Bioinformatika 2 5. előadás

5. előadás Prof. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz. Bioinformatika proteomika Előadás és gyakorlat 2018.10.01.

Fehérje térszerkezet megjelenítése A fehérjék meglehetősen összetett szerkezetek, ezért speciális eszközökre van szükség a megjelenítésükhöz. Az ábrán egy relativ kisméretű fehérje, az acilfoszfatáz (PDB kód 2ACY) szerkezete látható. Egyszerűsítések nélkül még ennek a kisméretű fehérjének a szerkezete is kezelhetetlen. 2 2018.10.01.

RasMol http://www.openrasmol.org Fehérje térszerkezet megjelenítése A fehérjelánc (backbone) megjelenítése A fehérjelánc lefutása simított interpolált görbével jeleníthető meg (2ACY) 3 2018.10.01.

Swiss PDB Viwer: http://spdbv.vital-it.ch/ Fehérje térszerkezet megjelenítése A fehérjelánc szekunder szerkezeti elemek szerinti megjelenítése A fehérjelánc lefutása a szekunder szerkezetnek megfelelő szalagokkal jeleníthető meg (2ACY) 4 2018.10.01.

Fehérje térszerkezet megjelenítése A fehérje szekunder szerkezeti elemek szerinti sematikus megjelenítése A fehérje a szekunder szerkezetnek megfelelő sematikus elemekkel megjelenítve (2ACY) 5 2018.10.01.

Fehérje térszerkezet megjelenítése A fehérje szerkezet fejlett vegyes módú megjelenítése A fehérje szerkezet fejlettebb programokkal vegyes módon is megjeleníthető (2ACY) 6 2018.10.01.

Összerendelések megjelenítése A többszörös összerendelések megjelenítése és vizuális elemzése a leghatékonyabb eszköz amivel a molekuláris biológiával foglalkozó kutató dolgozhat, akár a laboratóriumi asztalról. Ne is gondoljunk azonban hatékony eszközre - felhasználásra, ha nem alkalmazunk kölönböző színeket az aminosavak kölönböző fizikokémiai típusai szerint. Szín Oldallánc típusa Aminosavak Sárga Kicsi, apoláris Gly, Ala, Ser, Thr Zöld Hidrofób Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp Magenta Poláris Asn, Gln, His Piros Negatív töltésű Asp, Glu Kék Pozitív töltésű Lys, Arg 7 2018.10.01.

Összerendelések megjelenítése A színezés és vizuális megjelenítés fontossága tioredoxin enzimek példáján: A tioredoxin enzimek minden sejtben megtalálhatóak. A biológiai folyamatok széles skálájában részt vesznek, mint pl sejtosztódás, véralvadás, csírázás, inzulin lebontás, oxidatív sérülések javítása, stb... Közös hatásuk a proteinek diszulfid hídjainak redukciója. Az E. coli tioredoxin szerkezete egy központi ötszálú β-redős lemezt tartalmaz, minden oldalról α-hélixekkel körbevéve. A hélixeket és a redőket az α és β szimbólumok jelzik. Elvárható, hogy a többi tioredoxin enzimek többé-kevésbé, de nem teljesen megegyező szerkezeti elemeket tartalmaznak, mint az E. coli enzim. A következő néhány képen a tioredoxin enzimek példáján láthatjuk a színek alkalmazását többszörös összerendelések és szerkezeti elemzés során. 8 2018.10.01.

Többszörös összerendelések megjelenítése (a) Az E. coli tioredoxin és homolgjai aminosav szekvenciáinak többszörös összerendelése. Néhány szekvenciát a végeknél elvágva láthatunk. A tábla számai az E. coli szekvencia pozícióinak felelnek meg (felső sor). A hélix ( ) és redő (β) hozzárendelések az E. coli 9 2018.10.01. tioredoxin kísérleti szerkezetéből származnak (PDB kód: 2TRX).

Szekvencia Logo megjelenítése (b) Az E. coli tioredoxin és homolgjai aminosav szekvenciáinak többszörös összerendeléséből származtatott szekvencia Logo. Jól láthatóak a konzervált szerkezeti részletek és az ezekben részt vevő aminosavak sajátságai. 10 2018.10.01.

Térszerkezet megjelenítése (c) Az E. coli tioredoxin [2TRX] szerkezete egy központi ötszálú β-redős lemezt tartalmaz, minden oldalról α-hélixekkel körbevéve. Az aminosavak számozása megegyezik a szekvencia összerendelés táblázatban találhatóval. Az N- és C-terminális részek és minden tizedik C α atom (gömbök) kiemelve láthatóak. A reaktív diszulfid hidak a Cys32 és Cys35 aminosavak között sárga. A többszörös szekvencia összerendelések segítségéval remélhetjük hogy egyes szerkezeti és működési sajátságok azonosíthatóak. 11 2018.10.01.

Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A legjobban konzervált régiók valószínüleg megfelelnek az aktív helynek. Az E. coli tioredoxin Cys32 és Cys35 aminosavak közötti reaktív diszulfid hidak a fehérje családon belül a konzerválódott WCGPC[K/R] motivumban találhatóak. A szekvencián belül további konzerválódott régiók is találhatóak: a PT (76 77) és a GA (92-93) aminosavak a szubsztrát 12 2018.10.01. kötésben fontosak.

Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A beszúrásokban/törlésekben gazdag helyek valószínüleg felszini hurkok. Konzervált Gly ill. Pro valószínüleg fontos kanyaroknak (turn) felel meg. A kanyar (turn) egy nem szokásos főlánc konformáció, általában nagy mozgékonyságú glicineknél fordul elő. A konzervált Gly92 az E. coli tioredoxinban például egy kanyar része. Kanyart okozó szerkezeti rész lehet még a 13 2018.10.01. prolin. A konzervált Pro76 az E. coli tioredoxinban például szintén egy kanyar része.

Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A 2 egységenként hidrofób oldalláncokat a köztes egységekben változatosabb és hidrofil oldalláncokat is tartlamazó aminosavakkal tartalmazó szekvencia β-redő jelelétére utal. Ez a mintázat figyelhető meg az 50-60 közötti β-redőnél. 14 2018.10.01.

Térszerkezet / funkció / szekvencia összefüggés A ~4 egységenként hidrofób oldalláncokat tartalmazó szekvencia -hélix jelelétére utal. (Az -hélix menetemelkedése 3,6 aminosav). Ez a mintázat figyelhető meg a 40-49 hely közötti -hélixnél. 15 2018.10.01.

Fehérjeszekvenciák és szerkezetek analízise 1. Egyszerű fehérje elemzések 2. Térszerkezet előrejelzése 2.1. A probléma bonyolultsága 2.2. A predikció szintjei 2.3. 1D predikciók (másodlagos szerkezet, hozzáférhetőség, transzmembrán hélixek) 3. Térszerkezetek kísérleti meghatározása 3.1. Fehérje szerkezetek kristályos fázisban (Röntgen diffrakció) 3.2. Fehérje szerkezetek oldatfázisban (NMR módszerek) 4. Térszerkezetek elemzése 4.1. Másodlagos szerkezet elemzése 4.2. Fehérje szerkezet minősége 4.3. Szerkezeti motívumok 4.4. Kölcsönhatás ligandumokkal 4.5. Egyéb (töltésviszonyok, felszínek, üregek) 16 2018.10.01.

EXPASY Tools: http://www.expasy.org/proteomics Fehérjeszerkezet és funkció analízis 17 2018.10.01.

Egyszerű fehérje elemzések Fehérjeazonosítás (ld.: EXPASY Tools AACompIdent, Multident,...) AACompIdent: (http://web.expasy.org/aacompident/ ) Fehérje azonosítása aminosav összetétel ill. opcionálisan még pi (izoelektromos pont) és Mw (molekulatömeg) alapján a SwissProt/TrEMBL adatbázisokban (-> rangsorolt lista a bevitt adatokhoz hasonló fehérjékről -> esetleges távoli homológiák találhatóak!) 18 2018.10.01.

Fehérjeazonosítás tömegspektrometriai módszerekkel Adott proteázzal (pl. tripszin) való emésztés után a képződő peptid fragmentumok pontos molekulatömege tömegspektrometriával mérhető, így a fehérje azonosítható (tömeg ujjlenyomat mass fingerprinting) Elterjedt módszer: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry) MALDI-TOF: a fehérjét (ill. fragmentumait) UV elnyelő anyagba ágyazzák (mátrix), ezt a réteget pulzáló UV lézerrel besugározzák. Az ionizált molekulák leválnak a mátrixról. Az elektromos térben felgyorsított ionok becspódását detektáljuk. A becsapódásig eltelt időből (time of flight - TOF) számítható a tömeg. 19 2018.10.01.

MASCOT: http://www.matrixscience.com/ Fehérje elemzés Mass fingerprinting MOWSE, MASCOT: Az emésztéshez használt proteáz és a peptidtömegek megadásával rangsorolt listák nyerhetőek a megadott adatoknak megfelelő, elsődleges fehérje szekvencia adatbázisban (pl. OWL, SwissProt, stb. megtalálható fehérjékről 20 2018.10.01.

Térszerkezet előrejelzés bonyolultsága Általános cél: határozzuk meg egy adott fehérje(szekvencia) azon konformációját, amelyhez a szabadentalpia globális minimuma tartozik. Kisebb modellek segítségével igazolható, hogy a feladat ún. NP nehéz, azaz a megoldáshoz szükséges idő a (fehérje)mérettel nempolinomiális függvény szerint (hanem gyorsabban) növekszik (tehát a probléma adott mérethatár fölött nem megoldható.) A valós fehérjék esetében a probléma legtöbbször kezelhető, mert a valós fehérjék szekvenciái meglehetősen specifikusak (evolúció során kiválogatódtak); a predikcióhoz tudásbázisként felhasználhatjuk a már ismert térszerkezeteket 21 2018.10.01.

Térszerkezet előrejelzés szintjei 22 2018.10.01.

Térszerkezet előrejelzés szintjei 1D: egy dimenziós string-ként leírható, az egyes aminosavakhoz rendelhető tulajdonságok Pl.: szekvencia, másodlagos szerkezet, oldószer általi elérhetőség, hidrofobicitás 23 2018.10.01.

Térszerkezet előrejelzés szintjei 2D: aminosavpárok közötti távolságok, kontaktusok Pl.: HB plot hidrogénhidas kötések elemzése) 24 2018.10.01.

Térszerkezet előrejelzés szintjei 3D: az összes atomi koordináta megadása ab-initio módszerek Homológia modellezés 25 2018.10.01.

EXPASY Tools: http://www.expasy.ch/tools/#primary/ 1D predikciók Másodlagos szerkezet 26 2018.10.01.

1D predikciók Másodlagos szerkezet 1. és 2. generációs módszerek: az egyes aminosavak különböző másodlagos szerkezetekben való előfordulási gyakoriságai alapján. Pontosság <70%, -szerkezetre csak 28 48%, túl rövid hélixek és szálak Chou Fasman: hélix: 6 egymás melletti aminosav közül 4 hélixbéli előfordulási valószínűsége legalább 1,03; szál: 5 egymás melletti aminosav közül 3 szálbéli előfordulási valószínűsége legalább 1,0. Kiterjesztés mindkét irányban, amíg 4 egymás melletti aminosav átlagos hélix, ill. szál képzési valószínűsége 1,0 alá nem csökken GOR (Garnier Osguthorpe Robson): 17 aminosav szélességű ablakban vizsgálja az aminosavakat, előfordulási gyakoriság alapján jósolja az ablak közepén található aminosav másodlagos szerkezetét 3. generációs módszerek: a vizsgált szekvenciákhoz hasonlóakból többszörös összerendezés, majd a többszörös összerendezésekben található információk felhasználása [pl. információk az együtt mutálódó aminosavakról (korrelált mutációk), amelyek a térszerkezetben általában egymáshoz közel vannak]. Mivel tehát a többszörös összerendezés információt tartalmaz a fehérje harmadlagos szerkezetéről, így lehetővé teszi a másodlagos szerkezet jóslását. Konszenzusos módszerek: több módszert (fejlettebb 2. és 3. generációs módszereket) 27 2018.10.01. alkalmaznak, és az eredmények konszenzusát veszik.

B. Rost.: Meth. Enzymol. 1996, 266, 525-539. Másodlagos szerkezet PHD módszer 1. Rokon szekvenciák a SwissProt adatbázisból (BLAST program) 2. Többszörös összerendezés (MaxHom program) 3. Az összerendezés szűrése, jó homológok megtartása, újbóli összerendezés 4. A végső összerendezés alapján minden pozícióra elkészül az előforduló aminosavcserék profilja 5. Ez a neuronhálózat bemenete (két szintű: PHDsec és PHDhtm; vagy egy szintű: PHDacc) 28 2018.10.01.

PredictProtein: http://www.predictprotein.org Másodlagos szerkezet PHD módszer 29 2018.10.01.

PredictProtein: http://www.predictprotein.org Fejlett módszerek, regisztráció szükséges Másodlagos szerkezet PHD módszer 30 2018.10.01.

PredictProtein: http://www.predictprotein.org Másodlagos szerkezet PHD módszer 31 2018.10.01.

JPred: http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/ Másodlagos szerkezet Konszenzus módszer 32 2018.10.01.

Oldószer elérhetőség becslése Oldószer elérhetőség becslés Az adott oldallánc felszíni vagy eltemetett Kezdetleges módszerek: az oldallánc hidrofobicitása alapján > gyenge eredmény Jobb becslés: evolúciós információ bevitele többszörös összerendezésekkel > 75% pontosságú jóslás (PHDacc) Az előző példákból látható volt, hogy a legtöbb szekunder szerkezet becslő program becslést ad az oldószer elérhetőségről is. 35 2018.10.01.

2D predikciók Oldallánc kölcsönhatások becslése Az összes oldallánc kölcsönhatás figyelembe vételével elvben felépíthető a 3D szerkezet (ld. később NMR módszerek) Kölcsönhatások becslésére felhasznált sajátságok/adatok: a szekvenciában távoli aminosavak együtt előforduló (korrelált) mutációi statisztikai adatok átlagtér potenciálok neuronhálózatok Az oldallánc kölcsönhatások becslésére tett eddigi próbálkozások nem jártak kielégítő eredménnyel. 36 2018.10.01.

3D szerkezetek Kísérleti módszerek? Valóság - Kísérlet Modell?? 37 2018.10.01.

Fehérjék szerkezetének meghatározása HTP kristályosítás és röntgendiffrakció Fehérjekristályosító robot (nanoliter méret, automatizált) A BME 3Dstruct labor röntgenkrisztallográfja 38 2018.10.01.

Fehérjék szerkezetének meghatározása HTP kristályosítási eredmények 39 2018.10.01.

Fehérjék szerkezetének meghatározása Röntgen krisztallográfia 40 2018.10.01.

Fehérjék szerkezetének meghatározása NMR spektroszkópia Az NMR mérések során a magok mágneses perdületének változásai követhetőek a magok környezetétől függően. Értkető módon a magok érzékenyen reagálnak a kémiai környezet változásaira így a módszer erről ad információt. Az NMR spektroszkópusok alapvetóen a proteinek oldatfázisú szerkezetét képesek vizsgálni. Fontos információk nyerhetőek a fehérjék dinamikus viselkedéséről is. 41 2018.10.01.

Fehérjék szerkezetének meghatározása NMR módszer lépései 42 2018.10.01.

ehérjék szerkezetének meghatározása NMR spektroszkópia 43 2018.10.01.

44 2018.10.01.