A vesebiopszia standard laboratóriumi vizsgálata Daru Krisztián, Dr. Iványi Béla SZTE ÁOK Pathologiai Intézet Szeged
Mintavétel Intézetek között előre egyeztetett időpontban Percutan biopszia, vese alsó pólusából 16 G-s tűvel, UH-vezérelt biopsziás pisztollyal Minta tűről történő kíméletes eltávolítása - fiziológiás sóoldatos lemosással Legalább két szövethenger vétele az elegendő glomerulusszám biztosítására Asszisztens sztereomikroszkóp alatt ellenőrzi és osztja a mintát a mintavétel helyén
Glomerulus sztereomikroszkópos jellemzői Halványabb kéregállomány, sötétebb velőállomány Glomerulusok kapillárisgomolyagból álló apró vörös foltok Egyes betegségekben sárgás foltok Anémiás glomerulusok színtelenek, nehezen észrevehetőek
Glomerulusok száma Minimum 20 gl/biopszia a reprezentatív Optimális a szövethenger felosztása, ha: FM legalább 12 gl IF 5 gl EM 3 gl Vesebiopszia - kéregállomány
Szövethengerek osztása I. Fiziológiás sóoldattal átitatott szűrőpapíron Éles, egyszer használatos pengével kíméletes, határozott vágási felszínek Perirenális zsírszövet, vesetok eltávolítása Háromféle vizsgálatnak megfelelően
Szövethengerek osztása II.
Mintavételi hibák Klimatizált szobában a minta kiszáradhat Szükség szerint fiziológiás sóoldattal nedvesítsük meg a mintát a felosztási procedúra alatt A minta mechanikailag sérülhet csipesszel történő összenyomás miatt Nedves csipeszen lévő vékony folyadékréteg segítségével vegyük fel a mintákat
Immunhisztokémiai vizsgálat Rutinszerűen: IF technika fagyasztott mintából Speciális esetben: IPO technika paraffinba ágyazott mintából Kis mennyiségű biopsziás minta fagyasztás nem készül Nem áll rendelkezésre fagyasztott minta paraffinos konzultációs blokk esetében
Immunfluoreszcens technika Fixálás: fagyasztással folyékony nitrogénben Metszés: kriosztátban, -20 C -on, 4 µm vastag sorozatmetszetek; a minta teljes elfaragása Metszetek tárgylemezen való rögzítése: szárítással, 37 C -os termosztátban Rehidrálás: 0.1 M, ph 7.2 sós foszfát pufferben Inkubálás antitesttel Mosás PBS-ben Fedés zselatin glicerinnel
Minta fagyasztása Kriosztát tárgyasztalára, annak felszíni síkjával párhuzamosan, beágyazó gél segítségével felrögzített parafa darabkára Hiba: nincs párhuzamosítás mintát a metszés során ferdén faragom be, értékes részletek veszhetnek el Fagyasztás előtt a minta felszínén lévő folyadékot itatós papír segítségével eltávolítjuk Hiba: jelentős folyadékréteg marad a minta felszínén kialakuló jégkristályok a minta szerkezetét roncsolják
IF - Natív vesebiopszia Direkt IF technika: IgG, IgA, IgM, AHF, C3, C1q: glomerularis betegségek Kappa, lambda: amyloidosis, könnyűlánc betegség Indirekt IF technika: Alport nephropathia gyanújakor IV-es típusú kollagén molekula alfa-láncai ellenes savók
IF szemcsés, ill. lineáris festődés IgG IgA IgG
IF - Allograft vesebiopszia Direkt IF vizsgálat: HLA-DR: akut T-sejtes kilökődésre C3, IgG, IgA, IgM: glomerularis betegség kórismézésére Indirekt IF vizsgálat: C4d: antitest-közvetített kilökődésre
IF C4d+ Humoralis rejectio markere C4d
Fénymikroszkópos vizsgálat 3 µm vastagságú sorozatmetszetek Rotációs mikrotóm használata egyenletes metszetvastagság biztosítása Metszetek hármasával felszedve 26 tárgylemez / eset teljes biopsziás mintába való betekintés (Focalis sclerosis)
Hematoxilin-eozin Tájékozódásra: sejtdússág, lobsejtek, hialincsepp (vörös), cilinder Magfestés: Gill-féle hematoxilinnal (kék) Eozin: citoplazma, fehérjecilinder, egyéb szövetelemek rózsaszínűek
HE Ciklosporin-indukálta TMA
PAS A bazális membránok, kefeszegély feltüntetésére rózsaszín-piros festődés Perjódsav és Schiff-reagens ne legyen Perjódsav és Schiff-reagens ne legyen elhasználódott halvány a festés (egyszerre cserélni)
PAS Transzplantációs glomerulopathia
Crossmon - trikróm A fibrin (piros), valamint a kollagénrostok, ill. bazális membrán (kék) elkülönítésére Oranzs-fukszin (Oranzs G + savanyúfukszin) Foszforvolfrámsav - kötőszövetből vörös színt kivonja; meggátolja, hogy az anilinkék a már vörösre festett elemeket megfesse Anilinkék Gyors differenciálás ecetsavval, pirosas színig (kék szín kioldódhat) Öblítés deszt. vízben Gyors dehidrálás - ne fakuljon a szín Derítés, fedés
Crossmon FSGS
AFOG - trikróm A bazális membránok és a kollagén (kék), fehérjecseppek (piros), immundepozitumok (vörösek) elkülönítésére Refixálás: Bouin oldat, 1 óra, 60 C Folyó csapvízben mosás fehér színig Magfestés: Gill-féle hematoxilin (5 ) Csapvízben kékítés (5 ) Foszformolibdénsav (5 ) AFOG oldat (7 ) anilinkék, savanyúfukszin, Oranzs G vizes oldata, ph 1.0 Öblítés röviden csapvízben, gyors dehidrálás Derítés, fedés
AFOG IgA nephropathia
Jones-féle ezüst A bazális membránok feltüntetésére Perjódsav (30 ) Csapvíz, dv Ezüst methenamin oldat (30 mh.sütő, barnásfekete színig 60 C) Hexametilén-tetramin oldat + ezüst-nitrát oldat + nátrium-tetraborát oldat (bórax) Arany-klorid szürke színig (2 ) Na-tioszulfát lilás színig (5 ) Bouin oldat (10 mh.sütő, 3 szobahőn) Foszforvolfrámsav (1 ) Chromotrope 2 R (15 ) Csapvizes öblítés Gyors víztelenítés, derítés, fedés
Jones Membranosus nephropathia
Elastica Rugalmas rostok feltüntetésére (rozsdabarna) Festés orceinnel savas-alkoholos közegben (30 ) Differenciálás alkohollal háttér csökkentése Magfestés, kékítés Transzplantációs arteriopathia
Kongóvörös Amyloid kimutatására (barnásvörös) Gill-féle hematoxilin (3 ) Kékítés csapvízben (5 ) A-oldat (kongóvörös + nátriumkarbonát vizes oldata) B-oldat (50%-os alkohol) 1:1 arányú friss elegye (3 ) Gyors öblítés dv-ben, alkoholban Gyors víztelenítés Derítés, fedés
Immunperoxidáz technika Paraffinos metszetek deparaffinálása, rehidrálása Endogén peroxidáz gátlás 3 % H 2 O 2 (10 ) Antigén feltárás proteázzal, illetve hővel Nem specifikus kötőhely blokkolás - Ultra V Block (Lab Vision) (7 ) Primer antitest Real EnVision jelölő rendszer (30, DAKO) Jel előhívás DAB segítségével, mikroszkóp alatt, szemkontroll mellett Magfestés, kékítés Dehidrálás, derítés Fedés
Antigén feltárás Enzimatikus: XIV. típusú proteáz / TRIS puffer 37 Cº-os termosztátban IgG (30 ), IgA, IgM, C3, C1q, Kappa, Lambda (20 ) Mosás: TRIS pufferben (0.05 M, ph 7.6) Feltárás hővel: 0.1 M citrát puffer, ph 6,0 (25 ) Kuktában, légköri nyomáson Hűtés szobahőn (15 ) C4d Mosás: 0,2 M PBS, ph 7,4
IF / IPO IGA C4d C3
IPO - előnyök, hátrányok Előnye: Minta osztása két részre (EM, FM) Paraffinos metszeteken végezhető speciális festésekkel összevethető Fénymikroszkópos értékelés A jel és a struktúra együtt tanulmányozható A jel stabil, a metszetek tárolhatók Lehetőséget ad konzultációs tevékenységre Nehézsége: Háttérfestődés kiküszöbölése Antigén feltárás standardizálása
Elektronmikroszkópos vizsgálat Fixálás 3 %-os glutáraldehid (PBS-ben, 2% dextrán) Minta 0.5x1.5 mm-nél ne legyen nagyobb Hiba: nagy méretű minta közepe nem rögzül Glutáraldehid penetrációja lassabb, mint a formaldehidé Több keresztkötés, erőteljesebb fixálás PBS: fiziológiás körülmények Dextrán optimális ozmolaritást biztosítja penetrációt elősegíti
EM Beágyazás I. Automatában (3.5 óra) PBS: glutáraldehid kimosása 0.5 % OsO 4 (PBS): utófixálás, fekete festék, nagyon lassan penetrál (1 óra, 45 C) Mosás PBS-ben 50 majd 70 %-os alkohol Telített uranilacetát oldat blokkfestésre (5, 30 C) (70 %-os alkoholban oldva) Víztelenítés felszálló alkoholsorban (70 %, 96 %, abszolút), acetonban Epon 812 gyanta : aceton = 1 : 1 elegye (1 óra, 30 C)
EM Beágyazás II. EmBed-812 beágyazó kit átitatás 1 óra, 60 C-os termosztátban Epoxigyanta monomer Keményítő adalék térhálósít, polimer létrehozása Lágyító adalék metszhetőség javítása, ridegség csökkentése Gyorsító adalék (akcelerátor) katalizátor, térhálósodás sebességét növeli (BDMA benzildimetilamin) Hiba: részleges átitatás rosszul metszhető blokk Kapszulázás formába öntés Polimerizáltatás friss gyantával 60 C-on, másnapig
EM Blokk befaragása Blokk trimmelése mintát felülről borító gyantaréteg levágása, trapéz alakú felület (csonka gúla) kifaragása szetereomikroszkóp alatt Két szemközti párhuzamos oldal kialakítása alsó él hosszabb a felső élnél, magasság fele az alsó él hosszának Metszeten könnyebb tájékozódás Szalagszerű sorozatmetszetek
EM Félvékony metszet Blokk háromszög alakú üvegkés éléhez történő párhuzamosítása, befaragása Metszés ultramikrotómmal, gyémántkéssel Hiba: kés élén szennyeződés, sérült él metszet gyűrődik, csíkos a metszet Metszetvastagság 0.7-1.0 µm Metszet színe: zöldes (vékony), kékeslila (vastagabb) Metszet szempillával való felvétele, tárgylemezre cseppentett desztillált vízcseppre helyezése Szárítás 90 C-os forró lapon metszet kiterül, megtapad
Toluidinkék festés Zsírtalanított tárgylemez - alkohollal Megszárított metszet Néhány csepp 1%-os toluidinkék Forró lapon festés Csapvíz, deszt. víz Szárítás forró lapon Fedés műgyantával Betekintés - fénymikroszkóppal
EM Ultravékony metszet Félvékony metszet alapján elváltozást tartalmazó blokkrészlet kifaragása Metszetvastagság: 70 nm Metszet színe: tejfehér-sárgás (aranysárga vastag metszet) Metszet felvétele rézből készült, egy lyukú gridre kifeszített Formvar-hordozóhártyára Hiba: lyukas hártya, porszennyeződés
Kontrasztozás Automatizált kombinált festés Uranilacetát oldat (0.25 %, 30 perc, 40 C) DV mosás Reynolds oldat (Ólom-nitrát oldat + Na-citrát + Na-hidroxid) DV mosás Metszet szárítása Tárolás metszettartó boxban Kiértékelés - elektronmikroszkóppal
Laboratóriumi vizsgálatok Immunhisztokémiai vizsgálatok Fénymikroszkópos vizsgálatok Elektronmikroszkópos vizsgálatok 95 %-os diagnosztikai pontosság
Köszönöm a figyelmet!