COBAS TaqMan CT Test, v2.0

COBAS TaqMan CT Test, v2.0 IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v2.0 48 Tests P/N: 05055202 190 AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 Tests P/N: 20759414 122 ART: 07 5941 4 US: 83315 FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS TaqMan CT Test v2.0 egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a Chlamydia trachomatis DNS kvalitatív kimutatására női méhnyakkenet mintából, illetve férfi vagy női vizeletből. A minta manuális előkészítése az AMPLICOR CT/NG Minta-előkészítő Készlet használatával történik, az automatikus amplifikálás és kimutatás pedig a COBAS TaqMan 48 analizátor segítségével. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A chlamydiák Gram-negatív, nem mozgó baktériumok, amelyek mivel képtelenek ATP szintézisére, eukarióta sejtek obligát intracelluláris parazitáiként léteznek. A Chlamydia nemzetségbe négy ismert faj tartozik: A C. trachomatis, a C. psittaci, a C. pecorum és a C. pneumoniae (korábban TWAR ágens). A C. psittaci elsődlegesen állati kórokozó, és a C. pecorum kóroki szerepe nem tisztázott 1. A Chlamydia trachomatis fertőzéseket ma a szexuális úton terjedő betegségek (STD) második legjelentősebb okának tartják világszerte évi mintegy 89,1 millió esettel 2. Az Egyesült Államokban mintegy 2,8 millió eset fordul elő évente 3.A Chlamydia trachomatis kóroki szerepe a következő betegségekben ismert: cervicitis, kismedencei gyulladásos betegség (PID), gyermekkori conjunctivitis, gyermekkori pneumonia, urethritis, epididymitis és proctitis 1,4.A Chlamydia trachomatis ugyancsak a leggyakoribb oka a non-gonococcalis urethritiseknek (NGU) férfiakban (az esetek mintegy 25-55%-a). Nőkben a kezeletlen chlamydia fertőzéseknek súlyos következményei lehetnek. Tekintve, hogy ezen fertőzések megközelítőleg fele tünetmentes, sok eset nem kerül felismerésre és kezelésre, mely további problémákhoz vezet különösen terhes nőknél. Chlamydiafertőzött nők újszülöttjei nagy kockázattal betegszenek meg zárványtestes conjunctivitisben és pneumoniában. A C. trachomatis azonosításának hagyományos referencia standardja a tenyésztéses vizsgálat. Ugyanakkor a standardizálási nehézségek, a gyakorlati nehézségek és a tenyésztést megelőző transzport és tárolás során az organizmusok életben tartásának szükségessége a nem tenyésztéses C. trachomatis-vizsgálatok kifejlesztéséhez vezetett 5. Ezek a módszerek, amelyek nem igényelnek élő organizmusokat, egyebek között a nukleinsav-amplifikációs vizsgálatok (NAAT), a nukleinsavpróba vizsgálatok, az enzim immunoassay (EIA) vizsgálatok, a direkt fluoreszcens antitest (DFA) vizsgálatok és a komplement kötés 1,5. Klinikai tanulmányok kimutatták, hogy a NAAT-módszerek érzékenyebbek, mint a tenyésztéses és az egyéb nem tenyésztéses módszerek, és így ez vált a klinikai laboratóriumok preferált módszerévé a C. trachomatis-fertőzések diagnosztikájában 5. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI The COBAS TaqMan CT Test, v2.0 két fő lépésből áll: 1) manuális minta-előkészítés a CT DNS izolálására; (2) a target DNS PCR-amplifikálás 6 CT specifikus komplementer primerek segítségével és a hasított, kettősen jelölt oligonukleotid próbák szimultán kimutatása, amely lehetővé teszi a CT target amplifikált termék (amplikon) és a (mintával egyidejűleg amplifikált és detektált) CT belső kontroll DNS kimutatását. A master mix reagens a CT kriptikus plazmid DNS-re, a CT kromoszomális DNS ompa génjére és a CT belső kontroll DNS-re egyaránt specifikus primer párokat és próbákat tartalmaz. A master mix reagenst minden 15 CT szerovariáns kimutatásának biztosítására fejlesztették ki. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és belső kontrollra specifikus kettősen jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a CT amplikon és a CT belső kontroll amplikon független azonosítását. Minta előkészítése A tamponos mintáról vagy vizeletüledékből gyűjtött urogenitális hámsejteket a chlamydia retikuláris testekben lévő DNS felszabadításához detergens oldattal kell kezelni. Majd a roncsolt minta amplifikálásra való előkészítéséhez egy második detergens oldat hozzáadása szükséges. 1

PCR Amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A kromoszomális DNS mellett a C. trachomatis tartalmaz még egy megközelítően 7500 bázispár nagyságú kriptikus plazmidot, amely valamennyi C. trachomatis szerovariánsra jellemző 7,8. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 a C. trachomatis kriptikus plazmid DNS-ében egy hozzávetőleg 206 nukleotid hosszúságú szekvenciának megfelelő CP102 és CP103 primereket használ. Ezen felül a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 a C. trachomatis kromoszomális DNS-ében egy hozzávetőleg 182 nukleotid hosszúságú szekvenciának megfelelő CTMP101 és CTMP102 primereket használ. Target-amplifikáció Az előkészített mintákat a K-csövekben vagy K-tálcákban lévő amplifikáló elegyhez adják, ezekben megy végbe a PCR-amplifikáció. Az izolált DNS denaturálása és a primer targetszekvenciák felszabadítása végett reakcióelegyet fel kell melegíteni. Ahogy az elegy kihűl, az upstream és downstream primerek specifikusan kötődnek az egyik DNS-szálhoz, a Z05 pedig meghosszabbítja a primert, és egy második DNS-szál szintetizálódik. Ezzel a véget ér a PCR első ciklusa, a CT DNS és a CT belső kontroll DNS target régiójának kettős szálú DNS-másolatát létrehozva. A reakcióelegyet újbóli melegítésével a kapott kettős szálú DNS szétválik, és szabaddá válnak a primer targetszekvenciák. Az elegy kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A Z05 DNS-polimeráz enzim Mn 2+ és feleslegben lévő dntp-k jelenlétében a primerekre a target templátoknak megfelelő kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS TaqMan 48 analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, ahol az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. A szükséges ciklusok számát a COBAS TaqMan 48 analizátor programja tartalmazza. Az amplifikálás csak a CT kriptikus plazmid és/vagy a kromoszomális ompa primerek közötti régiójában zajlik; a teljes CT kriptikus plazmid vagy kromoszóma nem amplifikálódik. Belső kontroll amplifikálása A PCR-hez hasonló enzimreakción alapuló amplifikálási eljárások során a mintákban gátlóanyagok lehetnek jelen, amelyek csökkenthetik a hatékonyságot. A CT belső kontroll lehetővé teszi az olyan feldolgozott minták azonosítását, amelyekben a PCR amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. A CT belső kontroll egy nem fertőző, rekombináns plazmid DNS a C. trachomatis targetszekvenciával identikus régiókhoz kötődő primerrel, a C. trachomatis targetszekvenciához hasonló hosszúságú és bázisösszetételű random belső szekvenciával, és egy egyedi próbához kötődő régióval, amely elkülöníti a CT belső kontrollt a target amplikontól. Ezeket a jellemzőket azért választották ki, hogy biztosítsák mind a CT belső kontroll, mind a C. trachomatis target DNS ekvivalens amplifikálását. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 tartalmazza a CT belső kontroll reagenst, és a reagens a mintából származó DNS-sel való egyidejű amplifikálás céljából minden egyes amplifikálási reakcióhoz hozzáadandó. A CT belső kontrollt annak garantálására tervezték, hogy a minták nem tartalmaznak gátló anyagokat, amelyek a C. trachomatis (Poisson analízissel meghatározott) 20 feletti kópiaszámban való amplifikálását és detektálását zavarnák. Szelektív amplifikálás A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracil- N-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 9, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, mivel a master mix reagens a dntp-k egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; így csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti mangán okozta aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridincsoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le az amplifikálás során képződött targetamplikont. PCR-termékek kimutatása COBAS TaqMan vizsgálat során A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 valós idejű 10,11 PCR-technológiát alkalmaz. A kettősen jelölt fluoreszcens próbák használata lehetővé teszi a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A CT kriptikus plazmidra, a CT ompa génre és a CT belső kontrollra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0-ban a CT kriptikus plazmid és az ompa próbák ugyanazt a fluoreszcens jelzőfestéket használják, a CT belső kontroll próba pedig a kriptikus plazmid és az ompa próbákétól eltérő fluoreszcens jelzőfestékkel van jelölve. Amíg a fluoreszcens festékkel kettősen jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája a Förster-féle energiatranszfer jelenség révén a blokkoló festék közelsége miatt gátolt. A PCR során a próbák hibridizálnak a saját targetszekvenciájukkal, és az 5-3 nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS polimeráz hasítja azokat. Amikor a jelző és gátló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfestékek 2

fluoreszcens aktivitása megnő. A CT kriptikus plazmid és/vagy az ompa target DNS amplifikálásának mérése a CT belső kontrollétól függetlenül és különböző hullámhosszon történik. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden egyes ciklusban jelentősen növelve az adott jelzőfestékek emissziós intenzitását, ezáltal lehetővé téve a CT DNS és a CT belső kontroll DNS független azonosítását. REAGENSEK AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit CT/NG PREP 100 teszt AMPLICOR CT/NG minta-előkészítő készlet (P/N: 20759414 122; ART: 07 5941 4; US: 83315) CT/NG URINE WASH 1 x 50 ml (CT/NG vizelet mosópuffer) trisz-hcl puffer 300 mm nátrium-klorid < 0,1% detergens 0,09% nátrium-azid CT/NG LYS 1 x 25 ml (CT/NG roncsoló reagens) trisz-hcl puffer < 1% oldószer 0,09% nátrium-azid CT/NG DIL 2 x 50 ml (CT/NG minta oldószer) trisz-hcl puffer 6 mm magnézium-klorid < 25% detergens 0,05% nátrium-azid COBAS TaqMan CT Test, v2.0 CTM CT v2.0 48 teszt (P/N: 05055202 190) Kontroll reagensek CT IC 3 x 0,1 ml (CT belső kontroll) trisz-hcl puffer 8 kópia/µl nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely C. trachomatis primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próba kötő régiót tartalmaz, mely körülbelül 20 IC kópia/teszt mennyiséggel egyenértékű < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) EDTA amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid CT (+) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis (+) kontroll, v2.0] trisz-hcl puffer 8,6 kópia/µl nem fertőző plazmid DNS (szintetikus), amely körülbelül 20 kópia/teszt mennyiséggel egyenértékű C. trachomatis szekvenciát tartalmaz < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid CT ( ) C, v2.0 1 x 0,75 ml [C. trachomatis ( ) kontroll, v2.0] trisz-hcl puffer < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid 3

Amplifikációs és kimutatási reagensek CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT master mix, v2.0) tricin puffer kálium-hidroxid kálium-acetát glicerin < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% CT kriptikus plazmid és CT ompa upstream és downstream primerek < 0,001% CT kriptikus plazmidra, CT ompa génre és a CT belső kontrollra specifikus fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próba < 0,001% aptamer < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid CT Mn 2+ (COBAS TaqMan CT mangánoldat) < 1,0% mangán-acetát jégecet 0,09% nátrium-azid 3 x 0,75 ml 3 x 0,2 ml FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA. B. Ebben a tájékoztatóban a kópia kifejezés a C. trachomatis target nukleinsavjának 1 kópiáját jelenti. Egy (1) kópia ekvivalens a C. trachomatis target nukleinsavjának azzal a legkisebb mennyiségével, amely pozitív PCR-teszteredményt ad. C. Ez a teszt kizárólag endocervicalis minták és vizeletminták vizsgálatára alkalmas. Nem alkalmas torokból, végbélből vagy máshonnan származó minták vizsgálatára. D. Ne pipettázzon szájjal. E. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos gumikesztyűt, köpenyt és szemvédőt a minták és tesztreagensek kezelése alatt. A minták és tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. F. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális szennyeződését. G. Steril, egyszer használatos pipetták és pipettahegyek használata javasolt. H. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. I. Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket. J. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. K. Ne használja a készletet a lejárati idő után. L. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában. M. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. Az adott preamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket tilos más műveletekhez használni, vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell cserélni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos a minta-előkészítési műveletekhez használni, illetve amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. N. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 12 és az CLSI Document M29-A3 13 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő felel meg 0,5%-os nátriumhipoklorit oldatnak. 4

O. M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben szállított minták esetén a minta inokuláció szemmel látható bizonyságául a mintavételező tamponokat a transzport csőben kell hagyni. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 klinikai értékelését olyan minták használatával végezték, amelyeket az M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeges csőben lévő tamponnal együtt transzportáltak. M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben, mintavételező tampon nélkül transzportált mintákat nem kiértékeltek, és használatuk ehhez a vizsgálathoz nem javasolt. P. A vizeletminták 24 órát meghaladó tárolása szobahőmérsékleten (15 30 C) a minta bomlását eredményezheti. Szobahőmérsékleten(15 30 C) 24 óránál hosszabb ideig tárolt vizeletmintákat nem szabad a vizsgálatra felhasználni. Q. A CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT MMX, v2.0, CT Mn 2+, CT IC, CT (+) C, v2.0 és CT ( ) C, v2.0 nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel reakcióba léphet, erősen robbanékony fém-azidokat képezve. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót az azidlerakódás megakadályozására. R. A minták kifröccsenését és a keresztszennyeződését megelőzendő a minta- és kontrollelőkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. S. Viseljen szemvédőt, köpenyt és egyszer használatos gumikesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. Ezen reagenseket kiömlés esetén a szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A reagenseket és kontrollokat ne fagyassza le. A. A CT/NG LYS 2 25 C-on tárolandó. A CT/NG URINE WASH és CT/NG DIL 2 8 C-on tárolandó. Ha tárolás közben bármelyik reagensben csapadék képződik, használat előtt melegítse szobahőmérsékletre (15 30 C) és erőteljesen keverje fel. Ezek a reagensek a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. B. A CT MMX, v2.0; CT Mn 2+, CT (+) C, v2.0; CT ( ) C, v2.0 és CT IC 2 8 C között tárolandó. Ezek a reagensek a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. C. A részben felhasznált kontrollok 2 8 C között tárolandóak két gépi ciklus között. Használat előtt ellenőrizze a bontott kontrollok lejárati idejét. A CT (+) C, v2.0 és CT ( ) C, v2.0 reagensek legfeljebb három alkalommal használhatóak fel CT (+), v2.0 és CT ( ), v2.0 kontrollok készítésére. D. A CT MMX, v2.0; CT Mn 2+ és CT IC 16 reakcióra elegendő, egyszer használatos csövekben vannak. Felbontást követően a fel nem használt anyagot ki kell dobni. E. A master mix munkareagenst (CT Mn 2+ és CT IC reagenseket adva a CT MMX, v2.0 reagenshez) szobahőmérsékleten (15 30 C) sötétben legfeljebb 2 óra hosszat, illetve 2 8 oc-on legfeljebb 16 óra hosszat lehet tárolni. Az előkészített mintákat és kontrollokat a szobahőmérsékleten (15 30 C) tartott master mix munkareagenshez annak elkészítésétől számított 2 órán belül, a 2 8 C-on tartott master mix munkareagenshez pedig 16 órán belül hozzá kell adni. F. A feldolgozott minták 15 30 C-on legfeljebb 2 órán át, 2 8 C-on legfeljebb 7 napig stabilak. G. Az amplifikálást a minták és a kontrollok master mix munkareagenshez való hozzáadásától számított 90 percen belül meg kell kezdeni. A KÉSZLET TARTALMA Minta-előkészítő reagensek A. AMPLICOR CT/NG Specimen Preparation Kit AMPLICOR CT/NG minta-előkészítő készlet (P/N: 20759414 122; ART: 07 5941 4; US: 83315) CT/NG LYS (CT/NG roncsoló reagens) CT/NG URINE WASH (CT/NG vizelet mosópuffer) CT/NG DIL (CT/NG minta oldószer) CT/NG PREP 5

Amplifikációs és kimutatási reagensek B. COBAS TaqMan CT Test, v2.0 (P/N: 05055202 190) CT IC (CT belső kontroll) CT (+) C, v2.0 [C. trachomatis (+) kontroll, v2.0] CT ( ) C, v2.0 [C. trachomatis ( ) kontroll, v2.0] CT MMX, v2.0 (COBAS TaqMan CT master mix, v2.0) CT Mn 2+ (COBAS TaqMan CT mangánoldat) CTM CT v2.0 SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver COBAS TaqMan 48 analizátor AMPLILINK szoftver Az AMPLILINK szoftverhez készült adatállomás COBAS TaqMan 48 analizátor Felhasználói kézikönyv az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra AMPLILINK szoftver 3.2 verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, COBAS TaqMan analizátorral, COBAS TaqMan 48 analizátorral és COBAS AMPLICOR analizátorral való együttes használatra K-cső kupakrögzítő COBAS TaqMan 48 analizátor K-hordozó COBAS TaqMan 48 analizátor K-tálca hordozó Mintavétel és transzport M4RT MicroTest BL KIT Ref. 12620 gyártója és terjesztője a Remel, Inc. Ez a termék a Roche rendszerén keresztül is megrendelhető (P/N: 04863607190). Polipropilén, tartósítószermentes vizeletgyűjtő tartályok Egyszer használatos anyagok K-csövek COBAS TaqMan 48 analizátor K-tálcák EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Eppendorf Repeater pipetta 1,25 ml Eppendorf Combitip tartállyal (steril, egyenként csomagolt) Vortex keverő Pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100) vagy ekvivalens 2,0 ml polipropilén csavarókupakos csövek, steril, nem szilikonozott, kúpos (Sarstedt 72.693.105 vagy ekvivalens)** Csőtartó állványok (Sarstedt 93.1428 vagy ekvivalens) Pipettorok (50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl és 1000 µl térfogatú)* szűrős (aeroszolbarrieres) vagy pozitív kiszorításos (dugattyús) hegyekkel Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, vagy ekvivalens Kiterjesztett szűrővel ellátott hegyek (Matrix 7055 vagy ekvivalens) az M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben transzportált mintákhoz (M4RT MicroTest BL KIT) 37 C ± 2 C fűtőblokk Szűrőpapír Egyszer használatos gumikesztyűk, púdermentes * A pipetták pontossága a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Szűrős vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes (illetve nukleáz-mentes) pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető a minta és az amplikon keresztszennyeződésének megelőzése. ** A minta és a kontroll előkészítéséhez csavarókupakos csöveket kell használni, megelőzendő a minták és kontrollok kifröccsenését és az esetleges keresztszennyeződést. Ne használjon pattintókupakos csöveket. 6

MINTAVÉTEL, TRANSZPORT ÉS TÁROLÁS MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. Kizárólag az alábbi minták elfogadhatóak: 1. Vizeletminták (férfi és női), tiszta polipropilén tartályokban szállítva. Tartósítószert tartalmazó tartályokba gyűjtött vizeletmintákat ne használjon. 2. M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegbe gyűjtött és abban szállított endocervicalis tamponos minták. A megbízható vizsgálati eredmények érdekében kövesse az alábbi utasításokat a megfelelő mintavételezésre vonatkozóan. Ehhez a vizsgálathoz nem szabad torok, végbél vagy egyéb nem javasolt mintát használni. A laboratóriumi vizsgálatra kerülő minták jó minőségének biztosítása érdekében a vizelet és az endocervicalis tamponos mintákat a lehető legrövidebb időn belül a laboratóriumba kell szállítani. Nem szabad a mintákat szabályozott hőmérsékleti körülmények biztosítása nélkül szállítani. A. Mintavétel Vizeletminták (férfi és női) MEGJEGYZÉS: A betegnek nem szabad a mintavételezést megelőző 2 órában vizelnie. 1. Gyűjtsön 10-50 ml elősugár vizeletet (a vizeletáram első részét) egy tiszta, tartósítószert nem tartalmazó polipropilén tartályba. 2. Zárja le a tartályt, és lássa el megfelelő jelöléssel. Kövesse a laboratóriumi mintavételezési és szállítási eljárást. A minta a vizsgálati helyre szobahőmérsékleten (15 30 C) szállítható. M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegbe gyűjtött tamponos minták (női) 1. Endocervicalis tamponos minták 3 ml-es M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegbe gyűjthetőek és szállíthatóak. Alkalmazza az ajánlott módszereket hengerhám és laphám-hengerhám sejtek nyerésére a cervicalis nyák eltávolítását követően 14. 2. Csak dakron, műselyem vagy kalcium-alginát végű, műanyag- vagy alumíniumtól eltérő fém pálcás mintavételező tampont használjon. Ne használjon fa- vagy alumínium pálcás mintavételező tampont. 3. Hagyja a tamponokat a transzport tápközegben. Zárja le a tartályt, és lássa el megfelelő jelöléssel. Kövesse a laboratóriumi mintavételezési és szállítási eljárást. A minta a vizsgálati helyre szobahőmérsékleten (15 30 C) szállítható. B. Minta szállítása Vizeletminták (férfi és női) 1. A vizeletminták a vizsgálati helyre 15 30 C-on szállíthatóak. A vizeletminták 15 30 C-on 24 órán belül stabilak. 2. Eltérő helyszínen lévő vizsgálati centrumokba szállítandó vizeletmintákat olyan éjszakai kézbesítéssel kell megoldani, ahol garantált a 24 órán belüli megérkezés; a szállítás 15 30 C-on történhet. Ha a vizeletmintákat 15 30 C-on szállítják, akkor a szállítást megelőzően 2 8 C-on kell tárolni azokat annak biztosítására, hogy a 15 30 C-on való tárolás ne haladja meg a 24 órát. A minták szállítása meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó valamennyi helyi, állami és országos szabályozásnak 15. M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegbe gyűjtött tamponos minták (női) 1. A tamponos minták a vizsgálati helyre 15 30 C-on szállíthatóak feltéve, ha 15 30 C-on a tárolás és szállítás összideje kevesebb, mint 14 nap. Ha a tamponos minták szállítása a laboratóriumba a levételtől számítva több, mint 14 napig tolódna, akkor a mintákat tegye hűtőszekrénybe. Tenyésztési szándék esetén a mintákat a tenyésztésre vonatkozó javaslatok szerint kell kezelni (-60 C, ha 24 órán belül nincs leoltva). 2. Eltérő helyszínen lévő vizsgálati centrumokba szállítandó tamponos mintákat a levételt követően 15 30 C-on kell szállítani a tamponos minták transzportjára vonatkozó laboratóriumi eljárásoknak megfelelően. A minták szállítása meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó valamennyi helyi, állami és országos szabályozásnak 15. C. Minta tárolása MEGJEGYZÉS: A minták rutinszerű lefagyasztása vagy hosszú távú tárolása befolyásolhatja a vizsgálat eredményességét. Vizeletminták (férfi és női) A mintavételtől számított 24 órán belül fel nem dolgozott vizeletmintákat 2 8 C-on kell tárolni, és a mintavételtől számított 7 napon belül fel kell dolgozni. A mintavételtől számított 7 napon belül fel nem dolgozott minták -20 C vagy az alatti hőmérsékleten legfeljebb 30 napig tárolhatók. 7

M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegbe gyűjtött tamponos minták (női) Azokat a tamponos mintákat, amelyeket megérkezésükkor a vizsgáló laboratórium nem tesztel azonnal, 15 30 C-on kell tárolni, és 14 napon belül fel kell dolgozni. A mintavételtől számított 14 napon belül fel nem dolgozott tamponos mintákat -20 C-on vagy az alatti hőmérsékleten kell tárolni, és a mintavételtől számított 30 napon belül fel kell dolgozni. HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: A részletes üzemeltetési utasításokért, az eredmények kinyomtatásáért és a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: COBAS TaqMan 48 analizátor felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 verziójú sorozatával való használathoz, és az AMPLILINK szoftver 3.2 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan analizátor, COBAS TaqMan 48 analizátor és COBAS AMPLICOR analizátor használatához. MEGJEGYZÉS: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt szobahőmérsékletűnek kell lennie (15 30 C); legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a tároló 2 8 C-ról. MEGJEGYZÉS: A tamponos és vizelet mintákat felhasználás előtt 15-30 percig hagyni kell, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet (15 30 C). MEGJEGYZÉS: Ahol előírt, használjon szűrős vagy pozitív kiszorításos hegyeket a pipettákhoz. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi COBAS TaqMan CT Test, v2.0 készlet elegendő reagenst tartalmaz három darab 16 mintás futtatáshoz, amelyek külön-külön vagy párhuzamosan is kivitelezhetőek. Valamennyi, legfeljebb 48 mintát és kontrollt tartalmazó futtatásnak egy CT ( ) C, v2.0 kontrollt és egy CT (+) C, v2.0 kontrollt kell tartalmaznia (lásd Minőség-ellenőrzés fejezet). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 16 tesztre elegendő egyszer használatos fiolákban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat 16 többszörösének megfelelő tételekben ajánlott feldolgozni. A minta-előkészítő reagensek külön, 100 tesztre elegendő üvegekben vannak. Minta és kontroll előkészítése A. Munkaterület a minta előkészítéshez: Preamplifikálási Minta-előkészítő terület Vizeletminták (férfi és női) 1. Minden egyes betegminta számára jelöljön meg egy-egy 2,0 ml-es csavarókupakos csövet. 2. Mérjen 500 µl CT/NG URINE WASH puffert minden egyes megcímkézett csőbe. 3. Vortexelje a vizeletet alaposan (3-10 másodpercig). Fagyasztott minták felhasználásához vortexelés előtt olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten (15 30 C) (2 ml-nél nagyobb térfogatokat egy éjszakán át olvadni kell hagyni 2 8 C-on); folytassa a feldolgozást akkor is, ha csapadékos a minta. Óvatosan távolítsa el a vizeletminta-tartályok kupakjait. Ügyeljen a gumikesztyűk kupakokban levő vizelettel való szennyezésének elkerülésére. Ha mégis előfordulna szennyeződés, akkor a következő mintára való továbblépés előtt cserélje le a kesztyűket egy tiszta párra. 4. Mérjen minden egyes jól megkevert beteg vizeletmintából 500 µl-t a megjelölt CT/NG URINE WASH puffert tartalmazó csőbe. Használjon új szűrős hegyet minden egyes mintához. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és vortex segítségével keverje meg alaposan azokat. 5. Inkubálja a csöveket 15 percig 37 C-on. 6. Centrifugázza 12 500 x g-n 5 percig. 7. Öntse le a felülúszót, és itassa ki az egyes csöveket egy-egy szűrőpapírlapon. 8. Használjon új szűrős hegyet minden egyes minta esetén, és mérjen minden csőbe 250 µl CT/NG LYS reagenst. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és vortex segítségével keverje meg alaposan azokat. 9. Inkubálja a csöveket 15 percig szobahőmérsékleten (15 30 C). 10. Használjon új szűrős hegyet minden egyes minta esetén, és mérjen minden csőbe 250 µl CT/NG DIL oldószert. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és vortex segítségével keverje meg alaposan azokat. 11. Centrifugázza a csöveket 12 500 x g- 10 percig. 12. A feldolgozott mintákat legfeljebb 2 óra hosszat lehet szobahőmérsékleten (15 30 C) tartani azt megelőzően, hogy master mix munkareagenst tartalmazó K-csövekbe mérné azokat. A maradék feldolgozott mintákat, melyeket 2 órán belül nem mér be a K-csövekbe vagy K-tálcákba, 2 8 C-on tárolja. A 2 8 C-on tárolt feldolgozott mintákat 7 napon belül le kell mérni. 8

Tamponos minták MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 klinikai értékelését M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeggel végezték. Más transzportközeg használatát a laboratóriumnak kell kiértékelni. 1. Ellenőrizze, hogy a M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeges cső tartalmazz-e tampont. A tamponokat a M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeges csőben kell hagyni a hibás kezelés elkerülése végett. A mintavevő tampon jelenléte az M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeges csőben nem bizonyítja a megfelelő mintavételt. 2. Minden egyes betegminta számára jelöljön meg egy-egy 2,0 ml-es csavarókupakos csövet. Ne használjon pattintókupakos csöveket. 3. Mérjen 100 µl CT/NG LYS reagenst a megjelölt 2 ml-es polipropilén csövekbe. 4. Keverje össze a mintákat vortexszel. Fagyasztva tárolt minták esetén olvassza fel azokat szobahőmérsékleten (15 30 C) vortexelés előtt. Óvatosan távolítsa el a mintacsövek kupakjait. Ügyeljen a kesztyűk szennyeződésének elkerülésére. Ha mégis előfordulna szennyeződés, akkor a következő mintára való továbblépés előtt cserélje le a kesztyűket egy tiszta párra. 5. Használjon új szűrős hegyet, és mérjen 100 µl jól összekevert mintát a megfelelő CT/NG LYS reagenst tartalmazó csőhöz. Használjon új szűrős hegyet minden egyes mintához. Csavarja vissza a csőre a kupakot, és vortex segítségével keverje meg alaposan. 6. Inkubálja a csöveket 10 percig szobahőmérsékleten (15 30 C). 7. Használjon új szűrős hegyet minden egyes minta esetén, és mérjen minden csőbe 200 µl CT/NG DIL oldószert. Csavarja vissza a csőre a kupakot, és vortex segítségével keverje meg alaposan. 8. Inkubálja a csöveket 10 percig szobahőmérsékleten (15 30 C). 9. A feldolgozott mintákat legfeljebb 2 óra hosszat lehet szobahőmérsékleten (15 30 C) tartani azt megelőzően, hogy master mix munkareagenst tartalmazó K-csövekbe vagy K-tálcákba mérné azokat. A maradék feldolgozott mintákat, melyeket 2 órán belül nem mér be a K-csövekbe vagy K-tálcákba, 2 8 C-on tárolja. A 2 8 C-on tárolt feldolgozott mintákat 7 napon belül le kell mérni. B. Kontroll előkészítés munkaterület: Preamplifikálási Minta-előkészítő terület MEGJEGYZÉS: A kontroll munkaoldatokat frissen kell elkészíteni minden nap, mikor vizsgálat történik. A kontroll munkaoldatok a nap során többször felhasználhatóak feldolgozott kontroll oldatok készítésére, de a nap végén ki kell őket dobni. MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 készletben lévő CT (+) C, v2.0 és CT ( ) C, v2.0 reagenseket úgy tervezték, hogy legfeljebb három alkalommal használhatóak fel CT (+), v2.0 és CT ( ), v2.0 kontroll munkaoldatok készítésére. MEGJEGYZÉS: Ha tamponos és vizeletmintákat is vizsgál, akkor mindkét mintatípus számára szükséges egy-egy kontrollszett elkészítése. Kontroll munkaoldatok: Készítse el a következő CT (+), v2.0 és CT ( ), v2.0 kontroll munkaoldatokat. 1. Steril pipettaheggyel ellátott pipetta segítségével mérjen 1 ml CT/NG DIL oldószert mindkét 2 mles csavarókupakos polipropilén csőbe. Feliratozza a csöveket a következőképpen: CT (+), v2.0 kontroll munkaoldat, illetve CT ( ), v2.0 kontroll munkaoldat. 2. Vortexelje a CT (+) C, v2.0 és CT ( ) C, v2.0 csöveket maximum sebességen 5 másodpercig. Óvatosan távolítsa el a csövek kupakját. Ügyeljen a kesztyűk szennyeződésének elkerülésére. Ha mégis előfordulna szennyeződés, akkor a továbblépés előtt cserélje le a kesztyűket egy tiszta párra. 3. Új szűrős heggyel ellátott pipettával mérjen 100 µl CT (+) C, v2.0 kontrollt a CT (+), v2.0 kontroll munkaoldat jelzésű csőbe. Csavarja vissza a kupakot, és tárolja a CT (+) C, v2.0 csövet 2 8 C-on. 4. Új szűrős heggyel ellátott pipettával mérjen 100 µl CT ( ) C, v2.0 kontrollt a CT ( ), v2.0 kontroll munkaoldat jelzésű csőbe. Csavarja vissza a kupakot, és tárolja a CT ( ) C, v2.0 csövet 2 8 C-on. 5. Csavarja vissza a kontroll munkaoldatok kupakját, és vortex segítségével keverje meg alaposan. Tárolja szobahőmérsékleten (15 30 C), és a munkanap végén dobja ki azokat. Vizeletminták: Készítse el a következő CT (+), v2.0 és CT ( ), v2.0 feldolgozott kontroll oldatokat. 1. Steril pipettahegyes pipetta segítségével mérjen 250 µl CT/NG LYS reagenst két darab 2 ml-es csavarókupakos polipropilén cső mindegyikébe. Feliratozza a csöveket a következőképpen: CT (+), v2.0 feldolgozott kontroll oldat, illetve CT ( ), v2.0 feldolgozott kontroll oldat. 2. Új szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével mérjen 250 µl CT (+), v2.0 kontroll munkaoldatot a CT (+), v2.0 feldolgozott kontroll oldat címkéjű csőbe. 9

3. Új szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével mérjen 250 µl CT ( ), v2.0 kontroll munkaoldatot a CT ( ), v2.0 feldolgozott kontroll oldat címkéjű csőbe. 4. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és vortex segítségével keverje meg alaposan. Inkubálja a csöveket 10 percig szobahőmérsékleten (15 30 C). Tárolja szobahőmérsékleten (15 30 C), és a munkanap végén dobja ki azokat. Tamponos minták: Készítse el a következő CT (+), v2.0 és CT ( ), v2.0 feldolgozott kontroll oldatokat. 1. Steril pipettahegyes pipetta segítségével mérjen 100 µl CT/NG LYS reagenst két darab 2 ml-es csavarókupakos polipropilén cső mindegyikébe. Feliratozza a csöveket a következőképpen: CT (+), v2.0 feldolgozott kontroll oldat, illetve CT ( ), v2.0 feldolgozott kontroll oldat. 2. Steril pipettahegyes pipetta segítségével mérjen 100 µl M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápoldatot mindegyik CT/NG LYS reagenst tartalmazó csőhöz. 3. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és vortex segítségével keverje meg alaposan. 4. Új szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével mérjen 200 µl CT (+), v2.0 kontroll munkaoldatot a CT (+), v2.0 feldolgozott kontroll oldat feliratú csőbe. 5. Új szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével mérjen 200 µl CT ( ), v2.0 kontroll munkaoldatot a CT ( ), v2.0 feldolgozott kontroll oldat feliratú csőbe. 6. Csavarja vissza a csövekre a kupakokat, és vortex segítségével keverje meg alaposan. Inkubálja a csöveket 10 percig szobahőmérsékleten (15 30 C). Tárolja szobahőmérsékleten (15 30 C), és a munkanap végén dobja ki azokat. Amplifikáció és kimutatás MEGJEGYZÉS: A K-hordozókat és a K-hordozó tartót 70%-os izopropanol oldattal nedvesített, szálmentes ruhával le kell törölni. A. Reagens előkészítése MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan CT master mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), a master mix munkareagens (MMX munkareagens), valamint a feldolgozott mintákat és kontrollokat tartalmazó MMX munkareagens fényérzékeny. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan CT master mix, v2.0 (CT MMX, v2.0), a COBAS TaqMan CT mangánoldat (CT Mn 2+ ) és a COBAS TaqMan CT belső kontroll (CT IC) reagenseket azonos hőmérsékletűre kell hozni legalább 30 percig szobahőmérsékleten (15 30 C) hagyva a master mix munkareagens elkészítése előtt. MEGJEGYZÉS: Az MMX munkareagenst a minta és kontroll előkészítés befejeztével készítse el. MEGJEGYZÉS: Az MMX munkareagenst az elkészítést követően szobahőmérsékleten (15 30 C) hagyva 2 órán belül, 2 8 C-on tárolva 16 órán belül fel kell használni. MEGJEGYZÉS: Ha egyszer a feldolgozott mintákat és kontrollokat a MMX munkareagenshez hozzámérte, az amplifikálást 90 percen belül meg kell kezdeni. 1. Hagyjon egy fiola CT MMX, v2.0, egy fiola CT IC és egy fiola CT Mn 2+ oldatot legalább 30 percig, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet (15 30 C). 2. Helyezzen egy K-hordozót a K-hordozó-tartóba. Helyezzen új K-csöveket a K-hordozóba úgy, hogy ne érjen hozzá a K-csövek falához. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 3. Távolítsa el a K-csövek kupakját, ha rendelkezésre áll, K-cső kupakrögzítő segítségével. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba. 4. Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: 16 teszt esetén mérjen 150 µl CT Mn 2+ és 50 µl CT IC oldatot egy fiola CT MMX, v2.0 reagenshez. Csavarja rá a kupakot az üvegre, és 10-szeri átfordítással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. Védje az MMX munkareagenst a fénytől és az elkészítést követően szobahőmérsékleten (15 30 C) hagyva 2 órán belül, 2 8 C-on tárolva 16 órán belül használja fel. 5. Pipettázzon 50 µl MMX munkareagenst minden K-csőbe, vagy a K-tálca lyukaiba. MEGJEGYZÉS: Az amplifikálást megelőzően fagyasztva tárolt feldolgozott minták esetén olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten (15 30 C), és keverje jól össze vortexszel. A feldolgozott vizeletmintákat centrifugázza 12 500 x g-n 10 percig. MEGJEGYZÉS: Ne érintse hozzá a pipettahegyet semmilyen egyéb felülethez a kívánt K-csövön vagy a K-tálca lyukán kívül az MMX munkareagens adagolása közben. Ha bármilyen érintkezés történt a K-tálca hordozó felületével, a hegyet el kell dobni, hogy elkerülje a PCR inhibitor anyagok bevitelét. 10

6. Mérjen szűrős vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes feldolgozott mintából vagy kontrollból 50 µl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe vagy a K-tálca lyukaiba. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat okozna. MEGJEGYZÉS: Ne érintse hozzá a pipettahegyet semmilyen egyéb felülethez a kívánt K-csövön vagy a K-tálca lyukán kívül a feldolgozott minták és kontrollok adagolása közben. Ha bármilyen érintkezés történt a K-tálca hordozó felületével, a hegyet el kell dobni, hogy elkerülje a PCR inhibitor anyagok bevitelét. 7. Ismételje meg a 6. lépést minden egyes feldolgozott minta és feldolgozott kontroll esetében, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe, vagy a K-tálca megfelelő lyukaiba. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. Fedje le a K-tálcát vagy K-cső kupakrögzítő segítségével tegye fel a K-csövek kupakját. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek-e összemérve. 8. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe vagy K-tálca lyukaiba való bemérésétől számított 90 percen belül meg kell kezdeni. 9. A feldolgozott minták maradékát 2 8 C-on tárolja arra az esetre, ha a vizsgálatot meg kellene ismételni. Bármilyen ismételt vizsgálatot a minta előkészítéstől számított 7 napon belül el kell végezni. B. A COBAS TaqMan 48 analizátor betöltése és működtetése 1. Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Windows XP-be a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval. 2. Kapcsolja be a COBAS TaqMan 48 analizátort. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatás(ok)ból K-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó szállító segítségével. 3. Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be. 4. Hogy megadja a K-hordozó vizsgálandó mintáinak sorrendjét, kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson az New gombra és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be minden minta sorszámát. Válassza a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 vizsgálatdefinícióját. Ismételje meg minden minta esetében. Kattintson a Save gombra. MEGJEGYZÉS: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5. A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlethez biztosított COBAS TaqMan CT Test, v2.0 vizsgálatra vonatkozó adatokat. Adja meg a megfelelő mezőkbe a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 tételszámát, lejárati dátumát, az alacsony (+) kontroll tartományát, valamint a kalibrációs együtthatókat. Kattintson az OK gombra. 6. Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A K-Carrier ID jobb oldalán lévő cellába a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével adja meg a K-hordozón lévő vonalkódból a K-hordozó számot. Ne feledje, hogy az ugyanezen K-hordozó azonosítóhoz rendelt korábbi futtatás eredményeit el kell fogadni. Azt követően, hogy ugyanazon K-hordozó vonalkódszám kétszer került felhasználásra egyetlen készüléken, annak a mintacsoportnak az eredményeit el kell fogadni, archiválni és törölni mielőtt ugyanaz a vonalkódszám újra használható lenne. Válassza ki a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 vizsgálatdefinícióját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből. 7. A Worklist munkalistában jelölje ki a Type (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Majd a következő sorhoz kattintson kétszer a mintaazonosító mezőre. A LookUp Control ablak megjelenik valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő kalibrációs és kontroll értékek megjelennek a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén. 8. Ha mintákat akar megadni a Worklist munkalistára, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta beviteléhez. Meg fog jelenni a hozzárendelt mintasorrendet tartalmazó Lookup Sample ablak. Egynél több sorszám kijelölését a Shift + Nyíl gombokkal végezheti el. Ellenőrizze, hogy minden sorrendhez a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 vizsgálatdefiníciója van-e hozzárendelve. 9. A K-hordozóhoz rendelt sorszámok mentéséhez kattintson a Save gombra. 11

C. Amplifikáció és kimutatás 1. Válassza ki a System fül Systems ikonját; a PCR-készülék kinyitásához kattintson az Open gombra. Ha a PCR-készülék teteje teljesen nyitva van, és a Systems ablakban a Ready to Load (betöltésre kész) felirat látható, emelje fel és nyissa ki a PCR-készülék fedelét. A K-hordozó transzporter segítségével vigye át a kupakkal lezárt master mix munkareagenst és mintákat, illetve kontrollokat tartalmazó K-csövekkel, vagy K-tálcával betöltött K-hordozót a PCR-készülékbe. Csukja le a készülék fedelét. 2. A PCR-készülék tetejének zárásához és a futtatás elindításához kattintson a Start gombra a Systems ablakban a TC ikon alatt. 3. A COBAS TaqMan 48 analizátor az amplifikálást és kimutatást automatikusan elvégzi. EREDMÉNYEK Eredmények kiszámítása A COBAS TaqMan 48 analizátor automatikusan meghatározza, hogy kimutatható-e CT DNS a mintából vagy a kontrollból. A COBAS TaqMan 48 analizátor: Meghatározza a CT DNS és a CT belső kontroll DNS ciklus küszöbértékét (Ct). Meghatározza, hogy van-e kimutatható CT DNS a CT DNS és a CT belső kontroll küszöbértékek alapján. Futtatás validálása Ellenőrizze az AMPLILINK szoftver v3.2 eredményablakában vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás értékelhető(valid)-e. A futtatás akkor értékelhető, ha a COBAS TaqMan CT kontrollok, v2.0 egyikénél sem jelenik meg jelző. Egy értékelhető futtatásnál a következő eredmények fordulhatnak elő: Kontroll Eredmény Magyarázat Negatív kontroll Target Not Detected Kontroll a tartományon belül Pozitív kontroll 1 Positive Kontroll a tartományon belül A futtatás nem érvényes, ha a COBAS TaqMan CT kontrollok, v2.0 az alábbi jelzők bármelyikét kapják: CT negatív kontroll, v2.0: Jelző Eredmény Magyarázat _N_NC_INVALID Invalid Szennyeződés, vagy nincs IC-jel CT pozitív kontroll, v2.0: Jelző Eredmény Magyarázat _L_LPC_INVALID Invalid Kontroll a tartományon kívül, nincs targetjel vagy IC-jel Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes futtatást (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás). 12

Eredmények értelmezése: Értékelhető futtatáshoz ellenőrizzen minden mintát az eredménylapon, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést. Az alábbiak szerint értelmezze az eredményeket : Egy értékelhető futtatás mind értékelhető, mind nem értékelhető mintaeredményeket is tartalmazhat, az egyes mintákra vonatkozó jelzőktől és/vagy megjegyzésektől függően. A mintaeredmények az alábbiak szerint értelmezendőek: Jelző Eredmény Magyarázat Nincs jelző Target Not Detected C. trachomatis DNS nem kimutatható. A minta feltételezhetően negatív C. trachomatis-ra. A negatív eredmény nem zárja ki a C. trachomatis-fertőzés jelenlétét, mivel az eredmény a megfelelő mintavételen, a gátlóanyagok hiányán és az elegendő mennyiségű kimutatható DNS jelenlétén is múlik. Nincs jelző 1 Positive C. trachomatis DNS kimutatható. A minta pozitív vagy C. trachomatis-ra. > 1 Positive _Q_RFITOOLOW > 1 Positive C. trachomatis DNS kimutatható. A minta pozitív C. trachomatis-ra. _Q_QS_INVALID Invalid Gátolt minta. C. trachomatis DNS, ha jelen is van, nem kimutatható. Az eredeti minta egy másik részletével ismételje meg a vizsgálatot. A gátlóanyagok gyakran labilisak, és az eredetileg ilyen tartalmú minták az ismétléskor már nem mutatnak gátlást. Ha az eredeti minta nem elérhető, új mintát kell venni. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi futtatásnak egy COBAS TaqMan CT ( ) kontrollt, v2.0 és egy COBAS TaqMan CT (+) kontrollt, v2.0 kell tartalmaznia. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében, a vizsgálatot végző fontolja meg további kontrollok használatát minden alkalommal addig, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Nincs előírás a kontrollok K-hordozóban való elhelyezkedését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a futtatás értékelhetőségéről. Negatív kontroll A CT ( ) C, v2.0 kontrollnak Target Not Detected eredményt kell adnia, azaz a CT DNS kritikus küszöbérték meghaladta a vizsgálat korlátait, vagy nincs CT DNS küszöbérték, ugyanakkor a CT belső kontroll DNS érvényes küszöbértékkel rendelkezik. Ha a CT ( ) C, v2.0 kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a CT ( ) C, v2.0 kontroll következetesen nem érvényes, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével. Pozitív kontroll A CT (+) C, v2.0 kontrollhoz tartozó kijelölt tartomány a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 adatkártyán van feltüntetve. Az CT (+) C, v2.0 kontroll értéke bele kell, hogy essen a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 adatkártyán feltüntetett tartományba. Ha a pozitív kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a pozitív kontroll eredménye rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche irodától. A CT (+) kontroll, v2.0 megközelítően 20 kópia/teszt C. trachomatis plazmid DNS szekvenciát tartalmaz. Ez körülbelül a vizsgálat Poisson-analízissel meghatározott alsó kimutatási szintjének a négyszerese. A CT (+) kontroll, v2.0 amplifikálása és kimutatása biztosítja, hogy az amplifikálás megtörtént. A CT (+) kontroll, v2.0 ugyanakkor nem mutatja az amplifikálás hatékonyságát vagy a vizsgálat kimutatási szintjét. Belső kontroll A belső kontroll feladata a polimeráz inhibitorokat tartalmazó minták azonosítása. A belső kontroll használata ugyanakkor nem zár ki minden álnegatív vizsgálati eredményt. 13

ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas analitikai érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szigorúan ellenőrizni kell. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. Csak a jelzett mintatípusokat vizsgálja. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 klinikai értékelése M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegbe levett női endocervicalis tamponos mintákkal, valamint tartósítószer nélkül gyűjtött női és férfi vizeletmintákkal történt. Más típusú minták vizsgálatát nem értékelték, és az álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat. 2. A C. trachomatis kimutatása a mintában jelen lévő organizmusok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, STD az anamnézisben, tünetek megléte), a fertőzés stádiuma és/vagy a fertőző C. trachomatis törzs. 3. Álnegatív eredmények polimerázgátlás miatt is előfordulhatnak. A CT belső kontroll azért lett hozzáadva a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 vizsgálathoz, hogy lehetővé tegye az olyan feldolgozott minták azonosítását, amelyekben a 20 kópia/tesztnél nagyobb PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. 4. A chlamydia infekció előfordulási gyakorisága egy populációban hatással lehet a vizsgálat eredményességére. A pozitív prediktív értékek csökkennek, amikor alacsony előfordulási gyakoriságú populációkat vagy fertőzési kockázattal nem rendelkező egyéneket vizsgálnak. Mivel a C. trachomatis előfordulása egyes populációkban, illetve betegcsoportokban alacsony lehet, a 4-5%-os álpozitivitási arány meghaladhatja a valódi pozitivitás arányát, és így egy pozitív teszt prediktív értéke nagyon alacsony. Miután egyes valóban fertőzött betegek nem kerülnek felismerésre egyetlen minta vizsgálatával, az álpozitívok tényleges arányát nem lehet meghatározni vagy megjósolni a klinikai adatokból. Az álpozitív vizsgálati eredmények aránya függhet a képzettségtől, vizsgáló képességeitől, reagenstől és mintakezeléstől, vagy az egyes laboratóriumok hasonló tényezőitől. 5. A megbízható eredmény a mintalevételen, szállításon, tároláson és feldolgozáson múlik. A tárolásból származó eltéréseket nem határozták meg maradéktalanul. 6. Az AmpErase enzim hozzáadása a master mixhez lehetővé teszi a target DNS szelektív amplifikálását; ugyanakkor a reagensek szennyeződésének elkerüléséhez a helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges. 7. A vizsgálat segítségével terápiás siker vagy kudarc nem határozható meg. 8. Mint minden diagnosztikus vizsgálat esetén, a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 eredményeinek értékelését a klinikai és laboratóriumi leletekkel együtt kell megtenni. 9. A terméket a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. 10. A minta megfelelő mivolta (tamponos minták esetén) csak a mintákban lévő hengerhámsejtek mikroszkópos megtekintésével értékelhető. 11. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 nem javasolt nemi erőszak, vagy egyéb igazságügyi orvostani javallatok értékelésére. 12. További vizsgálatok javasoltak bármely olyan esetben, amikor az álpozitív vagy álnegatív eredményeknek káros orvosi, társadalmi vagy pszichológiai következményei lehetnek. 13. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 minőségi eredményeket szolgáltat. Semmilyen korreláció nem állítható fel egy pozitív COBAS TaqMan CT Test, v2.0 könyökértéke és egy fertőzött mintában lévő C. trachomatis sejtek száma között. A vizsgálat csak C. trachomatis kimutatására alkalmas, C. psittaci, C. pneumoniae, és C. pecorum kimutatására nem. 14. Férfi és női vizelet vizsgálata esetén a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 elvégzése elősugár random vizeletmintákon (definíció szerint a vizeletsugár első 10-50 ml-én) javasolt. Egyéb mintavételi lehetőségek, mint például elősugár vs. középsugár, irrigálás utáni stb. mintavétel hatását nem vizsgálták. 15. Más potenciális tényezők, mint a hüvelyfolyás, tamponhasználat, hüvelyöblítés stb., valamint a mintavételi körülmények hatását nem vizsgálták. 16. A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 nem helyettesíti a méhnyak vizsgálatát, és az endocervicalis mintavételt urogenitális fertőzések diagnosztikája céljából. A betegeknek lehet egyéb eredetű cervicitise, urethritise, húgyúti fertőzése vagy hüvelyfertőzése, illetve egyéb ágens okozta társfertőzése. 17. Ez a termék csak COBAS TaqMan 48 analizátorral használható. 18. PCR-inhibitorok jelenléte álnegatív vagy nem értékelhető eredményeket okozhat. 14

19. Zavaró anyagok egyebek között, de nem kizárólag az alábbiak: Nyák jelenléte a cervicalis mintákban gátolhatja a PCR-t, és álnegatív eredményeket okozhat. A vizsgálat optimális kivitelezéséhez nyák-mentes minták javasoltak. Mintavétel előtt távolítsa el a cervicalis váladékot és folyást szivacs vagy egy nagy törlő segítségével 16. Az 1%-nál (v/v) több vért tartalmazó minták álpozitív eredményt adhatnak. 20. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a C. trachomatis a vizsgálat primerei és/vagy próbái által lefedett kriptikus plazmid, illetve kromoszomális DNS-ének nagyfokban konzervált régióiban lévő mutációk következtében a baktérium kimutatása sikertelen lesz. 21. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Analitikai specificitás: A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 specificitását úgy értékelték, hogy sejtkultúrákból, víruskultúrákból, illetve plazmid szerkezetekből származó DNS-t adtak CT/NG mintaelőkészítő reagensekhez, majd azokat és a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 eljárással vizsgálták. A vizsgált organizmusok között sok olyan van, amely az urogenitális traktusból izolálható. Az alább felsorolt organizmusok vagy vírusok között egy sem mutatott reaktivitást a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 vizsgálatban: Achromobacter xerosis Acinetobacter Iwoffi Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter sp. genospecies 3 Actinomyces isrealii Aerococcus viridans Aeromonas hydrophila Agrobacterium radiobacter Alcaligenes faecalis Bacillus thuringiensis Bacillus subtilis Bacteroides fragilis Bacteriodes caccae Bifidobacillus longum Bifidobacterium adolescentis Branhamella catarrhalis Brevibacterium linens Candida albicans Chlamydia psittaci Chlamydia pneumoniae Chromobacter violaceum Citrobacter freundii Clostridium innocuum Clostridium perfringens Corynebacterium genitalium Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Deinococcus radiopugnans Derxia gummosa Epstein-Barr vírus Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus avium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Erysipelothrix rhusiopathiae Escherichia coli Ewingella americana Flavobacterium meningosepticum Lactobacillus acidophillus Lactobacillus brevis Lactobacillus crisptus Lactobacillus lactis lactis Lactobacillus oris Lactobacillus parabuchnerri Lactobacillus vaginalis Lactococcus lactis cremoris Legionella bozemanii Legionella pneumophila Leuconostoc paramesenteroides Micrococcus luteus Moraxella osloensis Morganella morganii Mycobacterium smegmatis Mycoplasma hominis Neisseria elongata Neisseria mucosa Neisseria perflava Neisseria polysaccharea Pasteurella maltocida Pediococcus acidilactica Peptostreptococcus magnus Peptostreptococcus productus Prevotella bivia Prevotella corporis Prevotella intermedia Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Providencia stuartii Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Rahnella aquatilis Salmonella minnesota Salmonella typhimurium Serratia denitrificans Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis 15

Gardnerella vaginalis Gemella haemolysans Gemella morbillorum Haemophilus influenzae Haemophilus ducreyi Herpes simplex vírus 1 Herpes simplex vírus 2 Human papilloma vírus 16-os típus Human papilloma vírus 18-as típus Kingella kingae Klebsiella pneumoniae ss ozaenae Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus bovis Streptococcus dysgalatia Streptococcus equinis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Treponema pallidum Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Analitikai érzékenység: Tisztított DNS Az analitikai érzékenység tisztított DNS-re való meghatározásánál a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 reprodukálhatóan ( 95% pozitív eredmény) képes kimutatni 5 vagy több kópia tisztított C. trachomatis DNS-t PCR reakciónként. Az ebben a kísérletben használt C. trachomatis DNS kópiaszámát Poissonanalízissel határozták meg. Kimutatási határ: nem variáns C. trachomatis sejtek A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 kimutatási határának meghatározása M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben és normál emberi vizeletben tenyésztett C. trachomatis sejtoldatok vizsgálatával történt. Mindkét mátrixtípus esetén legalább 6 független hígítási sorozatot analizáltak. Mindkét mátrixtípus esetén koncentrációnként összesen 144 ismétlést vizsgáltak meg. A negatív szinteket 72 ismétlést végezve vizsgálták. A vizsgálati eredményeket az 1. táblázat tünteti fel, ahol a Probit analízis szerint a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 3,9 IFU/ml vagy nagyobb koncentrációnál a C. trachomatis-t 95%-os vagy nagyobb pozitivitással kimutatja mind M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben, mind vizeletben. A COBAS TaqMan CT Test (v1.0) készüléken végzett párhuzamos vizsgálat igen hasonló Probit eredményeket produkált, a két vizsgálat azonos érzékenységét mutatva. A C. trachomatis tenyészeteiben található zárványtestek eltérő száma miatt az élő C. trachomatis organizmusok száma nincs közvetlen összefüggésben az amplifikálható CT target mennyiségével. 16

1. táblázat A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 kimutatási határa nem variáns C. trachomatis sejtek esetén Mátrix Minta koncentráció (IFU/ml) Minta koncentráció (IFU/PCR) Átlag CT könyök Átlag IC könyök Összes igazolt (n) Pozitív találat % Pozitív M4RT 80 1,0 34,1 35,9 144 144 100% M4RT 8 0,1 37,5 36,2 144 144 100% M4RT 4 0,05 38,6 36,2 144 144 100% M4RT 2 0,025 39,5 36,2 144 134 93,1% M4RT 1 0,0125 40,9 36,3 144 115 79,9% M4RT 0 0 0 36,3 69 0 0% 95% probitérték: 2,0 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum: 1,7 2,6 Mátrix Minta koncentráció (IFU/ml) Minta koncentráció (IFU/PCR) Átlag CT könyök Átlag IC könyök Összes igazolt (n) Pozitív találat % Pozitív Vizelet 20 1.0 36,2 36,0 144 143 99,3% Vizelet 4 0,2 38,1 36,0 144 138 95,8% Vizelet 2 0,1 38,5 36,1 142 120 84,5% Vizelet 1 0,05 39,2 36,1 144 120 83,3% Vizelet 0,5 0,025 40,3 36,1 144 116 80,6% Vizelet 0,25 0,0125 41,0 36,2 144 82 56,9% Vizelet 0,125 0,0063 41,9 36,1 144 55 38,2% Vizelet 0 0 0 36,1 70 0 0% 95% probitérték: 3,9 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum: 2,9 5,9 Kimutatási határ: C. trachomatis nvct (svéd variáns) sejtek A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 kimutatási határának meghatározása M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben és normál emberi vizeletben tenyésztett C. trachomatis nvct sejtoldatok vizsgálatával történt. Mindkét mátrixtípus esetén legalább 6 független hígítási sorozatot analizáltak. Mindkét mátrixtípus esetén koncentrációnként összesen 144 ismétlést vizsgáltak meg. A negatív szinteket 72 ismétlést végezve vizsgálták. A végső Probit eredmény kiigazításához 7-szeres és 10-szeres közötti korrekciós faktort használtak, hogy kompenzálják a targetkópiák különbségeit, ami az ompa gén (1 kópia sejtenként) és a rejtett plazmid (7 10 kópia sejtenként) közötti különbségből adódik. A vizsgálati eredményeket az 2. táblázat tünteti fel, ahol a Probit analízis szerint a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 a C. trachomatis nvct-t (svéd variáns) 36,4 és 52 IFU/ml közötti koncentrációnál M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben (átlagosan 44,2 IFU/ml) és 16,8 és 24 IFU/ml közötti koncentrációnál vizeletben (20,4 IFU/ml) 95%-os vagy nagyobb pozitivitással kimutatja. A C. trachomatis tenyészeteiben található zárványtestek eltérő száma miatt az élő organizmusok száma nincs közvetlen összefüggésben az amplifikálható CT target mennyiségével. 17

2. táblázat A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 kimutatási határa C. trachomatis nvct (svéd variáns) sejtek esetén Mátrix Panelszint (IFU/ml) Panelszint (IFU/PCR) Átlag CT könyök Átlag IC könyök Összes igazolt N Pozitív eset % Pozitív M4RT 80 1,0 35,1 36,2 144 144 100,0% M4RT 8 0,1 38,9 36,3 144 142 98,6% M4RT 4 0,05 40,0 36,3 144 130 90,3% M4RT 2 0,025 40,7 36,2 144 101 70,1% M4RT 1 0,0125 41,8 36,2 144 56 38,9% M4RT 0 0 0 36,1 72 0 0% 95% probitérték (nem korrigált) 5,2 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 4,4 6,7 95% probitérték (target kópiaszám 7-szeres korrekciós faktorral) 95% probitérték (target kópiaszám 10-szeres korrekciós faktorral) 95% probitérték (target kópiaszám átlagolt korrekciós faktorral) 36,4 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 30,8 46,9 52 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 44 67 44,2 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 37,4 57,0 Mátrix Panelszint (IFU/ml) Panelszint (IFU/PCR) Átlag CT könyök Átlag IC könyök Összes igazolt N Pozitív eset % Pozitív Vizelet 20 1,0 35,3 35,9 144 144 100,0% Vizelet 4 0,2 37,7 36,0 144 141 97,9% Vizelet 1 0,05 39,6 35,9 144 121 84,0% Vizelet 0,25 0,0125 40,6 35,9 144 58 40,3% Vizelet 0,125 0,00625 40,7 36,0 143 37 25,9% Vizelet 0 0 0 36,0 72 0 0% 95% probitérték (nem korrigált) 2,4 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 1,8 3,4 95% probitérték (target kópiaszám 7-szeres korrekciós faktorral) 95% probitérték (target kópiaszám 10-szeres korrekciós faktorral) 95% probitérték (target kópiaszám átlagolt korrekciós faktorral) 16,8 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 12,6 23,8 24 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 18 34 20,4 IFU/ml 95% konfidenciaintervallum 15,3 28,9 18

Inkluzivitás A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 képes kimutatni egy IFU/PCR mennyiséget valamennyi C. trachomatis szerovariáns esetén. 15 különböző C. trachomatis szerovariáns mennyiségileg meghatározott ATCC tenyészeteiből készítettek hígításokat M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeggel és normál emberi vizelettel rendre 80 IFU/ml és 20 IFU/ml koncentrációkban. Ezek a koncentrációk mindkét mátrixtípusra nézve 1 IFU/PCR mennyiséget reprezentálnak. Mindegyik szerovariáns esetén mindkét mátrixtípusnak huszonkét (22) ismétlését dolgozták fel COBAS TaqMan CT Test, v2.0 segítségével. Mindkét mátrixtípus esetén mind a 15 szerovariánst 100% pozitivitással kimutatták. Reprodukálhatóság A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 reprodukálhatóságának felmérésére kettő, négy tagból álló mintasorozatot vizsgáltak, az egyiket M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben, a másikat normál emberi vizeletben készítették elő. A mintasorozatok C. trachomatis kvantifikált ATCC tenyészetéből készültek és -80 C fokra lettek fagyasztva. A mintasorozat elemeit úgy készítették, hogy azok CT koncentrációi a klinikai minták tenyészetében potenciálisan előforduló legkisebb C. trachomatis baktériumszámot reprezentálják: 0, 0,5, 1,0 és 1,5 IFU a végső PCR reakcióhoz az M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegű mintákra és 0, 0,5, 1,0 és 2,0 IFU a végső PCR reakcióhoz a vizeletmintákra. A reprodukálhatóságot különböző reagenstételek és készülék (vizsgáló) futtatások segítségével vizsgálták. Valamennyi vizsgáló 5 napos tesztsorozatot végzett három reagenstétel mindegyikével. A tanulmány 2700 eredményét a 3. táblázat foglalja össze a feldolgozott M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegű mintákra és a 4. táblázat a feldolgozott vizeletmintákra. Mindkét mátrix 270 darab CT negatív mintája esetén 100%-ban negatív eredményt kaptak. A teljes reprodukálhatóságot az M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegű és vizeletminták esetén rendre a 3. és 4. táblázat foglalja össze. A vizsgálatban mindkét mátrix esetén valamennyi CT pozitív tag 100%-ban pozitív volt. A CT könyökértékek szórás együtthatója 2,3% vagy kisebb volt M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegű ismétlések esetén, és 4,2% vagy kisebb volt vizelet ismétlések esetén. Ez a vizsgálat kvalitatív eredményeinek jó reprodukálhatóságát mutatja. 3. táblázat Teljes reprodukálhatósági eredmények C. trachomatis sejtekre M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegben CT target IFU/PCR Érvényes ismétlések teljes száma 0 IFU/PCR 0,5 IFU/PCR 1,0 IFU/PCR 1,5 IFU/PCR 270 360 360 360 Pozitív eredmények %-a 0% 100% 100% 100% Átlag CT könyök Minimumérték 0 35,3 34,3 33,7 0 32,5 31,3 31,4 Maximumérték 0 39,1 37,1 37,8 Szórás 0 0,79 0,74 0,79 Variációs koefficiens 0 2,2% 2,2% 2,3% 19

4. táblázat Teljes reprodukálhatósági eredmények C. trachomatis sejtekre vizeletben CT target IFU/PCR Érvényes ismétlések teljes száma 0 IFU/PCR 0,5 IFU/PCR 1,0 IFU/PCR 2,0 IFU/PCR 270 360 360 360 Pozitív eredmények %-a 0% 100% 100% 100% Átlag CT könyök Minimumérték 0 35,7 35,0 33,8 0 34,1 33,2 31,9 Maximumérték 0 41,9 40,3 39,4 Szórás 0 1,02 1,35 1,41 Variációs koefficiens 0 2,9% 3,9% 4,2% Diagnosztikai szenzitivitás, diagnosztikai specificitás és korreláció A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 és a ProbeTec CT Test (Becton Dickinson, Sparks, MD USA) teljesítőképességét hasonlították össze CT fertőzött és egészséges alanyoktól M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegű tamponos és vizeletminták analízisével. A mintákat Svédország azon területein gyűjtötték és vizsgálták, ahol magas a svéd variáns törzs (nvct) prevalenciája. Összesen 758 vizeletmintát (141 archív fagyasztott vizeletminta és 617 frissen gyűjtött vizeletminta) vizsgáltak a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 és a BD ProbeTec ET Test segítségével. Két következetesen invalid mintát eltávolítottak a mintakészletből. A diagnosztikai szenzitivitás vizeletminták esetén 95,7% volt. A diagnosztikai specificitás 99,8% volt, vizeletmintákra a teljes megfelelési arány a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 és a BD ProbeTec ET Test között 98,7% volt (lásd 5. táblázat). Amennyiben nem szerint választották szét a vizelet eredményeket (lásd 6. és 7. táblázat), a diagnosztikai szenzitivitás 95,9% volt a férfi minták és 95,5% a női minták esetében {Fisher egzakt teszt (p-érték ~ 1,0)}, a diagnosztikai specificitás 99,8% volt a férfi minták és 100% a női minták esetében {Fisher egzakt teszt (p-érték ~ 1,0)}, a teljes megfelelési arány pedig 98,8% volt a férfi minták és 98,4% a női minták esetében {Fisher egzakt teszt (p-érték ~ 0,7165)}. A Fisher egzakt teszt nem mutat statisztikailag szignifikáns különbséget a férfi, a női vagy a teljes vizeletminták korrelációjában a két vizsgálati eljárás között. Összesen 413 M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközegű endocervicalis tamponos mintát (mind frissen levett) vizsgáltak a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 és a BD ProbeTec ET Test segítségével. A diagnosztikai szenzitivitás M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeges endocervicalis tamponos minták esetén 96,0% volt. A diagnosztikai specificitás 100% volt, M4RT MicroTest Culture Transport System (Remel, Inc.) tápközeges endocervicalis tamponos mintákra a teljes megfelelési arány (lásd 8. táblázat) a COBAS TaqMan CT Test, v2.0 és a BD ProbeTec ET Test között 99,5% volt. 5. táblázat A COBAS TaqMan CT Test, v2.0 és a BD ProbeTec ET Test eredményeinek összefoglalása egészséges és CT-fertőzött betegek vizeletmintáit vizsgálva Vizelet összes N=758 BD ProbeTec ET Test Pozitív Negatív Összes Pozitív 202 1 203 CTM CT Test, v2.0 Negatív 9 546 555 Összes 211 547 758 Diagnosztikai szenzitivitás = 202/211 = 95,7% (95% CI 92,0%, 98,0%) Diagnosztikai specificitás = 546/547 = 99,8% (95% CI 99,0%, 100,0%) Teljes megfelelés % = 748/758 = 98,7% (95% CI 97,6%, 99,4%) 20