Az Egészségügyi Minisztérium szakmai irányelve. A tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájáról. I. Alapvetõ megfontolások

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3405 egfr >15 ml/perc/1,73 m 2 : végstádiumú veseelégtelenség Vesepótló kezelés elkezdése mérlegelendõ. Teendõ: szoros, 1-3 havonta történõ nephrológiai gondozás, ennek során egfr meghatározás is. Vesepótló kezelés elkezdése klinikai tünetektõl függõen diabetes nephropathiában általában 10-15 ml/perc/1,73m 2, egyéb betegekben 8-12 ml/perc/1,73m 2 esetén indokolt. Dialízált betegben az egfr nem alkalmas a maradék vesefunkció megítélésére. Irodalom: 1. Javaslat a vesefunkció laboratóriumi vizsgálatára felnõttekben. Nephrológiai Útmutató Szerk: Túri S., Mátyus J., Kiss I., Kárpáti I. Medition 2005; 5-9. 2. Az angol Royal College of Physicians 2006-os ajánlása: www.renal.org/ckdguide/full/ukckdfull.pdf 3. National Kidney Disease Education Program, Suggestions for Laboratories www.nkdep.nih.gov/resources /laboratory_reporting.htm 4. K. Murthy, L.A. Stevens et al.:, Variation in the serum creatinin calibration. Kidney International 2005; 68:1884-1887. 5. P. Delanaye, J.M. Krzesinski.: The New Mayo Clinic Equation for Estimating Glomerular Filtration Rate. Ann. Internal Medicine 2005;142(8): 679-680. (Amennyiben idõközben új bizonyítékok jelennek meg a szakirodalomban az útmutató frissítését a kiadók biztosítják.) A szakmai irányelv érvényessége: 2010. szeptember 30. Az Egészségügyi Minisztérium szakmai irányelve A tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájáról Készítette: az Orvosi Mikrobiológiai Szakmai Kollégium I. Alapvetõ megfontolások 1. A protokoll alkalmazási / érvényességi területe 1.1. A protokoll témája a tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikája a járó- és fekvõbeteg szakellátásban. 1.2. A protokoll célja az egységes hazai gyakorlat kialakítása, figyelembe véve a témában meghatározó jelentõségû nemzetközi (WHO, IUATLD, EuroTB, ECDC) és más külföldi szervezetek (CDC, FDA) ajánlásait és az érvényben lévõ hazai rendelkezéseket. 1.3. A protokoll célcsoportjai (a protokollt alkalmazó ellátók köre): mikrobiológiai laboratóriumok mycobacteriológiai részlegei, önálló mycobacterologiai laboratoriumok, klinikai osztályok, szakrendelõk, pulmonológiai gondozó hálózat 1.4. Ellátottak: tuberkulózis fertõzés és megbetegedés gyanúja, tuberkulózissal fertõzöttek, tuberkulózis betegségben szenvedõk, tuberkulózis betegségre veszélyeztetettek. 1.5. A protokollt alkalmazó ellátók: mycobacteriológiai diagnosztikát végzõ mikrobiológiai laboratóriumok. 1.6. Ellátási szint: II. és III. kompetencia szintû mikrobiológiai laboratóriumok, melyek mycobacteriológiai diagnosztikát, mycobacteriológiai laboratóriumi szakellátást végeznek. 2. Definíciók Bakteriológiailag igazolt eset Bakteriológiailag nem igazolt eset Újonnan igazolt eset Korábban tuberkulózis miatt már kezelt eset Antituberculotikum rezisztens tuberkulózis, polyrezisztens, multi-drug rezisztens (MDR) és extensively-drug rezisztens (XDR) eset

3406 EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 21. szám II. Diagnosztikai eljárások Tuberkulózis gyanúja esetén a mikrobiológiai diagnosztikai módszerek széles skálájával és korszerû technikáinak felhasználásával (direkt mikroszkópos vizsgálatok, tenyésztés, identifikálás, nukleinsav amplifikációs technikák) törekedni kell arra, hogy a fertõzõ ágenst a lehetõ legrövidívebb idõn belül igazoljuk, és a definitív diagnózist követõen a rezisztencia vizsgálatok eredményét a kezelõ orvossal közöljük. Kötelezõ (minimálisan elvégzendõ) mikrobiológiai diagnosztikai vizsgálatok és azok gyakorisága A tuberkulózis definitív diagnózisa felállításának alapfeltétele a M. tuberculosis-nak a beteg testnedveibõl (köpet, pleurális folyadék, vizelet, hörgõmosó folyadék, stb) tenyésztéssel történõ kimutatása, vagy a kórokozó direkt nukleinsav amplifikációs módszerekkel történõ detektálása direkt mikroszkópos vizsgálattal kapott saválló pozitivitás mellett. A diagnózis felállításához minimum három, maximum öt adekvát vizsgálati mintára van szükség. A terápiában még nem részesült, vagy két hónapnál kevesebb ideig kezelt beteg elsõ M. tuberculosis tenyészetébõl a kezdeti rezisztencia vizsgálatok kötelezõen elvégzendõk. Ismert fertõzés fennállásakor pedig követni kell a beteg fertõzõképességét (mikroszkópos vizsgálatok), és monitorozni kell a gyógyulás folyamatát (tenyésztés és rezisztencia vizsgálatok). A kezelés 4. hónapját követõen is baktériumot ürítõ beteg esetén a rezisztencia vizsgálat megismétlendõ. A beteg akkor tekinthetõ gyógyultnak, ha a kezelés alatt, illetve annak befejezése után megfelelõ számú negatív tenyésztési lelettel igazolták, hogy nem ürít baktériumot. 1. Szakmai háttér A mycobacteriológiai laboratóriumok alapvetõ szerepet játszanak a tuberkulózis elleni hatékony védekezésben, hiszen a definitív klinikai diagnózis felállításához nélkülözhetetlen feltétel a kórokozó baktérium izolálása és identifikálása. A mycobacteriológiai vizsgálatok elengedhetetlen információkat szolgáltatnak az antituberkulotikum kezelés összetételének meghatározásához, valamint a kezelés hatásosságának monitorozásához is, részben a kórokozó kimutathatóságával, részben az izolálást követõ rezisztencia vizsgálatok eredményeivel. Magyarországon a bakteriológiailag igazolt TBC-s betegek aránya évek óta mindössze 46 % körüli értéken van. Ennek okai között szerepet játszik, hogy az ország legtöbb TBC laboratóriumában jelenleg alkalmazott bakteriológiai módszerek érzékenysége nem megfelelõ illetve, hogy a betegek egy jelentõs százalékában (bakteriológiailag negatív esetek egyharmadában) egyáltalán nem készül tenyésztés, illetve az adatközlés nem megfelelõ. További gond, hogy a tenyésztés és az ebbõl végzett rezisztencia meghatározás átfutási ideje klinikai szempontból elfogadhatatlanul hosszú. Így a terápia rezisztens betegek idõbeni felismerése, illetve érzékeny mycobacterium okozta fertõzés esetében a kezelés 8. hetének végén szükséges gyógyszer kombináció szûkítés, valamint a kezelés hatékonyságának megfelelõ monitorozása megoldatlan. Ezt a megállapítást támasztják alá a gyógyszeredmények, melyek szerint a gyógyult betegek aránya nem éri el a 60 %-t, a nemzetközi 80 %-os elvárásokkal szemben. 2. Bakteriológiai vizsgálatok 2.1 Mintavétel, mintatovábbítás, tárolás (1-3) A tuberkulózis és az egyéb mycobacterialis fertõzések megbízható, pontos és fõleg gyors mikrobiológiai diagnosztikájának alapja a megfelelõ mennyiségû, minõségû, és kellõ számú minta továbbítása a laboratóriumba. Az inadekvát mintavételbõl fakadó problémákat a legmodernebb molekuláris biológia módszerek sem képesek kiküszöbölni. Nagyon fontos, hogy a minták késedelem nélkül megérkezzenek a laboratóriumba, mivel egyes vizsgálatok átfutási idejét (pl. mikroszkópos vizsgálat és direkt nukleinsav amplifikáció eredménye 24 órán belül) és minõségét (tenyészetek befertõzõdése) nagyban befolyásolhatja, ha a vizsgálati anyagot a laboratórium mintavételt követõ 24-48 órán belül nem kapja kézhez. Mycobacteriológiai vizsgálatra alkalmatlan a nyálköpet, a gyûjtött köpet, a tamponnal vett garat és sebváladék. A reggeli, ébredés utáni köpet begyûjtésére kell törekedni. A felköhögött köpetet a beteg ürítse az erre a célra rendszeresített steril edénybe. A legmegfelelõbb a 30-50 ml térfogatú, steril, milliliteres beosztású, kónuszos aljú, csavaros fedelû, mûanyag centrifugacsõ. Optimális esetben a köpet 5-10 ml térfogatú. Ügyelni kell a mintavételi csövek megfelelõ címkézésére az azonosíthatóság érdekében. A mintavételi edények 1-2 órán át szobahõmérsékleten, 24-72 órán át 2-8 C-n hûtõben tárolandók. Nagyobb nyári meleg esetén érdemes azonnal hûtõszekrényben tárolni a mintákat. Amennyiben a laboratórium nem házon belül van, akkor a centrifuga csöveket jól

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3407 zárható fémtartályokba, majd ezeket papírdobozba csomagolva a megfelelõ kísérõ papírokkal ellátva kell továbbítani a laboratórium részére. Egyebekben 121/ 2000 Postaügyi értesítõ 32. Fertõzõ anyagok kezelése címû utasítása a mérvadó. A kísérõlap feltétlenül tartalmazza a beteg adatai mellett, hogy a kért vizsgálat célja a diagnózis felállítása/megerõsítése, vagy a kezelés eredményességének ellenõrzése. Fel kell tüntetni azt is, hogy korábban tuberkulózis miatt nem kezelt, vagy tuberkulózis miatt már korábban is kezelt betegtõl származik-e a vizsgálatra küldött minta. Ha ismert, fel kell sorolni azokat az antituberkulotikumokat (legfõképpen a rifampicin vonatkozásában) is, amelyekre a beteg izolátuma a korábbi vizsgálatok során rezisztens volt. Utóbbi információk kiemelten fontosak a rezisztencia vizsgálatok indítása és értékelése szempontjából a laboratórium és a klinikus számára is. Amennyiben a beteg alkalmatlan értékelhetõ köpet adására úgy meg lehet kísérelni hypertoniás (5-10%) sóoldattal való inhaláltatást követõen ún. indukált köpet gyûjtését, illetve ébredés utáni, még az ágyban levett éhgyomori gyomorbennék aspirátum (és nem mosás) nyerését. Négy órát meghaladó tárolás esetén a gyomorsav mycobacteriumokat is elölõ hatását 100 mg steril szódabikarbona segítségével semlegesíteni kell. A köpeten kívül a leggyakrabban beküldésre került minták a következõk: bronchusmosó folyadék, bronchoalveoláris lavage, pleurális, pericardiális vagy ascites folyadék (steril edényben, utóbbi három esetében 0,2 mg/ml steril heparin hozzáadásával vagy közvetlenül folyékonytáptalajba oltva), vizelet (> 40 ml, reggeli középsugár vagy katéteres, nem gyûjtött, nem katéter zsákból, kellõ genitális toalettet követõen), széklet (> 1 g), liquor (> 2-5 ml), seb vagy tályogváladék (steril fecskendõbe felszívva amennyit csak lehetséges), menstruációs folyadék, biopsziás minta (nem formalinba ágyazott, csak fiziológiás sóoldatban). A ritkábban elõforduló minták esetében a mintavétel elõtt érdemes a laboratórium tanácsát kérni a mintavételi, tárolási és szállítási elõírásokat illetõen. A mikroszkópos vizsgálatokat minden alkalommal három különbözõ alkalommal levett mintából, a tenyésztéseket öt különbözõ alkalommal levett mintából kell végezni. 2.2 A minta elõkezelése: homogenizálás, dekontaminálás (1-4, 6) A minta elõkezelése, homogenizálása, dekontaminálása a fertõzés veszély elkerülése érdekében laminális box-ban (minimálisan BSL2) kell hogy történjen. A mycobacteriumok osztódási ideje meglehetõsen hosszú (16-20 óra) ezért a nem steril testtájékokról származó minták (pl. köpet, vizelet, széklet) nem mycobacteriális, ún. kontamináns baktériumai számottevõen gyorsabb növekedési ütemüknek köszönhetõen könnyen túlnõhetik az adott klinikai minta mycobacteriumait. Az álnegatív eredmények elkerülése céljából a mycobacteriológiai laboratóriumok ezeket a klinikai mintákat ún. dekontaminációs eljárásnak vetik alá. A dekontamináció steril minták esetében (pl. liquor, pleurális folyadék) nem szükséges. A dekontaminálás során alkalmazott vegyszerek a kontamináns baktériumok vagy gombák elölésén kívül segítenek a gyakran erõsen purulens minták homogenizálásban, valamint a centrifugálási lépések közbeiktatásával azok koncentrálásában is. A dekontaminálás hatékonyságát befolyásolja az alkalmazott reagens toxicitása, expozíciós ideje, és a centrifugálási lépés során keletkezõ hõ károsító hatása. Mindezektõl függõen még a legenyhébbnek számító dekontaminálási módszer a N-Acetyl-L-Cystein-NaOH (NALC-NaOH) is elpusztítja a minta mycobacterium tartalmának legalább 33%-át, míg erõsebb reagensek (pl. klórhexidin digluconikum) alkalmazása esetén ez az érték könnyen 70%-ra emelkedhet, amely jelentõsen csökkentheti a tenyésztés érzékenységét. A táptalaj beszennyezõdés mértékébõl következtetni lehet az alkalmazott eljárás helyességére. Így szilárd táptalajon a 3%-nál alacsonyabb, ill. folyékony táptalajt használva az 5-8 %-nál alacsonyabb kontaminációs ráta esetén a dekontaminálás túl erõs, míg az ezen értékek feletti arány túl gyenge dekontaminálásra utal. Többféle elõkezelési technika ismert. A hazai TBC tenyésztéssel foglalkozó laboratóriumok 1976 óta egységesen a klórhexidinum-digluconatos eljárást alkalmazzák, ami a maga idejében egyszerûsége, olcsósága miatt megfelelõ választás volt. A módszer nem túl munkaigényes, egyszerûen kivitelezhetõ, nem kell a vizsgálati anyagot centrifugálni, semlegesíteni, ezért tömeges minta feldolgozására is kiválóan alkalmas. Számításba kell azonban venni, hogy közel 30 évvel ezelõtt a laboratóriumok a mai mintaszámnak több mint hússzorosát dolgozták fel. A módszer hátránya, hogy jobban károsítja a mycobacteriumokat, mint a NALC-NaOH technika, és csak szilárd alapú tenyésztéshez alkalmazható. A két eljárás összehasonlító vizsgálata szerint a LJ-en történõ tenyésztés pozitivitásának aránya közel duplájára emelkedett a NALC-NaOH elõkezelés mellett. A klórhexidines módszer folyékony táptalajon történõ tenyésztésre alkalmatlan (roncsolja a táptalajt), így napjainkban az újabb folyékony alapú táptalajok hazai elterjesztésének gátjává vált. Ezen okok miatt a CDC, valamint a jelentõsebb nyugat-európai mycobacteriológiai referencia laboratóriumok is a NALC-NaOH elõkezelést ajánlják. A folyékony tenyésztõ rendszerek rutinszerû alkalmazásának feltétele az adekvat elõkezelési technika használata, ezért elengedhetetlen ennek az új módszernek a fokozatos hazai bevezetése.

3408 EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 21. szám Bizonyos betegcsoportok megkülönböztetett figyelmet igényelhetnek a dekontaminálás vonatkozásában. Így például a cisztikus fibrózisban szenvedõ betegek légúti mintájából egyre gyakrabban kerül izolálásra klinikai szignifikanciával (pl. transzplantálhatóság kérdése) bíró Nem Tuberculosist okozó Mycobacterium (NTM). Azonban a betegek 80%-ban a minta P. aeruginosa-t is tartalmaz, amely könnyedén túlnövi a tenyésztés során a mintában jelenlévõ NTM-ot, és álnegatív tenyésztéshez vezet még a rutinszerûen alkalmazott dekontaminálási módszerek mellett is. Ezért az ilyen betegek esetében speciális 5% oxálsavas kezeléssel kiegészített dekontaminálás javasolt. 2.3 Direkt vizsgálatok 2.3.1 Mikroszkópos vizsgálatok (1-3, 6, 9-12) A direkt mikroszkópos vizsgálat a mycobacteriológiai vizsgálatok legolcsóbb, legegyszerûbben kivitelezhetõ és leggyorsabb módszere. Egyes laboratóriumokban a minta a dekontaminálás elhagyásával, közvetlenül kerül mikroszkópos vizsgálatra, az így készült keneteket direkt keneteknek, az így végzett vizsgálatotokat direkt mikroszkópos vizsgálatnak nevezzük. A mikroszkópos vizsgálat leggyakoribb módja azonban hogy a minták dekontaminálásra kerülnek és a mikroszkópos kenet nem közvetlenül a klinikai mintából, hanem a minta elõkezelt, centrifugált üledékébõl készül. Magasabb érzékenysége miatt a direkt módszerrel szemben ez a módszer választandó, azonban tudni kell, hogy a dekontaminálás során felhasznált steril desztillált víz tartalmazhat elölt saválló környezeti baktériumokat, amelyek fals pozitívvá tehetik a kenetet, ezért ilyenkor szûrt, steril desztillált víz használata ajánlott. A kenetkészítést követõen a festés a Ziehl-Neelsen (ZN), Kinyoun-féle karbol fukszin alapú vagy auramin alapú fluoreszans eljárásokkal történhet. A Kinyoun-féle festés alacsony érzékenysége miatt nem ajánlott módszer. A ZN festést követõen a mycobacteriumok vörös pálcákként észlelhetõek a kék, vagy zöld háttér kontrasztja mellett. Az auramin festést követõen a mycobacteriumok sárgás-zölden fluoreszkálnak fekete háttér mellett. A fluoreszans mikroszkópia elsõsorban azon laboratóriumok számára ajánlható, amelyek nagy esetszámmal dolgoznak. A sötét háttér mellett ugyanis a mycobacteriumok könnyebben észlelhetõk, a fluoreszcens mikroszkóp látótere nagyobb, mindezek miatt egy-egy kenet áttekintése gyorsabb. Ez a módszer azonban még a ZN vizsgálathoz képest is nagyobb gyakorlatot igényel, a kevésbé tapasztalt vizsgáló gyakran jelez vissza álpozitív eredményt, a fluoreszcein festékrögöket nézve baktériumnak. Emellett, a fluoreszcens festés a karbol fukszinhoz képest sokkal jobb hatásfokkal képes megfesteni az antituberkulotikum kezelés miatt már károsodott saválló baktériumokat, így a mikroszkópos pozitivitás a fluoreszcens festés mellett hosszabb ideig detektálható egy kezelt beteg esetében, amely nem feltétlenül jelenti azt, hogy a kezelés inadekvát vagy a beteg még mindig fertõzõ. További eltérés a ZN festéshez képest, hogy a mintában esetlegesen jelenlévõ vér álpozitivitást okozó fluoresceinciát eredményezhet. Mindezek miatt minden újonnan felismerésre került beteg esetében a fluoreszcens mikroszkópos pozitivitást ZN vizsgálattal meg kell erõsíteni. 2.2.1/a Módszer érzékenysége, specificitása: A mikroszkópos vizsgálat legnagyobb hátránya, hogy nem kellõen érzékeny és a negatív eredmény kiadásához minimum 100-300 látótér áttekintése szükséges, ami meglehetõsen munkaigényes. A mikroszkópos vizsgálat érzékenysége az adott beteg populáción belül a kiterjedt tuberkulózisban szenvedõ betegek hányadától, a vizsgált minta típusától (felsõlégúti vs. mélylégúti), a mintagyûjtés minõségétõl, a mycobacteriumok mintán belüli számától, az alkalmazott dekontaminálási és centrifugálási módszertõl (cytocentrifugálás), a centrifuga minõségétõl (legalább 3000 x g) függõen 50-75%. Míg a pozitív mikroszkópos eredmény a tuberkulózis preszumptív diagnózisa mellett szól, addig a negatív eredmény, az alacsony érzékenységi mutató miatt, nem zárja ki a tuberkulózis lehetõségét. Legalább 10.000 mycobacterium milliliterenkénti jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kenet teljes átvizsgálását követõen legalább néhány saválló pálcát találjunk. A mikroszkóposan pozitív betegek tehát megkülönböztetett figyelmet igényelnek, hiszen az általuk ürített baktérium mennyiség miatt ezek a betegek a legfertõzõbbek. Éppen ezért, hogy az ilyen esetben szükséges izolációs lépések idõben foganatosíthatóak legyenek, a mikroszkópos vizsgálat eredményét a laboratórium 24 órán belül vissza kell, hogy jelezze a vizsgálatkérõ számára. Nem szabad elfeledkeznünk azonban arról a tényrõl sem, hogy a mikroszkópia nem képes különbséget tenni élõ és élettelen mycobacterium között. Így egy megfelelõen kezelt és ellenõrzött beteg esetében a mikroszkópos vizsgálat negatívvá válást követõ esetleges pozitivitása nem feltétlenül a klinikai állapot romlásának a jele. Ugyancsak fontos szem elõtt tartani azt a tényt is, hogy a mikroszkópos vizsgálat nem tud különbséget tenni a M. tuberculosis complex és NTM-ok között. Azaz a kenet pozitivitás atípusos Mycobacterium jelenlétének eredménye is lehet, amely nem biztos, hogy klinikai fontossággal bír. Egy hazai felmérés szerint ugyan Magyarországon a mikroszkópos vizsgálat pozitivitásának hátterében az esetek több mint 90 %-ában M. tuberculosis jelenléte igazolható tenyésztéssel, de HIV

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3409 fertõzött vagy egyéb immunszuprimált betegek esetében, vagy olyan földrajzi területeken, ahol bizonyos NTM elõfordulási gyakorisága magas, mindig gondolni kell NTM jelenlétére is. Emellett az aerob Actinomycetaceae-k, legionellák egyes fajai is saválló pozitivitást mutathatnak. Mindezek miatt a mikroszkópos vizsgálat eredményét saválló baktérium pozitív vagy negatív megjelöléssel kell visszajelezni. 2.2.1/b Minõségbiztosítás: Pozitív és negatív kontrollt kell alkalmazni minden új festék sarzs használatánál. Minden kenet pozitív mintát és a negatívak legalább 10%-át egy második vizsgálónak ellenõriznie kell. Ugyancsak figyelemmel kell kísérni a mikroszkóposan pozitív és tenyésztéssel negatív betegek arányát is. Az ilyen betegek (elsõsorban az újonnan nyilvántartásba vett betegekrõl van szó) arányának kevesebb, mint 1%-nak kell lennie. Az ennél magasabb arány dekontaminálási, tenyésztési (táptalaj minõség, rövid inkubációs idõ) hibát, nehezen tenyészthetõ NTM (pl. M. haemophilum, M. genavense) jelenlétét vagy laboratóriumi keresztfertõzést jelezhet. 2.3.2 Direkt nukleinsav-amplifikációs módszerek (2,6,7,12,14,15) A direkt nukleinsav amplifikációs módszereknek (DNAM) a mycobacteriológiában való alkalmazása a lassan tenyészthetõ M. tuberculosis és a bizonyos speciális tenyésztési feltételeket igénylõ, ezért nehezen izolálható NTM-ok direkt (közvetlenül a klinikai mintából) történõ detektálásának gyors, 24 órán belüli kivitelezésének lehetõségét teremtette meg. A módszer minden mintából történõ rutinszerû alkalmazása szükségtelen. Mikroszkópos vizsgálattal pozitívnak bizonyuló mintából csak akkor javasolt a teszt elvégzése, ha olyan betegrõl van szó, akinél NTM kóroktani szerepe vetõdik fel (pl. HIV fertõzött, transzplantált beteg, cisztikus fibrózis esetében). A tesztek érzékenysége a mikroszkóposan pozitív légúti minták esetében közel 100 %. Mikroszkóposan negatív minták esetében csak akkor végezzünk ilyen vizsgálatot, ha a tuberkulózis diagnózisának felállítása komoly differenciáldiagnosztikai problémát jelent a rendelkezésre álló egyéb klinikai adatok tükrében. A tesztek érzékenysége ezen betegcsoport esetében függ az alkalmazott módszertõl, mérvadó irodalmi adatok alapján 70-90%. Az eredmények értékelése minding individuálisan történjék. Elengedhetetlen hogy a direkt nukleinsav amplifikációs vizsgálatra kerülõ mintákból a mikroszkópos és tenyésztéses vizsgálatok is elvégzésre kerüljenek. A módszerek légúti vizsgálati anyagokra vannak validálva, érzékenységük extrapulmonális minták esetében alacsonyabb. Extrapulmonális kórképekben a módszer szenzitivitását jelentõsen csökkenti a minta jellemzõen alacsonyabb csíraszáma, és az amplifikációt gátló inhibítorok jelenléte, amelyek aránya szignifikánsan magasabb, mint a légúti anyagokban. A központi idegrendszer tuberkulózisa a humán gümõkór legveszélyesebb formája, ezért ebben a kórképben a gyors diagnózis felállítása kiemelkedõen fontos. A publikált esetek alacsony száma és a módszerek elégtelen szenzitivitása miatt a meningitis basilaris diagnózisának gyors felállítására jelenleg nincs nemzetközileg ajánlott módszer. Az utóbbi idõben megjelent metaanalízis megállapítása szerint a DNAM technikák érzékenysége extrapulmonális esetekben a vizsgáló helyektõl és módszerektõl függõen széles határok között (27-85%) mozog. Meningitisben átlagosan 56% körüli. A Pulmonológiai Szakmai Kollégium a módszerek indikációjára vonatkozó 2000-ben kiadott korábbi állásfoglalása továbbra is mérvadó. Ennek megfelelõen a DNAM indikációi: Mikroszkóposan negatív, akut súlyos állapotú betegnél tuberkulózis gyanúja esetén (pl. lélegeztetést igénylõ pneumonia) Bármilyen rendkívüli sürgõsséget igénylõ esetben (pl. nem tüdõbetegellátó intézmény ellátására szoruló beteg esetében) Mikroszkóposan pozitív immunszuprimáltaknál NTM fertõzés fokozottabb veszélye miatt Szervtranszplantált betegeknél Fertõzési veszély vélelmének kizárására fokozottan veszélyeztetettek védelmében (mikroszkópos negativitás mellett) A DNAM legfontosabb elõnye, hogy 6-8 órán belül elvégezhetõek, ezért a klinikus részérõl elvárható, hogy az eredmények még a mintafeldolgozás napján, de legkésõbb 24 órán belül visszajelzésre kerüljenek. Jelenleg többféle kereskedelmi teszt van forgalomban, (Amplicor PCR-Roche Molecular Systems, Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test AMTD-Gen-Probe Inc., BDProbeTec-Becton-Dickinson, GenoType Mycobacteria Direct-HAIN, Genotype MTBDRplus-HAIN), amelyek a minta elõkezelésébõl, nukleinsav izolálásából, amplifikációból és detektálásból állnak, és minden egyes kit lépésenként más-más módszert alkalmaz. Egyes tesztek csak a M. tuberculosis complexet detektálják, mások a M. tuberculosis complexet és az isonicid (INH) és a rifampicin (RMP) rezisztenciához társuló mutációkat is, és megint mások a M. tuberculosis complexen belüli specieseket, ill. a

3410 EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 21. szám gyakori és klinikailag releváns nem tuberkulózist okozó mycobacteriumokat (NTM) is képesek kimutatni. A módszerek szenzitivitása alapvetõen a kenet pozitivitásának függvénye, de az alkalmazott tesztenként is változó. 2.4 Tenyésztés (1-6, 9, 11, 12) A mycobacteriológiai vizsgálatok következõ lépése a dekontaminált minta tenyésztése, amely továbbra is nélkülözhetetlen a következõ okok miatt: a tenyésztés érzékenysége nagyságrendekkel nagyobb, mint a mikroszkópos vizsgálatoké, a M. tuberculosis complexen belüli differenciáláshoz, a különbözõ NTM azonosításához, a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok elvégzéséhez (DNS ujjlenyomat vizsgálat) megfelelõ mennyiségû biomasszára van szükség, amelyet a tenyésztés biztosít, a rezisztencia vizsgálatok elvégzéséhez élõ kórokozót ugyancsak a tenyésztés biztosít. A mycobacteriumok izolálására használt talán legismertebb táptalaj a tojás alapú, szilárd Löwenstein-Jensen (LJ) táptalaj. Az agar alapú táptalajok, mint amilyen a Middlebrook 7H10 vagy 7H11 agar, a LJ táptalajhoz képest a némileg gyorsabb tenyésztési idõ, és a transzparenciájuk folytán megvalósítható egyszerûbb kolónia morfológia vizsgálat lehetõsége miatt kedveltek. Mindazonáltal, ezeken a hagyományos szilárd táptalajokon a M. tuberculosis telepei általában 3-6 hét elteltével jelennek csak meg. Az izolálást követõ identifikálás, majd rezisztencia meghatározás további 3-6 héttel növelheti ezt az amúgy is tetemes tenyésztési idõt. Mindemellett vizsgálatok azt is igazolták, hogy csak szilárd táptalajon tenyésztve a klinikailag egyértelmûen tuberkulózisként diagnosztizált betegek mintáit mintegy 20-30%-ban nem sikerült a M. tuberculosis izolálása. Ez az adat világosan jelzi, hogy a szilárd táptalajon való tenyésztés érzékenysége, bár lényegesen jobb, mint a mikroszkópos vizsgálaté, mégsem haladja meg a 70-80%-ot. A CDC és a WHO jelenlegi ajánlása az, hogy a TBC izolálása, identifikálása valamint az ezt követõ rezisztencia vizsgálatok lehetõleg a mintavétel idõpontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás) illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül történjenek meg. Ez az átfutási idõ nélkülözhetetlen ahhoz, hogy a klinikus a kezelés nyolcadik hetének végén el tudja dönteni, hogy az alkalmazott négyes kombinációból biztonsággal elhagyhatja-e a pyrazinamidot (PZA) és az ethambutolt (EMB). Ahhoz, hogy ez az ajánlás a gyakorlatban is megvalósítható legyen, nélkülözhetetlen az újabb, folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszerû alkalmazása. Folyékony táptalajon tenyésztve, a tenyésztési idõ a minta mycobacterium tartalmától függõen 1-3 hétre rövidíthetõ. Emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása 90% feletti. Hátrányuk, hogy jóval hajlamosabbak a befertõzõdésre. 2.4/a Módszer érzékenysége Bár a folyékony táptalajok alkalmazása jelentõsen csökkenteni képes a tenyésztési idõt, szilárd táptalajra azért továbbra is szükség van, mivel bizonyos törzsek nem növekednek jól folyékony miliõben. A tenyésztés érzékenységét jelentõsen befolyásolja a szilárd táptalaj ph értéke is. Felmérések azt jelzik, hogy a rutinszerûen alkalmazott ph 7-es LJ táptalaj nem felétlenül alkalmas minden Mycobacterium optimális tenyésztésére. Így olyan helyeken, ahol bizonyos NTM okozta megbetegedések gyakoribbak (pl. HIV fertõzöttek), vagy endémiásak szükség lehet egy savanyú ph érékû LJ-re vagy a ph 6 értékû Ogawa (Japánban elterjedt tojás alapú táptalaj) táptalajra való leoltásra is. A szilárd táptalaj további elõnye, hogy a növekedés kvantitatív formában is visszajelenthetõ, a kolónia morfológia és a pigment termelés is vizsgálható, illetve kellõ biomassza biztosítható az identifikálást segítõ biokémiai tesztekhez. Önmagában tehát sem a szilárd, sem a folyékony táptalaj érzékenysége nem éri el a 100%-ot, azaz mindkét táptalajtípus esetében elõfordulhatnak olyan törzsek, amelyek vagy csak az egyik vagy csak a másik táptalajtípuson képesek növekedni. Ez az oka, hogy jelenleg a nemzetközi ajánlásoknak megfelelõen a mycobacteriumok izolálása szilárd és folyékony táptalaj kombinációján kell, hogy alapuljon a kórokozó minél gyorsabb és érzékenyebb detektálása, valamint a rezisztencia vizsgálatok minél gyorsabb elvégezhetõsége érdekében. Amennyiben a beoltott szilárd vagy folyékony táptalajokon növekedés nem észlelhetõ, úgy negatív tenyésztési eredmény 8 illetve 6 hetes inkubálást követõen adható ki.

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3411 2.4/b Minõségbiztosítás az elõkezelési és tenyésztéses vizsgálatok ellenõrzéséhez Általános: Összes eszköz és berendezés szabályozott idõközönkénti kontroll vizsgálatát el kell végezni, különös tekintettel a laminális boxokra és a centrifugákra Naponként: Reagensek lejárati idejének kontrollja: a NALC-ot mindig a munkafolyamat kezdetén kell a NaOH-hoz adni, NALC-NaOH oldatot 24 órán túl nem szabad felhasználni Monitorozni kell a szennyezett minták százalékos elõfordulását: ha 10 elõkezelt mintát véres táptalajra inokulálunk, 24-48 óra múlva szennyezõ baktérium nem, ill. minimális mennyiségben tenyészhet csak ki. Ha ismételten azonos szennyezõ baktérium tenyészik ki, ellenõrizni kell az összes felhasznált reagens sterilitását. A dekontaminálás kezdetén és végén 1-1-csõ (5 ml) steril desztillált víz ill, fiziológiás só oldattal is el kell végezni a munkafolyamatot. Az elõkezeléshez használt reagenseket a munkafolyamat elõtt véres agárra kell oltani. Ellenõrizni kell a táptalajok és reagensek lejárati idejét. Minden új, házilagosan gyártott táptalaj sarzs minõségi vizsgálatát M. fortuitum (ATCC 6841), egy gyorsan növõ NTM-el ajánlott elvégezni. A kereskedelmi forgalomban kapható, minõségbiztosítási bizonylattal ellátott táptalajokat nem szükséges ellenõrizni, de a felhasznált táptalajok gyártási számát fel kell jegyezni. Hetente: Meg kell határozni a szennyezett tenyészetek százalékos elõfordulását. Szilárd táptalaj esetén a 5%, folyékony táptalaj esetén a 8-10 % kontamináció inadekvát elõkezelési munkafolyamatra utal. A < 3% szennyezõdés túl erõs dekontaminációt jelez. Havonta: Monitorozni kell a M. tuberculosis pozitív tenyészetek számát. Monitorozni kell a kenetben pozitív és tenyésztéssel negatív minták számát. Ha az ilyen minták száma meghaladja az 1 %-ot, ez túl erõs elõkezelésre, megfelelõ minõségû táptalajokra, különleges igényû mycobacteriumokra, vagy antituberculotikum kezelés alatt álló beteg mintájára utal. Monitorozni kell a kenet negatív, tenyésztéssel pozitív minták számát. Az elvárhatóság kb. 30%. Monitorozni kell a kenet negatív és mindössze egy pozitív tenyészettel rendelkezõ betegek számát. Monitorozni kell a kenetben és tenyésztéssel is pozitív esetek arányát. Az elvárt mérték 95 %. Monitorozni kell a tenyészetek pozitívvá válásának idejét külön a szilárd és folyékony táptalajok esetében mind kenet pozitív, mind a kenet negatív mintáknál A fenti értékektõl való szignifikáns eltérés nem megfelelõ elõkezelési eljárásra, vagy fals pozitív tenyészetek elõfordulására utal. Fals pozitív tenyészetek elõfordulása kenet pozitív mintákkal történõ kontamináció következtében: A mycobacteriológiai laboratóriumokban az elõkezelési és tenyésztéses eljárások során a vizsgálati anyag keresztfertõzése következtében fals pozitívvá válhat. A fals pozitív tenyészetek elfogadható aránya kb. 3%. A keresztfertõzés létrejöhet az elõkezelõszer adagolása, vagy a semlegesítés során az aerosol képzõdés miatt, esetleg a reagens csövek, vagy oldatok kontaminálódhatnak saválló baktériummal. Ez utóbbiak könnyen szennyezõdhetnek a vízben gyakran elõforduló atípusos mycobakteriumokkal (M. gordonae, M. xenopi), ha a felhasznált víz nem volt steril. A vizsgálati anyagok átfertõzõdésének esélyét csökkenti, ha a laminális boxban kisebb mennyiségû reagenst használunk, a manipulációk során alkalmanként csak egy minta csöve van nyitva, és a centrifuga csövek zárókupakját lassan nyitjuk ki az aerosol képzõdés csökkentése érdekében. 2.5 Identifikálás (1-3, 6, 11, 12) 2.5.1 Identifikálás hagyományos módszerrel A különbözõ Mycobacterium fajok egymástól való elkülönítésének, identifikálásának hagyományos útját a különbözõ hõmérsékleti szinteken mutatott növekedési sajátságok, a telepmorfológia és pigment termelés vizsgálata, valamint különbözõ enzimaktivitás vagy növekedésgátlás kimutatását célzó biokémiai reakciók elvégzése jelenti. Ezeknek a hagyományos identifikálási teszteknek a legnagyobb hátránya, hogy elvégzésük jelentõs mennyiségû biomasszát

3412 EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 21. szám igényel, amely szubkulturákra való átoltással és a primér izolálást követõen még további több hetes tenyésztéssel és idõveszteséggel jár. Emellett a vizsgálatok elvégzése munkaigényes, az eredmények értékelése sok esetben szubjektív. Az utóbbi évek során nagy számban írtak le olyan új NTM törzseket, amelyek identifikálása a hagyományos módszerek segítségével egyáltalán nem lehetséges, ezeket a fajokat csak az új molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával lehet felismerni. Mindezen okok miatt a hagyományos identifikálási módszerek szerepe világszerte igen jelentõsen visszaszorulóban van. A M. tuberculosis complex identifikálására és az ehhez szükséges alapvetõ hagyományos identifikálási módszerek elvégzésére (niacin, nitrát reduktáz teszt) minden mycobacteriológiai laboratóriumnak képesnek kell lennie. Az átfutási idõ mérséklésére azonban hazai viszonylatban is meg kell teremteni a molekuláris vagy egyéb gyors identifikálási módszerekhez való hozzáférés lehetõségét legalább a magasabb kompetenciájú, regionális laboratóriumok számára. 2.5.2 Identifikálás molekuláris biológiai és egyéb technikákon alapuló módszerekkel A kereskedelmi forgalomban napjainkban többféle identifikáló teszt kapható, amelyek különbözõ géntechnikai, kromatográfiás, vagy tömegspektrografiás módszert alkalmaznak a mycobacterium speciesek azonosítására. 2.5.2.1 Nukleinsav hibridizációs módszer: A kereskedelmi forgalomban hozzáférhetõ AccuProbe (Gen-Probe Inc., San-Diego, CA) nukleinsav hibridizációs teszt bevezetése jelentõsen meggyorsította a M. tuberculosis complex, a M. avium complex, a M. gordonae, és a M. kansasii identifikálását. Mivel a teszt nem alkalmaz amplifikációs lépést így közvetlenül a klinikai mintából való kórokozó kimutatásra alkalmatlan, pozitivitásához legalább 10 5 számú baktérium jelenléte szükséges. A teszt azonban kiválóan alkalmas a pozitív folyékony vagy szilárd tenyészetek esetében (ahol a teszt érzékenységéhez szükséges baktérium mennyiség többszöröse rendelkezésre áll) a kitenyészett saválló baktérium identifikálására 1-2 órán belül. 2.5.2.2 Reverz hibridizáción alapuló identifikáló tesztek: A tesztek során a speciális DNS szakaszt sokszorozzuk PCR segítségével, majd a DNS terméket egy tesztcsíkon elhelyezett, az egyes mycobacteriumokra specifikus próbákkal hibridizáltatjuk. Ez a rendszer a GenoType MTB-HAIN módszer esetében a M. tuberculosis complex-en kívül az összes jelenleg ismert klinikailag szignifikáns NTM kimutatására is alkalmas. Az InnoLipa (Innogenetics) módszerrel a M. tuberculosis complex, a M. avium, a M. intracellulare, a M. kansasii, a M. xenopi, a M. gordonae, a M. scrofulaceum, és M. chelonae azonosítható. 2.5.2.3 DNS szekvenálás: A DNS szekvenálás a mycobacteriumok identifikálásának jelenleg a legpontosabb módszere. Az egyes törzsek azonosításán kívül információval szolgál az egyes fajok filogenetikájáról és rokonsági fokáról is. A DNS szekvenálás során egyes gének olyan fajspecifikus szakaszainak bázissorrendjét határozzák meg, amelyet azután már ismert és jól karakterizált törzsek bázissorendjével vetnek össze. A referencia bázissorend adatbázis összeállítása történhet házilagosan, de kereskedelmi forgalomban árult adatbázisok is rendelkezésre állnak. A rutinalkalmazásban mintegy referencia módszerként legelterjedtebb DNS szekvenálás a 16S rrns hypervariábilis régiójának vizsgálatán alapszik. Automata DNS szekvenáló mûszer segítségével a vizsgálat 1-3 nap alatt elvégezhetõ. A DNS szekvenálás lehetõvé tette olyan NTM fajok felfedezését is, amelyek nem vagy nagyon nehezen tenyészthetõek, potenciálisan patogének, vagy egyelõre még nem kellõen karakterizáltak, nem minden szempontból ismertek (patogenitás, rezervoár, transzmisszió stb.). A módszer alkalmazása referencia laboratóriumban indokolt. 2.5.2.4 Magas hatékonyságú folyadék kromatográfia (high-performance liquid chromatography; HPLC): A Mycobacterium sejtfala fajonként változó és specifikus mycolsav összetételének gyors és pontos vizsgálati lehetõségét kínálja a HPLC, amellyel számos ismert, sõt új, korábban még azonosítatlan Mycobacterium faj identifikálása lehetséges. A HPLC berendezés megléte esetén a mérés olcsó és gyors, 2 órán belül elvégezhetõ. A módszer hátránya, hogy a szükséges mûszer költséges és az eredmények értékelése gyakorlatot, nagy tapasztalatot igényel. A módszer alkalmazása referencia laboratóriumban indokolt.

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3413 2.5.2.5 A tömeg-spektrometriás módszer egy olyan új, modern technika, amellyel a lézerrel ionizált sejt komponensek tömegét mérik, az eredményt egy detektoron regisztrálják, így megkapják az egyes speciesekre jellemzõ spektrum profilt. Egy software segítségével a spektrum profil alapján a törzs beazonosítható. A módszer alkalmazása referencia laboratóriumban indokolt. 2.5.2.6 A Capilia TB Test (Tauns, Numazu, Japan Nippon Becton-Dickinson Tokio: Az egyszerû és gyorsan elvégezhetõ, immunkromatografiás assay a M. tuberculosis complex-et különíti el a NTM törzsektõl. A módszer a M. tuberculosis törzsekre specifikus MPB64 protein és a gén által termelt monoklonális antitestek reakcióján alapszik. Pozitív reakció esetén a cellulóz membránhoz kötött anti-mpb64 monoklonális antitestek reakcióba lépnek a MPB64 proteinnel, és 15 percen belül egy piros gyûrû válik láthatóvá. A módszer specificitása a vizsgálatok szerint 100 %, és a szenzitivitása is 90 % feletti. 2.6 A M. tuberculosis és az NTM genotipizálása, molekuláris epidemiológiai vizsgáló módszerek (2,6) Az utóbbi években a DNS ujjlenyomat vizsgálat, a PCR alapú spoligotyping és VNTR-MIRU, (Variable Numbers of Tandem Repeats of Mycobacterial Interspersed Repetitive Units) valamint a tömeg spektrometriás módszerek segítségével lehetségessé vált a M. tuberculosis nagy pontosságú tipizálása. A spoligotyping és VNTR-MIRU technikák a PCR-el amplifikált DNS-t detektálják. A spologotipizálás dot blot módszerrel mutatja ki a speciális DR locuson a spacer szekvenciák jelenlétét, vagy hiányát, a VNTR-MIRU a különbözõ számban ismétlõdõ mycobacteriális repetitív egységeket detektálja azok mérete alapján. Ezekkel a módszerekkel az izolátumok un. clusterekbe sorolhatók, és a clonális tipizálásra kiválóan alkalmasak. A tömeg-spektrometriás módszerrel a lézerrel ionizált sejt fehérje komponensek tömegét mérik, egy detektoron regisztrálják, így megkapják a mycobacterium spektrum profilját, azaz a specifikus ujjlenyomatát. Jelenleg a molekuláris epidemiológia arany standard módszere a DNS ujjlenyomat Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) vizsgálat. Az enzimemésztés során nyert fragmentumok molekuláris mérete oly módon variálódik, hogy két nem rokon M. tuberculosis törzs egymástól eltérõ mintázatot mutat a jelölt IS6110 próbával való hibridizációt követõen. A DNS ujjlenyomat vizsgálatot sikeresen alkalmazzák különbözõ járványok vizsgálatára, a tuberkulózis aktív transzmissziójat befolyásoló rizikó tényezõk vizsgálatára (pl. antituberkulotikum rezisztencia), a konvencionális módszerekkel azonosíthatatlan kontaktok kiszûrésére és ezáltal a fertõzési lánc felderítésére, különbözõ veszélyeztetett szubpopulációkon belül a tuberkulózis transzmisszójának vizsgálatára, és a laboratóriumi keresztfertõzések okozta téves diagnózisok kiszûrésére. Az ezekben a helyzetekben szükséges prevenciós lépések meghatározásához és megtételéhez hazánkban is szükséges a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok bevezetése legalább a referencia laboratóriumban. 2.7 Rezisztencia meghatározás (1-3, 8,9, 11, 12) 2.7.1 Alapfogalmak Az eddigi genetikai vizsgálatok szerint a M. tuberculosis antituberkulotikumokkal szembeni rezisztenciájának megjelenéséért vagy a gyógyszer támadáspontját kódoló génekben, vagy a gyógyszer aktiválásáért felelõs enzimeket kódoló génekben kialakuló spontán pontmutációk a felelõsek. A rezisztenciával kapcsolatos pontmutációk, deléciók és inzerciók az összes elsõ vonalbeli szernél (isonicid {INH}, rifampicin {RMP}, pyrazinamid {PZA}, ethambutol {EMB} és már néhány másodvonalbeli újabb szernél (streptomycin, ethionamid, fluorokinolonok, makrolidek,) is felismerésre kerültek. Mindezek alapján nagy valószínûséggel kizárható egy olyan egyedüli gén jelenléte, amelynek mutációi önmagukban vezetnének a polirezisztens (rezisztencia RMP mellett több más antituberculotikummal szemben) illetve a multidrug rezisztens (MDR) (rezisztencia legalább INH-val és RMP-el szemben; MDR) fenotípus kialakulásához. Az extensively-drug rezisztens (XDR) Mycobacterium törzsek (rezisztencia RMP és INH mellett fluoroquinolonokra, és iv. adagolható kanamycin, capreomycin és amikacin-ra) megjelenése és terjedése tovább erõsíti azt az igényt, hogy a rezisztencia vizsgálat minden elõször izolált törzs esetében megtörténjen. Úgy tûnik, hogy a MDR és XDR több, egymással párhuzamosan, illetve lépcsõzetesen kialakuló mutációk sorozatának az eredménye a különbözõ génszakaszokon. Rezisztencia leggyakrabban a nem megfelelõ gyógyszeres kombináció és dózis, a beteg nem megfelelõ compliance következtében, az egyébként természetes körülmények között is mindig elõforduló, de csak igen kis kópiaszámban jelenlévõ mutáns törzsek szelektálódásával alakul ki. A Nemzeti Tuberkulózis Program szabályozásának megfelelõen minden újonnan felismerésre került, tuberkulózisban szenvedõ beteg elsõként izolált tenyészeteibõl kötelezõen rezisztencia vizsgálatokat kell végezni (kezdeti rezisztencia

3414 EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 21. szám vizsgálat). Ellenõrzõ rezisztencia vizsgálatok végzése akkor szükséges, ha a beteg kontroll tenyésztései a kezelés negyedik hónapja után is pozitivitást mutatnak, illetve ha radiológiai állapotromlás vagy reaktiváció jelei észlelhetõk. Rezisztens Mycobacterium okozta infekció veszélye merül fel akkor, ha a beteg ismert rezisztens M. tuberculosis okozta infekcióban szenvedõ beteg kontaktja, a beteg korábban már antituberkulotikum kezelést kapott, a beteg az alkalmazott antituberkulotikum kezelés ellenére progressziót mutat (tenyésztései a három hónapos kezelés után is pozitívak), a beteg olyan országból származik, ahol a rezisztens Mycobacterium okozta infekció gyakorisága magas. 2.7.2 Szilárd és folyékony alapú rezisztencia vizsgálat, a vizsgálat átfutási ideje 2.7.2.1 A szilárd táptalajon (proportios módszer) végzett rezisztencia-meghatározás bár pontos, de meglehetõsen idõ (az izolálást követõ további 3-5 hetes tenyésztés) és munkaigényes. A vizsgálat biomassza igénye miatt szükség van az identifikált kórokozó LJ vagy egyéb szubkultúrán történõ felszaporítására, vagy ha a M. tuberculosis NTM-al együtt ún. kevert tenyészet formájában került izolálásra, akkor a tenyészetnek az álrezisztenciához vezetõ NTM-tól való megtisztítására, ami újabb több hetes idõveszteséget okozhat. 2.7.2.2 Folyékony alapú rezisztencia vizsgálatok A Bactec MGIT, a radiometriás Bactec 460 TB, vagy a Bact/Alert rendszer segítségével az öt elsõvonalbeli antituberkulotikumon kívül a másodrendû szerek többségével szembeni rezisztencia vizsgálatok kb. 4-6 nap alatt elvégezhetõk, és a klinikus számára visszajelezhetõk. Mind az antituberculoticum-érzékeny, mind a rezisztens kórokozót hordozó betegek esetében az adekvát kezelés folytatásához, a beteg compliance-nak megtartásához és javításához kívánatos, hogy a rezisztencia vizsgálatok eredményei mihamarabb, de a mintavételtõl számított legkésõbb 8 héten belül rendelkezésre álljanak. Ehhez a kórokozó izolálásához, identifikáláshoz és a rezisztencia vizsgálatokhoz alkalmazott gyorsabb átfutási idõt biztosító újabb módszerek hazai rutinszerû bevezetése szükséges. 2.7.2.2./a Külsõ minõségi kontroll A rezisztencia vizsgálatok megbízhatósága kiemelten fontos, ezért elengedhetetlen, hogy minden rezisztens izolátum kontroll vizsgálata megtörténjen és a vizsgálat eredménye a Referencia Laboratóriumban megerõsítésre kerüljön. Különösen fontos a MDR törzsek rezisztenciájának minõségi kontrollja. Az MDR törzsek ellenõrzõ vizsgálata mellett a Referencia Laboratórium automatikusan elvégzi a másodvonalbeli szerekkel szembeni rezisztencia meghatározást is, ezért ezen törzseknek a Referencia Laboratóriumba történõ továbbítása kötelezõ. 2.7.3 Rezisztencia meghatározás géntechnikai módszerrel (13) A rifampicin (RMP) kulcsfontossággal bír a tuberkulózis kezelésében és a gyógyszerrel szembeni rezisztencia mihamarabbi felismerése vitális a beteg számára. Mindemellett a RMP monorezisztencia ritka, a RMP rezisztencia leggyakrabban polirezisztencia vagy az INH rezisztenciához társulva MDR formájában jelentkezik. Így a RMP rezisztencia gyors kimutatása nemcsak a kezelés optimalizálása szempontjából, hanem a legveszélyeztetettebb MDR törzs okozta megbetegedésben szenvedõ betegek gyors azonosítása szempontjából is fontos. A RMP rezisztenciát okozó mutációknak a kimutatása néhány órán belül elvégezhetõ az rpob gén specális szakaszának DNS szekvenálásával, vagy a PCR és reverz hibridizáción alapuló (GenoType HAIN és Inno-LiPA Rif TB Innogenetics) line probe assay-k segítségével. Az újabb kereskedelmi forgalomban kapható tesztek a rifampicin rpob génjének és az isonicid (INH) katg és inha génjének mutációját szimultán is képesek kimutatni az izolált törzsbõl (GenoType MTB DR HAIN) és közvetlenül a mikroszkópos vizsgálattal saválló pozitívnak bizonyult beteg mintájából is (GenoType MTB DRplus HAIN). A MDR tuberculosis fenyegetõ mértékû globális terjedése miatt, a gyors rezisztencia eredményekhez való hozzájutás érdekében a WHO új diagnosztikai algoritmus bevezetését javasolja elsõsorban a mikroszkópos vizsgálattal saválló pozitív betegek esetében. A WHO állásfoglalása szerint: A line probe assay-k alkalmasságát a mikroszkóposan pozitív esetek RMP, ill. INH + RMP rezisztencia detektálására megfelelõ számú evidencián alapuló vizsgálattal bizonyították A módszerek bevezetését a referencia laboratóriumokban ill. a technikailag jól felszerelt és képzett munkaerõvel rendelkezõ mikrobiológiai laboratóriumokban ajánlják

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3415 Ha a line probe assay érzékeny törzset detektál, az érzékeny M. tuberculosis okozta infekció diagnózisa elfogadható, és a kezelés az elsõrendû szerekkel azonnal megkezdhetõ Ha a line probe assay rezisztens törzset detektál, további tenyésztés, majd a kitenyészett törzsbõl az elsõ és másodrendû szerek iránti rezisztencia vizsgálat is azonnal elvégzendõ A szükséges közegészségügyi intézkedések késedelem nélkül beindíthatók A M. tuberculosis-sal szemben a NTM esetében - egyes kivételektõl eltekintve (M. avium, M. kansasii, gyorsan növõ NTM-k) - a rutinszerû rezisztencia meghatározás a megfelelõen standardizált módszerek hiányában nem javasolt. Az 1. ábra a mycobacteriumok okozta infekciók egyszerûsített diagnosztikus sémáját, algoritmusát mutatja. 2.8. Látens-és aktív tuberculosis fertõzés kimutatása immunológiai módszerekkel A kereskedelmi forgalomban levõ technikák (T-SPOT-TB és Quantiferon-TB Gold) olyan gyors vértesztek, amelyek a M. tuberculosis specifikus antigénjei által aktivált immunsejtek (T sejtek) fokozott jelenlétét, ill. a sejtek által termelt ( interferon kimutatását teszik lehetõvé. A tesztek a Mantoux próbát helyettesítik, de annál határozottan specifikusabb módszerek, fajlagosságukat a BCG vaccináció, és az atípusos mycobacteriumok (NTM) okozta infekciók többsége nem befolyásolja. Immunszuprimált betegeken a módszer érzékenysége még nem kellõen bizonyított. A protokoll bevezetésének feltételei A tárgyi és személyi feltételeket a kompetencia szinteknek megfelelõen a 15/2004 ESZCSM rendelet tartalmazza. 1. Tárgyi feltételek A Mycobacterium diagnosztika az ország egész területén elérhetõ, jelenleg összesen 10 TBC Tenyésztõ Laboratórium és a Nemzeti Mycobacteriológiai Referencia Laboratórium mûködik. A TBC tenyésztõ laboratóriumok alkalmasak direkt mikroszkópos, tenyésztéses vizsgálatok végzésére és legalább a M. tuberculosis identifikálására, egyes laboratóriumok rezisztencia vizsgálatokat is végeznek. Egyes III. kompetencia szintû mikrobiológiai laboratóriumok néhány molekuláris genetikai vizsgálat végzésére is alkalmasak. A Referencia Laboratóriumban történik a rezisztens törzsek kontroll vizsgálata, az atípusos Mycobacterium (NTM) törzsek identifikálása, egyes esetekben rezisztencia vizsgálata, és a molekuláris technikák alkalmazása. (direkt kimutatás, species identifikálás, rezisztencia gének detektálása, tipizálás epidemiológiai érdekbõl) 2. Személyi feltételek A kompetencia szinteknek megfelelõ személyi feltételek: a 15/2004 ESZCSM rendelet szerinti megfelelõ számú diplomás és egészségügyi szakdolgozó 3. Szakmai képzési feltételek A jelen protokoll oktatása a szakorvosképzés, egyéb diplomásképzés és továbbképzés keretében történik A diagnosztikus vizsgálatok megfelelõségének indikátorai Direkt mikroszkópos, tenyésztéses és genetikai vizsgálatok eredményinek összevetése (szenzitivitás, specificitás, pozitív és negatív prediktív érték) A bakteriológiailag igazolt esetek aránya a regisztrált esetekhez viszonyítva. Tenyésztéssel pozitív esetekben a rezisztencia vizsgálatok aránya. III. Irodalomjegyzék 1. Kent, P. T., and G. P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology. A guide for a level III laboratory. Center for Disease Control, Atlanta, GA. 2. Dunlap, N. E., J. Bass, P. Fujiwara, P. Hopewell, J. Horsburgh, C.R., M. Salfinger, and P. M. Simone. 2000. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. This official statement of the American Thoracic Society and the Centers for Disease Control and Prevention was adopted by the ATS Board of Directors, July 1999. This statement was endorsed by the Council of the Infectious Disease Society of America, September 1999. Am. J. Respir. Crit Care Med. 161:1376-1395.

3416 EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 21. szám 3. Metchock, B. G., F. S. Nolte, and J. Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, p. 399-437. In P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Szabó, N., Lipót Z., Vámos M., Nagy J. 2003. A mycobacteriumok tenyésztésének hatásfoka különbözõ elõkezelési eljárások és tenyésztési módszerek függvényében. Medicina Thoracalis 56: 188-192. 5. Somoskovi, A., C. Kodmon, A. Lantos, Z. Bartfai, L. Tamasi, J. Fuzy, and P. Magyar. 2000. Comparison of recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 TB system, and Lowenstein-Jensen medium. J. Clin. Microbiol. 38:2395-2397. 6. Somoskovi, A., J. Mester, Y. M. Hale, L. M. Parsons, and M. Salfinger. 2002. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Clin. Chest Med. 23:585-597. 7. 2000. Update: Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb.Mortal.Wkly.Rep. 49:593-594. 8. Mester, J., Vadász I., Bártfai Z., Ködmön CS., Somoskövi Á.. 2002. A Mycobacterium tuberculosis antituberkulotikum-rezisztenciájának molekuláris alapjai. Medicina Thoracalis 55:30-36. 9. Fodor T., Lõrinczi I., Szikra L. A Mycobacterium tuberculosis és egyéb típusos mycobacterium fertõzések bakteriológiai vizsgálatának módszerei. 555-557. old. In: Czirók É. (szerk.): Klinkai és járványügyi bakteriológia kézikönyv. Melánia, Budapest 1999. 10. National plan for reliable tuberculosis laboratory services using a systems approach Morb. Mortal. Wkly.Rep. 54: No: RR-6. 2005. 11. Drobniewski F.A., Hoffner S., Rüsch_Gerdes S., Skenders G., Thomsen V. and the WHO European Laboratory Strengthening Task Force. Recommended standards for modern tuberculosis laboratory services in Europa. Eur.Respir J. 28. 903-909. 2006. 12. Somoskövi Á., Szabó N., Nagy E.: A tuberkulózis mikrobiológiai diagnosztikájának irányelvei. A Tüdõgyógyászati Szakmai Kollégium és az Orvosi Mikrobiológiai Szakmai Kollégium közös állásfoglalása. Med. Thor. 57. 116-137. 2004. 13. World Health Organization: Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) policy statement 27 June 2008. 14. Pai M., L.L Flores, Pai N., Hubbard A., Riley L.W., Colford J.M. Jr. 2003 Diagnostic accuracy of nucleic acid amplification tests for tuberculosis meningitis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect.Dis 3: 633-643. 15. Rock R.B., Olin M., Baker C.A., Molitor T.W., Peterson P.K. 2008. Central nervous system tuberculosis: Pathogenesis and clinical aspects. Clin.Microbiol.Review 21: 243-261. A szakmai irányelv érvényessége: 2009. szeptember 30. IV. Melléklet 1. A protokoll fejlesztés módszerei: 1.1. A nemzetközi szervezetek (WHO, IUATLD, CDC, ECDC) és tekintélyes külföldi un. supranacionális laboratóriumok és társaságok (CLSI) által kiadott irányelvek alapján, azokat az irodalmi hivatkozásokat vettük figyelembe, amelyek megfelelnek a fenti irányelveknek. 1.2. A felhasznált nemzetközi irányelveket a hazai nemzeti tuberculosis programban foglaltaknak megfelelõen adaptáltuk. 1.3. A mycobacteriumok okozta infekciók egyszerûsített diagnosztikus sémáját az 1. ábra mutatja 1.4. Az protokollban használt röviditések: WHO = World Health Organisation IUATLD = International Union against Tuberculosis and Lung Disease CDC = Center for Disease Control and Prevention EuroTB = Európai Tuberculosis Surveillance Központ ECDC = European Centre for Diseases Control and Prevention NTM = Non Tuberculous Mycobacterium DNAM = Direkt Nukleinsav Amplifikációs Módszerek CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute FDA = Food and Drug Administration VNTR-MIRU = Variable Numbers of Tandem Repeats of Mycobacterial Interspersed Repetitive Units

21. szám EGÉSZSÉGÜGYI KÖZLÖNY 3417 INH = Isonicid RMP = Rifampicin ETB = Ethambutol PZA = Pyrazinamid MDR = Multi-Drug Rezisztens Tuberculosis (Rezisztens INH + RMP) XDR = Extensively-Drug Resistens Tuberculosis (Rezisztens INH+RMP+Fluoroquinolon+iv adható szerek egyike: amikacin, kanamycin, capreomycin)