TENYÉSZTÉSES MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK II. 1. Mikroorgaizmusok számáak meghatározása telepszámlálásos módszerrel A telepszámlálásos módszerek esetébe a teyésztést szilárd táptalajo végezzük, így - szembe az MPN-módszerrel, ahol a csíraszámot idirekt úto, statisztikai módszerrel határoztuk meg - a kifejlıdött telepek közvetleül megszámolhatók. A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságáak alapfeltétele, hogy a táptalajoko kiıtt telepek egyetle sejt szaporodásából származzaak, és a telepek számolhatók legyeek, vagyis a cél olya lemezteyészetek elıállítása, amelye az egyedülálló (soliter) telepek száma 10-00 közötti. Akárcsak az MPN-módszerrıl, a telepszámlálásos módszerekrıl is elmodható, hogy - a táptalajtól és a teyésztési techikától függıe - alkalmas mid az összcsíraszám; mid pedig valamely tetszıleges mikrobacsoport számáak meghatározására. Élısejtszám meghatározás lemezötéses módszerrel A lemezötéses módszert fıkét kevéssé hıérzékey, em obligát aerob mikroorgaizmusok teyésztésére haszáljuk. Alkalmazható az összcsíraszám, valamit szelektív vagy elektív táptalajok és optimális teyésztési viszoyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíra-számáak meghatározásához. A vizsgálat elsı lépése - mit mide élıcsíra-szám meghatározást célzó teyésztéses módszer esetébe - a megfelelıe elıkészített mitából decimális hígítási sor készítése. Ezt követıe a hígítási sor tagjaiból - - egyértelmő jelzéssel (mitaszám, leoltás dátuma, alkalmazott táptalaj rövidített eve, hígítás foka) ellátott - Petri-csészébe 1-1 cm szuszpeziót kell pipettázi steril pipettával a legmagasabb hígítástól kezdve a agyobb sejtsőrőségő tagok felé haladva (19. ábra). Pipettázáskor em vesszük le teljese a csészék fedelét, csupá ayira emeljük fel, hogy a pipettával be tudjuk yúli (1) (0.ábra). A sterilezett, 45-50 C hımérséklető, táptalajból kb. 15 cm meyiséget ötük a megemelt fedelő Petri-csészékbe (), majd egyeletes rotáló mozgatással a - még folyékoy - táptalajt alaposa elkeverjük a Petri-csészébe lévı szuszpezióval (). Ügyeli kell arra, hogy mozgatás közbe a tápközeg e kerüljö a Petri-csésze falára és tetejére, valamit e szeyezze a köryezetet. Az iokulum szétosztása és a táptalaj ötése közötti idıtartam e haladja meg a 15 percet. A tápközeg megszilárdulása (4) utá a Petri-csészéket meg kell fordítai úgy, hogy a lemez kerüljö felülre (5). Eek célja egyrészt a képzıdı kodezvíz visszacsöpögéséek, a gyors kiszáradásak, valamit a telepek elvádorlásáak megakadályozása. A lemezeket ezt követıe megfelelı hımérséklető termosztátba kell helyezi, és elıírt ideig teyésztei. 1
1-1 cm 1. ábra: A lemezötéses módszer kivitelezéséek rajzos vázlata I. O= Petri-csésze. ábra: A lemezötéses módszer kivitelezéséek rajzos vázlata II. Kerüljük a termosztátok túlterhelését. A csészeoszlopok között, az oszlopok és termosztát falai, valamit az oszlopok és a polc lapjai között legalább 9 mm hézagot kell hagyi. Egy oszlopba legfeljebb 6 csésze legye. Az ikubálás lejárta utá a lemezeket kivesszük a termosztátból, és a rajtuk kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Csak azokat a lemezeket vojuk be az értékelésbe, amelyeke a telepszám 10-00 (agymérető telepek eseté 10-150) közötti. A csíraszámot az értékelésbe bevot lemezeke (két egymást követı hígítás) megszámlált telepszámok súlyozott átlagakét adjuk meg a hígítási fok figyelembe vételével az alábbi képlet alapjá: C= c (1 + 0,1 ) * V * d ahol
C = telepszám súlyozott középértéke c =a számításba bevot valameyi lemeze számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) 1=az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szit hígítási foka (pl. 10 - ) V =a lemezekre vitt kultúra meyisége (jele esetbe 1 cm ) A kapott értéket mide esetbe ormál alakba hozva adjuk meg eredméykét. Eél a vizsgálati módszerél célszerő az alkalmazott táptalajt úgy megválasztai, hogy az tiszta, áttetszı legye, mert az opálos szíő táptalajok zavarhatják a kolóiák felismerhetıségét. 1. GYAKORLAT Pasztırözött tej összcsíraszámáak meghatározása lemezötéses módszerrel Összcsíraszám alatt értjük azokak az élı mikroorgaizmusokak a számát, amelyek 0 C hımérséklete aerob körülméyek között 48-7 óra alatt telepet képezek (összes élı, aerob és fakultatív aaerob, mezofil és fakultatív pszichrotróf mikrobák száma). A vizsgálatot szilárd alaptáptalajo kell végezi, mit pl. a triptot, élesztıkivoatot és glükózt tartalmazó Plate-Cout agar Szükséges ayagok és eszközök: 90 cm steril hígítóvíz Erlemeyer-lombikba, 10 cm -es steril pipetta, 5 x 9 cm steril hígítóvíz kémcsıbe, 1 cm -es steril pipetta, 6 db steril Petri-csésze, olvasztott Plate-Cout agar Mikroorgaizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat meete: A pasztırözött tejmita 10 cm -ét bemérjük 90 cm steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposa összekevert alaphígításból további decimális hígításokat készítük 10-5 hígítási fokig. A hígítási sor utolsó három tagjából 1-1 cm t pipettázuk hígításokét ; azoosítható jelöléssel ellátott steril Petri-csészébe, majd felolvasztott és 45 C-ra visszahőtött Plate-Cout agarral lemezt ötük. Szilárdulás utá a lemezeket 48-7 órára 0 C-ra állított termosztátba helyezzük. Az ikubálási idı utá a kifejlıdött telepeket megszámoljuk, és a feti képlet alapjá kiszámoljuk a tej 1 cm -ére voatkoztatott összcsíraszámot. Ha valamely képletrıl szabad szemmel em tudjuk eldötei, hogy telep-e, célszerő lupéval is megvizsgáli. Megjegyzés: a módszer alkalmas az aerob spóraszám meghatározására is, ha a mitát vagy a hígítási sor tagjait 80 C-o 10 perce át kezelve a vegetatív alakokat elpusztítjuk. Eredméyek:
. ÉLİSEJTSZÁM MEGHATÁROZÁSA FELÜLETI SZÉLESZTÉSSEL A felületi szélesztés alkalmazható hıérzékey, obligát aerob mikroorgaizmusok teyésztésére is. Eél a módszerél alkalmazhatuk opálos szíő (általába tojássárgaemulziót tartalmazó) táptalajokat, mivel a mikrobaszaporodás a táptalaj felszíé törtéik, így a telepek szabad szemmel is jól láthatók. A felületi szélesztéses módszer - akár az MPN, vagy a lemezötéses eljárás - alkalmazható az összcsíraszám, valamit szelektív vagy elektív táptalajok és optimális teyésztési viszoyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíraszámáak meghatározásához. A felületi szélesztéses eljárás sorá a már elıre leötött és megszilárdított, szikkasztott felülető lemez felületére pipettázuk hígításokét 0,1 cm szuszpeziót (19. ábra). Ha ics más elıírás a szárítást beoltás elıtt fedı élkül, lefelé ézı agarfelülettel kell elvégezi egy 50 C-os termosztátba 0 percig. A táptalaj szikkasztására azért va szükség, mert a edves felülető lemeze ehéz a szélesztés, és a kifejlıdı telepek szétfutak. Beoltás utá a megfordított lemezeket megfelelı körülméyek között meghatározott ideig ikubáljuk. Az ikubációs idı letelte utá a kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Az értékelésbe csak azokat a lemezeket vojuk be, amelyeke a telepszám 10-00 (agy telepek eseté 10-150) közötti. A csíraszám meghatározása súlyozott átlag számításával az elıbb már említett képlet alapjá törtéik: ahol C = telepszám súlyozott középértéke c C = + 0,1 ) * V * d ( 1 c =a számításba bevot valameyi lemeze számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) 1=az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szit hígítási foka (pl. 10 - ) V =a lemezekre vitt kultúra meyisége (jele esetbe 0,1 cm ) 0,1-0,1 cm. ábra: A felületi szélesztéses módszer kivitelezéséek rajzos vázlata O= Petri-csésze 4
Látható, hogy a lemezötéses módszerél a lemezekre vitt iokulum meyisége 1 cm, a felületi szélesztéses módszerél 0,1 cm. Az eredméyt mide esetbe ormál alakba hozva kell megadi CFU/ cm vagy CFU/g mértékegységgel. A fetiekbıl következik, hogy szilárd miták esetébe, a vizsgálat érzékeysége legalább 10 mikroba/g, folyékoy miták esetébe pedig; 10 1 mikroba/ cm. Elıfordulak azoba olya vizsgálati miták, amelyekbe a keresedı mikroorgaizmus eél kisebb számba, fordul elı. Ezek kimutatását célozza az u. "három-lemez"-módszer. Eek léyege, hogy a hígítási sor elsı tagjából - szilárd miták esetébe ez az l-es hígítás (alapszuszpezió), folyékoy miták esetébe pedig maga a mita (0-s hígítás) - összese 1 cm meyiséget három lemez felületé oszlatuk el, majd a megfelelı ikubálás eltelte utá a telepeket midhárom lemeze megszámláljuk, és a kapott értékeket összeadjuk. Ez a szám megmutatja, hogy - szilárd miták esetébe - az alapszuszpezió, illetve - folyékoy miták esetébe - a mita 1 cm -ébe háy mikroba található.. GYAKORLAT Pasztırözött tej összes Staphylococcus-, és feltételezhetıe Staphylococcus aureus számáak meghatározása felületi szélesztéses módszerrel A Staphylococcus emzetség tagjai megtalálhatók az ember és az állatok bıré, felsı légutaiba, a húgy és emi szervek yálkahártyái, illetve egyes fajaik a tejbe és tejtermékekbe is. Élelmiszerhigiéiai szempotból legjeletısebb képviselıjük a Staphylococcus aureus, amely hıtőrı eterotoxi-termelése révé az ételmérgezı mikroorgaizmusok közé tartozik. A Staphylococcus-ok szelektív teyésztésére a szulfamethazi-tojássárga-tellurit tartalmú szelektív és differeciáló agarlemezt alkalmazzuk. A szulfamethazi visszaszorítja a kísérı mikroflórát, a tellurit a Staphylococcusok-ra jellemzı tellurit-redukció kimutatását célozza, amelyek eredméyekét a telepek fekete vagy grafitszürke szíbe tőek föl. A táptalajo vizsgálható a Staphylococcus aureus-ra jellemzı lipáz-lecitiáz aktivitás. A lipáz pozitívak azok a telepek, amelyek felülete a keletkezı zsírsavak miatt gyögyházféyő. A lecitiáz aktivitást az u. Nagler-reakció mutatja. Eek léyege, hogy a leciti elbotása miatt a telepek körül - a tojássárga-tartalom miatt - egyébkét opálos táptalaj feltisztul. Szükséges ayagok és eszközök: 90 cm steril hígítóvíz Erlemeyer-lombikba, 10 cm -es steril pipetta, 9 cm steril hígítóvíz kémcsıbe, 1 cm -es steril pipetta, 4 db Baird-Parker agarlemez, steril Wasserma-csövek Mikroorgaizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat meete: A pasztırözött tejmita 10 cm -ét bemérjük 90 cm steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposa összekevert alaphígításból további decimális hígítást készítük 10 - hígítási fokig. A hígítási sor tagjaiból 0,1 0,1 cm -t pipettázuk hígításokét, azoosítható jelöléssel ellátott steril Baird-Parker agarlemezre. A lemezeket 4-48 órára 7 C-ra állított termosztátba helyezzük. Az ikubálási idı utá a kifejlıdött fekete vagy grafit szürke telepeket, valamit ezek közül a gyögyházféyő és Nagler-reakciót mutató telepeket megszámoljuk, és a feti képlet alapjá kiszámoljuk a tej 1 cm -ére voatkoztatott Staphylococcus-, valamit feltételezett Staphylococcus aureus-számot 5
Számolási példa telepszám súlyozott átlagáak kiszámítására lemezötéses módszer esetébe Tegyük fel, a lemezeke kiıtt telepek leszámolása utá az alábbi eredméyeket kaptuk a yers tej összcsíraszámáak vizsgálatakor. Hígítási szit 10-1 10-10 - 10-4 10-5 Hígítási fok 1 4 5 1. párhuzamos lemezei kiıtt sok sok 80 7 telepek száma (c). párhuzamos lemezei kiıtt sok sok 5 telepek száma (c) A kiértékelésbe csak a fekete égyzettel körülvett telepszámokat vohatjuk be, mert ezek felelek meg a 10<c<00 elıírásak. C c 80 + 5 + 7 + 565 = = = ( 1 + 0,1 ) * V * d ( + 0,1* ) *1*10, *10 5 = 56,8 *10 =,57 *10 CFU cm,57*10 5 a yers tej miták összcsíraszáma. Figyelem: 1 1 10 - =0.001=1/1000, így = 10 1 = 1000 = 10 1000 =. Membrászőréses módszer A membrászőréses módszert alacsoy csíraszámú folyadék- és gázmiták vizsgálatára alkalmazzuk. A mita meghatározott meyiségét membráfiltere átszívatva aak pórusai a mikrobák visszamaradak. A membráfiltert táptalajra helyezve a filtere átdiffudáló tápayagok révé a telepek magá a filtere alakulak ki. A membrászőréses módszer alkalmazásáról és techikai kivitelezésérıl részletese a "Víz összes csíraszámáak meghatározása membrászőréses módszerrel" címő gyakorlat keretébe lesz szó. 6