Perinatális mortalitás kóroktani és immunológiai vizsgálata, illetve prevenciója Holstein-fríz állományokban. A projekt címe

A projekt címe Perinatális mortalitás kóroktani és immunológiai vizsgálata, illetve prevenciója Holstein-fríz állományokban A projekt nyilvántartási száma: GAK-CALVES05 OMFB-00173/2006 OMFB-00174/2006 A szerzıdés száma: OMFB-00175/2006 OMFB-00176/2006 OMFB-00177/2006 Munkaszakasz számát 1-3 A beszámolási idıszak 2005.10.01. 2009.01.31. tényleges kezdési és befejezési idejét Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Nyugat-Magyarországi Egyetem, Mosonmagyaróvári Agrártudományi Centrum A támogatott szervezetek neve Kaposvári Egyetem Mezıgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont AGROPRODUKT Mezıgazdasági Termelı és Értékesítı ZRT A projektvezetı neve Dr. Szenci Ottó

Összefoglaló záróbeszámoló Konzorciumi tagok Szerzıdésszám Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar OMFB-00173/2006 Nyugat-Magyarországi Egyetem, Mosonmagyaróvári Agrártudományi Centrum OMFB-00174/2006 Kaposvári Egyetem OMFB-00175/2006 Mezıgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont OMFB-00176/2006 AGROPRODUKT Mezıgazdasági Termelı és Értékesítı ZRT OMFB-00177/2006 2

1. Szent István Egyetem Állatorvos-tudományi Kar a. Klinikai -, Anyagforgalmi, és Endokrinológiai vizsgálat A vizsgálati idıszakban 208 ellés adatait dolgoztuk fel, amelyhez 26 halvaszületés társult. Bár a pályázatunkban nem szerepelt, de lehetıségünk adódott arra is, hogy a különbözı immunglobulin meghatározási módszereket összehasonlítsuk. Ugyanis az újszülött borjak számára a kolosztrummal felvett és felszívódott immunglobulinok (Ig) nélkülözhetetlenek, mivel ezek az immunglobulinok biztosítják a borjak számára a fertızésekkel szembeni védettséget (anyai v. passzív immunitás). Ha az ellenanyagok felvétele nem megfelelı mértékő, akkor az immunglobulin-felszívódás hiánya (failure of passive transfer, FPT) alakul ki. Ilyen esetekben a borjú szérum IgG1 koncentrációja 10 g/l alatti. Számos módszert dolgoztak ki a kolosztrum és a borjú szérum immunglobulinkoncentrációjának meghatározására. A kolosztrum Ig-tartalmának mérésére a következı módszerek használatosak: kolosztrométer, refraktométer, laterális immundiffúziós teszt, radiális immundiffúziós teszt (SRID), ELISA-teszt. A borjúvér immunglobulinellátottságának mérésére az alábbi módszerek alkalmasak: nátrium-szulfit precipitációs próba (kolosztrumszonda), cink-szulfát próba, glutáraldehid koagulációs próba, refraktométer, laterális immundiffúziós teszt, latex-agglutinációs teszt, egyszerő immundiffúziós teszt, radiális immundiffúziós teszt (SRID), elektroforézis. Vizsgálataink során a Midland-féle laterális immundiffúziós gyorsteszttel végeztünk méréseket kolosztrum-, illetve borjú vérmintákon, a gyártó utasítása szerint. A telepi körülmények között végzett méréseink szerint a vizsgált Holstein-fríz tejelı tehéntıl származó 81 kolosztrumminta 93,8%-a tartalmazott megfelelı koncentrációban IgG1-t (>50 mg/ml). Másrészrıl a 81 vizsgált 1 napos borjútól származó szérummintáknak mindössze 69,1%-a mutatott elégséges IgG1 felvételt (>10 g/l IgG1), míg 30,9%-uk FPT-re utalt. Másik 97 egynapos borjú szérummintáját is megvizsgáltuk nátrium-szulfit precipitációs próbával. Ezen borjak szérummintájából laboratóriumban, radiális immundiffúziós módszerrel pontos mérések elvégzésére is sor került. A radiális immundiffúziós módszerrel végzett mérések alapján 28 borjú (28,86%) esetében fordult elı FPT, míg 69 (71,13%) megfelelı mennyiségő immunglobulint vett fel. A 28 FPT-s ború közül 14 esetében (50%) jelentkezett hasmenés, vagy légzıszervi fertızı betegség életük elsı 14 3

napjában. A normális IgG szintő borjak közül csak 12 (17,39%) mutatott valamilyen gastrointestinális, vagy légzıszervi betegség tüneteit a születésüket követı 14. napig. A két csoport közötti különbség statisztikailag szignifikáns volt (P<0.01). A Midland-féle laterális immundiffúziós gyorsteszt és a nátrium-szulfit precipitációs próba érzékenységét, specifikusságát, pozitív és negatív elırejelzés %-át is vizsgáltuk az eredményeket radiális immundiffúziós módszerhez hasonlítva. A Midland-féle laterális immundiffúziós gyorsteszt érzékenysége 61,1%, specifikussága 90,5%, pozitív elırejelzı értéke 84,6%, ill. negatív elırejelzı értéke pedig 73,1% volt. A nátriumszulfit precipitáció értékelése a következı volt: Se=100%, Sp=93,75%, PPV=77,27% and NPV=100% 5 mg/ml-es koncentráció értéknél. Vizsgálataink célja különbözı immunglobulin mérési módszerek összehasonlítása volt, valamint, hogy felhívjuk a figyelmet a megfelelı immunglobulin felvétel fontosságára. Klinikai vizsgálat keretében került sor császármetszéssel született újszülött borjak (n=10) tüdıfolyadék felszívódásának az ellenırzésére röntgenfelvételek készítésének segítségével. A röntgenfelvételeket közvetlenül a kiemelés után, valamint 1, 6 és 24 órával késıbb készítettük. Ezen idıszakokban még a felvételek elkészítését megelızıen vért vettünk a v. jugularisból a borjak sav-bázis egyensúlyának a meghatározása végett. A klinikailag egészséges újszülött borjak enyhe fokú kevert respiratorikus, metabolikus acidózist mutattak, amelyek a vizsgálat idıszaka alatt kompenzálódtak. Ugyanakkor a tüdıben lévı folyadék a megszületést követı 6. órára teljesen felszívódott, amit a mellékelt képeink is jól szemléltetnek. A tüdıfolyadék felszívódásának kiemelt élettani jelentısége van, hiszen ezáltal képes a megfelelı légcserét biztosítani. Vizsgálati eredményeinket a normál értékektıl való eltérés alapján is értékeltük. Mindezek alapján egyértelmően megállapítható, hogy vizsgált anyagforgalmi paraméterek nem alkalmasak a halvaszületések elırejelzésére (Szenci és mtsai, 2009). Az endokrinológiai vizsgálat során kapott eredményekbıl egyértelmően megállapítható, hogy mindkét vizsgált idıszakban az egyes hormon koncentrációk változása az idıfüggvényében elérte a szignifikáns szintet. Ugyanakkor a halvaszületés nem volt hatással az egyes hormonok változásaira. A halvaszületés és idı-intervallum egymás közötti kapcsolata csak az oestradiol esetében (második kísérlet) érte el a szignifikáns szintet (P = 0.028). Ugyanakkor, amikor az egyes csoportokat (normál ellés / halvaszületés) hasonlítottuk össze Student -t test segítségével, akkor közvetlenül az ellés után vett minták progeszteron koncentrációja szignifikánsan (P<0.001) eltért egymástól, vagyis halvaszületéskor magasabb értéket mutatott. Oestradiol esetén fordított volt a 4

különbség és csak az elsı évben tért el szignifikánsan (P< 0.01). A vemhességi fehérje koncentráció változásai mindkét csoportban különbséget jelzett 3 héttel a várható ellés elıtt, ill. <1 órával az ellés után, de a különbség mértéke nem érte el a szignifikáns szintet. A peripartális idıszakban az egyes hormon (progeszteron, oestradiol) és a vemhességi fehérje koncentráció-változások hozzájárulhatnak ahhoz, hogy a halvaszületést elıre jelezzük, de ezt a hipotézisünket további vizsgálatokkal kell megerısítenünk. A kortizol, az inzulin, az IGF1, a T3, és a T4 koncentráció meghatározások nem segítették a halvaszületés bekövetkezésének elırejelzését. A projekt által elért eredmények további hasznosításának lehetısége: Bár az anyagforgalmi és endokrinológiai vizsgálatok nem hoztak olyan egyértelmően hasznosítható eredményeket, amelyek segítségével a halvaszületések elırejelezhetıek lennének, mégis a vizsgálatok továbbfolytatását igénylik. Ugyanis a halvaszületések is polifaktoriális háttérre vezethetık vissza, ezért minden egyes eset részletes analízisétıl remélhetı az elırelépés. Továbbra is kutatni kell a monitoringra alkalmas módszereket, hogy a gyakorlat számára a halvaszületés bekövetkezése egyértelmően elıre jelezhetı legyen. b. Immunglobulinok transzportjának és katabolizmusának vizsgálata Minthogy az anyaállat szervezetében képzıdı ellenanyagok a fejlıdı magzatba a placenta felépítése miatt nem juthatnak át, ezért minden újszülött borjú agammaglobulinaemiásan születik. Egészségük megóvása érdekében alapvetı fontosságú, hogy megszületést követıen minél elıbb jó minıségő kolosztrumhoz juthassanak és az ellenanyagok minél nagyobb mennyiségben az élet elsı 24 órájában felszívódjanak. Amerikai felmérés szerint 10-15%-ra is tehetı azon borjak aránya, amelyek a megfelelı minıségő és mennyiségő kolosztrum itatás ellenére csökkent immunglobulin ellátottsággal rendelkeznek. Pályázatunknak fontos célja volt ezen arányok meghatározása hazai viszonyaink között. Mivel az újszülött állatok keringésébe bekerült maternális IgG lebomlása az FcRn molekulától függ, szintén célunk volt e receptor genetikai polimorfizmusát elemezni. Vizsgálataink során a következı megállapításokat tettük: 1. A vizsgált idıszakban (2006-2007) a kolosztrum és borjúsavó IgG tartalma alapján nem tudtunk kimutatni szoros korrelációt, azaz megállapíthattuk, hogy a 5

kolosztrum IgG szintje alapvetıen a fajtára jellemzı értéket mutatott (sok esetben annál magasabb) viszont nem mutatott összefüggést a borjak vérében levı IgG koncentrációval. 2. Kimutattuk, hogy a borjak vérében lévı IgG koncentráció alapján az irodalmi adatokhoz hasonlóan jelentıs különbségek vannak, és viszonylag magas azoknak a borjaknak az aránya, amelyek nem rendelkeztek megfelelı mennyiségő IgG-vel a születést követı második napon (<10 mg/ml; FPT: failure of passive transport). Megjegyzendı, hogy a vizsgált telepen ebbıl a szempontból jelentıs fejlıdést tapasztaltunk, miszerint az elsı vizsgálati idıszakban (2006) igen magas 42% (!), addig 2007-ben a nemzetközi gyakorlathoz közelítı 27% volt az ilyen borjak aránya (1. ábra). Tekintettel arra, hogy a borjak IgG ellátottsága nem mutatott összefüggést a kolosztrum IgG tartalmával (ld. 1. megállapítás), valamint a 2007. évben az elızı évhez képest tapasztalt jelentıs progressziót láttunk a borjak IgG ellátottságában, megítélésünk szerint ennek egyik oka a telepen folyó kutatómunka és ezzel összefüggésben a gondosabb felügyelet lehetett, amely ismételten felhívja a figyelmet a tartástechnológiai szabályok megfelelı betartására. 3. Tekintettel arra, hogy a borjú a születését követı mintegy 2 hónapig nem termel megfelelı mennyiségő és minıségő saját ellenanyagot és ezért rendkívül jelentıs, hogy a kolosztrumból felvett IgG az állat szervezetében mennyi ideig perzisztál. Az irodalmi adatok szerint a borjak szérumában lévı IgG kiürülése 26-38 nap felezési idıvel jellemezhetı. A vizsgált mintegy 50 borjú (a vizsgálatba csak azokat az állatokat vontuk be, amelyek megfelelı mennyiségő szérum IgG-t tartalmaztak a születést követı második napon) IgG lebomlása a 2-14 nap között 28.39 ± 22.96 nap (±SD) felezési idıvel volt jellemezhetı. A rendkívül jelentıs mértékő szórás oka, hogy több állatban nagyon rövid (5-12 nap; 13 állat) felezési 6 % IgG felezési idı (nap) 70 60 50 40 30 20 10 0 125 100 75 50 25 0 27 42 15 11 62 <10 10-15 >15 2.ábra 4. ábra 42 1.ábra 2007 2006 5-13 nap 14-40 nap 40-120 nap

idıt mértünk. Ugyanakkor olyan állatokat is találtunk, amelyekben az IgG rendkívül lassan bomlott le (>40 nap; 7 állat) (2. ábra). A rövid felezési idı annyit jelentett, hogy ezeknek a borjaknak a szérum IgG szintje a második hétre a veszélyes <10 mg/ml (FPT) szintet mutatta (annak ellenére, hogy az elsı-második napon megfelelı volt a szérum IgG szintjük). Ezt a felismerést számottevınek gondoljuk, és mivel az FcRn alapvetı szerepet játszik az IgG lebomlásban, megalapozottnak láttuk eredeti hipotézisünket azzal kapcsolatban, hogy az FcRn genetikai polimorfizmusát érdemes tanulmányozni (ld. 4. pont). Másfelıl, gyakorlati javaslatot teszünk, azaz javasoljuk, hogy a tehenészetekben az eddigi gyakorlat helyett, ne csupán a borjak elsı-második napján mérjék a szérum IgG koncentrációt, hanem ezt egészítsék ki egy 14 nappal késıbbi vizsgálattal annak érdekében, hogy pontosabban becsülhetı legyen az anyai IgG hiányos (FPT) borjak száma és az ebbe a kategóriába tartozó egyedek a szükséges megelızı kezeléseket még idıben megkaphassák. 4. Elemeztük azoknak az állatoknak az FcRn genomikus szekvencia kitüntetett szegmenseit (promoter és az IgG megkötésében szerepet játszó exon3-exon4 szakaszok 3. ábra), amelyekben az IgG metabolizmus anomáliáit észleltük (ld. 3. pont). A szekvencia eredmények alapján számos ponton találtunk eltérést a GenBank referencia szekvencia alapján, amelyek közül számos a promoterben volt 3. ábra promoter ATG exon 1 exon 2 exon 3 exon 4 intron 1 intron 2 intron 3 intron 4 ~600 bp ~600 bp exon1 signal v. leader régió exon2 - alpha 1 domén exon3 - alpha 2 domén elsıdleges IgG kötı hely exon4 - alpha 3 domén kimutatható, míg a többi az exon4-ben (a mutációk egy része nem jelent meg az alpha3-domén fehérje szekvenciájában (ún. silent mutációk), míg néhány ezek közül aminosav cserét jelenthet. Ezek pontos szerepét az FcRn funkciójában további elemzésekkel kell tisztázni. Mindezek alapján, kijelenthetjük, hogy vizsgálataink egyfelıl gyakorlati jelentıséggel bírtak (1. 2 és 3. pontok), másfelıl új elméleti eredményekhez (3. pont) és kérdésfelvetésekhez vezettek (4. pont). 7

c. In vivo méhkontrakciók vizsgálata A pályázatban kitőzött célok: A méhösszehúzódások intenzitásának csökkenése a méh mechanikai aktivitásának romlását eredményezi, ami közrejátszhat az ellés folyamatának elhúzódásában. Ez hozzájárul a születı borjakban az acidózis kialakulásához, ami súlyos esetekben akár a halvaszületések egyik összetevıjévé is válhat. Ezért a pályázat során fı célként tőztük ki annak vizsgálata, hogy megállapíthassuk, vajon található-e kapcsolat a magzat/újszülött elhullása és az anyaállat méhének mechanikai aktivitása között a puerperális idıszak kezdetén. A szakmai feladatok megvalósítása, a kitőzött célok teljesülése: Irodalmi adatok alapján kapcsolatot feltételeztünk a magzat/ megszületı újszülött elhullása és az anyaállat méhének mechanikai aktivitása között az ellést követıen, kiemelve az ellési segélynyújtás szerepét, a borjú asphyxia és következményes acidózis jelentıségét elhúzódó ellés során. Utóbbiban a magzat mérete, de más tényezık mellett a méh mechanikai aktivitása is jelentıs szerepet játszhat. Érintettük a vér Ca 2+ -koncentrációjával kapcsolatos saját korábbi mérési eredményeinket. Elızıleg egészséges, korai postpartum idıszakban lévı teheneken végzett vizsgálatainkból megállapítottuk, hogy a méhösszehúzódások átlagos gyakorisága, amplitúdója és a görbe alatti területek átlagos nagysága nagy egyedi variabilitás mellett folyamatosan úgy csökkent az ellést követı elsı 48 órában, hogy annak mértéke a 12. és 24. óra között volt a legnagyobb. Ugyanakkor a méh mechanikai aktivitásának jellemzésére szolgáló paraméterek értékei és a vér Ca 2+ -koncentrációi között nem volt szignifikáns összefüggés. Holtelléses tehenekbıl ugyanakkor eddig nem álltak rendelkezésünkre ezzel összevethetı adatok ezen ellést követı idıszak méhmőködésére vonatkozóan. A méhkontrakciók méréséhez és elemzéséhez egy korábban nemzetközi együttmőködéssel kifejlesztett digitális, belsı méhnyomást mérı rendszert használtunk, amely mőtéti beavatkozás nélkül, nagyüzemi gazdaságokban is alkalmas in vivo mérésekre. Elınye, hogy az állat környezetében anélkül tudunk pontos adatokat nyerni, hogy a mérésbe bevont állat egészégét veszélyeztetnénk, az állat a 8

méréseket követıen is a termelésben tartható. A vizsgálatok révén pontosabb képet kaptunk a puerperális méhösszehúzódások esetleges szerepére vonatkozóan a borjak perinatális mortalitásának alakulásában. A méréseket egy, a frissen ellett tehenek méhébe a nyakcsatornán át bevezetett, és az elızıleg vemhes méhszarv egy méhpogácsájához kézzel rögzített, nyitott végő mőanyag katéterrel és ehhez egy, a fartájékon rögzített nyomás-átalakító transzducerrel végeztük 10 holtelléses tejhasznú tehénen. Az itt nyert analóg jeleket erısítést, majd digitalizálást követıen rögzítettük, az így kapott eredményeket pedig egy másik célprogram segítségével elemeztük. Így kaptuk meg a nyomásgörbe intenzitását (végsı amplitúdó, AMP), hosszát (idıtartam, DUR), görbe alatti területét (area under the curve, AUC), illetve ezek idıegység alatti átlagát, valamint az összehúzódások számát (gyakoriság, FREQ), továbbá az idıegység alatti méhnyomás görbék összes görbe alatti területének nagyságát (TAUC). Az állatok vérének Ca 2+ - koncentrációjának mérésével a hipokalcémia elıfordulását is vizsgáltuk a méhtevékenység szempontjából, és megállapítottuk, hogy közepes, vagy enyhe fokú hipokalcémia mindössze 3 állatban fordult elı, klinikai tünetekkel járó ellési bénulás azonban nem jelentkezett. A méhtevékenységrıl összefoglalóan megállapíthattuk, hogy az aktív volt és maradt is a vizsgált korai puerperális idıszakban, de a szabályosan ellett kontrollokhoz hasonlóan itt is számottevıek voltak az egyedi eltérések. Megjegyzendı, hogy ismereteink, miszerint holtellést, ikerellést követıen megnı a MBV elıfordulási aránya, ez esetben is igazolódott, hiszen az 70%-ukat érintette. Ugyanakkor az elıfordult, különbözı fokú hipokalcémiás vérértékek ellenére az érintett tehenek méhe is megfelelı kontraktilitást jelzett, csak a legkevésbé érintett élettani alsó határérték közeli állat esetében (MBV-s csoport) csökkent a 24. órára az átlagosnál jobban a méh munkája. A méh mechanikai funkciója összességében tehát nem volt lényegesen kisebb, sıt sok esetben még nagyobb is volt, és nem is esett vissza az egészséges kontroll tehenekhez hasonló drasztikus mértékben ezekben a több peripartális problémával egyidejőleg terhelt állatokban. A méhet érintı negatív hatások tehát már ekkor kezdıdtek, és várhatóan nagy mértékben befolyásolták az állatok involúcióját, kihatva a következı vemhesülés eredményére. A belsı méhnyomás-mérési eredményeink azon fı feltételezésünket, hogy ok-okozati összefüggés állhat fenn a halvaszületések és a postpartum idıszak során esetleg mérhetı csökkent méhkontraktilitás között, el kellett vetnünk. 9

A projekt által elért eredmények további hasznosításának lehetısége: Az eredmények alapján a további hasznosíthatóságra vonatkozóan megemlíthetı a súlyos kalciumhiányos tehenek méhmőködése és a halvaszületések közötti összefüggés részleteinek további vizsgálata, valamint az ikerellések esetén a méhmőködést jellemzı fıbb paraméterek összehasonlítása a méhszarvak párhuzamos méréseivel. Az egyidejőleg folytatott technikai fejlesztések révén kisebb és korszerőbb méréstechnikai háttér áll rövidesen rendelkezésünkre. d. Kórbonctani és kórszövettani vizsgálat A pályázatban kitőzött célok: A veszélyeztetett újszülött borjak klinikai, anyagforgalmi, ill. modern képalkotó vizsgálaton alapuló mőszeres vizsgálatával az irreverzibilis elváltozások mértékét kívánjuk felmérni egyrészt klinikai beteganyagon (n=50), másrészt kísérletesen elıidézett asphyxia (n=10) esetén. A halvaszületett borjak részletes kórbonctani és kórszövettani vizsgálatával a perinatális mortalitás hazai elıidézı okát kívánjuk megismerni, ugyanis erre vonatkozóan hazai irodalmi adatok nem állnak rendelkezésünkre. A szakmai feladatok megvalósítása, a kitőzött célok teljesülése: A vizsgálat harmadik évében 86 halvaszületett borjú kórbonctani vizsgálatára került sor. Az ivararány a következı volt: bikaborjú: 59 (68,6%), üszıborjú: 27 (31,4%). Az elhullott borjak átlagos testtömege és szórása 39,4 + 7,2 kg volt, 22 (min) - 55 (max) kg közötti ingadozással. Vizsgálataink szerint közel 27%-ban nem találtunk kórjelzı értékő elváltozásokat, míg 3 esetben (3,4%) fejlıdési rendellenesség fordult elı. A fennmaradó esetekben vizenyıs beszőrıdést és/ill. véres beívódásokat diagnosztizáltunk. Fontos megjegyezni, hogy a tüdı az esetek nagy részében (n=67 /76,1%/) légtelen volt, míg 20 esetben (22,7%) részlegesen volt légtelen és csak egy esetben (1,2%) találtunk ép tüdıt. Mindezen eredményekbıl arra lehet következtetni, hogy az esetek jelentıs részében a borjúmagzatok már intrauterin elhullottak. Eredetileg 50 magzat vizsgálatát terveztük, de mivel szakmai értelemben rendkívül gazdag vizsgálati anyaghoz kerültünk, ezért lehetıségeink szerint tovább folytatjuk az esetek győjtését és feldolgozását. 10

A projekt által elért eredmények további hasznosításának lehetısége: A kórbonctani vizsgálat eredménye is felhívja a figyelmet arra, hogy a korábbi hipotézisünknek megfelelıen fokozottabb figyelmet kell fordítani az ellések elkezdıdésének az idıpontjára, mivel az elpusztult borjak 76,1%-a már intrauterin elhulott, vagyis az ellés elkezdıdését nem vették észre idıben és mire segélynyújtásra került volna sor a borjúmagzat már nem élt. 2. Nyugat-Magyarországi Egyetem, Mosonmagyaróvári Agrártudományi Centrum 1. kutatási év: A projekt elsı évében a kutatási cél a halvaellések genetikai okainak feltárása volt, ennek megfelelıen 5 évre visszamenıen (2001-2005) vizsgáltuk az ellések alakulását, ezen belül is a halvaellések elıfordulását. Összesen 8427 ellést vizsgáltunk meg. A vizsgálatok során megállapítottuk, hogy ebbıl 784 halvaellés volt, amely 9,3%-os arányt jelent. Az öt év részletes eredményeit vizsgálva megállapítható, hogy 2001-ben a halvaellési % 9,6 volt, ez 2002-ben 11,2%-ra emelkedett. Tíz százalék feletti (10,3%) az arány 2003-ban is, 2004-ben viszont csökkenés figyelhetı meg, ebben az évben kaptuk a legalacsonyabb átlagot (6,8%). 2005-ben a halvaellések száma kismértékben újra emelkedett, 8,8%-ot számoltunk. 1. táblázat: Halvaszületések évenkénti megoszlása (2001-2005) Év Ellés (n) Halvaszületés (n) Halvaszületés (%) 2001 1560 150 9,6 2002 1726 194 11,2 2003 1690 174 10,3 2004 1858 126 6,8 2005 1593 140 8,8 Összesen 8427 784 9,3 2. kutatási év: Ebben az idıszakban a halvaelléseket az életkör függvényében vizsgáltuk. Ha az összes halvaszületést (784) 100%-nak vesszük, az elsı laktációban az összes halvaellés 44-57%-a fordult elı. A második laktációra az összes halvaellés 15-28%-a 11

esik. A harmadik laktációban, ebben a tenyészetben 11-20%-os halvaellés a jellemzı. A negyedik laktációban figyelhetı meg nagyobb mértékő csökkenés a halvaellések elıfordulásában (5-11%). Az ötödik laktációban az elıfordulás gyakorisága 1-4% között alakult. A hatodik laktációra már az a jellemzı, hogy nem minden évben fordul elı halvaellés, ha igen, akkor 2-4% között alakult. A nyolcadik laktációban, egy év kivételével (2%) az évenkénti halvaellési arány 1-1%. A kilencedik laktációban egy év kivételével (2%) az évenkénti halvaellési arány 1-1%. A kilencedik laktációban, két évben volt 1-1%-os halvaellési arány. A vizsgált állománynál a tízedik laktációban nem fordult elı halvaellés, a tizenegyedik laktációban csak egy évben számoltunk 1%-ot. Az elsı laktációban az összes ellés 3,1-5,9%-a a halvaellés, ez az arány a második laktációban 1,6-2,1%. A harmadik laktációban a halvaellések száma csökkent (0,9-2,2%). A negyedik laktációban további csökkenés figyelhetı meg (0,3-1,1%), mely folytatódik az ötödik laktációban is (0,1-0,4%). A hatodik laktációban tapasztaltuk azt, hogy az öt év közül csak három évben volt halvaellés igen kis arányban (0,1-0,2%). Hasonló tendencia figyelhetı meg a hetedik laktációban is, úgy, hogy az arányok kismértékben csökkennek (0,1-0,06%). A nyolcadik laktációban négy év során volt halvaellés, ezt követıen a tizenegyedik laktációban és csak egy évben, viszont igen kis arányban. 2. táblázat: A halvaszületések ellések száma szerinti és évenkénti megoszlása az összes ellés függvényében (2001-2005) Ellés Halvaszületési % 2001 2002 2003 2004 2005 1 4,2 5,9 5,9 3,1 4,3 2 2,2 1,7 1,7 1,9 1,8 3 1,9 2,3 1,2 0,9 1,4 4 0,6 0,8 1,1 0,3 0,8 5 0,3 0,4 0,4 0,1 0,1 6 0,2 0,0 0,0 0,3 0,3 7 0,1 0,0 0,0 0,1 0,1 8 0,0 0,2 0,1 0,1 0,1 9 0,0 0,1 0,0 0,0 0,1 12

10 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 11 0,0 0,0 0,0 0,1 0,0 n 1560 1726 1690 1858 1593 3. kutatási év: Arra kerestük a választ, hogy mely bikák lányainál fordul elı halvaszületés, és milyen arányban. Elemeztük a bikákat nemcsak évente, hanem az egész vizsgált idıszak alatt, azaz egy-egy bika, mint apa melyik évben szerepelt, illetve melyek azok az évek, amikor a lányainál halvaszületés fordult elı. 2005-ben 66 bika lányainál fordult elı halvaellés, ebbıl a 66 bikából a 2005. évi 140 darab halva elléshez viszonyítva van olyan bika, melynél a halva ellési arány 0,7% és van olyan bika, ahol az arány 10,7%. Azt is megállapítottuk, hogy a 2005-ben halva ellést produkált bikák közül 27 bika (41%) 2004-ban is olyan tehénnek volt az apja, melyeknél az ellésminısítés halvaellés volt. 2003-ban 18 ilyen (27%) bikát találtunk. 2002-ben is van 9 (14%) olyan bika, mellyel 2005-ben is találkozhatunk. 2001-ben ez a létszám 5 (7%). 2004-ben a 27 bika halvaellési aránya 0,8-7,1% között változott. 2003-ban a 18 bika halvaellési aránya 0,6-10,9%, 2002-ben a 9 bikáé 0,5-14,9%, 2001-ben pedig az 5 bika esetében 3,3-10,7% között alakult. 2004-ben a 126 halvaellés 51 bika között oszlott meg. 12 (23%) olyan bika volt, melyek az elızı években is szerepeltek. 12 (23%) bikával találkoztunk 2003-ban, 6 (11,5%) bikával 2002-ben, 2001-ben pedig 2 (3%) bikával. 2004-ben a 12 bika halvaellési aránya 0,8-3,2% között alakult, 2003-ban a 12 bika 0,6-4%-os halvaellést produkált, 2002-ben a 6 bika halvaellési %-a 0,5-8,8%, 2001- ben pedig 1,3-2,7%-os aránnyal találkoztunk két bika esetében. 2003-ban az összes halvaellések száma 174 volt, ez 63 bika között oszlott meg, 16 olyan bikával találkoztunk, melyek megtalálhatók az elızı években is, 2002-ben valamennyi bika 16 (100%) produkált halvaellést, 12 bika lányai (75%) pedig 2001- ben. 2003-ban a 16 bika halvaellési %-a 0,6-4,0%, 2002-ben a 16 bika halvaellési %-a 0,5-2,6%, valamint 2001-ben a 12 bika 0,7-7,3%-os halvaellést produkált. 13

2002-ben 194 halvaellés volt, ezt 63 bika produkálta, ebbıl 7 (11%) olyan bika volt, mely 2001-ben is a halvaellettek között szerepelt. 2002-ben a 7 bika (0,5-1,5%), 2001-ben pedig szintén a 7 bika esetében (0,7-1,3%) között halvaellést tapasztaltunk. 3. táblázat: A lányok holt elléseinek (halvaszületéseknek) apai származás szerinti vizsgálata Év Apák szám a* Lányok száma ** 2002 63 194 2003 63 174 2004 51 126 2005 66 140 Holtellési % a vizsgált évben 2002 0,5 1,5% (n = 63) 2003 0,6-4,0% (n = 63) 2004 0,8-3,2% (n = 51) 2005 0,7-10,7% (n = 66) 2001 0,7-1,3% (n = 7) 2002 0,5-2,6% (n = 16) 2003 0,6-4,0% (n = 12) 2004 0,8-7,1% (n = 27) Holtellési% a korábbi években Holtellési % (min. max.) - - - 0,5-1,5% 2001 0,7-7,3% (n = 12) 2002 0,5-8,8% (n = 6) 2003 0,6-10,9% (n = 18) - - 0,5-7,3% 2001 1,3-2,7%) (n = 2) 2002 0,5-14,9% (n = 9) - 0,5-8,8% 2001 3,3-10,7% (n = 5) 0,5-14,9% Megjegyzés: * apák, amelyek lányainál holtellés fordult elı ** lányok, amelyeknél holtellés fordult elı. Vizsgáltuk a megszületett borjakat évente és apaállatok szerint. Arra kerestük a választ, hogy a tenyészetben használt termékenyítı anyagok (tenyészbikák) közül melyek azok, amelyek után elléskor halvaszületés következett be. 2005-ben 35 olyan bika szerepelt borjú apjaként, melynél halvaszületés történt. A 35 apából 5 olyan volt, melyek az elızı években is szerepeltek. Évenkénti bontásban 2004-ben 5 bika, 2003-ban 3, 2002-ben pedig 1 bika. 2005-ben ez az 5 bika 0,7-5,7%, 14

2004-ben szintén az 5 bika 2-23%, 2003-ban a 3 bika 1-36%, 2002-ben az 1 bika 19%-os halvaszületést eredményezett. 2004-ben 33 bika szerepelt, mint apa a halvaszületésekor, ebbıl 9 bika megtalálható az elızı években is, 9 volt 2003-ban is és 1 bika 2002-ben. A legkisebb és legnagyobb százalékok a vizsgált években a következıképpen alakultak: 2004-ben 1-8%, 2003-ban 2-15%, 2002-ben 1,5%. 2003-ban 34 olyan bika volt, melyeknek borjai halva születtek meg. Ebbıl 13 szerepelt a korábbi években is, úgy, hogy 2002-ben 13, 2001-ben pedig 7 bika. Ezeknél a bikáknál a legkisebb és legnagyobb halvaszületési arányok 2003-ban 1-12%, 2002-ben 1-7%, 2001-ben 0,7-7,3% között alakultak. 2002-ben 30 bika utóda született holtan, ebbıl 5 szerepelt az elızı évben, 2001-ben is. A többször elıforduló bikák esetében a legkisebb és legnagyobb arányok 2002-ben 1-3,1%, 2001-ben 0,7-13%. Az adatok alapján megállapítható, hogy vannak olyan bikák, amelyek mind az 5 évben magas halvaellési %-ot produkáltak. A halvaszületést okozó bikák közül vannak olyanok, amelyeknél minden évben a megszületett borjúk esetében igen magas a halvaszületési %, az adott év összes halvaelléséhez viszonyítva. Ez akár elérheti a 36%-ot is. Több bika fordul elı több évben is, de ezeknél a százalékos arány lényegesen kisebb. 3. táblázat: A halvaszületések apai származás szerinti vizsgálata Év Apák száma * 2002 30 2003 34 2004 33 2005 35 Halvaszületés i % a vizsgált évben 2002 1,0 3,1 % (n = 30) 2003 1,0 12,0% (n = 34) 2004 1,0 8,0% (n = 33) 2005 0,7 5,7% (n = 35) 2001 0,7 13,0 % (n = 5) 2002 1,0 7,0% (n = 13) 2003 2,0 15,0 % (n = 9) 2004 2,0 23,0% (n = 5) Halvaszületési % a korábbi években Halvaszületé si % (min. max.) - - 0,7 13,0 % 2001 0,7 7,3% (n = 7) 2002 1,5% (n = 1) 2003 1,0 36,0% (n = 3) - 0,7 12,0% - 1,0 15,0% 2002 19,% (n = 1) 0,7 36,0% 15

Megjegyzés: GAK program * apák, amelyek borjainál halvaszületés történt. Az eredmények felhívják a figyelmet a vizsgálatok fontosságára, a tenyészbikák megbízható tenyészérték becslésére, illetve a vizsgálatok (genetikai, élettani, környezeti, személyi tényezık) további folytatására. A halvaszületések arányának emelkedése hazai viszonyaink között is egyértelmő. Általános gyakorlat, hogy mindent elkövetünk, hogy állataink vemhesek legyenek, de a továbbiakban mintha elfelejtkeznénk róluk, vagyis nem teszünk meg mindent azért, hogy halvaszületés ne fordulhasson elı. Megfelelı ellési felügyelettel és szakszerő ellési segítségnyújtással, valamint a tenyészállatok gondos felnevelésével és tenyészpárosítással a születendı borjak életképessége, illetve az anyaállatok újravemhesíthetısége biztosítható, ezért folyamatosan értékelni kell az eredményeket, hogy a halvaszületésekbıl eredı kártételeket csökkenteni tudjuk. Ugyanakkor szükség van a befolyásoló tényezık jobb megismerését, megértését célzó kutatásokra, azok támogatására, hogy az állatorvosi neonatológia, mint új tudományág fejlıdhessen, valamint a perinatalis mortalitásból eredı kártételek mérsékelhetık legyenek. 3. Kaposvári Egyetem A projekt keretén belül a Kaposvári Egyetem kutatócsoportjának feladata volt a várható ellési idıpont elırejelzési lehetıségének kidolgozása a kanca prekolosztrumának makro- és mikroelem-tartalmának változása alapján. A tejmirigyszekrétum Ca-, K-, Na-, Mg-, P-, Zn-, Fe-, Cu- és Mn-koncentrációját atomabszorpciós spektrofotométerrel mérve az ellést megelızı idıszakra remélt változásból szerettük volna az ellés idıpontját jelezni. Célul tőztük ki olyan gyorsteszt kidolgozását is, ami a gyakorló állatorvos számára is hozzáférhetı módon, istállóteszt alapján könnyen lehetıvé tenné az elırejelzést, segítve ezzel is a felkészülést a várható ellésre, csökkentve a borjú magzatok ellési elhullásának veszélyét. A 2006-2008 évben végzett kísérletsorozat során az ásványianyag-tartalom mérése nem tette lehetıvé a várható ellés elırejelzését. A mért elemek változása folyamatosan csökkenı vagy növekvı értékeket mutatott, ami az ellést megelızı rövid idıszakban nem mutatott semmilyen jelentıs változást. Ezen túl a prekolosztumban lévı makroelemek, melyektıl a lehetséges elırejelzést remélhettük, 16

nagy egyedi különbségeket is mutattak, ezzel teljesen bizonytalanná téve azt a lehetıségét, hogy az állatorvos számára információt szolgáltasson az ellés várható idıpontjára. Azt gondoljuk azonban, hogy mégsem volt hiábavaló a három éves munka, mert a szarvasmarha prekolosztrumából elvégeztük mindazokat a vizsgálatokat, melyekbıl az ellést megelızı állapotra széleskörő információhoz jutottunk. Az általunk levizsgált nagyszámú minta eredményei alapján megismerhettük a prekolosztrum szárazanyag-, hamu-, makro- és mikroelem-tartalmát, a fehérje, a nyerszsír változását, és adatokat kaptunk az aminosav- és a zsírsav-összetétel alakulására is, kiegészítve azokat az ismereteket, melyeket a korábbi kutatásaink során kaptunk a kolosztrum és a tej összetételére. Ezek az adatok mindenképp hiánypótlóak, hiszen sem a külföldi, sem a magyar szakirodalomban nem találkoztunk ilyen vizsgálatokkal. Úgy gondoljuk, hogy a kísérletsorozat folytatásának semmilyen lehetısége nincs, az ellési idıpont elırejelzése az ásványianyag-tartalom változása alapján nem prognosztizálható. 4. Mezıgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont Kettıs transzgénikus egérmodell létrehozása és vizsgálata A bovine FcRn transzgénikus egerekben jelen lévı egér FcRn alfa-lánc által okozott hatások egyértelmően kizárása érdekében olyan kettıs transzgénikus egérmodellt hoztunk létre, amely az egér FcRn alfa-láncát nem hordozza, viszont továbbra is jelen van benne a bovine FcRn alfa-láncot expresszáló gén. A szarvasmarha FcRn transzgénikus egereket olyan egértörzzsel kereszteztük, amelybıl génkiütéssel eltávolították az egér saját FcRn alfa-láncának kódoló szakaszát (mfcrn -/- ). Ez az egértörzs jól jellemzett és kereskedelmi forgalomban beszerezhetı (Roopenian et al., 2003 http://jaxmice.jax.org/findmice/index.html). A kettıs transzgénikus egerek detektálása multiplex PCR reakcióval történt. A PCR-ben alkalmazott primerek a szarvasmarha FcRn alfa-láncát, az egér-fcrn alfa láncát és a KO egér elıállításánál alkalmazott NEO szakaszt ismerik fel (1. ábra). A két egértörzs homozigóta egyedeinek keresztezésébıl származó G1 nemzedékben minden utód hordozza a bfcrn, a mfcrn és a NEO géneket. Ezen G1 generáció egyedeinek párosításából származó utódok között már találhatunk olyan egyedeket, amelyek nem hordozzák az egér saját FcRn alfa-láncot kódoló gént (2. ábra). Az így kapott egerekben mért 17

bármely, a szarvasmarha FcRn receptorhoz köthetı tulajdonságot a szarvasmarhából átvitt alfa-lánc fog meghatározni. Ezeket a példányokat kiemelve és továbbtenyésztve homozigóta 4 és 10 kópiás vonalakhoz jutottunk (a keresztezés kiindulásakor két 4 és 10 kópiás homozigóta vonal állt rendelkezésünkre a bfcrn-t is hordozó egerekbıl). A fentiek alapján elıállított bfcrn homozigóta állatok egér FcRn KO egerekkel való keresztezésével heterozigóta formában 2 és 5 kópiás kettıs transzgénikus vonalak is a rendelkezésünkre állnak. Alkalmazott primerek: KOegérNEO_F: 5 -GGA ATT CCC AGT GAA GGG C-3 KOegérNEO_R: 5 -CGA GCC TGA GAT TGT CAA GTG TAT T-3 FcRn wt_f: 5 -GCC ACA CCC AGC TAA TTG TT-3 BfcL: 5 -GCC GCG GAT CCC TTC CCT CTG-3 BfcSu:5 - CTC CTT TGT CTT GGG CAC TT-3 Termékek: mfcrn: 278 bp NEO: 345 bp bfcrn: 610 bp 1. ábra Multiplex PCR tesztelése 18

Sorszám Templát Primerek 2. ábra bfcrn xko bfcrn mfcrn egér egerek G1és G2 tesztelése G1 generáció 1. KO Neo-f, KO Neo-r, mfcrn wt-f DNS 2. KO egér DNS KO Neo-f, KO Neo-r, mfcrn wt-f 3. 4. 5. bfcrn egér DNS bfcrn egér DNS KO x bfcrn egér DNS bfcsuf, bfcl KO Neo-f, KO Neo-r, mfcrn wt-f, bfcsuf, bfcl KO Neo-f, KO Neo-r, mfcrn wt-f, bfcsuf, bfcl 1-9.: utódok G2 generáció 1-12.: utódok; 13.: szarvasmarha DNS; 14.: bfcrn Tg egér DNS; 15.: víz A kettıs transzgenikus egérmodell alkalmazása A szarvasmarha FcRn szövet- és fejlıdésspecifikus szabályozásán túlmenıen a kettıs transzgénikus egérmodellünk lehetıséget ad arra is, hogy az FcRn alfa-lánc szabályozásában résztvevı faktorokat in vivo vizsgálhassuk. Az ELTE, Immunológia Tsz-én Dr Kacskovics Imrével és munkatársaival együttmőködve, 2008 folyamán az in vivo LPS injektálás hatását vizsgáltuk a bfcrn receptor expressziójára. Amennyiben a sejtfelületi receptorokhoz a megfelelı ligand kötıdik (LPS, TNFα) úgy a szignálkaszkád hatására az lκb fehérje lebomlik és a felszabaduló NF-κβ transzkripciós faktorok a sejtmagba kerülnek és ott a megfelelı promóter 19

szakaszokhoz kapcsolódva indukálják az adott gént. Ezt bizonyítandó három egymástól független csoportot (A, B, C) alakítottunk ki 4 kópiás kettıs transzgénikus egerekbıl csoportonként 8 db állattal és 250 µg/100 g LPS-t (SIGMA L-3129) injektáltunk i.p.. Az LPS injektálást követıen 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 órával mindhárom csoportból egy-egy állatot leöltünk és kivettük a májat és a lépet. A szerveket folyékony nitrogénbe helyeztük, majd felhasználásig -70 C fokon tároltuk. Minden mintavételi idıpontnál minden állatnak rektálisan megmértük a testhımérsékletét. Az egerek hımérsékletének folyamatos követése (folyamatos csökkenés) és egyéb tüneteik (borzolt szır, levertség étvágytalanság) arra utaltak, hogy az LPS kezelés hatására szepszis alakult ki, melyet a szervek boncoláskori állapota is alátámasztott. Az expresszió változását Northern analízissel (3/A ábra) és Real-Time PCR-rel detektáltuk (3/B ábra). A lépeket Precellys 24 homogenizátorban RNAzol Bee (AMS Biotechnology) feltárópufferben homogenizáltuk majd izopropanolos kicsapásos módszerrel RNS-t izoláltunk. 3 µg RNS-t vittünk fel 1%-os formaldehid gélre és 3 órán keresztül futtattuk, majd Hybond N + membránra (Amersham Biosciences) blottoltuk át 20x SSC pufferben. Szarvasmarha máj cdns-bıl B7-B8 (B7: 5 -GGC GAC GAG CAC CAC TAC-3 B8: 5 -GAT TCC CGG AGG TC (AT) CAC A-3 ) primerpárral készített PCR terméket jelöltünk (HexaLabel DNA Labeling Kit Fermentas) dctp-vel ( 32 P). Az RNS loadingot és a Northern blot-on kapott jelek denzitását GeneTools From Syngene programmal értékeltük és Excel program segítségével ábrázoltuk. Eredményeink szerint az LPS kezelt transzgenikus egerekben a bovine FcRn mrns igen gyors indukciója következik be, amely csökkenı amplitúdóval 24 óra alatt megközelíti a kiindulási értéket (3/C ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy az FcRn molekula expressziójának szabályozásában az NFκB transzkripciós faktor fontos szerepet játszik. 3/A. ábra LPS kezelt egerek lépmintáinak Northern blot átlageredményei LPS kezelt egerek lépmintáinak (A,B) Northern hibridizáció átlageredményei 600000 500000 400000 denzitás 300000 200000 100000 0 20 0 1 2 4 6 8 12 24 LPS injektálás után eltelt idı

3/B. ábra LPS kezelt egerek lépmintáinak Real-Time PCR átlageredményei AGROPRODUKT Mezıgazdasági Termelı és Értékesítı 3 ZRT 2,5 LPS kezelt egerek lépmintáinak (A,B) Real-Time PCR átlageredményei 2 denzitás 1,5 1 0,5 0 0 1 2 4 6 8 12 24 LPS injektálás után eltelt idı 3/C. ábra LPS kezelt egerek lépmintáinak Real-Time PCR és Northern blot átlageredményeinek összehasonlítása LPS kezelt egerek lépmintáinak (A,B) Real-Time PCR és Northern hibridizáció átlageredményei denzitás 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 1 2 4 6 8 12 24 LPS injektálás után eltelt idı Real-Time átlag Northern átlag 21

5. AGROPRODUKT Mezıgazdasági Termelı és Értékesítı ZRT Az AGRORPODUKT Mezıgazdasági Termelı és Értékesítı ZRT feladata a vizsgálatok helyszínének és a kísérletbe vont állatok biztosítása, valamint a halvaszületett borjak rendelkezésre bocsátása volt, amelynek mind a három kísérleti évben messzemenıen és magas színvonalon biztosított. A gazdaság számára a projekt kézzel fogható közvetlen eredményeként csökkent a halvaszületések elıfordulása, ugyanis 4521 ellés esetén csak 6,6%-os volt az elhullás, szemben a korábbi években észlelt 9,3%-os (n=8427 ellés) elıforduláshoz. Mintegy 120 borjú megmentésével (50000 Ft/ újszülött borjú) 6 millió Ft bevétel kiesést lehetett elhárítani. Minthogy a gazdaság mind a három telepén csökkent a halvaszületésekbıl eredı veszteség, így a közvetlen nyereség közel háromszorosra tehetı. A további vizsgálatok folytatásához a Gazdaság szívesen állna rendelkezésre, hiszen a tehenészetek számára a mai tejátvételi árak mellett egyetlen lehetıség maradt, még pedig a termelési költségeknek a csökkentése, hogy a következı években is tudják biztosítani a tejtermelés zavartalanságát. Sajnos meg kell állapítani, ha ezen a téren nem történik elırelépés Magyarország tejtermelése kerül veszélybe. Üllı Dóra major, 2009. április 16. Dr. Szenci Ottó klinikavezetı egyetemi tanár konzorciumvezetı 22