A biomolekuláris szerkezet és dinamika vizsgálómódszerei: Röntgendiffrakció, tömegspektrometria, infravörös spektrometria. Smeller László A molekuláris szerkezet és dinamika vizsgáló módszereinek áttekintése Szerkezet Röntgenkrisztallográfia NMR spektroszkópia Tömegspektrometria Infravörös spektroszkópia Lumineszcencia spektr. Dinamika Fluoreszcencia élettartam Dinamikus fényszórás ESR (EPR) spektroszkópia FCS (Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia Miért fontos a szerkezet ismerete? Szerkezet - dinamika Kis molekulák dokkolása Forrás:http://www.cipsm.de http://en.academic.ru 3 4
Röntgendiffrakció Röntgendiffrakció Mit (Milyen információt ad)? Molekulák térbeli szerkezete. Minden (nehéz) atom x,y,z koordinátáját. Miért érdekes/hasznos az orvostudományban? Biológiai folyamatok megértése pl. DNS transzkripció, enzimműködés, molekuláris felismerés, mutációk hatása Gyógyszermolekulák tervezése (kötődés, dokkolás) Hogyan? 5 6 Emlékezetőül: fényelhajlás Röntgendiffrakció Fényelhajlás (diffrakció) optikai rácson: Milyen rács illik a röntgensugárzáshoz? Rácsállandó: sinα k kλ d α k λ Rtg 0 00 pm H 00 pm Pl. Cu Kα vonal: λ54 pm α k t mérjük, λ ismert d meghatározható Atomgi er nλ d sinθ 7 NaCl rácsállandó: 564 pm 8
A Röntgendiffrakciós készülék elvi vázlata Röntgencső 0-40 kv Makromolekulák szerkezetvizsgálata röntgendiffrakcióval Nobel díj 96 Globuláris fehérjék szerkezetvizsgálata M. F. Perutz, J. C. Kendrew mioglobin:~00 atom Kristály ólomkollimator 0-ad rendű sugár (nem térül el) Nobel díj 96 DNS szerkezete Francis Crick James Watson Maurice Wilkins Elhajlott sugarak Fluoreszcens lemez v. félvezető detektor 9 Rosalind Franklin 0 Makromolekulák szerkezetvizsgálata röntgendiffrakcióval Nobel Díj 003 Roderick MacKinnon Fehérjekristályok Nobel díj 009 Riboszóma szerkezetvizsgálata V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, A. E. Yonath 30S alegység: ~35000 atom, 50S alegység:~64000 atom
Fehérjeszerkezet meghatározása röntgendiffrakcióval Fehérje oldat Kristály ~ 0.05 -mm Diffrakciós mintázat Elektronsűrűségi térkép Elsődleges szerkezet atomi pozíciók 3 Egykristály előállítása szükséges Stabil konformációjú fehérjék vizsgálhatók (globuláris fehérjék) A kristálybeli elektronsűrűség térbeli és időbeli átlagát kapjuk meg Fehérjeszerkezet meghatározása röntgendiffrakcióval 05676 rtg kriszt. 399 NMR 06 Május 3 án 880 struktura! Lizozim 5 6
Fehérje adatbázisok PDB Protein Data Bank 3D szerkezetek (>00 ezer) Röntgenkrisztallográfiai ill. NMR mérésekből Swiss prot Szekvenciák Proteomikai segédprogramok, Szerkezet becslés (homológia modellezés) Kémiai paraméterek becslése (pl. izoelektromos pont ) Szekvenciák hasonlósága Krisztallográfia NMR Avagy tényleg ugyanolyan a fehérje szerkezete fiziológiás oldatban mint a kristályban? 7 mioglobin 8 Tömegspektrometria Tömegspektrometria Mit (Milyen információt ad)? A minta molekuláit (ill. annak fragmentumait) tömeg (pontosabban m/z*) alapján szétválasztja, azonosítja a fragmentumokat ill. a molekulákat. Miért érdekes/hasznos az orvostudományban? proteomika, diagnosztika, szűrés, intraoperatív szövettan Hogyan? 9 *z: a töltés elemi töltés egységekben 0
Lépések: A tömegspektrométer elve. A minta gázállapotba hozása. Ionizácó 3. Fragmentálás (molekulatöredékek keltése) 4. Elválasztás 5. Detektálás 6. Kiértékelés Gázállapotba hozás, ionizáció Leggyakrabban alkalmazott módszerek: ESI (electrospray ionisation) Elektron ionizáció Laser deszorpció MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation) Elektrospray ionizáció elve Elektron ionizáció oldószer párolgás kisebb csepp nagyobb felületi töltés Coulomb taszítás felrobbannak a cseppek ionizált gyorsított molekulák Elektronsugárral ütköztetjük a már gázállapotú mintát. Ionizál és fragmentál is. izzókatód minta töltött molekulák......... Lézer deszorpció U elektronokgyorsításhoz U Gyorsítófeszültség 3 4
MALDI matrix assisted laser desorption ionisation Analízis A lézersugárzást a mátrix atomjai (molekulái) abszorbeálják. Nagy molekulák vizsgálatához ideális. Mágneses Kvadrupol TOF 5 6 Mágneses tömeganalizátor Kvadrupol tömeganalizátor B B R R m m Detektor F v Manapság nem használják, mert a mágnes nagy és nehéz. Kiválaszt egy szűk m/z tartományt, ami a ráadott feszültségekkel állítható be. 7 8
Time of Flight elve Time of flight MS gyorsítás elektromos térben repülés elektromos tér mentes l d úton A repülési idő számolása: minta detektor ionok ebből az m/z arány: U n repülési időt mérjük m/z-t számoljuk m/z 9 Pillanatszerű mintabevitel kell (lp. lézeres deszorpció) 30 Alkalmazások: proteomika Alkalmazások: diagnosztika 3 C-urea kilégzési teszt Helicobacter pylori kimutatására 3 C-urea tabletta 30 perc múlva a kilégezett levegőben a 3 CO mennyiségének növekedése a (Helicobacter pylori által termelt) ureáz enzim jelenlétére utal. A 3 CO mennyiségét tömegspektrometriával határozzák meg a kilélegzett levegőből. 3 3
Alkalmazások: szűrés Alkalmazások: rákdiagnosztika Anyagcsere betegségek szűrése csecsemőknél egy csepp vérből. 33 Takeda és mtsai: Innovations in Analytical Oncology - Status quo of Mass Spectrometry-Based Diagnostics for Malignant Tumor Journal of Analytical Oncology, 0,, 74-80 34 Alkalmazások: intraoperativ MS Itt egy szép ház állhatott Itt pedig egy kalyiba 35 36
Infravörös spektroszkópia IR spektroszkópia Mit (Milyen információt ad)? Molekulák rezgési frekvenciája, térszerkezete Miért érdekes/hasznos az orvostudományban? molekulák azonosítása molekulaszerkezet változások követése diagnosztika Hogyan? 37 38 Infravörös spektroszkópia Infravörös fény: λ800 nm mm közép infra tartomány:,5 50 μm abszorpciós spektroszkópia az elnyelt infravörös sugárzás molekularezgéseket kelt érzékeny a molekulaszerkezetre speciális detektálás: FT spektrométer Molekularezgések Az elektronok könnyűek, gyorsan követik az atommag mozgását, ezért az atommagok rezgéseit az elektronok nem befolyásolják. A klasszikus fizikai leírásban az atommagok közti kötést, egy rugóval vesszük figyelembe. 39 40
Molekularezgések: kétatomos molekula m a középiskolából ismert: f π m m D m l l l l D D F / D F / D Δl Δl l l F DΔl l + l l l l + m m + m + m m 4 4 tehát: m + m D, amit az D f m D π m egyenletbe helyettesítve a rezgési frekvencia: π Redukált tömeg: m mm redukált m m ezzel a frekvencia: + D f π f m redukált D( m m m + m) 43 Ilyen frekvenciájú fény hullámhossza: c mredukált λ πc f D hullámszáma hullámhossz reciproka (ν): ν λ πc D m redukált ν [cm ]: hány hullám fér el egységnyi hosszúságon? Példa: CO A mért rezgési hullámszám: ν 43 cm λ4,67μm f 6,43 0 3 Hz D875 N/m m C 0 6 kg, m O,7 0 6 kg Ha ν ismert, D számolható ha D ismert, ν számolható 44
Klasszikus fizikai rezgések és energianívók kapcsolata Klasszikus kép Energianívók A rezgési frekvencia függése a tömegtől és a kötéserősségtől Tömeg: Kötéserősség: S Infravörös rezgési frekvenciák (cm - ) B-H 400 C-H 3000 N-H 3400 O-H 3600 F-H 4000 C N: 00 cm, CN: 660 cm, C N: 0 cm. f π D m redukált S 0 ΔE Al-H 750 Si-H 50 Ge-H 070 P-H 350 As-H 50 S-H 570 Se-H 300 Cl-H 890 Br-H 650 rezonancia az f frekvenciájú fénnyel ΔEhf u.a.!!! 45 Víz (O-H): 3600 > nehézvíz: 600 cm - 46 Sokatomos molekulák rezgései N atomos molekula: 3N szabadsági fok, 3 3 a teljes molekula transzlációja ill. rotációja 3N 6 rezgési szabadsági fok (lineáris molekuláknál csak 3N 5) normálrezgések Normálrezgések Minden atom ugyanazzal a frekvenciával, de különböző amplitúdóval és irányban rezeg. Pl. víz: antiszimmetrikus 47 48
A víz normálrezgései Néhány tipikus rezgési frekvencia Nem rezgés, hanem gátolt forgás 49 50 Példa: Formaldehid Illusztrációként: különféle molekularezgések http://www.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/infrared/infrared.htm 5 5
Flavin 53 54 Makromolekulák rezgései Globális rezgések (bonyolultak) Lokalizált rezgések (csoportrezgések) a rezgő csoport környezetéről adnak információt pl: CH rezgések a lipidekben Fehérjék infravörös spektroszkópiája Konformációérzékeny rezgés 55
Fehérje rezgések Amid rezgések a fehérjékben A spektrum mérése: Fourier transzformációs spektrométer (FTIR) Konformációra érzékenyek: másodlagos és harmadlagos szerkezetre 57 tk 6.7 ábra 58 Alkalmazások lipid kettősréteg fázisátalakulása fényforrás hő-sokk fehérjék kölcsönhatása a lipidréteggel FT tk 6.8 ábra 59 60
fehérjedenaturáció Alkalmazások Molekula azonosítás C 4 H 8 O Meersman és mtsai. Biophys 6 J. http://www.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/virttxtjml/spectrpy/infrared/infrared.htm 6 Infravörös mikroszkópia Infravörös mikroszkópia 64x64 detektor ν ν ν 3 ν 4 minden képpontban megmérjük az egész spektrumot Abszorbancia ν ν ν 3 ν 4 hullámszám 63 64
Vesekövek osztályozása IR mikrospektroszkópiával Amid I rezgés (fehérje) Számítógépes analízis (6 osztály) hisztológiai kép Számítógépes analízis (5 osztály) colonic mucosa 66 vége 67