakulásával. Az újszülöttkori szepszis illetve a magzati gyulladásos reakció (FIRS) patomechanizmusával számos vizsgálat foglalkozott (43-47). 3.8.3.6. A perinatális gyulladásos reakció fázisai A bakteriális kórokozók eliminálásáért újszülöttkorban döntően a veleszületett immunitás a felelős, az immunreakció szabályozásában azonban a lymphocyták is szerepet játszanak (42). A gyulladásos reakció első lépése, a kórokozó felismerése, a bakteriális mintázat felismerő receptorok (TLR, CD14, MBL) segítségével történik. A sejtek aktivációja intracelluláris kinázokon illetve a nukleotidkötő oligomerizációs domén (NOD) család fehérjéin keresztül történik, ami végül az NF-κB sejtmagba történő transzlokációjához vezet (47-49). Az így aktivált makrofágok és neutrophil granulocyták gyulladásos citokinek szekrécióján keresztül auto- és parakrin módon kommunikálnak egymással és a gyulladásos reakciót szabályzó limfocitákkal, ezáltal további aktivációs lépéseken mennek keresztül. A kemotaktikus faktorok és adhéziós molekulák expressziója fokozódik, lehetővé téve a fagocita sejtek kitapadását és extravazációját. Az extravazációban szerepe van az endothel állapotának is. Ennek 25
jelzője lehet az endotheliális faktoroknak (mint az ACE) expressziója (49,50). A folyamat utolsó lépése a kórokozók elpusztítása fagocitózissal, reaktív oxidatív szabadgyökökkel és proteolítikus enzimekkel (18,21,22). A szepszis generalizálódásában fontos szerepet játszik a gyulladásos és a véralvadási rendszer kölcsönhatása is (47). 3.8.4. A gyulladással kapcsolatos vizsgálataink A BPD összetett patomechanizmusú kórkép, kialakulásában azonban a gyulladásnak központi szerepe van. Az elhúzódó gépi lélegeztetésre és oxigénterápiára hajlamosító kórképek többségében szintén meghatározó szerepe van a gyulladásnak. A magas oxigénkoncentrációk illetve a gépi lélegeztés által okozott barotrauma, volutrauma és túlfeszítettség szövetkárosító hatása szintén gyulladásos mechanizmussal valósul meg. A gyulladásos reakcióban központi szabályozó szerepe van a gyulladásos citokineknek. A citokinek szabályozzák a fehérvérsejtek gyulladás helyére történő vándorlását, a szövetkárosító proteolítikus enzimek és reaktív oxidatív ágensek felszabadulását. A gyulladásos reakciót szabályzó anyagok és a tüdőfejlődés mediátorai között számos átfedés van, ezért a gyulladásos citokinek megzavarhatják a normális tüdőfejlődést, ezzel is hozzájárulva a BPD kialakulásához (17). Mivel a gyulladás központi szerepet játszik a BPD kialakulásában, vizsgálataink során elsősorban a gyulladásos reakcióval foglalkoztunk. A koraszülöttek immunrendszere éretlen, eltér a felnőttekétől, azonban ezt részleteiben még kevesen vizsgálták. A gyulladásos folyamatok szabályozásában azonban koraszülöttek esetén is a citokinek a legfontosabb mediátorok, ezért genetikai vizsgálatainkban a citokin gének polimorfizmusai és a BPD kockázata közötti kapcsolatot vizsgáltuk. 3.8.4.1. Az immunrendszer részei Az immunrendszeren belül elkülönítik a veleszületett immunitást, ami az összes kórokozóval szembeni aspecifikus, gyors, elsődleges védelmi vonalat jelenti, és a szerzett immunitást, ami a T és B sejteken keresztül specifikusan bár, de lassabban reagál az ismert antigénekre. A két rendszer átfedi egymást, szoros együttműködés van 26
közöttük. Minden antigénhatásra először a veleszületett immunitás reagál, majd ezután aktiválja a szerzett immunitás effektor mechanizmusait. A szerzett immunitás esetén is a kórokozók végső eliminálását a veleszületett immunitás sejtes elemei biztosítják (51). 3.8.4.2. Az újszülött immunrendszere Születéskor az immunrendszer még éretlen, különösen igaz ez a szerzett immunitásra, ahol a hatékony működéshez az antigénekkel történő találkozás szükséges. Ezért az újszülöttek immunvédekezésében az anyától kapott immunglobulinok mellett a veleszületett immunitásnak van meghatározó szerepe. A veleszületett immunitás több szinten működik, részt vesznek benne a határfelületek barrierjei, antibakteriális enzimek, pl. lizozim, akut fázis fehérjék, komplement rendszer. Legfontosabb részei azonban a fagocita sejtek, amelyek a kórokozók eliminálását végzik. Különösen fontosak a makrofágok, amelyek az ősi, testidegen anyagokra jellemző molekuláris mintázatokat felismerő receptorokkal rendelkeznek. A veleszületett immunitás sejtes elemei két citokin, az IL-12 és az IFNγ, szabályozása alatt állnak (3. ábra) (52-55). A koraszülöttek éretlen immunrendszerérere jellemző a nem megfelelő citokinválasz, a többi citokinhez hasonlóan az IFNγ és IL-12 termelése is csökkent mértékű koraszülöttekben (52.) 3.8.4.3. A neutrophil granulocyták, makrofágok és természetes ölő sejtek Vizsgálataink során elsősorban a veleszületett immunitás sejtes elemeit vizsgáltuk. A veleszületett immunitáshoz a klasszikus fagocita sejtek tartoznak, a neutrophil granulocyták, a makrofágok és a természetes ölősejtek (NK). Ezekre a sejtekre.az jellemző, hogy kórokozó felismerésük kevésbé specifikus, mint az adaptív immunitás sejtjeinek, a limfocitáknak, antigén felismerése. Általános, ősi, baktériumokra jellemző konzervatív motívumokat ismernek fel, mint például a lipopoliszacharid, CpG szekvenciák. A felismerésben az úgynevezett mintázatfelismerő receptoroknak van szerepe, az egyik legismertebb a toll-like receptor család. Az adaptív immunitás B és T limfocitái peptidkötő-receptoraikkal sokkal specifikusabb antigének felismerésére képesek, a HLA rendszer révén képesek a szervezet saját fehérjéit elkülöníteni a 27
testidegen fehérjéktől. A limfociták hátránya, hogy csak peptid típusú antigének felismerésére képesek (kivétel a CD1 T sejtek), míg a veleszületett immunitás sejtjei lipid és cukor természetű antigéneket is felismernek. A kisebb specificitás és a konzervált motívumok felismerése a veleszületett immunitás sejtjei számára nagyon gyors reakciót tesznek lehetővé. Ezek a sejtek jelentik a szervezet első védelmi vonalát, ezek találkoznak előszőr a kórokozókkal és kezdik meg azok eliminálását, fagocitózisát. Bár ez a folyamat gyors, kevésbé hatékony, mint az adaptív immunreakció. A veleszületett immunitás sejtjei a kórokozókkal való találkozás után a belőlük felszabaduló citokineken, mediátorokon keresztül aktiválják az adaptív immunitás sejtjeit is, illetve az adaptív immunreakció során is szabadulnak fel olyan anyagok, amelyek viszont a veleszületett immunitás sejtjeit aktiválják, például, fokozzák a makrofágokban az oxidatív szabadgyökök termelését. A kétféle immunrendszer tehát nagyon szorosan összefügg, nem választható el egymástól. Sokszor az adaptív immunfolyamatoknál is a végső eliminációs lépést a veleszületett immunitás sejtjei végzik (51). 3. ábra: Az IFNγ és IL-12 hatása egymás termelődésére Aktivált makrofág NK sejt Az NK és T sejtek által termelt IFNγ aktiválja a makrofágokat, fokozza az adhéziós molekulák expresszióját, a fagocitózist, az oxidatív gyökök és az IL- 12 termelését. Az aktivált makrofágok által termelt IL-12 NK sejt aktivációt, fokozott IFNγ termelést okoz. 28
3.8.4.4. A citokinek általános jellemzői Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken keresztül valósul meg. Valamennyi immunsejt képes citokinek termelésére, illetve rendelkezik a citokinek érzékeléséhez szükséges specifikus receptorokkal. Az immunsejteken kívül azonban a gyulladásos és immunfolyamatokban szerepet játszó más szervrendszerek, így elsősorban a haemopoeitikus és neuroendokrin rendszer, sejtjei is képesek citokinek termelésére és érzékelésére. A citokinek kis molekulatömegű (10-40kD) fehérjemolekulák, elhelyezkedhetnek a sejtfelszínen, vagy szolubilis formában a plazmában. A citokinek nómenklatúrája változatos, a legkorábban felfedezett citokinek a feltételezett funkcióról kapták a nevüket, pl. tumor nekrózis faktor (TNF). Később a citokint termelő sejtek alapján elkülönítettek monokineket, illetve limfokineket. A fehérvérsejtek közötti kommunikációban résztvevő citokineket szokás interleukineknek (IL) nevezni. A citokinek változatos szerkezetű polipeptidek. Közös jellemzőjük, hogy rendszerint valamilyen külső stimulus hatására termelődnek. Általában nem raktároz a sejt előre szintetizált citokineket, a stimulus hatására a sejt aktiválódik, és ez transzkripción keresztül vezet a citokinek szintéziséhez. A szintézis után, a citokinek azonnal kiválasztódnak a sejtből, ezáltal biztosítva a gyors hatás kialakulását. A citokinek hatása pleiotróp és redundáns, azaz a legtöbb citokin többféle sejtre is képes hatást gyakorolni, ugyanakkor többféle citokin is kiválthat azonos hatást a célsejteken. A citokinek hatásukat rendszerint kaszkádok formájában, felerősítve fejtik ki, egyes citokinek további citokinek termelését indukálják. A citokinek hatása lehet autokrin, parakrin, sőt a nagy mennyiségben a keringésbe jutó citokineknek endokrin hatásuk is lehet. A citokinek hatásukat specifikus nagy affinitású receptorokon keresztül fejtik ki, ezért nagyon alacsony 10-10 -10-12 M koncentrációban is hatásosak. Citokinek hatására rendszerint receptoraik expressziója is változik, tovább erősítve vagy gyengítve a citokinek hatását. Funkciójuk alapján megkülönböztethetők a veleszületett immunitás citokinjei, az adaptív immunitás citokinjei és a haemopoietikus citokinek (51). 29
3.8.4.5. Az általunk vizsgált citokinek Vizsgálataink során, mi elsősorban a klasszikus gyulladásos citokineket és a veleszületett immunitás citokinjeit vizsgáltuk. TNFα A TNFα az akut gyulladásos válasz központi mediátora. Elsősorban az aktivált mononukleáris fagocita sejtek termelik, de a T, NK és hízósejtek is képesek termelésére. A TNFα termelés leghatékonyabb stimulusa a lipopoliszacharid (LPS). Az NK sejtek által termelt IFNγ fokozza a makrofágok TNFα termelését. A TNFα monoglikozilált II-es típusú membránproteinként szintetizálódik, kis intracelluláris aminoterminussal és nagy extracelluláris karboxil terminussal rendelkezik. A membránban homotrimer formában helyezkedik el, és a II-es típusú TNFα receptorokat képes aktiválni. A szolúbilis TNFα egy membrán metalloproteináz által történt hasítás után keletkezik. Három 17 kd-os polipeptid lánc alkotja az 51 kd-os szolúbilis TNFα molekulát. A szolúbilis TNFα hatását az I-es és II-es típusú TNF receptoron keresztül fejti ki. A receptorok TNFα kötése után intracelluláris jelátviteli kaszkád aktiválódik, majd végül az NF-κB transzkripciós faktoron keresztül alakul ki a TNFα hatása. A TNFα fő funkciója a neutrophil granulocyták és monocyták toborzása a fertőzés helyére. Hatására az endothel sejtek felszínén fokozódik az adhéziós molekulák expressziója, fokozódik a kemokinek szekréciója is. Bizonyos sejtekben a TNFα apoptózist indukál. A gyulladásos válaszreakció során nagymennyiségű TNFα kerül a keringésbe, aminek szisztémás hatásai is lehetnek. A TNFα a hypothalamusban hozzájárul a láz kialakulásához, csökkenti az éhségérzetet, a májban hatására fokozódik az akut fázis fehérjék szintézise, az anyagcserét katabolikus irányba tolja, nagy mennyiségben myocardium depresszor hatással rendelkezik, az endothelre kifejtett hatásai miatt intravasculáris koagulációt is képes okozni. Ezáltal a TNFα a szeptikus sokk és a következményes több szervi elégtelenség kialakulásának központi mediátora (51). 30
IL-1β Az IL-1 a TNFα-hoz hasonlóan a gyulladásos válaszreakció központi mediátora. Az IL- 1 is elsősorban aktivált makrofágokban termelődik LPS és TNFα hatására, azonban más sejtek, így a neutrophil granulocyták, endothel és epithel sejtek is képesek a termelésére. Az IL-1-nek két izoformája ismert az IL-1α és az IL-1β. Mindkét izoforma azonos sejtfelszíni receptorokhoz kötődik, és azonos hatásokkal rendelkezik. Mindkét izoforma 33 kd-os prekurzorként szintetizálódik, amiből enzimatikus hasítás után alakul ki a 17 kd-os szekretált forma. Az IL-1α mindkét formában aktív, míg IL-1β esetén csak a 17 kd-os hasított formának van biológiai aktivitása. A keringésben inkább az IL-1β izoforma található. AZ IL-1-nek két receptora ismert mindkettő az Ig superfamily-be tartozik. Az I-es típusú receptor majdnem minden sejten megtalálható, a II-es típusú receptor főleg B-lymphocytákon fordul elő. Az IL-1 a receptorkötés után IRAK kinázon keresztül végül az NF-κB transzkripciós faktor segítségével fejti ki hatásait. Az IL-1β hatásai a TNFα-éhez hasonlók. Kis mennyiségben az endothel sejtek aktivációját, a sejtfelszíní adhéziós molekulák expressziójának fokozódását okozza. Nagyobb mennyiségben a szisztémás keringésbe kerülve hozzájárul a láz kialakulásához, és az akut fázis fehérjék szintéziséhez. Bár az IL-1β és a TNFα hatásai hasonlóak az IL-1β nem okoz apoptózist, és önmagában szeptikus sokk kiváltására is képtelen. Az IL-1-nek létezik egy funkció nélküli szerkezeti homológja az IL-1 receptor antagonista. Ez a citokin valószínűleg az IL-1 hatásainak endogén szabályozásában játszik szerepet (51). IL-6 Az IL-6 mind a természetes, mind az adaptív immunitásban szerepet játszó citokin. Proés antiinflammatorikus hatásokkal is rendelkezik. Mononukleáris fagocytákban endothelsejtekben, fibroblastokban és más sejtekben termelődik elsősorban IL-1β és TNFα hatására. Homodimer formában hatásos, mindkét alegység négy globuláris láncból épül fel. Hatásait I-es típúsú citokinreceptoron illetve JAK/STAT kinázokon keresztül fejti ki. 31
Az IL-6 fokozza az akut fázis fehérjék szintézisét, illetve a csontvelőben a neutrophil granulocyták képződését. Az adaptív immunitásban elősegíti a B-sejtek érését és az antitestek termelődését (51). IL-10 Az IL-10 gátló hatású citokin, ami hatással van a természetes és az adaptív immunitás sejtjeire is. Elsősorban aktivált makrofágok termelik, de a T-sejtek és a keratinocyták is képesek termelésére. Négy alfa-hélix szerkezetű globuláris doménből épül fel. Hatásait II-es típusú citokinreceptoron keresztül fejti ki. Az IL-10 feladata az immunreakció kioltása a fertőzés eliminálását követően. Hatásait elsősorban az aktivált makrofágok gátlásán keresztül fejti ki. Az IL-10 gátolja az aktivált makrofágok és dendritikus sejtek IL-12 termelését, illetve gátolja a makrofágok és dendritikus sejtek MHC II expresszióját, ezáltal gátolva a T-sejt választ és az adaptív immunreakciót (51). IL-12 Az IL-12 teremti meg a kapcsolatot a veleszületett és az adaptív immunitás között. A veleszületett immunitás alapvető mediátora, aktiválja a sejt közvetített szerzett immunitást. Az antigénprezentáló sejtek (APC), azaz a makrofágok és dendritikus sejtek termelik bakteriális endotoxin (LPS), intracelluláris kórokozók, és antigénnel stimulált T sejtek hatására. Az IL-12 egyedi szerkezetű citokin, 70 kd tömegű heterodimerek alkotják, melyek egy 35kD és egy 40 kd tömegű alegységből épülnek fel. A p35 alegység 4 α-globulin láncból áll, a 3p12-q13.2 locusban kódolódik. A legtöbb sejtben termelődik. A p40 alegység I-es típusú citokinreceptor szerű, de Ig-like domént is tartalmaz, az 5q31-32 locusban kódolódik, csak az APC sejtek képesek szintetizálni, így csak ezekben alakul ki aktív IL-12 heterodimer. (létezik solubilis p40 is). Hatását I-es típusú wsxws szekvenciát tartalmazó citokinreceptoron keresztül fejti ki. JAK és STAT4 kinázokat aktivál. Az IL-12 fokozza az NK és T sejtek IFNγ termelését, ami makrofág aktivációhoz vezet. Hatására a CD4 pozitív T sejtek Th 1 sejtekké differenciálódnak, (T sejt növekedési faktor). A Th 1 sejtek az adaptív immunitás fagocitáit aktiválják. Az NK sejtek IL-12 32