Érzékenység vs dwell time analyte peak area [cps] 3.000.000 2.500.000 2.000.000 1.500.000 1.000.000 500.000 0 0 20 40 60 80 100 dwell time [ms] 25ms dwell time alatt számottevő a csökkenés (API 2000 LC/MS/MS system) 100 peszticid per injection
Gyors MRM figyelés 50ms dwell time 2ms dwell time Nincs csökkenés 200 MRM csatorna figyelése esetén sem? 3.60 6 MRM 200 MRM
Maximális érzékenység Átlagos csúcsszélesség A csúcs jellemzéséhez 8-10 mintavételi pont szükséges 4,0e4 3,5e4 4,0e4 3,0e4 3,5e4 2,5e4 3,0e4 2,0e4 2,5e4 1,5e4 2,0e4 1,0e4 5000,0 0,0 24 sec 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 Time, min 1,5e4 1,0e4 5000,0 0,0 5,6 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 Time, min egy 24 sec széles csúcs 9 pontos jellemzéséhez szükséges minimális pásztázási idő 2,667 sec. a pásztázási sebesség állításának lehetőségei: dwell time (msec) pause time (msec)
Maximális érzékenység Pause time fixed at 5 msec Dwell time [msec] Total scan time incl. Pause [sec/scan] No. of data points (for 24 sec peak width) 10 4.740 5 8 4.090 5 6 3.476 6 5 3.160 7 4 2.844 8 3 2.530 9 2 2.212 11 1 1.896 12 D w e m e o r a 3 1 6 m a s s r a n s o n Dwell time for all 316 mass transition x e d a 6 m s e c fixed at msec Total scan Pause time incl. No. of data points time Pause (considering 24 [msec] [sec/scan] sec peak width) 5 3 4 7 6 3.476 7 4 3.16 7 3 2 8 4 4 2.844 8 2 2 5 2 8 2.528 9 1 2 2 1 2 2.212 1 0 10 Con centr ation: N/A Cal culat ed Con c: 0.00 ng /ml Int ensity,cps 5. 1e4 5. 0e4 4. 9e4 4. 8e4 4. 7e4 4. 6e4 4. 5e4 4. 4e4 4. 3e4 4. 2e4 4. 1e4 4. 0e4 3. 9e4 3. 8e4 3. 7e4 3. 6e4 3. 5e4 3. 4e4 3. 3e4 3. 2e4 3. 1e4 3. 0e4 2. 9e4 2. 8e4 2. 7e4 2. 6e4 2. 5e4 2. 4e4 2. 3e4 2. 2e4 2. 1e4 2. 0e4 1. 9e4 1. 8e4 1. 7e4 1. 6e4 1. 5e4 1. 4e4 1. 3e4 1. 2e4 1. 1e4 1. 0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 0. 0 Dwell times 1 msec msec 5. 88 5.85 2 4 msec 5.87 5 msec 5.87 6 msec S/N ratio msec 5.86 2 1 4 2 3 6 4 2 5 8 6 4 7 1 2 6 3 4 8 1 5 2 6 3 7 4 1 5 2 6 3 7 4 1 5 2 6 3 7 4 1 5 2 6 3 7 4 5 6 7 Time, min Time,min Time,min Time,min Time, min Ti me,min T ime, min T ime, min 8 10 msec S/N optimum 158 komponensre: dwell time: 6 msec pause time: 4msec 5. 85 25 msec 5. 85 250 200 150 100 50
A LINAC cella teljesítőképessége XIC of +MRM (297 pairs): 226.2/170.0 amu from Sample 1 (MRMs 100) of Data MRM pesticides_02.wiff (Turbo Spray) Max. 1.1e6 cps. 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5 6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5 2.50e5 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e4 11.79 300 gyógyszermetabolit egyidejű vizsgálata 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Time, min
Információfüggő vizsgálat Information Dependent Analysis (IDA) Felhasználása: minden olyan LC-MS mérésnél, ahol előre nem ismert komponensekről kell MSMS felvételeket készíteni, illetve limitált mennyiségű minta áll rendelkezésre (fehérjeazonosítás, metabolitvizsgálatok stb.)
Információfüggő vizsgálat (IDA)
Multi-target target screening
Multi-target target screening
Kizárás (dynamic exclusion) Paracetamol Codeine Nicotine Caffeine Dibenzepin Propranolol
Kizárás A Paracetamol kizárása szükséges a Propranolol csúcs azonosításához
Screening módszerek előnyei 300 komponens MRM technikán alapuló mennyiségi meghatározása a LINAC segítségével lehetséges A konfirmáció EPI spektrumok és spektrumkönyvtár alkalmazásával megoldható A konfirmáció a quantifier/qualifier csúcsok arányával is megoldható
Screening módszerek korlátai Az alacsonyabb dwell timenak (5ms) köszönhetően kisebb érzékenység (LOD) Hosszú ciklusidő (max 4s) következtében kevesebb pont nyerhető Kevesebb adatpont következtében Kisebb a reprodukálhatóság (CV %) Kisebb a pontosság (%) Csúcsalakok nem szépek Kisebb szelektivitású oszlop, szélesebb csúcs, kisebb érzékenység
Összehasonlítás 24 MRM Colour Data points Area Green 28 1900 Blue 15 1200 Red 9 940 300 MRM 300 MRM + EPI
Oszlop szerepe XIC of +MRM (297 pairs): Exp 1, 85.0/58.0 amu from Sample 1 (Mix 100) of Data Pesticide MTS_01.wiff (Turbo Spray) Max. 600.0 cps. I n t e n s i t y, c p s 2.4e6 2.2e6 2.0e6 Aqua: szélesebb csúcsok 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Time, min XIC of +MRM (297 pairs): Exp 1, 85.0/58.0 amu from Sample 1 (Mix 100) of Data Pesticide MTS Fusion_01.wiff (Turbo Spray) Max. 200.0 cps. I n t e n s i t y, c p s 3.0e6 2.5e6 2.0e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 Fusion: nagyobb érzékenység 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Time, min
Mindenre egyformán alkalmas módszer nem létezik!
Orvosi diagnosztika Megoldandó feladatok: Módszerek átvétele Új módszerek kifejlesztése Szűrés A vizsgálat menete: Metanolos extrakció Beszárítás Észterképzés Beszárítás Feloldás
Mintaelőkészítés 1. Vérminta szűrőpapíron (kb 6 µl) 2. Hozzáadunk 100µL izotópjelzett belső standardot tartalmazó metanolt 3. 20 percig állni hagyjuk 4. A metanolt lepipettázzuk, majd N 2 áramban beszárítjuk 5. BuOH/HCl-t adunk hozzá majd 65 C-on 20 percig tartjuk 6. N 2 áramban szárazra pároljuk (~ 40 C) 7. Az eluensben felvesszük (100µL ACN/H 2 O 50:50 0.02% HCOOH) 8. 10 µl-t injektálunk folyadékáramba 9. Elválasztás nélküli direkt vizsgálat 10.Flow Injection Analysis (FIA) TurboIonSpray forrással 11.Tipikus IS koncentrációk: ~ 60 fmol/µl C8-carnitine ~ 100 fmol/µl D5 phenylalanine
MS vizsgálati módok Prekurzor ion scan - acilcarnitinek Semlegesvesztéses scan aminosavprofil
Acilkarnitinek R Acilkarnitinek butilvesztése: H 3 C CH 3 N CH 2 O CH H CH O C O CH 2 CH R = H carnitine CH 2 CH 3 R = acyl acylcarnitine CH 3 H H 2 C CH CH COOH + N(CH 3 ) 3 + ROH + C 4 H 8 Precursor Ion Scan of 85amu
Aminosavak Aminosavak butilvesztési reakciója: H H N R C O C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 R = aminosav oldallánc H H H H N C R H + O H C O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 Neutral Loss Scan of 102amu
Kibővített vizsgálati módszer Acilkarnitin profil Precursors (Parents) of 85 Da Aminosav profil Neutral Loss of 102 Da Bázikus aminosav profil Neutral Loss of 119 Da MRM (5 masses): 189 Da(Orn) -232 Da(Cit) -246 Da {homocit} Arginin profil Neutral Loss of 161 Da MRM (2 masses): 231 Da(Arg), 237 Da (C 13 D 5 -Arg)
Aminosav profil +Neutral Loss (102): 7.74 min (8 scans) from juhar Pro 4.04e4 cps 30000 Leu, OH-Pro Normal amino acid profile Intensity, cps 20000 10000 Ala Ser Val Thr Met His Phe Tyr Glu 140 160 180 200 220 240 260 m/z, amu +Neutral Loss (102): 1.10 min (8 scans) from juhar 4e5 3e5 Leu/OH-Pro Maple Syrup Urine Disease profile 4.71e5 cps Intensity, cps 2e5 Val 1e5 Ala Ser Pro His Phe Tyr Glu 140 160 180 200 220 240 260 m/z, amu
Aminosav profil 100 Phe Pro INTERNAL STANDARDS % Intensity 50 Ala Phe Leu+Ile Gly Gly Ala Ser Gln Val Val Leu Met Cit Tyr Tyr Asp Glu Glu 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z, amu
Fenilketonúria (PKU) +Neutral Loss (102): Expt. 2, 0.50 min (16 scans) from 991124519 P h e n y l a l a n i n phenylalanine 222.2 2.26e5 cps 1.5e5 1.0e5 5.0e4 D 5 -phenylalanine d 5 - P h e n y l a l a n i n 2 2 7. 3 146.2 162.2 172.2 191.2 209.2 242.2 263.3 140 160 180 200 220 240 260 m/z, amu +Neutral Loss (102): Expt. 2, 0.42 min (13 scans) from 991124547 3.79e4 cps 1.5e5 1.0e5 5.0e4 146.2 162.2 172.2 191.2 209.2 227.2 242.2 260.3 140 160 180 200 220 240 260 m/z, amu
Közepes szénláncú AcCoA Dehidrogenáz hiány +Precursor (85): Expt. 1, 0.53 min (16 scans) from 990309272 344.4 Octanoylcarnitin 20000 MCAD-Patient C 8 -carnitine 2.39e4 cps Intensity, cps 15000 10000 260.3 459.5 5000 218.2 291.3 316.3 347.3d3-C8 372.4 400.4 428.5 482.5 250 300 350 400 450 500 m/z, amu +Precursor (85): Expt. 1, 0.53 min (16 scans) from 990309273 1.20e4 cps 20000 15000 Intensity, cps 10000 260.3 Normal 459.5 5000 218.2 291.3 347.4 372.4 400.4 428.5 482.5 250 300 350 400 450 500 m/z, amu
Szűrhető betegségek Fenilketonúria ésegyéb hiperfenilalaninémiák Tirozinémiák Jávorfaszörp betegség (MSUD) Izovaleriánsavacidémia (IVA) Propionsavacidémia Metilmalonsavacidémia Glutársavacidúria I., II. Karnitintranszporter defekt Karnitinpalmitoli transzferáz I hiány Nonketotikus Hyperglicinémia Homocisztinúria (CBS deficiency) Rövid szénláncú AcCoADehidr. hiány(scad) 3 metilkrotonilglicinémia Közepesszénláncú AcCoA Dehidr. hiány(mcad) Hosszúszénláncú AcCoA Dehidr. hiány(lcad) Citrullinémia Hisztidinémia 3 hidroxi 3 metilglutaril CoAliáz hiány Béta ketotioláz hiány TöbbszörösAcCoAhiány Hipervalinémia Hiperornitinémia
Immunoszuppresszánsok H 3 C (CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 3 O HO CH 3 O H 3 C N N N H N N CH 3 O CH(CH 3 ) 2 CH 3 O R O (H 3 C) 2 CHCH 2 CH2 CH(CH 3 ) 2 O CH 3 O O N CH 3 H 3 C N N H H N N H N CH 2 CH(CH 3 ) 2 O CH 3 O CH 3 O Cyclosporin A CH(CH 3 ) 2 Mol. Wt. 1202.624 Exact Wt. 1201.841
Normál Q1 MS 4.0e5 3.8e5 3.6e5 3.4e5 3.2e5 3.0e5 2.8e5 2.6e5 2.4e5 2.2e5 2.0e5 1.8e5 1.6e5 1.4e5 1.2e5 1.0e5 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 0.0 M+H + 1203.4 1204.4 M+NH 4 + 1225.3 1220.5 1221.5 M+Na + 1226.2 1227.1 1228.2 1229.3 1230.2 M+K + 1241.3 1243.1 1244.2 1195 1200 1205 1210 1215 1220 1225 1230 1235 1240 1245 1250 m/z, amu
Mennyiségi értékelés
Mennyiségi értékelés
Mennyiségi értékelés r=0.9992
A módszer összehasonlítása 1400 1200 CSA concentration by FPIA (ng/ml) 1000 800 600 400 200 0 y=1.48147*x+63.26744 r 2 =0.94263 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 CSA concentration by LC-MS (ng/ml)
A módszer összehasonlítása 1200 1000 CSA concentration by EMIT (ng/ml) 800 600 400 200 0 y=1.23452*x+27.61295 r 2 =0.948676 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 CSA concentration by LC-MS (ng/ml)
Igazságügyi gyi alkalmazások +MRM: 304/182 304/105 304/82 304/77 2400 2200 2000 1800 1600 O C O CH 3 H 3 C N O C O 182 105 Kokain meghatározása hajból Intensity, cps 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time, min
Alprazolam kalibrációs görbe 2.0 Calibration Alprazolam y = 0.000198 x (r = 0.9985) CH 3 N N N Analyte Area / IS Area 1.0 Cl N 5000.0 1.0e4 Analyte Conc. / IS Conc.
Alprazolam időbeli változása hajban Conc [pg/mg] 10 8 July 2001 January 2002 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Segment [cm]