Forlay-Frick Péter Budapest, 2004.

Ph.D. Értekezés Forlay-Frick Péter Budapest, 2004.

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Általános és Analitikai Kémia Tanszék FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉK-KROMATOGRÁFIÁS ÁLLÓFÁZISOK OSZTÁLYOZÁSA HAGYOMÁNYOS ÖSSZEHASONLÍTÓ MÓDSZERREL ÉS FŐKOMPONENS- ELEMZÉSSEL, PUFFEROLT MOZGÓFÁZISOK ALKALMAZÁSÁVAL Ph.D. Értekezés Forlay-Frick Péter Témavezetők: Dr. Fekete Jenő egyetemi tanár BME Dr. Héberger Károly MTA doktora MTA Kémiai Kutató Központ EGIS Gyógyszergyár Rt. Budapest, 2004.

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőimnek, Dr. Fekete Jenőnek és Dr. Héberger Károlynak, mind a doktori kutatás kísérleti részében, mind pedig a jelen értekezés elkészítésében nyújtott önzetlen támogatásukért, hasznos és ötletébresztő tanácsaikért. Ugyancsak meg szeretném köszönni Dr. Fekete Jenőnek a publikációk elkészítésében nyújtott segítségét is. Köszönettel tartozom továbbá az EGIS Gyógyszergyár Rt.-nek, valamint munkatársaimnak és barátaimnak. Végül, de nem utolsó sorban hálával tartozom szüleimnek, akik a doktori munka elkészítésében a legnagyobb támogató és ösztönző erőt jelentették. Nélkülük nem sikerülhetett volna.

TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS... 2 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 4 2.1. A fordított fázisú, alkil-módosított, szilikagél-alapú állófázisok... 4 2.2. Fordított fázisú állófázis vizsgálati módszerek... 9 2.2.1. Fordított fázisú HPLC-s töltetek jellemzése különböző tesztvegyületekkel... 10 2.2.2. Többváltozós (kemometriai) eljárások fordított fázisú állófázisok jellemzésére... 13 2.3. Főkomponens-elemzés (PCA)... 16 3. KÌSÉRLETI RÉSZ... 18 4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK... 22 4.1. Szilikagél-alapú állófázisok összehasonlítása poláris csoportot tartalmazó tesztvegyületekkel... 22 4.1.1. Állófázisok összehasonlítása egyszerű, monofunkciós tesztvegyületek alkalmazásával... 22 4.1.2. Állófázisok összehasonlítása több funkciós csoportot tartalmazó tesztvegyületek alkalmazásával... 30 4.2. Az injektálás hatása... 38 4.3. Szilikagél-alapú állófázisok összehasonlítása főkomponens-elemzéssel... 44 4.3.1. Állófázisok összehasonlítása egyszerű, monofunkciós tesztvegyületek alkalmazásával... 44 4.3.2. Állófázisok összehasonlítása több funkciós csoporttal rendelkező tesztvegyületek alkalmazásával... 58 4.3.3. Mérési adatok minimalizálása PCA segítségével... 72 5. ÖSSZEFOGLALÁS ÉS TÉZISEK... 75 6. MELLÉKLET... 79 7. IRODALOMJEGYZÉK... 93 PUBLIKÁCIÓK.....96 1

1. BEVEZETÉS Napjainkra az analitikai vizsgálatok mintegy 40-50 %-át a folyadék-kromatográfiás vizsgálatok teszik ki, melyek 90 %-ában fordított fázisú (RP, Reversed Phase) tölteteket használnak. A nagyszámú, jó minőségű RP állófázisok népszerűségét az magyarázza, hogy többféle mechanizmusú elválasztás valósítható meg rajtuk. Az elválasztást megszabó különböző kölcsönhatások (hidrofób, hidrofil, ionpárképzéses, valamint a méretkizárásos hatások), általában együttesen szabják meg az egyes töltetek alkalmazhatóságát, egy adott elválasztási feladat esetében. A töltetek népszerűségéhez hozzájárul még mindezeken túl az is, hogy az analitikai szempontból fontos, a folyadék-kromatografálhatóság alapfeltételeinek megfelelő szerves molekulák túlnyomó része apoláris vagy enyhén poláris jellegű, azaz éppen fordított fázisú tölteteken választhatók el a legjobban (pl.: gyógyszermolekulák). A jelenleg használt fordított fázisú töltetek mintegy 75 %-át a felületükön alkil csoporttal szubsztituált, úgynevezett alkil-módosított, szilikagél-alapú állófázisok teszik ki. A nagy víztartalmú mozgófázisokkal történő reprodukálható méréseket az alkil-láncokba beépített poláris csoportok vagy a poláris utószilanizáló szerek alkalmazása teszi lehetővé. A továbbiakban ezeket a poláris csoportokat is tartalmazó állófázisokat is az alkil-módosított szilikagélek közé sorolom. Ezek mellett azonban egyre gyakoribb az utóbbi évek fejlesztései révén piacra került szervetlen oxid alapú felületen polimerizált töltetek (pl.: alumínium- és cirkónium-oxid), a porózus grafitizált szén, valamint a polimer (polisztirol-divinilbenzol kopolimer) alapú állófázisok használata is. Az alkil-módosított, szilikagél-alapú állófázisok elterjedése a töltetek nagyobb mechanikai szilárdsága mellett, a velük elérhető nagyobb hatékonysággal és a kémiai szintézisük alapos ismeretével is magyarázható. Jelenleg világszerte mintegy 600 különböző, fordított fázisú töltetet gyártanak és ez a szám évente kb. további 20-30 új töltetfajtával növekszik. A gyártók az egyre bővülő piacon ezen állófázisokból mintegy 500 000 darabot adnak el évente, amely jól mutatja az RP-HPLC egyre növekvő jelentőségét [1,2]. Napjainkban mind a kutatók, mind pedig a gyártók arra törekednek, hogy az eddigieknél jobban megértsék a retenciót és a szelektivitást megszabó folyamatokat. Különösen fontos lenne, ha ezeket a folyamatokat vissza tudnánk vezetni a molekuláris történések szintjére és 2

így korrelációba hozni az állófázisok fizikai-kémiai tulajdonságaival. Ezzel lehetőség nyílna arra, hogy előre jelezzük az egyes állófázisok kromatográfiás tulajdonságait. A jelenleg ismert nagyszámú retenciós és szelektivitási modell állandó viták tárgyát képezi [3-5], ennélfogva a felhasználók a fordított fázisú töltetek és egyéb kromatográfiás paraméterek megválasztásánál sokkal inkább a tapasztalataikra és megérzéseikre támaszkodnak, mintsem objektív szempontokra. Ennek egyik további magyarázata az is, hogy a fordított fázisú kromatográfia nem rendelkezik általánosan elfogadott tesztelési módszerrel a töltetek kémiai minőségének a meghatározására. Az elválasztások tervezéséhez, az adott feladatra leginkább megfelelő töltet kiválasztásához olyan minősítő eljárások kidolgozására van szükség, amelyek az állófázisok széles körének vizsgálatára alkalmasak, továbbá egyedi kölcsönhatások alapján képesek értelmezni a retenciót megszabó töltettulajdonságokat. Doktori munkám során számos, kereskedelmi forgalomban kapható, szilikagél-alapú állófázis esetében vizsgáltam a felületen elhelyezkedő csoportoknak a vizsgált molekulák visszatartását és a kromatográfiás paramétereket (elméleti tányérszám és csúcsszimmetria) megszabó kölcsönhatásait. Ugyancsak vizsgáltam az injektált mintatérfogatnak, a molekulaméretnek és a mozgófázis szerves tartalmának (metanol, acetonitril) kromatográfiás paraméterekre kifejtett hatását. Arra is választ próbáltam kapni, hogy a kisebb molekulatömegű, monofunkciós tesztvegyületek alkalmazásával elvégzett oszloptesztek erdményeiből milyen következtetések vonhatók le a nagyobb molekulatömegű, több funkciós csoporttal rendelkező vegyületek vizsgálatára nézve. Mindezek mellett megpróbáltam az utóbbi években egyre jobban előtérbe kerülő főkomponens-elemzést (PCA) alkalmazni a mérési adataim feldolgozásában és a következtetések levonásában. 3

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A fordított fázisú, alkil-módosított, szilikagél-alapú állófázisok A szilikagél-alapú, alkil-láncokkal módosított felületű RP állófázisoknál az elválasztást több paraméter együttesen szabja meg. Ezek közül a felületen immobilizált alkil-lánc koncentráció csak az egyik, sok esetben azonban döntő tényező. Számos vizsgálat alátámasztotta, hogy különösen a bázikus tulajdonságú vegyületeknél van meghatározó szerepe a reagálatlan, de a vizsgált molekula számára hozzáférhető szilanol csoportoknak, valamint az állófázisok fémszennyezőinek. Ezeket a hatásokat együttesen az állófázis-hatások közé soroljuk. A másik, ugyancsak döntő tényező a mozgófázis-hatások összessége. Ezek közé tartozik pl.: az alkalmazott szerves oldószerek minősége, a ph, a pufferkomponensek, továbbá a különböző additívok (pl.: trietil-amin, kvaterner ammónium sók) hatásai. Végezetül mind az állófázis, mind pedig a mozgófázis megválasztásánál a vegyületek fizikai-kémiai tulajdonságainak is összhangban kell lennie a fentebb említettekkel. Olyan tulajdonságok összehangolására van szükség, mint a pórusátmérő-vegyület méret, apolaritás (logp)-szerves oldószer összetétel, pk a -ph, állófázis polaritás-vegyület polaritás, hogy csak néhányat említsek. Mindezek mellett a folyadék-kromatográfiás rendszer működési paramétereinek is meg kell felelnie a lineáris elúciós technika követelményeinek. Az apoláris vegyületek elválasztásánál az elválasztást alapvetően meghatározó tényező az állófázisok alkil-ligandumjai és a mintamolekulák apoláris részei között fellépő London-féle diszperziós kölcsönhatás. A kromatográfiás terminológia szerint ezt nevezzük az állófázisok hidrofób tulajdonságának [4,5]. Az állófázis hidrofóbicitása és a felületre felvitt ligandumok szénatom száma, illetve borítottsága között egyértelmű összefüggés mutatható ki. Poláris csoportokat tartalmazó vegyületeknél a szilanol csoportok nyújtotta, a mai terminológiával poláris kölcsönhatás egy további, a kromatográfiás paramétereket alapvetően meghatározó tényező. A fémionoknak a szilanol csoportok savasságának befolyásolásában van szerepe. Az eltérő aktivitású szilanol csoportok előfordulása a módosított szilikagél felületén az előállítás függvénye. A pórusos szerkezetű, amorf szilikagél felületén a háromféle szilanol csoport mellett (izolált, geminális és vicinális) sziloxán csoportok és felületi fématomok is találhatók (1. ábra). 4

1.ábra: A szilikagél felületén lévő különböző aktív helyek: a: izolált szilanol csoport, b: geminális szilanol csoport, c: vicinális szilanol csoport, d: sziloxán csoport, e: felületi fématom (fémion), f: savas szilanol fématom közelében Egyes szilanol csoportok, főként az izolált vagy a fématom szomszédságában lévők, erősen savas karakterűek (pk a <3) is lehetnek [6,7]. Ezek az erősen savas felületi csoportok felelősek a bázikus vegyületek elválasztásakor tapasztalható csúcstorzulásért, a retenció megnövekedéséért és az elméleti tányérszám romlásáért. A szilanol csoportok hatásának csökkentése érdekében alkalmazzák a gyártók az utószilanizálást, mellyel a felületen maradt szilanol csoportok mennyisége jelentős mértékben csökkenthető [8]. A szilanol csoportok erős adszorpciós helyeknek tekinthetők, míg a sziloxánok hidrofób karakterűek [8]. A δ kötések mellett a sziloxán csoportokban (Si O Si) d π p π kölcsönhatások is vannak: az oxigén mindkét nemkötő elektronpárja π kölcsönhatást alakít ki a szilícium atomokkal. Ezzel magyarázható például, hogy a sziloxán helyek a szilikagél felületén nem képeznek H-hidas kölcsönhatást H-donor vegyületekkel. A sziloxán csoportok elektron-donor tulajdonsága jóval kisebb, mint a C O C kötésé [9]. Scott és Kučera [10] kromatográfiásan (NPLC) igazolták, hogy a sziloxán csoportoknak nincs, vagy csak alig van szerepük a vizsgált vegyületek visszatartásában, de fontos szerephez jutnak a fordított fázisú elválasztásoknál kis borítottságú szilikák esetében [6,11,12]. Az elválasztásokban fontos szerephez jut a mozgófázis is. A mozgófázis szerves tartalmának jelentős hatása van valamennyi kromatográfiás paraméterre. A fordított fázisú kromatográfiában használt metanol, acetonitril és tetrahidrofurán oldószerek közül a legrosszabb csúcsalakokat (aszimmetrikus csúcsokat) acetonitril esetén kaphatjuk [13-15]. 5

Ezt az acetonitril azon képességével magyarázzák, hogy a másik két oldószerrel szemben nem képes H-hidas kölcsönhatás kialakítására a reagálatlan szilanol csoportokkal [14,16,17]. A mozgófázis ph-jának és a különböző puffereknek is jelentős szerepük lehet a komponensek elválasztásában. Általánosan elfogadott tény, hogy a ph-t mindig a szerves fázis hozzáadása előtt kell megmérni. A szerves oldószerek ugyanis hatással vannak mind a pufferkomponensek disszociációjára, mind pedig az analizálandó komponensek és az állófázis szilanol csoportjainak pk a értékére. A szerves-vizes rendszerek esetében mért ph értékek különböznek a csak vizes közegben mért ph értékektől. Az irodalomban fellelhető adatokból [18-21] látható, hogy a mozgófázis szerves tartalmának 10 %-os növelése a vegyületek pk a értékének akár 0,3 egységgel történő csökkenését is eredményezheti. Az eluens ph-jának változtatásával változik a felületi szilanol csoportok ionizáltsági foka is, ami lehetőséget nyújt ioncserés kölcsönhatások kialakulására. Ez elsősorban a bázikus vegyületek elválasztásánál okozhat problémát. Pufferolt mozgófázisok esetében az alkalmazott pufferképző sók akár ionpárokat is képezhetnek a felületen. Ezek, illetve a felületen adszorbeálódott vízmolekulák a szerves vegyületek retencióját és a kromatográfiás paramétereket nagymértékben befolyásolják. A bázikus vegyületek elválasztásában fontos szerep jut a mozgófázis kvaterner ammónium só (pl.: hexadecil-trimetil-ammónium) tartalmának [22-25], valamint az alkalmazott amin módosítóknak (pl.: trietil-amin, dimetil-n-oktilamin) is. A bázikus vegyületek és a reagálatlan szilanol csoportok között fellépő szilanofil (ioncserés) kölcsönhatás mértéke csökkenthető ugyan a mozgófázis víztartalmának növelésével, de ennek határt szab a komponensek megkívánt elúciója (k < 10), valamint a felhasználók által elvárt rövid analízisidő is. Jóval kézenfekvőbb megoldás ezért az amin módosítók, mint például a trietil-amin használata. A bázikus vegyületek esetében Kiel és munkatársai [26] szerint hidrofób, ioncserés és hidrogénhidas kölcsönhatások fellépésével számolhatunk. A tercier amin módosítók hasonló kölcsönhatások kialakítására hajlamosak, így csökkentik az ezen kölcsönhatásra képes helyek számát a felületen. Hill [27] amin módosítót használva a mozgófázisban, a nagy fémtartalmú ( A típusú szilikagél-alapú) és a nagytisztaságú ( B típusú szilikagél-alapú) állófázisok esetében hasonló retenciós eredményeket kapott. Az amin módosítók szerepe a visszatartásban a részlegesen ionizált vegyületek esetében nem jelentős, míg a nem ionizált vegyületek esetében egyáltalán nincs hatásuk a retencióra [28]. Kiel és munkatársai [26] primer, szekunder, tercier és kvaterner amin módosítókat vizsgálva arra a következtetésre jutottak, hogy legjobban a hosszabb láncú aminok csökkentik a bázikus vegyületek retencióját. Ugyancsak megállapították, hogy a tercier aminok hatásosabbak a szekunder és a 6

primer aminoknál és a csúcsszimmetriát javító hatásuk is jobb. Az eluens megfelelő amin módosító tartalma fontos kérdés. Általában a szükséges amin koncentráció függ az állófázis előállításához használt alapszilikagél minőségétől. A savasabb (heterogénebb) szilikák esetében több amin módosítóra van szükség. Viszonylag jó állófázisok esetében már a 0,02-0,05 mm amin koncentrációnak is elegendőnek kell lennie [7]. Mivel a megfelelő amin koncentráció alatt a bázikus vegyületek kromatográfiás viselkedése erősen függ a módosító koncentrációjától, ezért jobb, ha az amint a szükségesnél nagyobb mennyiségben használjuk. Dolen [29] szerint legalább 20-25 mm amin koncentrációjú mozgófázisok alkalmazása kívánatos. Fontos szerepe van az elválasztásokban a vizsgált molekulák méretének és az injektálási térfogatnak (sample size effect) is. Bázikus vegyületek esetében a molekulaméret hatását a visszatartásra már korán felismerték [7]. Bij és munkatársai [30] bizonyították, hogy a kisebb bázikus vegyületek visszatartása nagyobb, mint a nagyobb molekulaméretűeké és ez a hatás részlegesen befolyásolható a mozgófázishoz történő amin hozzáadással. A szerzők felhívták a figyelmet a ph hatására is. Magasabb ph-n a molekulaméretnek jelentősebb a visszatartást befolyásoló hatása, mint alacsonyabb ph-n. A szilanol csoportok ionizálódásával létrejövő ioncserés kölcsönhatás kialakítására képes úgynevezett ioncserés helyek magyarázatot adnak erre a jelenségre [30]. McCalley [31] a csúcsszimmetria és az elméleti tányérszám molekulamérettől való függését vizsgálta. Arra a következtetésre jutott, hogy a kisebb molekulaméretű vegyületek esetében a csúcsok aszimmetrikusabbak, mint a nagyobb molekulatömegű vegyületek esetében, ugyanakkor az elméleti tányérszám függetlennek bizonyult a molekulamérettől. Vervoort és munkatársai [32] hasonló következtetésre jutottak. A molekulaméret hatása a csúcsszimmetriára, különösen a nagy pk a értékű vegyületek esetében volt egyértelmű. A mintamennyiség hatását többek között Eble és munkatársai [33] is vizsgálták. Az angiotenzin adszorpciós vizsgálatával Zorbax ODS állófázison arra a következtetésre jutottak, hogy a kromatográfiás állófázisra juttatott minta mennyiségének növelésével, egy bizonyos szint fölött az elméleti tányérszám csökkenése tapasztalható. Ezt a jelenséget a szerzők az aktív szilanol helyek telítődésével magyarázták. Stadalius és munkatársai [34] szerint, bázikus vegyületek esetében 0,5 µg-nál nagyobb mintamennyiségek már telíthetik a kölcsönhatás szempontjából erős helyeket 25 cm-es állófázisok esetében. Mindez a csúcsszimmetria romlásával és a csúcsszélesség növekedésével (elméleti tányérszám csökkenésével) jár együtt. Ugyanakkor nem bázikus komponensek esetében ez a hatás csak 50-100-szor ekkora mintamennyiségek esetén jelentkezik [33,35]. Ha tehát a szilikagél felületén kevés savas ioncserés hely van, akkor ezeket a helyeket könnyű telíteni a 7

mintával, így a minta mennyiségének a csökkentése az elméleti tányérszám és a csúcsszimmetria javulását kell hogy eredményezze. Bázikus vegyületek esetében, a szilanol csoportok telítődésének elkerülése végett az injektált mintamennyiségnek kisebbnek kell lennie 1 µg-nál. A fordított fázisú elválasztást lényegileg megszabó kölcsönhatástípus a hidrofób kölcsönhatás. Mivel azonban az alkil-szilikagél állófázisok összetett szerkezetűek a reagálatlan szilanol csoportok mellett felületi fématomokat is tartalmazhatnak nem is beszélve a mozgófázisról és a vizsgált molekulák méretéről, nem lehet tisztán a hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiás elválasztást megvalósítani. A fellépő valamennyi kölcsönhatás együttesen szabja meg a visszatartást. A visszatartást megszabó hatások mértéke nem csak az egyes gyártók által azonos márkanéven, pl.: C18-as end-capped állófázis, hanem az egy gyártó által forgalmazott, de különböző sarzsokból származó, elvileg ugyanolyan állófázisok esetében is más és más. Ez annak a következménye, hogy a kölcsönhatások mértékét meghatározó tényezők, mint például a felületi reagálatlan szilanol csoportok száma, a gyártás során nem tarthatók kézben [36-40]. Az állófázisok kémiai tulajdonságainak kromatográfiás vizsgálata szempontjából napjainkban azok a kísérleti és adatfeldolgozást segítő eljárások kerültek a középpontba, melyek révén részletesebb képet kaphatunk az állófázisok különböző kromatográfiás körülmények között felvett szerkezetéről és kémiai minőségéről. 8

2.2. Fordított fázisú állófázis vizsgálati módszerek A napjainkban alkalmazott különböző vizsgálati módszerek az alábbi csoportokba [41] sorolhatók: 1. Az állófázisok fizikai és kémiai tulajdonságainak meghatározására szolgáló módszerek. Az állófázis töltetek gyártásában jelentős fejlődés figyelhető meg. A szilikagél-alapú állófázisok mellett különböző új, pl.: alumínium- és cirkónium-oxid alapú állófázisok is megjelentek a piacon. Az alapszilikák fémtartalma jelentősen csökkent és nagy a fejlődés a jól definiált morfológiájú és szűkpórusú (narrow pore) töltetek esetében is. Tanúi lehettünk a pellikuláris szerkezetű RP-HPLC-s töltetek újjászületésének, valamint az első szilikagél-alapú monolitikus RP állófázisok forgalomba kerülésének [7,42,43]. 2. Spektroszkópiás módszerek (IR, FL, NMR.). Ezek nélkülözhetetlen eszközeivé váltak a fordított fázisú töltetek és alapanyagok gyártásának. Különösen a CPMAS-NMR-nek van jelentős szerepe. Pl.: a 19 Si és 13 C CPMAS-NMR segítségével nélkülözhetetlen információkat kaphatunk a ligandumok alapszilikára való kapcsolódásáról, a ligandumok sűrűségéről és konformációjáról. Ráadásul az IR, FL és NMR spektroszkópia jelentős segítséget nyújt a visszatartás megértéséhez az RP-HPLC-ban [7,44-47]. 3. Termodinamikai módszerek. A vizsgált komponensek retenciós faktorát az abszolút hőmérséklet reciprokának függvényében ábrázolva, az így kapott Van t Hoff görbék segítségével lehetőség nyílik annak meghatározására, hogy az entalpia és az entrópia milyen mértékben járul hozzá a komponensek kromatográfiás visszatartásához vagy a szelektivitáshoz. 4. A kromatográfiás adatok feldolgozására és kiértékelésére szolgáló statisztikai módszerek. A megfelelő állófázis kiválasztása egy konkrét alkalmazáshoz nagy gyakorlati jelentőséggel bír, melyre számos lehetőség áll a felhasználók rendelkezésére. A kemometriás módszerek, mint a főkomponens-elemzés (PCA) és a csoportelemzés (CA) jól alkalmazhatók nagymennyiségű adat feldolgozására és kezelésére. A kemometriás módszerek egyik nagy előnye, hogy használatukkal objektív szempontok alapján osztályozhatók a fordított fázisú töltetek. Ennek következtében jelentősen csökken az állófázis-kiválasztásnak és a módszerfejlesztésnek az időigénye [48-50]. 9

5. Kromatográfiás teszt módszerek. Ezek szolgáltatják a legközvetlenebb és a gyakorlati szempontból legfontosabb információkat a fordított fázisú töltetek alkalmazhatóságával kapcsolatban. Napjainkban számos teszt létezik [37,46,48,51-56], de ezek közül egyik sem képes arra, hogy az egyes állófázisok kromatográfiás tulajdonságaiban lévő apró de lényeges eltérésekben, valamennyi szempont alapján különbséget tudjanak tenni. Számos gyakorlati alkalmazásból jól látható ugyanis, hogy az RP állófázisok kromatográfiás tulajdonságaiban lévő kétségtelenül kis mértékű különbségek igen gyakran döntő fontosságúak lehetnek a megfelelő elválasztást biztosító módszerek kidolgozásában. Az első 4 csoportba sorolt technikáknak fontos szerepük van az állófázisok fejlesztésében és jellemzésében, de a megfelelő állófázisok kiválasztása egy adott kromatográfiás elválasztáshoz, csak a különböző kromatográfiás állófázis-tesztelési módszerek alkalmazásával lehetséges. 2.2.1. Fordított fázisú HPLC-s töltetek jellemzése különböző tesztvegyületekkel A szakirodalomban számos módszer található, ezek közül azonban napjainkig egy sem vált széles körben elterjedté. Nincs egységes álláspont a mozgófázis, a tesztkomponensek, valamint a mérési körülmények és kiértékelési módszerek tekintetében sem. Mindez nagymértékben megnehezíti a fordított fázisú töltetek objektív összehasonlítását és csoportosítását. A jelenleg használt módszerek többségét szűkpórusú (NP) töltetekre, kis molekulatömegű tesztvegyületek alkalmazásával dolgozták ki. Számos tanulmányban olvasható azonban, hogy a kis molekulatömegű tesztvegyültekkel kapott eredményekből nem vonhatóak le hasznos információk a nagy molekulatömegű vegyületekre nézve, a megfelelő állófázis kiválasztásához [52,57]. Ugyancsak nem tisztázott, hogy az RP állófázisok tulajdonságainak jellemzésére elegendő-e csak egy módszer használata vagy pedig több standardizált módszerre van e szükség [39,58]. A jelenleg rendelkezésre álló eljárások közül többet is használnunk kell a állófázisok tulajdonságainak minél teljesebb jellemzése végett. Neue [36] és Kele [37] munkatársaikkal arra hívták fel a figyelmet, hogy a tesztek esetében az alkalmazott kromatográfiás körülmények (pl.: a ph, a mozgófázis szerves tartalma, az alkalmazott hőmérséklet) hatással 10

vannak az állófázisok esetében mért eredmények reprodukálhatóságára és megbízhatóságára. A különböző állófázis vizsgálatok esetében éppen ezért elengedhetetlen a pontos vizsgálati körülmények megadása. A hagyományos állófázistesztek nagy része [54,55] a homológ sorok egymást követő tagjai, pl.: amil-benzol butil-benzol (Tanaka) és etil-benzol toluol (Engelhardt), közötti szelektivitási tényező használatát javasolja az állófázisok hidrofóbicitásának a jellemzésére. Ez a paraméter jól tükrözi az RP állófázisok metilén szelektivitását is, melynek értéke adott eluens összetételnél számos fordított fázisú töltet esetében konstans. Nincs egységes álláspont a kromatográfusok körében a tekintetben, hogy az apoláris vegyületek visszatartása korrekten tükrözi-e az RP állófázisok hidrofóbicitását. Az állófázisok ionos és poláris tulajdonságait a fellépő számos fizikai-kémiai kölcsönhatás, az úgynevezett Van der Waals erők együttesen szabják meg. Ezen kölcsönhatások közé tartozik az ion-ion (ioncserés), az ion-dipól, a dipól-dipól (pl.: hidrogén-hidas kötés) és a London-féle dipól-indukált dipól kölcsönhatás [7]. A kölcsönhatások erősségének mértéke a felsorolás sorrendjében csökken. A fordított fázisú tesztek esetében a Van der Waals kölcsönhatásokat egyetlen paraméter, a szilanol aktivitás jellemzi. Számos, gyakran használt eljárással kapott szilanol aktivitási adatot közöltek Claessens és munkatársai különböző szilikagél, alumínium és polimer állófázisokra [53,56]. Az alapvető különbség a különböző töltettesztekkel kapott szilanol aktivitás értékek között az alkalmazott tesztvegyületekben, az eluensekben és az adatok kiértékelésében lévő eltérésekkel magyarázhatóak [59]. Az Engelhardt-teszt [60,61] például a szilanol aktivitás jellemzésére a tesztvegyületként használt p-etil-anilin 5%-os csúcsmagasságánál számított szimmetria faktor értékét használja. Az alkalmazott mozgófázis MeOH:H 2 O 55:45 v/v elegye. Ezzel szemben a Walter teszt [62] az N,N-dimetil-toluamid és az antracén tiszta acetonitril eluensben kapott retenciós idejéből számított szelektivitási tényezőt (α) használja. Ugyanakkor a jól ismert Tanaka módszer [54,63] nem méri közvetlenül a szilanolok aktivitását, de megadja a töltet hidrogén kötéses és ioncserés kapacitását, mint reprezentatív értékeket annak poláris/ionos kölcsönható képességére. Ez utóbbi két paramétert, mint a koffein és a fenol, illetve a benzilamin és a fenol közötti szelektivitás értékét MeOH:H 2 O 30:70 v/v és MeOH:0,02 M foszfát puffer (ph=7,6) 30:70 v/v elegyében méri. A különbségek a használt szerves oldószerek (metanol, acetonitril), a pufferolt és nem pufferolt mozgófázisok, valamint a kiértékeléshez használt módszerek között mind hozzájárulnak a mért poláris/ionos aktivitás értékek közötti eltérésekhez. Ugyancsak eltérést okoz az alkalmazott tesztvegyületek tulajdonságainak 11

(pl.: pk a értékeiknek) különbözősége. McCalley [64] és Vervoort [65] is megfogalmazta azokat a szempontokat, amelyek alapján a kiválasztott tesztkomponensek alkalmazásával megbízható oszlopteszt eredményeket kaphatunk. A fordított fázisú töltetek sztérikus szelektivitása a töltet azon képességét tükrözi, hogy az mennyire képes különbséget tenni a molekulák eltérő szerkezete között. Az állófázisok ezen tulajdonságának mérésére szolgáló módszert dolgozott ki Tanaka [54,63] és Engelhardt [66] is. Tanaka módszere trifenilén és o-terfenil használatán alapszik, és az ezen két vegyület közötti felbontás értékével jellemzi a töltetek sztérikus szelektivitását. Ugyancsak az állófázisok ezen tulajdonságának jellemzésére dolgozott ki eljárást Sander és Wise [67]. Kimutatták, hogy az eltérő térkitöltésű policiklusos molekulák elúciós sorrendje és a szilikagél felületére felvitt alkil-ligandumok felületi sűrűsége között szoros összefüggés van. A tesztvegyületként általuk használt benzo-(a)-pirén (A) és tetrabenzo-naftalin (B) között mért szelektivitás (α B/A ) alkalmasnak bizonyult a töltetek monomer (α B/A > 1,7) és polimer (α B/A < 1,0) jellegének a megkülönböztetésére. Ezt a módszert napjainkban számos gyártó alkalmazza állófázisainak jellemzésére. Az állófázisok egy másik fontos tulajdonsága a töltetek fémszennyezőinek aktivitása. A töltetbe beágyazódott fémszennyezők számos esetben nemkívánatos kölcsönhatást okozhatnak a molekulák és az állófázis között. A fémszennyezők ugyanis nagymértékben megnövelhetik a reagálatlan szilanol csoportok savasságát, s ez a retenciós idők rossz reprodukálhatóságát és aszimmetrikus csúcsalakot okozhat, különösen a bázikus karakterű vegyületek esetén [7]. A szilikagél-alapú állófázisok lehetséges fémszennyezőinek meghatározására szolgáló módszerek nagy többségénél kelátképző ágenseket alkalmaznak [68,69]. Verzele és munkatársai [68] által kidolgozott teszteljárás például az acetil-aceton, a naftalin és az 1-nitro-naftalin szelektivitás és relatív tányérmagasság adatai alapján jellemzi a töltetek fémszennyező-tartalmát. Az egyszerű kromatográfiás oszloptesztek legnagyobb előnye, hogy a mérések gyorsan kivitelezhetőek és a mérési adatok kiértékelése a megadott kritériumok alapján egyszerűen megoldható. Hátrányuk azonban, hogy a rögzített mérési körülmények miatt elsősorban csak a szűkpórusú (pórusátmérő 6-15 nm) C18-as és C8-as állófázisokra használhatók, a tágpórusú (pórusátmérő 30-400 nm) és más ligandumokat tartalmazó állófázisok (pl.: ciano állófázisok) esetében azonban nem alkalmazhatók. 12

2.2.2. Többváltozós (kemometriai) eljárások fordított fázisú állófázisok jellemzésére A számítástechnika és a mérőrendszerek rohamos fejlődésével lehetőség nyílt nagymennyiségű mérési adat gyűjtésére és azok gyors feldolgozására. Ebben a folyamatban a többváltozós (kemometriai) módszerek fontos szerephez jutnak [70]. Az állófázisok összehasonlítására leggyakrabban használt eljárások az úgynevezett lineáris szabadentalpia összefüggéseken (LFER, Linear Free Energy Relationships) alapulnak, melyeket tipikusan arra használnak, hogy az állófázisok tulajdonságait objektív paraméterekkel (pl.: a töltet protondonáló és -befogadó képességével) írják le. Speciális típusa az LFER-nek a mennyiségi szerkezet-retenció összefüggések (QSRR, Quantitative Structure-Retention Relationship) [71]. Jellemzőjük, hogy az elméleti úton (pl.: molekulamodellezés) a molekula szekezetét leíró paraméterek és a mért retenciós jellemzők közötti kapcsolatokat vizsgálják [46,53,72,73]. A QSRR modellek egyik általános egyenlete az Abraham modell, mely a megoszlási folyamat általános egyenlete [41]: logk = a + br 2 + cπ 2 H + dα 2 H + eβ 2 H + fv x ahol k: a vizsgált molekula retenciós faktora R 2 : az úgynevezett többlet moláris refrakció π H 2 : a molekula dipolaritásának/polarizálhatóságának a mérőszáma α H 2 :a molekula H-donor savassága β H 2 : a molekula H-akceptor bázicitása v x : a McGowan féle molekulatérfogat a-f: az egyenlet regressziós koefficiensei, melyek tükrözik a mozgó- és állófázis jellegzetes tulajdonságaiban lévő különbségeket Az egyenletben szereplő logk helyett más szabadentalpia változással arányos mérőszám is használható [74-80]. A QSRR módszerek alkalmazhatóságának van azonban néhány korlátja. Egyrészt nagyon nehéz olyan szolvatokrómos vagy kvantumkémiai paramétert találni, mely képes tökéletesen leírni az állófázis és az eluens tulajdonságait, másrészt a megbízható kvantitatív adatok meghatározásához nagyszámú molekula vizsgálata szükséges, mely ezen empirikus módszerek alkalmazhatóságát nagymértékben megnehezíti és időigényessé teszi. Az állófázisok vizsgálatára széles körben alkalmaznak többváltozós, különböző faktoranalízisen alapuló technikákat. Ezek közé tartozik a főkomponens-elemzés (PCA, 13

Principal Component Analysis), a célfaktor analízis (TFA, Target Factor Analysis) és a hasonlósági faktor analízis (CFA, Correspondence Factor Analysis). Számos faktoranalízissel kapcsolatos példa található Malinowszki és Howery könyvében [81]. Az állófázisok csoportosítására alkalmas többváltozós módszer még a csoportelemzés (CA, Cluster Analysis), a lineáris diszkriminancia elemzés (LDA, Linear Discriminant Analysis), valamint a spektrális leképezéses analízis (SMA. Spectral Mapping Analysis) is. Olsen és Sullivan [82] főkomponens-elemzéssel és klaszter analízissel különböző C18-as állófázisok összehasonlítását végezte el. Az állófázisok szilanol aktivitását, hidrofóbicitását, sztérikus szelektivitását, valamint fémszennyező-tartalmát vizsgálták. A többváltozós matematikai módszerekkel kapott eredményeket összevetették ugyanazon állófázisok gyógyszermolekulák esetében mért tulajdonságaival. Azt tapasztalták, hogy az általuk alkalmazott analízismódszerek alapján egy csoportba sorolt állófázisok a valós minták esetében is hasonló tulajdonságot (csúcsszimmetria, retenció) mutattak. Különböző C18-as állófázisok csoportosítását végezte el Delaney és munkatársai a főkomponens-elemzés segítségével [83]. A többváltozós módszerrel létrehozott főkomponensek alapján a vizsgált állófázisokat 3 csoportba sorolták. Az egyes csoportokba jó egyezéssel azok a töltetek kerültek, melyek szilanol aktivitásuk, hidrofóbicitásuk és hatékonyságuk alapján, az elméleti megfontolásoknak megfelelően egy csoportba kellett hogy kerüljenek. Különböző bázikus vegyületek elválasztásának szempontjából hasonlították össze az erre a célra gyártott, fordított fázisú tölteteket Vervoort és munkatársai [84], ugyancsak PCA segítségével. A mozgófázis ph-jának, a foszfát puffernek és a szilanol csoportok blokkolására használt felületmódosítóknak (pl.: trietil-amin) a retencióra, a csúcsszimmetriára és a hatékonyságra kifejtett hatását vizsgálták. Tesztvegyületként a szokásostól eltérő, bonyolult szerkezetű gyógyszermolekulákat használtak. A hasonló tulajdonságú állófázisokat főkomponens-elemzés segítségével csoportosították. A gyártók által tipikusan bázikus vegyületek elválasztásra kifejlesztett állófázisok egy része csak bizonyos vegyületek esetében volt alkalmazható. Engelhardt és munkatársai [85] az általuk kidolgozott egyszerű oszlopteszttel kapott eredményeiket hasonlították össze számos, többváltozós módszerrel (PCA, LDA, CA és CFA) kapott eredménnyel. Az elemzésekben az alkalmazott 9 benzolszármazék retenciós, szelektivitási és csúcsszimmetria adatait használták fel. Az általuk vizsgált C8-as, C18-as és polimer állófázisok esetében a legnagyobb különbségek az állófázisok szilanol aktivitásában 14

és hidrofóbicitásában mutatkozott. Valamennyi általuk használt többváltozós módszer a tesztvegyületek és az állófázisok viselkedésének szempontjából ugyanazt az eredményt adta. Walczak és Chrétien [86] 63 vegyület, 14 állófázison mért visszatartás tényezőinek logaritmusát felhasználva, hasonlósági faktoranalízissel a retenciós mechanizmust megszabó tényezőket vizsgálta meg. Vervoort és munkatársai [87] 5 bázikus tesztvegyülettel, 14 különböző állófázis csoportosítását végezték el a mért visszatartás tényező, elméleti tányérszám és szimmetria faktor adatok főkomponens-elemzésével. A PCA-t jól alkalmazhatónak találták az állófázisok osztályozására. A hasonló kromatográfiás viselkedésű, azaz megközelítőleg azonos retenciót, csúcsszimmetriát és elméleti tányérszámokat adó állófázisok a főkomponens ábrákon egymástól jól elkülönülő csoportokat (klasztereket) képeztek. A többváltozós módszerek használatával kapcsolatban számos egyéb alkalmazás, publikáció található a szakirodalomban [70,71,81,88-94]. Ezek között vannak olyanok, melyek a normál fázisú kromatográfiával [91] vagy a gázkromatográfiával [92-94] kapcsolatosak, mely a többváltozós módszerek jó alkalmazhatóságát bizonyítja minden olyan esetben, ahol nagymennyiségű adat feldolgozására és a megfelelő összefüggések feltérképezésére van szükség. Ezek a módszerek így a kromatográfia bármely ágában jól használhatók az állófázisok vizsgálatára, csoportosítására és a különböző elemzésekre. A tesztvegyületekkel kapott mérési adatokból (pl.: retenció, csúcsszimmetria), az adott eljárással előállított új változók (főkomponensek) nem feltétlenül rendelkeznek valós fizikai-kémiai tartalommal, így értelmezésük és a megfelelő információk kinyerése gyakran nehéz feladat elé állítja a felhasználókat. 15

2.3. Főkomponens-elemzés (PCA) A főkomponens-elemzés [70] során a kiindulási X adatmátrix M darab korrelált változója (oszlopa) közötti összefüggések vizsgálatának megkönnyítésére az eredeti változókat egy olyan transzformációnak vetjük alá, amely új, korrelálatlan változókat eredményez. Ezek az új változók a főkomponensek, amelyek az eredeti változók lineáris kombinációi és úgy vannak sorba rendezve, hogy elől állnak azok, amelyek az eredeti változók együttes varianciájának (X mátrix összes elemére számított szórásnégyzetnek) a legnagyobb részéért felelősek. A leírt transzformáció ortogonális, ezért a kapott főkomponensek korrelálatlanok lesznek. A főkomponens-elemzés lényege, hogy az eredeti X mátrixot olyan megkötésekkel, mint ortogonalitás és normálás, felbontjuk két mátrix szorzatára, melyek közül az egyik az objektumokat (S: főkomponens érték, score mátrix), a másik a változókat (L: főkomponensegyüttható, loading mátrix) jellemzi: X N,M = S N,F L F,M ahol: N,M: a kiindulási adatmátrix dimenziója F: főkomponensek száma A főkomponens-elemzéssel az adatokat úgy adjuk vissza kevesebb dimenzióban, hogy új, nem korrelált változókat állítunk elő. Az adatok kevesebb dimenzióban történő leképezése alapvető fontosságú, hiszen N > 3 dimenziójú adatkészletek az ember mintázatfelismerő képessége számára felfoghatatlan, szemben az egy-, kettő- vagy háromdimenzióssal, melyben a kapcsolatokat, hasonlóságokat könnyen észrevesszük. A főkompones-elemzés többféle algoritmussal valósítható meg. Ezek közül a leggyakrabban használt a sajátérték-elemzés, a szinguláris érték szerinti felbontás, valamint a nemlineáris iteratív részleges legkisebb négyzetek módszere (NIPALS, Nonlinear Interative Partial Least Squares), melyek ismertetésétől itt eltekintenék. A főkomponenseket a maximum variancia kritérium alapján határozzuk meg úgy, hogy a hozzájuk tartozó sajátérték nagysága alapján sorba rakjuk őket. Minden rákövetkező főkomponens annak a varianciának a legnagyobb részét írja le, amelyet nem magyaráznak meg az előző főkomponensek. Ezek szerint az adatokban lévő variancia legnagyobb részét az első főkomponens hordozza, a másodikban pedig több információ van, mint a harmadikban. 16

A főkomponenseket (röviden FK) úgy tekintjük, mint egy új, derékszögű koordináta-rendszer tengelyeit, értékeiket pedig mint az eredeti X adatmátrixban lévő oszlopvektor elemeinek vetítéseit ezekre a tengelyekre. Ehhez az eredeti X mátrixot a főkomponensek értékeivé kell transzformálni. Az új koordináták az eredeti változók lineáris kombinációi lesznek. Általában nem szokás, nem érdemes az összes főkomponenst felhasználni az eredeti adatmátrix reprezentálására. Többféle heuresztikus és statisztikus kritérium létezik arra, hogy meghatározzuk a szükséges főkomponensek számát. Ilyen a megmagyarázott variancia bizonyos százaléka, amikor is a főkomponensek közül csak annyit használunk fel, amennyi a teljes variancia előre meghatározott százalékát megmagyarázza, valamint a sajátérték egyenlő 1 kritérium, a hegyomlás ábra és a keresztellenőrzés. A főkomponens-elemzés eredményeinek láthatóvá tételét rendszerint a főkomponensegyüttható (loading) és a főkomponens érték (score) ábrákkal oldják meg. Mivel a variancia nagy része rendszerint leírható kevés, 1, 2 vagy 3 főkomponens segítségével, az adatokat láthatóvá, érzékelhetővé tehetjük azáltal, hogy a főkomponenseket egymás függvényében ábrázoljuk. Ami a főkomponens-együttható ábrákat illeti, azokból a tulajdonságváltozók hasonlóságaira, korrelációira lehet következtetni. Itt természetesen nem az új változók, azaz nem a főkomponensek közötti korrelációról van szó, hiszen ezek ortogonálisak, hanem az eredeti tulajdonságváltozók és a főkomponensek közötti korrelációról. A főkomponens-elemzéssel kapott főkomponensek az adathalmaz teljes varianciáját magyarázzák meg és nem az egyes változók korrelációját, de szerencsés esetben a teljes varianciát befolyásoló adatok csak néhány változóhoz rendelhetőek, így az egyes főkomponenseknek fizikai értelem is tulajdonítható. 17

3. KÌSÉRLETI RÉSZ A folyadék-kromatográfiás méréseket egy Spectra Focus HPLC-s rendszeren (Thermoseparation Products, USA) végeztem, mely az alábbi egységekből állt: egy P2000 pumpából, egy AS3000 automata mintaadagolóból, egy UV2000 kétcsatornás UV detektorból, egy SCM1000 vákuumos gázmentesítő egységből és egy SN4000 interface-ből. Az adatgyűjtéshez és az adatok feldolgozásához a kromatográfiás rendszer PC 1000-es (verziószám 3.03) szoftverét használtam. Az általam vizsgált alkil-módosított, szilikagél-alapú állófázisok fizikai-kémiai tulajdonságaik tekintetében igen eltérőek voltak (1. táblázat). Az állófázisok között, az utószilanizált (end-capped) és nem utószilanizált töltetek mellett jelen volt egy olyan állófázis is, mely a töltetek új generációját képviselte. Ez a Merck által forgalmazott Chromolith SpeedROD volt, mely a többi állófázistól eltérően nem szemcsés, hanem egyetlen porózus, nagytisztaságú szilikagélből (3. generációs állófázis) készült monolit állófázis. Vizsgálataim ezen újfajta állófázis alkalmazhatóságára és besorolhatóságára is kiterjedt. A kolonnák holtidejét minden esetben fáziszavarással, az eluens injektálásával határoztam meg. Az állófázisok összehasonlításához négyféle tesztvegyületet használtam: benzoesavat (122 g/mol), N,N-dimetil-anilint (121 g/mol), Ciprofloxacint (331 g/mol) és Vankomicint (1449 g/mol). Ez utóbbi két vegyület a gyógyszeriparban gyakran használt antibiotikum, melyek a másik két vegyülettől eltérően nagyobb molekulatömeggel és több (különösen a Vankomicin) poláris csoporttal rendelkeznek. A vegyületek szerkezete, valamint a poláris csoportjaik számított pk a értékei a 2. ábrán láthatók. A pk a értékek számítását, a Vankomicint kivéve, Pallas 3.0 pk a és lgd számoló szoftverrel végeztem. A Vankomicin poláris csoportjainak pk a értékét a Vankomicin nagy molekulatömege (1449 g/mol) miatt Marvin Sketch pk a és lgd számoló szoftverrel határoztam meg. A Ciprofloxacin poláris csoportjaira általam számított pk a értékekkel közel megegyező pk a értékeket publikált Maurer [95], valamint Ross és Riley [96] is. A vizsgálataimhoz 25 mm KH 2 PO 4, valamint trietil-aminra nézve 25 mm trietil-amin foszfát puffereket használtam. A pufferek ph-ját az egyes vegyületek esetében az alábbi értékekre állítottam be: 2,00 ± 0,05 benzoesav, 7,50 ± 0,05 N,N-dimetil-anilin, 3,00 ± 0,05 Ciprofloxacin és 2,80 ± 0,05 Vankomicin esetében. A ph pontos beállításához 18

1. táblázat: A vizsgált kromatográfiás állófázisok fizikai-kémiai jellemzői. Nucleosil 100-C-8 LiChrosorb RP-select B LiChrospher RP-18 Purospher RP-18e Prontosil 120-5-C18-AQ Symmetry C-18 Chromolith SpeedROD RP-18e 250 4 mm 250 4 mm 100 4 mm 125 3 mm 120 5 mm 150x4,6 mm 50 4,6 mm Alapszilikagél Nagy fémtartalmú (A típusú) Nagytisztaságú (B típusú) Állófázisok besorolása I. generácós állófázis II. generációs állófázis III. generációs állófázis Szemcseátmérő [µm] 5 ± 1,5 5 5 5 5 5 Egyetlen porózus szilika rúd Pórusátmérő [Å] 100 60 100 120 120 100 120 Makropórus / mezopórus méret 2 µm / 13 nm Pórustérfogat [ml/g] 1 0,75 1,25 1 1 0,90 1 Fajlagos felület [m 2 /g] 350 300 350 350 300 335 300 Borítottság [µmol/m 2 ] Nem ismert 4,21 3,61 Nem ismert Nem ismert 3,13 Nem ismert Tányérszám [Nm -1 ] Nem ismert 55.000 55.000 > 80.000 Nem ismert Nem ismert Nem ismert C tartalom[%] 9,0 11,4 21,0 18,0 13,0 19,1 17,0 ph stabilitás 1 9 2 7,5 2 7,5 2 7,5 2-7 2 8 2-7 Fémtartalom [ppm] < 350 > 350 < 350 < 5 < 1 < 10 < 10 Utószilanizált Nem Nem Nem Igen Igen Igen Igen 19

2. ábra: A tesztvegyületek szerkezete és poláris csoportjaik számított pk a értékei (az egyes csoportok pk a értéke a csoportok mellett látható): a: N,N-dimetil-anilin, b: benzoesav, c: Ciprofloxacin, d: Vankomicin H C N CH 3 3 5.06 O OH 4.20 F O 6.27 COOH N HN 9.08 a b c N 9.36 NH 2 OH OH H 3 C HO CH 3 O O CH 2 OH O O O O O HO H 9.80 HN N H O 8.71 COOH 3.18 Cl H H H N O N H O Cl d H O H NH CONH 2 OH H 3 C CH 3 O N H H 9.01 NH 6.32 H 3 C OH HO OH 8.46 N,N-dimetil-anilinnál kálium-hidroxidot, a többi vegyületnél pedig tömény foszforsavat használtam. A mozgófázisok acetonitrilt vagy metanolt tartalmaztak apoláris komponensként. Minden egyes állófázis és tesztvegyület esetében a mozgófázis szerves oldószer tartalmát úgy változtattam, hogy a vizsgált komponens retenciós faktorának tizes alapú logaritmusa a 0,1 1,3 tartományban 0,1-ekkel változzon. Az állófázisok összehasonlításának alapjául szolgáló elméleti tányérszám (N) és szimmetria faktor értékeket (A S ) minden egyes mérési pontban (1-8. melléklet), az Európai Gyógyszerkönyvnek (European Pharmacopoeia) [97] megfelelően, a következő összefüggések alapján számítottam: 20

ahol N t = 5, 54 w R h 2 t R : a vizsgált komponens retenciós ideje w h : a vizsgált komponens félértékmagasságnál mért csúcsszélessége A s = w0,05 2d ahol w 0,05 : a vizsgált komponensnek a csúcsmagasság 1/20 részénél mért csúcsszélessége d: a vizsgált komponens csúcsmaximumából az alapvonalra állított merőleges távolsága a kromatográfiás csúcs burkoló görbéjétől a csúcsmagasság 1/20 részénél A ph pontos beállításához Radiometer 28 ph-mérőt (Radiometer, Dánia), az eluensek gázmentesítéséhez pedig Realsonic RS-95 SF ultrahangos kádat (Magyarország) használtam. Mind a négyféle tesztvegyületből 0,1 mg/ml-es oldatot készítettem, melyekből 20-20 µl-eket injektáltam. Az alkalmazott áramlási sebesség Vankomicin esetében 0,5 ml/perc, a másik 3 vegyület esetében pedig 0,6 ml/perc volt. Az egyes komponensek detektálása maximális UVelnyelésük hullámhosszán, azaz benzoesavnál és Vankomicinnél 230 nm-en, N,N-dimetilanilinnél 250 nm-en és Ciprofloxacinnál 280 nm-en történt. A felhasznált vegyszerek és standardok minősége az a következő volt: acetonitril és metanol (Labscan, Irország) gradiens minőségű; trietil-amin (Aldrich, USA), kálium-dihidrogénfoszfát, cc. foszforsav és kálium-hidroxid (Reanal, Magyarország) analitikai minőségű. A pufferek elkészítéséhez a HPLC-s tisztaságú vizet Millipore Milli-Q (Bedford, USA) víztisztító rendszerrel állítottam elő. A vizsgálatokhoz felhasznált Ciprofloxacin Ciprobay infúziós oldatként (2 mg/ml Ciprofloxacin hydrochlorid) a Bayer AG (Németország), a Vankomicin, mint infúziós oldat (50 mg/ml Vankomicin hydrochloride) a Lilly Deutschland GMBH (Németország,), a benzoesav (> 99.5 %) és az N,N-dimetil-anilin (99 %) pedig a Sigma-Aldrich (Gillingham, UK) által forgalmazott termékek voltak. 21

4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 4.1. Szilikagél-alapú állófázisok összehasonlítása poláris csoportot tartalmazó tesztvegyületekkel A rendelkezésre álló nagyszámú mérési adat (1-8. melléklet) közül, mind a négy vegyület esetén csak a lgk = 0,1 és lgk = 1,0-nél mért elméleti tányérszám és szimmetria faktor értékeket használtam fel az állófázisok összehasonlítására. A vizsgálat alapjául azért választottam a lgk = 0,1 és 1,0-nél mért elméleti tányérszám és szimmetria faktor adatokat, mert a vizsgált lgk = 0,1-1,3 tartományban a lgk = 0,1-nél a legjelentősebbek az állófázison kívüli zónaszélesítő hatások (injektált térfogat, detektor térfogat, stb.), valamint az állófázis felületi heterogenitásából eredő hatások (reagálatlan szilanol csoportok, fémionok). A lgk = 1,0-nél (k = 10), amely egy általánosan használt visszatartás érték a kromatográfiában, a fentebb említett effektusok már kevésbé jelentősek. A még így is jelentős számú mérési adat összevetése komoly nehézséggel járt és sok időt vett igénybe. Kromatográfiás szempontból az állófázisoktól azt vártam el [97], hogy a rajtuk vizsgálni kívánt komponens(ek)re teljesüljön, hogy az N > 20000 Nm -1 és 0,8 < A S < 1,8. 4.1.1. Állófázisok összehasonlítása egyszerű, monofunkciós tesztvegyületek alkalmazásával Az állófázisok felületét, a fellépő különböző kölcsönhatásokat benzoesavval és az N,N-dimetil-anilinnel próbáltam jellemezni. Az N,N-dimetil-anilint (pk a = 5,06) ph = 7,50-on vizsgáltam az ioncserés kölcsönhatások elkerülése végett. Ezen a ph-n valamennyi N,N-dimetil-anilin disszociálatlan (Ph-N(CH 3 ) 2 ) formában volt jelen. A nagy fémtartalmú szilikagélből készült állófázisok esetében a reagálatlan szilanol csoportok kis pk a értékük (pk a 5) miatt teljes egészében ionizált (Si-O - ), míg a nagytisztaságú vagy dezaktivált szilikagélek esetén (pk a 6) ionizációjukban részben visszaszorított formában voltak jelen. Ioncserés kölcsönhatások fellépésével ezért ebben az esetben nem kellett számolnom. A visszatartást és a kromatográfiás paramétereket csak a hidrofób és a hidrogén-hidas kölcsönhatások határozták meg. 22

A benzoesavat (pk a = 4,20) ph = 2,00-on vizsgálva, az N,N-dimetil-anilinnél előbb már említett kölcsönhatásokkal kellett csak számolnom. A felületi szilanol csoportok (függetlenül az alapszilikagél fémtartalmától) és a benzoesav molekulák ionizálatlan formában voltak jelen az alkalmazott ph-n. A 2-3. táblázatban a benzoesav és az N,N-dimetil-anilin esetében, a különböző állófázisokon lgk = 0,1-nél és lgk = 1,0-nél mért szimmetria faktor (A S ) és elméleti tányérszám (N) értékek láthatóak. A táblázatokban használt rövidítések: N: Nucleosil, Lb: LiChrosorb, L: LiChrospher, Pu: Purospher, P: Prontosil, Sy: Symmetry, Sp: Chromolith SpeedROD, M: metanol, A: acetonitril, T: trietil-amin foszfát puffer. Amennyiben az A vagy az M után már más betű (T) nem áll (pl.: PA, LM, stb.), úgy azokban az esetekben KH 2 PO 4 puffer tartalmú mozgófázist használtam. Ezek alapján például az NM: Nucleosil állófázis metanol KH 2 PO 4 puffer összetételű eluens estében; NMT: Nucleosil állófázis metanol trietil-amin-foszfát puffer összetételű eluens esetében. 23

2. táblázat: A mért szimmetria faktor (A S ) értékek lgk = 1,0 és 0,1-nél benzoesavra és N,N-dimetilanilinre, valamennyi vizsgált álló- és mozgófázis esetében. Benzoesav A S [ ] N,N-dimetil-anilin A S [ ] lgk = 1,0 lgk = 0,1 lgk = 1,0 lgk = 0,1 0,837 (LM) 0,848 (SpM) 0,947 (LbMT) 0,881 (NAT) 0,864 (NM) 0,861 (SpMT) 0,958 (NA) 0,887 (NA) 0,865 (LMT) 0,879 (SpA) 0,971 (NAT) 0,891 (NM) 0,892 (SpM) 0,883 (LM) 0,980 (SpA) 0,953 (NMT) 0,901 (SpMT) 0,896 (NMT) 0,993 (LMT) 1,008 (LbMT) 0,917 (PuMT) 0,900 (NM) 0,994 (SpAT) 1,123 (SyMT) 0,921 (NA) 0,903 (SpAT) 1,003 (LbM) 1,128 (LMT) 0,931 (NAT) 0,967 (LMT) 1,012 (SyMT) 1,138 (SyAT) 0,951 (NMT) 0,969 (PuMT) 1,020 (NMT) 1,152 (LbM) 0,982 (SpAT) 0,984 (NAT) 1,026 (LAT) 1,171 (LAT) 1,025 (PMT) 0,990 (NA) 1,044 (SyAT) 1,187 (SyA) 1,095 (SpA) 1,018 (PMT) 1,046 (SpMT) 1,192 (LM) 1,181 (PAT) 1,087 (LAT) 1,063 (SpM) 1,224 (SyM) 1,186 (SyMT) 1,098 (PAT) 1,087 (SyM) 1,241 (PuMT) 1,203 (PM) 1,098 (PuAT) 1,091 (PuMT) 1,260 (PuM) 1,215 (PuAT) 1,120 (PM) 1,092 (NM) 1,282 (PuAT) 1,216 (LAT) 1,122 (LA) 1,108 (SyA) 1,292 (PuA) 1,239 (LbMT) 1,127 (SyMT) 1,119 (PuM) 1,339 (PMT) 1,262 (LA) 1,273 (PA) 1,125 (PuAT) 1,384 (LA) 1,334 (SyM) 1,314 (SyM) 1,129 (LA) 1,387 (SpAT) 1,366 (LbAT) 1,364 (SyAT) 1,148 (LM) 1,402 (SpMT) 1,407 (SyAT) 1,478 (SyA) 1,215 (PuA) 1,407 (PAT) 1,412 (SyA) 1,576 (LbMT) 1,243 (PMT) 1,419 (SpM) 1,418 (PuM) 1,586 (LbAT) 1,255 (PM) 1,420 (PA) 1,435 (LbM) 1,899 (LbM) 1,287 (PAT) 1,445 (SpA) 1,452 (LbA) 2,071 (LbA) 1,325 (PA) 1,462 (PM) 1,453 (PA) 2,195 (PuM) 1,651 (LbAT) 1,789 (LbAT) 1,845 (PuA) 2,678 (PuA) 1,714 (LbA) 1,903 (LbA) 24