A vira szekvenciák azonosítása Agrobacterium vitis törzsekből

A vira szekvenciák azonosítása Agrobacterium vitis törzsekből DIPLOMADOLGOZAT Készítette: RADVÁNYI ATTILA Biológus MSc szakos hallgató Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2017.

TARTALOMJEGYZÉK: 1. Irodalmi áttekintés... 3 1.1. Bevezetés... 3 1.2. Agrobaktérium fertőzés folyamata... 4 1.3. Virulenciagén-expresszió... 5 1.4. Aktiváló szignálok... 6 1.5. VirA fehérje és szignál érzékelés... 7 2. Célkitűzések... 11 3. Alkalmazott anyagok és módszerek... 12 3.1. Baktériumok, plazmidok, fágok... 12 3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése... 13 3.3. Primer tervezés... 13 3.4. Összes DNS izolálása... 14 3.5. Polimeráz láncreakció... 15 3.6. GenJet DNS tisztítás oszlopon... 15 3.7. Agaróz gélelektroforézis... 16 3.8. DNS ligálás... 16 3.9. Transzformálás... 16 3.10. Plazmid DNS izolálás és szekvenáló miniprep... 16 3.11. Emésztés restrikciós endonukleázokkal... 17 3.12. Fragment izolálás... 17 3.13. DNS-szekvencia meghatározás... 18 3.14. Háromszülős keresztezés... 18 4. Eredmények és megvitatásuk... 19 4.1. A vira szekvenciák meghatározása... 19 4.2. Egyedi hasítóhely kialakítása a vira fragmenten... 20 4.3. A kanamicin rezisztenciagén előkészítése a munkára... 23 4.4. Kanamicin rezisztenciagén beépítése a vira fragmentbe... 24 4.5. Háromszülős keresztezések eredményei... 27 5. Összefoglalás... 30 6. Irodalomjegyzék... 31 7. Köszönetnyilvánítás... 36 8. Melléklet... 37 9. Hallgatói nyilatkozat... 38 2

1. Irodalmi áttekintés 1.1. Bevezetés Az Agrobacterium a Rhizobiaceae családba tartozó nemzetség [FARRAND et al 2003], és kétszikű növényeket fertőznek meg, több mint 90 különböző növénycsaládból [MURUGESAN et al 2010]. Négy Agrobacterium fajt írtak le a Bergey s Manual of Systematic Bacteriologyban: az Agrobacterium radiobacter-t, Agrobacterium rhizogenes-t, Agrobacterium tumefaciens-t, és az Agrobacterium rubi-t, [KERSTERS and DE LEY 1984]. Az A. radiobacter-t nem patogén agrobaktériumnak tekintették. Azokat, melyek gyökér proliferációt indukálnak A. rhizogenes-ként definiálták. A koronagubacsot okozó agrobaktériumokat A. tumefaciensnek nevezték, három változattal; és azokat, melyek a Rubus fajokon okoznak tumort, A. rubinak. Felismerték, hogy ez a besorolás nem megfelelő, mert az A. tumefaciens és A. radiobacter csak abban különbözik, hogy tartalmaz-e Ti-plazmidot, vagy sem [HOLMES and ROBERTS 1981], amely egyébként átvihető a törzsek között [WATSON et al 1975]. Az A. vitis-t az A. tumefaciens 3-as változatának tudományos neveként javasolták [OPHEL and KERR 1990], és világszerte predomináns patogénként tekintettek rá a szőlőültetvényekben. Természetes gazdatartományáról kimutatták, hogy csak a szőlőkre korlátozódik [BURR et al 1998]. Az Agrobacterium vitis tumort okoz a szőlő törzsén és vesszőin, redukálja a növekedést, és potenciálisan a tőkék halálát eredményezi. A betegség limitáló faktor a szőlőtermelő régiókban szerte a világon és különösen jelentős olyan éghajlaton, ahol a hideg téli hőmérséklet sérüléseket okoz, melyek nélkülözhetetlenek a fertőzés megkezdéséhez [BURR and OTTEN 1999; PRATT and POOL 1981]. Az A. vitis fertőzési folyamatáról úgy gondolják, hogy hasonló az A. tumefaciens-éhez [BINNS and THOMASHOW 1988; BURR and OTTEN 1999; ZUPAN et al 2000], mert az A. vitis-nek is sérülésre van szüksége a fertőzéshez és hasonló Ti-plazmidokat hordoz, melyek által a törzsek kategorizálhatók [OTTEN et al 1996]. Jelenleg kevés stratégiánk van a betegség kezelésére. Miután egy területen megjelent, a baktérium évekig fennmaradhat a talajban, az élő és halott szőlőszövetben is; fertőzési forrásként funkcionálva [BURR et al 1995]. Ezért, a tiszta palántázó anyag használata olyan területeken, ahol korábban nem volt betegség, a legjobb lehetőség ennek a betegségnek a kontrollálására. 3

1.2. Agrobaktérium fertőzés folyamata Az Agrobacterium törzsek széles körben elterjedtek a természetben. Teljesen szaporodóképesek a talajban függetlenül a gazdától. A legtöbb izolátum nem tartalmaz Tiplazmidot [KRIMI et al. 2002]. Mindazonáltal, a törzsnek a tumorindukáló képesség egyértelmű szelekciós előnyt jelent azáltal, hogy a tumor táplálékforrást termel (az opinokat) a kiváltó baktérium számára. Azonban egyértelmű, hogy a növénytranszformációhoz szükséges bakteriális folyamatok összetettek és energetikailag megterhelők. Emiatt, a virulencia-indukáló folyamatoknak gondosan szabályozottnak kell lennie és csak akkor szabad megindulniuk, amikor a kompetens gazda felismert és elérhető. Az alábbi modell bemutatja a folyamata főbb lépéseit: 1. ábra: A fertőzési folyamat alapmodellje [MCCULLEN and BINNS 2006 módosított ábrája] A fertőzési folyamat a következő lépésekre tagolható: (1) a gazda kémiai felismerése és a virulencia gének bekapcsolása; (2) fizikai felismerés és kölcsönhatás a baktérium és a gazda között; (3) a transzferrendszer termelése; (4) fehérjék és DNA átjuttatása a gazdasejtbe; (5) majd a sejtmagba; (6) T-DNS beépülés a gazda genomjába; és (7) a T-DNS expressziója. 4

1.3. Virulenciagén-expresszió A szabályzás megértéséhez azok a munkák voltak az első lépések, melyek azonosítottak néhány Ti-plazmid hordozta operont a T-DNS-en kívül, amik a virulenciához szükségesek, a vir géneket (1. ábra) [KLEE et al. 1983, STACHEL and NESTER 1986]. Expressziójuk elemzése felfedte, hogy, a vira és virg kivételével, a vir gének lényegében némák [STACHEL and NESTER 1986]. A vira és virg kétkomponensű szabályzórendszereket kódoló génekkel szignifikánsan homológ, melyekben egy szenzor kináz reagál a bejövő jelre és kiváltja egy válasz regulátor aktivációját, utóbbi foszforilációs állapotának megváltoztatásával [WOLANIN et al. 2002]. Számos alapvető, kétkomponensű rendszerek által végrehajtott biokémiai lépés látható a VirA/VirG rendszerben (2. ábra). A membránba ágyazott szenzor kináz, a VirA, autofoszforilál egy konzervált hisztidin aminosavat; és átadja ezt a foszfátot a citoplazmikus válasz regulátor, a VirG konzervált aszparaginsavának. A VirG-P a vir promóterek specifikus, 12 bp-os DNS szekvenciáihoz (vir boxok) köt és aktiválja a transzkripciót [BRENCIC and WINANS 2005]. A legtöbb kétkomponensű, patogének virulencia rendszereit irányító rendszerrel szemben, itt azonosították a gazdától származó szignálokat, melyek a VirA/VirG rendszer aktivációjáért felelősek. Ezek fenolok, aldóz monoszacharidok, alacsony ph, és alacsony PO 4 -szint [BRENCIC and WINANS 2005, PALMER et al. 2004]. A fenolok feltétlenül szükségesek a vir gén expresszió indukálásához, míg a többi szignál érzékenyíti a baktériumot a fenolokra. 2. ábra: A ChvE/VirA/VirG jelátalakító rendszer [MCCULLEN and BINNS 2006 módosított ábrája] 5

1.4. Aktiváló szignálok A sebek gyakori helyei az A. tumefaciens általi transzformációnak [BRAUN 1952]. Bár a seb egyszerűen lehet belépési portál, előfordulhatnak más specifikus folyamatok a sérülés helyén, amik megkönnyíthetik a transzformációt. A vir-indukáló szignálok azonosítása szolgáltatta az egyik legvalószínűbb magyarázatot a sérülés helyének fontosságára: a fenilpropanoid útvonal magas aktivitása, alacsony ph, és sejtfalszintézishez kapcsolódó cukrok rutinszerűen kötődnek a sebgyógyuláshoz [BARON and ZAMBRYSKI 1995]. Braun [1952] felvetette, hogy a sejtosztódás a sérülés helyén a transzformációhoz szükséges sebválasz esszenciális komponense, és számos ezt követő vizsgálat mutatja, hogy az osztódó növényi sejtek sokkal hatékonyabban transzformálhatók, mint a nyugvó sejtek [pl., SANGWAN et al. 1992]. Az indukáló szignálok közül, az alacsony ph és PO 4 -szint képes aktiválni a virg expressziót a VirA-tól függetlenül a komplex virg promóter működésén keresztül [WINANS 1990]. A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy ennek a promóternek a ph regulációja egy külön ph-érzékelő kétkomponensű rendszeren, a ChvG/ChvI-n keresztül közvetítődhet. Ez a rendszer kromoszomálisan kódolt és szükséges mind a vir gén expresszióhoz, mind a virulenciához [LI et al. 2002], bár ezt a mechanizmust még nem dolgozták ki. Először a fenolokat azonosították a vir gén expresszió indukálóiként, a gyökerekből és levél protoplasztokból származó váladékok vizsgálata által [STACHEL et al. 1985]. A 3,5- dimetoxi-acetofenon, vagyis az acetosziringon (AS), nagy mennyiségben volt jelen ezekben a váladékokban, és a szintetikus AS-nak magas indukáló aktivitása volt megfigyelhető a növényi sejtek hiányában is. Szintetikus és természetben előforduló fenolok széles köre mutat aktivitást, ezek mind a fenilpropanoid-útvonalból származnak növényekben [review PALMER et al. 2004]. A cukrok szerepét a vir gén indukció folyamatában fiziológiai és genetikai munkákon keresztül ismerték fel. Az indukáló cukrokra adott válasz kettős: először is, a VirA/VirG rendszer szignifikánsan alacsonyabb fenoldózisnál indukálódik (pl., 0.5 μm AS szemben a 10 20 μm AS-nal), és másodszor, a vir indukció maximális szintje a fenol telítési koncentrációjánál öt- tízszeresére növekszik [CANGELOSI et al. 1990, SHIMODA et al. 1990]. Mutációk a kromoszómális virulencia lókuszon chve és a vira ban drasztikusan befolyásolhatják ezt a választ [BANTA et al. 1994, CANGELOSI et al. 1990, LEE et al. 1992, SHIMODA et al. 1993]. 6

Számos fenol- és cukorkomponens együttese játszik szerepet a felismerésben, valószínűleg ez alakítja ki az Agrobacterium széles gazdakörét. A fenolok, melyek feltétlenül szükségesek a vir gén aktivációhoz, különösen fontosak lehetnek ebben a tekintetben. Bár mindenütt jelen vannak a magasabb rendű növényekben, a fenolok különböző szubsztitúciós mintázatokkal specifikusak lehetnek adott nemzetségekre vagy fajokra [DIXON et al. 2002]. Így, a vir indukáló rendszer képessége, hogy felismerje a különböző fenolokat lehetővé teszi a virulencia gének expresszióját a gazdanövények széles skáláján. 1.5. VirA fehérje és szignál érzékelés A VirA egy dimer, membránba ágyazott fehérje, ami szignálok hiányában is megtalálható ebben az állapotban [PAN et al. 1993]. A fehérje számos doménjét azonosították (3. ábra) szerkezeti és genetikai munkákban [összefoglalva: BRENCIC and WINANS 2005]. Minden monomer tartalmaz egy kicsi N-terminális citoplazmikus domént, két transzmembrán (TM) domén által körülvett, 180-aminosavas periplazmikus (P) domént, és egy nagy citoplazmikus domént. Ez utóbbi három további doménből áll egy linker (L) doménből, ami részt vesz a fenol érzékelésben; egy kináz (K) doménből, ami magában foglalja a konzervált hisztidint (ami foszforilálódik), valamint egy ATP-kötő helyet; és egy vevő (receiver, R) doménből, melynek szekvenciája homológ a konzervált aszparaginsavat is beleértve a VirG N- terminális régiójával. Az indukáló szignálok észlelésének eszközeit változó sikerrel határozták meg. Az cukrok esetében, a kromoszomálisan kódolt, periplazmikus protein, a ChvE szerepe egyértelműnek tűnik. Ez a fehérje szignifikánsan homológ a periplazmikus cukorkötő fehérjék széles körével, és az ezt nélkülöző törzsek már nem tudnak válaszolni a cukrok vir-indukáló hatására [CANGELOSI et al. 1990]. Számos tanulmány szerint a ChvE összhangban dolgozik a VirA periplazmikus doménjével, hogy érzékenyítse a VirA-t a fenolos indukálókra, amikor cukor van jelen [BANTA et al. 1994, CHANG and WINANS 1996, SHIMODA et al. 1993]. A VirA/ChvE kölcsönhatás fizikai bizonyítékáról még nem számoltak be, és a ChvE fehérje cukorkötő aktivitására sincs biokémiai bizonyíték. A fenol észlelés fizikai alapja kevésbé világos. Genetikai analízis azt sugallja, hogy a linker domén kritikus ebben a folyamatban [CHANG and WINANS 1992, TURK et al. 1994]. Erre a legjobb bizonyíték, hogy a VirA egy verziója, mely csak az L és K doméneket (VirA LK ) tartalmazza, a VirA fenolra reagáló formája, míg a VirA K nem az [CHANG and WINANS 1992]. Bár a linker domén szerepet játszik a fenol észlelésben, nincs fizikai bizonyíték, hogy a fenol köt hozzá, vagy a VirA bármely más doménjéhez, amiről 7

beszámoltak. Nem került elő bizonyíték fenolkötő fehérjék bevonásáról sem a vir gén aktivációba. Genetikai bizonyíték a modellre, miszerint a fenol közvetlenül kölcsönhatásba lép a VirA-val, két irányból jön. Először is az Agrobacterium néhány törzse érzékeli a fenolok különböző változatait, és ez függ az aktuális vira gén jelenlététől [LEE et al. 1995, 1996]. Másodszor, egy fenol-reagáló VirA/VirG rendszert újraalkottak Escherichia coli-ban [LOHRKE et al. 2001]. Hacsak nincsenek fenolkötő fehérjék, amik E. coli-ban is léteznek, és produktívan kötődni tudnak a VirA-hoz és aktiválni azt, akkor a VirA-nak közvetlenül érzékelnie kell a fenolt. Ennek a kérdésnek a végső eldöntése várat magára a fenol:vira kölcsönhatás bemutatásáig és jellemzéséig. A harmadik bemeneti jel, amit a VirA érzékel, az alacsony ph (ph 5.5). Melchers és munkatársai megmutatták, hogy a nagy periplazmikus deléció a VirA molekulában indukálhatja a vir gén expressziót (fenolok jelenlétében) 7-es ph-n, ami normális esetben nem indukáló állapot [MELCHERS et al. 1989]. Újabb vizsgálatok azt mutatják, hogy mind az intakt periplazmikus doménnek [CHANG and WINANS 1996] és a ChvE-nek (és cukroknak) [GAO and LYNN 2005] jelen kell lennie a VirA-közvetítette, ph általi indukcióhoz. Bár a ChvE/cukor kölcsönhatás szükségesnek látszik a ph általi indukcióhoz, a cukor és a ph jel szétkapcsolható egy kis delécióval a VirA periplazmikus doménjében [BANTA et al. 1994, GAO and LYNN 2005]. A ph érzékelés fizikai mechanizmusa nem ismert. Mivel a ChvE megköti az arabinózt semleges ph-n [A. WISE, G. NAIR, és A. BINNS, publikálatlan adat], a cukorkötés nem lehet ph-függő. A ph hatással lehet a ChvE kölcsönhatására a VirA-val vagy a VirA válaszára erre a kölcsönhatásra. A VirA moduláris jellege nagyban segítette a szignálok integrációját és az átalakításukat vizsgáló munkákat. Kiterjedt genetikai analízis a kináz aktivitásra gyakorolt domén hatásokról egy modellt eredményezett (3. ábra). A részlegesen tisztított kináz domén képes foszforilálni a VirG-t in vitro, és ennek a doménnek (VirA K ) az expressziója Agrobacterium-ban aktiválja a vir gén expressziót, bár alacsony szinten és irányító szignál nélkül [CHANG and WINANS 1992, JIN et al. 1990]. A linker domén hozzáadása VirA LK formát eredményez, mely konstitutív indukáló aktivitást eredményez in vivo, de stimulálható fenolokkal is, jelezve ezeknek a szignáloknak a pozitív hatását [CHANG and WINANS 1992]. Azonban, mivel a vad típusú VirA szignálok hiányában inaktív (azaz nincs vir gén expresszió), más doméneknek represszív hatással kell lenniük az aktivitásra. Ennek egyik példája a periplazmikus domén. Bár a VirA nagy periplazmikus delécióval (VirA P ) érzéketlen a cukrokra, megnő a képessége, hogy indukáljon semleges ph-n és magas szintű vir gén expressziót vált ki válaszul a fenolokra, cukrok hiányában [BANTA et al. 1994, LEE et al. 1992, MELCHERS et al. 8

1989]. Ez azt sugallja, hogy a periplazmikus domén gátló hatást gyakorol a VirA citoplazmás részére. A cukor- és ph-modulált ChvE kölcsönhatása a VirA-val enyhíti ezt a gátlást, maximális érzékenységet és fogékonyságot eredményezve a fenolokra. A vevő doménnek is van gátló hatása a VirA kináz aktivitásával kapcsolatban. A VirA R nem igényel fenolokat az aktivációhoz, bár ez még függ a ph-tól és a cukorszignáltól [CHANG and WINANS 1992, 1996]. 3. ábra: A ChvE/VirA általi szignál integráció és aktivitás modellje [MCCULLEN and BINNS 2006 módosított ábrája] A VirA fehérje dimer állapota jellemző a legtöbb membránba ágyazott szenzor hisztidinkinázra és fontos a funkció szempontjából. Genetikai bizonyíték erősen azt sugallja, hogy ATP kötése az egyik VirA monomerhez, foszforilálja a másikat [BRENCIC et al. 2004]. A dimer állapot jelentőségét is igazolták a szignáltranszdukcióban. Egy, a linker doménben lévő pontmutáció miatt inaktív; és egy, a konzervált hisztidinnél mutációt (H474Q) hordozó inaktív VirA expressziója egy aktív, fenolra reagáló dimert eredményezett [TOYODA- YAMAMOTO et al. 2000]. Hasonlóképpen, a cukorra nem reagáló VirAE255L koexpressziója a 9

VirAH474Q-val egy cukorra reagáló fenotípusú törzset eredményezett [WISE et al. 2005]. A VirA verzióinak, melyekből hiányoznak a transzmembrán és periplazmikus domének, alacsony aktivitásuk van, még magas AS szint mellett is. Ez lehet az ilyen konstrukciók relatíve gyenge dimerizációjának eredménye [WANG et al. 2002]. 10

2. Célkitűzések Hosszú távú célunk az Agrobacterium vitis baktériumtörzsekben található vira gének összehasonlító vizsgálata. Ennek érdekében terveztük: 1) a fellelhető vira szekvenciák elemzésével a belső konzerválódott részekre primereket tervezünk és kipróbáljuk, hogy alkalmasak-e ismeretlen vira szekvenciák felsokszorozására; 2) az izolált vira részszekvenciákat klónozzuk és meghatározzuk pontos nukleotidsorrendjüket; 3) az új szekvenciákat összehasonlítjuk az adatbázisokban található gének szekvenciáival, hogy megtudjuk, mennyire hasonlóak vagy eltérőek. Ezen eredmények ismeretében további célul tűztük ki a vira gén teljes szekvenciájának izolálását és meghatározását az A. vitis AT1 törzsből. 4) Ennek érdekében egy kanamicin-rezisztencia gént terveztünk elhelyezni a megismert szekvenciában, és ezt a mutációt visszajuttatva az A. vitis AT1 törzsbe, homológ rekombinánst terveztünk előállítani. 5) A mutáns baktériumból a kanamicin rezisztencia segítségével kívántuk klónozni a teljes gént, a nem kódoló 5' és 3' részeit is ide értve. 11

3. Anyag és módszer 3.1. Baktériumok, plazmidok, fágok Munkánk során használt baktériumtörzsek, plazmidok, valamint fágok jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza. 1. táblázat: a munka során alkalmazott baktériumtörzsek és plazmidok ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA Escherichia coli törzsek: XL1-blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe4 rela1 [BULLOCK et al.] lacz_m15 Tc R PP4304 E. coli DH5α (pcu101) Cm R helper törzs Papp Péter PP211 E.coli JF1754 (prk2013) Km R helper törzs Putnoky Péter Fágok: PP2654 -fág::tn5 transzpozon Putnoky Péter Agrobacterium törzsek: PP4664 A. vitis AT1 nopalin pti Rif R Putnoky Péter PP4374 A. vitis Tm4 oktopin pti vad típus Szegedi Ernő PP4398 A. tumefaciens C58 noplain pti Rif R Putnoky Péter Plazmidok: pbs pbluescript SK II(+/-), klónozó vektor, Amp R STRATAGENE ppag160 szűk gazdaspecifitású konjugatív vektor, Spc R /Str R Papp Péter ppp2815 pat330 rkpk::tn5(207), RK2 plazmid származék, Putnoky Péter incp Tc R, Km R ppp4749 pbsecorv::vira(at1)::ecorv mutáció ez a munka ppp4750 pbsecorv::vira(at1)::ecorv mutáció ez a munka ppp4751 pbsecorv::km R fragment, ori I. ez a munka ppp4752 pbsecorv::km R fragment, ori II. ez a munka ppp4759 pbs vira (AT1)::Km R ez a munka ppp4760 pbs vira (AT1)::Km R ez a munka ppp4761 ppag160::vira(at1)::km R ez a munka 12

3.2. Táptalajok és baktériumok növesztése Az Agrobacterium törzseket 28 C-on TA [OROSZ et al. 1973] táptalajon, az E. coli törzseket pedig 37 C-on LB [SAMBROOK et al. 1989] tápközegben növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 2. táblázatban leírtak szerint tartalmaztak. Táptalaj készítésekor a tápoldatokat 1,5% agarózzal egészítettük ki. A baktérium törzseket 15 %-os glicerines TAban -20 C-on lefagyasztva tároljuk. 2. táblázat: Az alkalmazott antibiotikumok és koncentrációjuk ( g/ml) Antibiotikumok Rövidítés E. coli Agrobacterium törzsek Ampicillin Amp 100 - Kanamicin Km 30 200 Spectinomicin Spc 100 - Chloramfenikol Cm 15 - Tetraciklin Tc 15 15 Rifampicin Rif - 30 3.3. Primer tervezés A tervezett primereket a 3. táblázat tartalmazza. Olyan szekvenciákat kívántunk felsokszorozni, melyek még nem ismertek, ezért a primertervezéshez rokon fajok homológ szekvenciáit vettük alapul. A munkát kulcsszavas kereséssel kezdtük az NCBI honlapjának nukleotid adatbázisában. A megtalálható szekvenciák közül az A. tumefaciens C58 (NC_003065), SAKURA (NC_002147), Bo542 (DQ058764), A6 (AF242881) és az A. vitis S4 (NC_011982) törzsek szekvenciáit használtuk fel. A talált szekvenciák összeillesztéséhez az EMBL honlapján található Clustal Omega programot használtuk (http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/). A szekvenciákat FASTA formátumban egymás alá írtuk az adatbeviteli ablakba. Nem változtattunk a program alapbeállításain. A primer tervezést a Sequence Manipulation Suite oldalán található PCR Primer Stats nevű programot használtuk (http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html). A vira gén körülbelül 2500 bp hosszú, de mi két belső, konzerválódott részt keresve, rövidebb szakaszok felsokszorozásához terveztük a primereket. Így készült el a VirA11 VirA11R és a VirA-12 VirA-122R primerpár (3. táblázat). 13

Miután már megismertük az A. vitis AT1-es vira szekvenciájának egy részletét, annak felhasználásával terveztük meg a VirAm-VirAmR primerpárt, ami egy EcoRV hasítóhelyet tartalmaz. (3. táblázat és 4.2. fejezet 5. ábra). A kanamicin-rezisztencia gén felsokszorozásához a R5Km-Forward és Reverse primereket használtuk, amik a Tn5 transzpozonhoz lettek tervezve úgy, hogy egy-egy EcoRV restrikciós hasítóhelyet tartalmazzanak (3. táblázat). 3. táblázat: A munkában felhasznált oligonukleotidok Oligonukleotidok neve Bázissorrend Tm ( C) VirA-11 TGTGAAATGCAGCTTATGGAACT 63,40 VirA-11R ATCCAGAAAAGACGGTTGGTC 63,42 VirA-12 GGCTTGAAGCAGTTGGTAC 61,26 VirA-122R GAGGGAGATAAATGTCAAAGCGCG 66,56 M13-UNI GTAAAACGACGGCCAGT 59,97 M13-REV CAGGAAACAGCTATGAC 54,37 Termék hossza 1003 bp 650 bp változó VirAm TGAGCAGATATCGATGAACCTG 62,52 301 bp* VirAmR CAGGTTCATCGATATCTGCTCA 62,52 327 bp* R5Km-Forward AGATATCAAGGGCTGCTAAAGGAA 64,07 1255 bp R5Km-Reverse TGATATCTGGGCGAAGAACTCCA 66,00 * A termék hossza a VirAm primer esetén a VirA-122R primerrel, a VirAmR primer esetén a VirA-12 primerrel értendő. 3.4. Összes DNS izolálása Meade és társai [MEADE et al 1982] módosított eljárását alkalmaztuk. 1,5 ml éjszakán át TA tápoldatban növesztett baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük, és 300 μl TE oldatban (50 mm TrisHCL, 20 mm EDTA, ph 8,0) szuszpendáltuk. 100 μl 5% SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 μl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk hozzá. 1-3 órás 37 C-os inkubálás után 500 μl TE-vel telített fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a felülúszót új Eppendorf csőbe pipettáztuk át. 500 μl fenol : kloroform oldattal (25 térfogat fenol : 24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. 14

Centrifugálás után a felülúszóhoz 500 μl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform : 1 térfogat izoamil-alkohol) adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázisból a DNS-t 1000 μl abszolút etanollal kicsaptuk. A kocsonyás csapadékot új, 500μl 70%-os etanol tartalmú, Eppendorf csőbe tettük át pipettahegy segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot 100 μl desztillált vízben oldottuk fel. 3.5. Polimeráz láncreakció Az Agrobacterium törzsek vira szekvenciáit a VirA12, VirA-122R, VirAm és VirAmR primerek, valamint a VIRA52 és 58c40s program segítségével sokszoroztuk fel. (4.1. fejezet és 4. táblázat). A kísérletekben a THERMO SCIENTIFIC cég Dream Taq DNS polimeráz enzimét használtuk. 4. táblázat: Az alkalmazott PCR programok VIRA52 58c40s UNI 1. 95 C 2:00 94 C 2:00 94 C 2:00 2. 95 C 0:30 94 C 0:10 94 C 0:30 3. 52 C 1:00 58 C 0:20 53 C 0:30 4. 72 C 2:00 72 C 0:40 72 C 1:30 5. go to 2. 34 go to 2. 33 go to 2. 33 6. 20 C 2:00 25 C 2:00 end 7. end end 3.6. PCR fragmentek tisztítása klónozás előtt A polimeráz láncreakcióval felsokszorozott kanamicin-rezisztencia gént a GenJet kit (THERMO SCIENTIFIC) protokollja alapján izoláltuk, az alábbi lépéseket követve. A PCR-cső tartalmához 1 térfogat binding puffert adtunk, majd az elegyet egy oszlopra pipettáztuk és 30 másodpercig centrifugáltuk. 600 l mosó puffer (Wash Buffer) oszlopra pipettázása után újabb 30 mp centrifugálás következett. Ezután 1 percig centrifugáltunk az alkohol eltávolítása érdekében. Majd 30 l elúciós puffert pipettáztunk az oszlopra és egy percig szobahőn tartottuk, majd 1 perc centrifugálás következett. 15

A DNS-fragment végeit a Fast DNA End Repair Kit (THERMO SCIENTIFIC) protokoll segítségével alakítottuk tompa véggé. 13 l DNS-hez 1,5 l 10x puffert és 0,5 l enzim mixet adtunk. 5 percig szobahőn tartottuk az elegyet, majd megismételtük a GenJet fragment tisztító lépést. A DNS ezután lett alkalmas a ligálási reakcióra. 3.7. Agaróz gélelektroforézis A DNS-minták elválasztására 1-1,5%-os agaróz gélt és 0,5 TBE puffert használtunk, követve az általános módszertani leírásokat [SAMBROOK et al. 1989]. A futtatások során 5 l mintát vittünk fel a gélre 5 l 2xSTOP oldattal. Kontrollként 100 bp Plus DNS ladder-t alkalmaztunk (THERMO SCIENTIFIC). 3.8. DNS ligálás A ligálási reakciókat 20 μl térfogatban, 5 l fragment DNS, és 4 l 5xT4 DNS ligáz puffer (40 mm TrisHCL, 10 mm MgCl2, 10 mm DTT, 0,5 mm ATP, ph 7,8) segítségével végeztük el. A reakciókhoz 0,5 U T4 DNS ligáz enzimet (THERMO SCIENTIFIC) használtunk. Az elegyet egy éjszakán át, szobahőmérsékleten inkubáltuk a transzformáció előtt. 3.9. Transzformálás A kompetens sejtek az XL1-blue törzsből készültek, Inoue és társai módszere alapján [INOUE et al. 1990]. Egy transzformáláshoz 100 μl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80 C-ról jégre tettük. 15 perc eltelte után hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 20 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37 C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 μl LB tápoldatot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37 C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra tettük. A telepek β-galaktozidáz enzimaktivitását 40 mg/ml X-gal (5-bromo-4- chloro-3-indolylβ-d-galactopyranoside) és 40 mg/ml IPTG (isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside) jelenlétében teszteltük. Bizonyos kísérleteknél a szelekciót antibiotikum rezisztencia biztosította. 3.10. Plazmid DNS izolálás és szekvenáló miniprep A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében egy éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke [ISH-HOROWICZ and BURKE 1981] módszerének módosított változata szerint preparáltuk. 16

1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe tettünk es a sejteket centrifugálással leülepítettük. A tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12.000-res fordulatszámmal, szobahőmérsékleten. A sejteket 100 μl TEG oldatban (25 mm TrisHCl, 10 mm EDTA, 50 mm glükóz ph 8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 μl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0 C-on inkubáltuk, majd 160 μl jéghideg Naacetát oldatot (3M, ph 4,8) adtunk hozzájuk es az oldatot erősen összeráztuk. 5 perc 0 C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, es a felülúszóból 320 μl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20 C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 100 μl Tris-acetát pufferben (50 mm Tris, 100 mm Na-acetát, ph 8,0) feloldottuk. Ezután 200 μl etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk, szárítottuk az előzőekhez hasonló módon, majd 50 μl RN-áz tartalmú desztillált vízben (100 μg/ml forralt RN-áz) oldottuk fel. A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az előzőek szerint készített 50 μl plazmid preparátumhoz 0,1 térfogat 10% SDS oldatot es 1 térfogat 0 C-os 7,5 M NH 4 -acetát oldatot adtunk es 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20 C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás után a tisztított DNS-molekulát 40 μl desztillált vízben vettük fel. 3.11. Emésztés restrikciós endonukleázokkal A DNS-minták emésztését a (THERMO SCIENTIFIC) cég termékeit használva a megadott protokollok szerint végeztük. Kettős emésztés esetén, amennyiben az enzimek különböző puffert igényeltek, az első emésztés után a DNS-t 0,1 térfogat 3M Na-acetát (ph:7,0) és 2 térfogat abszolút etanol hozzáadásával kicsaptuk. 20 percig inkubáltuk -20 C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70%-os etanolos mosás, szárítás után 30 μl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót. Az emésztés sikerességét agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük. 3.12. Fragment izolálás A PCR terméket agaróz gélelektroforézis segítségével választottuk el. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk, és 15 perces 60 V feszültség melletti elektroforézis után a fragment a papírra került. A papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t kétszer egymás után 50 μl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS kicsapása 10 μl 3M Naacetát oldattal (ph:7,0) és 220μl abszolút etanollal történt. A csapadékot 20 perc, -20 C 17

inkubálás után lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 20μl steril desztillált vízben oldottuk fel. Ebből 5 l-t használtunk fel gélelektroforézishez, amivel az izolálás sikerességét ellenőriztük. 3.13. DNS-szekvencia meghatározás A munkánk során a tisztított plazmid DNS minták nukleotid szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/chromaspro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) program alkalmazásaival illesztettük össze. A szekvenciákat BlastN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) program segítségével hasonlítottuk össze a GenBank nukleotidszekvencia adatbázisban található szekvenciákkal. 3.14. Háromszülős keresztezés A donor, a recipiens és a helper baktérium törzseket TA táptalajon növesztettük, a megfelelő antibiotikumok jelenlétében, 1-2 napon keresztül. A felnőtt baktériumokból 0,5 ml TA tápoldatban szuszpenziót készítettünk, TA lemezen azonos arányban összecseppentve 28 C-on egy napig inkubáltuk őket. Az így felnőtt baktériumokból ismételten szuszpenziót készítettünk, majd az antibiotikumokat tartalmazó lemezekre szélesztettük őket, különböző hígításban. Két-három napon keresztül növesztettük őket. 18

4. Eredmények 4.1. A vira szekvenciák meghatározása Az adatbázisokban fellelhető vira szekvenciák alapján primereket terveztünk (3.3. fejezet), hogy több A. vitis törzsből is izoláljuk a még ismeretlen szekvenciájú vira gént. A polimeráz láncreakcióhoz a VirA-12 VirA-122R és a VirA-11 VirA-11R primerpárokat, a VirA52-es programot és templátként DNS-izolátumot használtunk. Előbbi primerpár az A. vitis AT1-es, utóbbi a Tm4-es törzs esetében működött. A fragmenteket gélből izoláltuk, majd a pbluescript plazmid EcoRV helyére klónoztuk be. A plazmidot XL1-blue sejtekbe transzformáltuk. A transzformálás eredményeként kapott fehér telepek valószínűleg tartalmazzák az izolálni kívánt DNS-szakaszt. Ennek ellenőrzéséhez az M13 UNI-REV primerpárt és az UNI PCR-programot használtunk. Ez a primerpár a Bluescript plazmid klónozóhelyének (MCS) két végére lett tervezve. Azokkal a telepekkel folytattuk a munkát, amelyek a reakció során megfelelő méretű fragmentet adtak. Az AT1-es törzs esetében nagyjából 700, a Tm4-es törzsnél pedig úgy 1100 bázispár hosszú fragmentet kaptunk. Ezeknek meghatároztattuk a pontos szekvenciáit (lásd 8. Melléklet 15. és 16. ábra). Az ellenőrzött és összeszerelt szekvenciákat először a BlastN program segítségével vizsgáltuk és megállapítottuk, hogy azok erősen homológok a már ismert Agrobacterium vira szekvenciákkal. Ezek után az újonnan meghatározott szekvenciákat bevonva sokszoros illesztésben vizsgáltuk a szekvenciák hasonlóságát (ClustalW program). Az összehasonlításhoz csak a mindkét esetben meglévő szekvenciarészletet használtuk fel, így a Tm4 szekvenciából kb. 350 bp-nyit nem vettünk figyelembe. 5. táblázat: Találatok BlastN programmal Törzs neve Accession Number Koordináták A. vitis S4 CP000637.1 184754..185404 A. rhizogenes pri2659 EU186381.1 156045..156695 A. rhizogenes pri1724 AP002086.1 190969..191619 A. tumefaciens KU12 AF001781.1 1581..2231 A. tumefaciens AB2/73 AF329849.1 3735..4385 A. tumefaciens C58 AE007871.2 182244..182869 19

4. ábra: A különböző vira szekvenciák rokonsági viszonyai (cladogram) A Tm4-es törzs szekvenciája igen nagyfokú hasonlóságot mutat az S4 törzsével. Ennek oka lehet, hogy a két törzs szekvenciája azonos helyről származik. Az AT1 törzs vira szekvenciája kevésbé rokon az ismert törzsekkel. Az A. tumefaciens AB2/73 törzsben található szekvenciával 76% azonosságot mutatott. Mivel ekkora az eltérés, úgy ítéltük meg, hogy ezen törzs vira génjét célszerűbb megismerni szekvencia szinten, ezért ezzel a törzzsel folytattuk a munkát és próbáltunk egy kanamicin-rezisztencia gént elhelyezni a vira szekvenciában, majd ennek segítségével izolálni a teljes gént, az előtte és utána elhelyezkedő nem kódoló szekvenciákkal együtt. 4.2. Egyedi klónozóhely kialakítása a vira fragmenten Munkánk célja az Agrobacterium vitis AT1-es törzs vira szekvenciájának mutagenizálása egy kanamicin-rezisztencia gén beépítésével. A gén egy Tn5-ös transzpozonon található, amit egy -fágtörzs is tartalmaz. A gént polimeráz láncreakcióval, az 58c40s programmal sokszoroztuk fel. A felhasznált R5Km-Forward és R5Km-Reverse primerek egy-egy EcoRV hasítóhelyet (gat atc) tartalmaznak, amik megkönnyítik a gén klónozását. Logikus tehát, hogy a kanamicin kazettát egy ilyen hasítóhelyre építsük be. Ehhez azonban szükség volt egy EcoRV restrikciós hasítóhelyre körülbelül a meghatározott vira szekvencia közepén. Mivel ilyet nem találtunk, úgy döntöttünk, készítünk egyet polimeráz láncreakció segítségével. Ehhez új primerpárt terveztünk, mely tartalmazza az enzim hasítóhelyének szekvenciáját. Szerencsére majdnem a fragment felénél találtunk négy bázist egymás mellett, ami része az enzim felismerési helyének. Tehát csak két bázist kellett módosítanunk. A primertervezéshez az AT1-es törzs vira fragmentjének korábban megismert szekvenciáját használtuk (5. ábra). 20

5. ábra: A VirAm-VirAmR primerek a restrikciós hasítóhellyel 6. ábra: A tervezett primerek helye a vira génen belül. A számértékek a gén bázispárjainak számát jelölik. 7. ábra: Primerek ellenőrzése PCR-reakcióval, a vira szekvenciarészletet használva templátként. L: 100 bp Plus DNS ladder kontroll; 1-2: VirA12-VirAmR primerpár; 3-4: VirAm-VirA-122R primerpár A VirAm-VirA-122R primerpár jól működött a reakció többszöri megismétlése esetén is; viszont a VirA12-VirAmR primerpár vagy nem adta a reakciót vagy csak gyengén, 21

amennyiben baktérium szuszpenziót használtunk templátként. Ennek oka például lehet, hogy a VirA12 primert homológ szekvenciák alapján terveztük, így valószínűleg nem teljesen komplementer az AT1-es szekvenciájával. Emiatt úgy döntöttünk, hogy még egy PCRreakciót végrehajtunk, melyben először a klónozott vira szekvenciarészletet sokszoroztuk fel, mely tartalmazza az említett primer szekvenciákat, és ezt használtuk templátként a további reakcióban. Ehhez a reakcióhoz a VirA12 VirA-122R primerpárt és a VIR52 programot használtuk, ahogyan korábbi munkánk során is (8. ábra, I. reakció). A terméket ezerszeresére hígítottuk és ezt adtuk templátként a következő reakcióhoz. Primerként a VirA12 VirAmR, illetve a VirAm VirA-122R kombinációkat használtuk a 58c40s programmal. Ezeknek a reakcióknak a terméke a vira szekvencia két fele, melyek a módosított bázissorrendet tartalmazzák a VirAm és VirAmR primerekkel szemben (8. ábra, II. reakció). Az utolsó PCR-reakciót két lépésben hajtottuk végre: (1) a vira fragment százszoros hígítása szolgált templátként, a II. reakció terméke pedig tízszeres hígításban primerként 5 cikluson keresztül, az 58c40s program használatával. A polimeráz kiegészíti a szálat, így olyan duplaszálú DNS-ünk lesz, aminek az egyik szála módosított (8. ábra, III/1-es reakció). (2) Az 1-es reakció termékét templátként alkalmaztuk a VirA12 VirA-122R primerpárral és ugyanazzal a programmal, de ezúttal 33 cikluson keresztül. A reakció végterméke a vira fragment, ami tartalmazza a kívánt EcoRV hasítóhelyet (8. ábra, III/2. reakció). Erről restrikciós emésztéssel és a plazmid DNS izolálása után szekvenálással bizonyosodtunk meg (9. ábra). Az elegy tartalmazhatja a vad típusú szekvenciát is, de ennek mennyisége csekély. 8. ábra: Az EcoRV hasítóhelyet tartalmazó szekvencia létrehozása. A csillagok a megváltoztatott bázisokat jelölik. 22

9. ábra: A szekvenálás eredménye: a megváltoztatott vira szekvencia, benne az EcoRV hasítóhellyel (sárgával jelölve) és a VirA12 VirA-122R primerekkel (pirossal jelölve) 4.3. A kanamicin rezisztenciagén előkészítése a munkára A kanamicin rezisztenciagént PCR-technika segítségével sokszoroztuk fel az 58c40s program és az R5Km primerek használatával. A felsokszorozott fragmentet GeneJet kit használatával tisztítottuk és XL1-blue törzsbe transzformáltuk. A sejteket kanamicin tartalmú szelektív táptalajra kentük, majd a felnövő telepekből véletlenszerűen kiválasztottunk hatot. Ezekből plazmid DNS-t izoláltunk a fragment orientációjának meghatározására bár ez itt még lényegtelen. A fragment kétféleképpen épülhet be a vektorba (10. ábra). A DNS-mintákat PstI enzimmel emésztettük, majd 1%-os agaróz gélen megfuttattuk. Az emésztés során keletkező, eltérő hosszúságú DNS-darabok jelzik az orientációt. 10. ábra: A kanamicin rezisztenciagén lehetséges beépülési módjai a PstI restrikciós hasítóhelyekkel; P: lacz promóter Az emésztés eredményét a következő gélfotó mutatja be. 23

11. ábra: A PstI restrikciós emésztés eredménye a kalkulált fragmentméretekkel: 1-3: I-es orientáció, 4-6: II-es orientáció, L: 100 bp Plus DNS ladder kontroll (3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500 bp) A fotó alapján a vizsgált mintáink fele-fele arányban tartalmazzák a két orientációt. A további munkához az 1-es és 6-os mintákat választottuk ki és tisztítottuk tovább. A 6-os minta esetében szekvenálással is megbizonyosodjunk meg az inszert jelenlétéről. 4.4. Kanamicin rezisztenciagén beépítése a vira fragmentbe Már rendelkezésünkre állt külön-külön a vira szekvencia - melybe bevittük a hasítóhelyet - és a beépítésre szánt rezisztenciagén, Bluescript plazmidokba építve. Most egyesíteni kellett a munka két szálát. Ehhez először EcoRV enzimmel megemésztettük mindkét plazmidot. A vira fragment közepén lévő hasítóhely felnyitásával a plazmid linearizálódik, mivel csak ez az egy ilyen hely található rajta. Innentől kezdve ez szolgál vektorként. A kanamicin-rezisztencia gént tartalmazó plazmid esete más. A gén két végén egy-egy hasítóhely van, így az emésztés után egy kisebb (Km R -gén) és egy nagyobb DNS-darab (plazmid) keletkezik. A két fragmentet agarózgélen elválasztottuk, majd a rezisztenciagént izoláltuk a gélből. Ezt követően a vektorba ligáltuk, majd XL1-blue törzsbe transzformáltuk (12. ábra). A sejteket ampicillin és kanamicin tartalmú szelektív táptalajra szélesztettük. Mivel antibiotikummal szelektáltunk, csak azok a baktériumok nőttek fel, amelyek felvették a rezisztenciagént tartalmazó plazmidot. 24

12. ábra: A pbs::vira::kmr konstrukció létrehozása A konstrukció ellenőrzéséhez és a kanamicin rezisztenciagén orientációjának meghatározásához 1-1 mintából plazmid DNS-t izoláltunk és megemésztettük PvuII enzimmel. A gén irányától függően kétféle emésztési mintát kaphatunk (13. ábra). 13. ábra: A PvuII-es emésztés eredménye. 1-3: minták; L: 100 bp Plus DNS ladder kontroll (3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 bp) 25

A gélképen látható legnagyobb bend a plazmidot jelöli 2700 bázispár körül; míg a legkisebb, 360 bp-os fragment a rezisztenciagénen belül található, így minden alkalommal ugyanakkora méretben jelenik meg. Ha a gén a vira fragmentnek megfelelően épül be, az egyik bend több, mint 800; a másik több, mint 1200 bp méretű lesz (2-3-as minta). Fordított beépülés esetén a kisebb fragment körülbelül 700 bp, a nagyobb pedig több, mint 1300 bázispár (1-es minta). A konstrukció ellenőrzése után a következő feladat a DNS bejuttatása Agrobacterium-ba. A Bluescript plazmid erre nem alkalmas, ezért szükség volt egy másik vektorra. Ez a szűk gazdaspecifitású ppag plazmid volt, ami spektinomicin rezisztenciát hordoz és helper plazmid segítségével képes bejutni Gram-negatív sejtekbe (pl.: Agrobacterium sejtek), de replikálódni ezekben nem tud. A konstrukciót EcoRI-KpnI emésztéssel kivágtuk a Bluescriptből és ugyanígy megemésztve linearizáltuk a ppag vektort is, mivel a két hasítóhely nagyon közel helyezkedik el egymáshoz a plazmidon. Az konstukciót a ppag-ba ligáltuk, majd E. coli-ba transzformáltuk (14. ábra). A transzformánsokból véletlenszerűen kiválasztottunk három telepet és plazmid DNS-t izoláltunk belőlük. EcoRV restrikciós emésztéssel ellenőriztük az inszert jelenlétét. A konstrukciót hordozó sejtek alkalmasak az úgynevezett háromszülős keresztezésre. 14. ábra: A konstrukció klónozása ppag vektorba, ami már átvihető Agrobacterium-ba 26

4.5. Háromszülős keresztezések eredményei Ezen keresztezéshez az elkészített konstrukciót tartalmazó sejteket (donor), az A. vitis AT1-et (recipiens) és a PP4304 jelű törzset (helper) használtuk. Kanamicin és rifampicin tartalmú lemezeken vártuk a mutáns törzsek megjelenését. A csak rifampicint tartalmazó lemezekre a recipiens sejtszám meghatározásához volt szükség. Azonban a kísérletek nem jártak sikerrel. Nem kaptunk kanamicin-rezisztens telepeket a kísérlet többszöri megismétlése, illetve a transzformáció során hosszabb ideig tartó inkubáció alkalmazása esetén sem. Úgy tűnt, hogy ez a konjugációs rendszer nem működik az AT1-es törzsben, holott az A. tumefaciens C58-ban (amiben régóta alkalmaztuk ezt a rendszert) nagy számban keletkeznek mutáns baktériumok. A kudarcnak több oka lehetett. Az AT1-es elég rosszul nő; a C58 törzzsel összehasonlítva legalább egy nagyságrenddel alacsonyabb sejtszámot produkál. A lassú növekedés miatt az E. coli törzsek túlnövik. Lehetséges, hogy nem zajlik le a konjugáció, degradálódik a bejutott DNS, vagy nem történik meg a homológ rekombináció. Ezért próbát tettünk egy másik konjugációs rendszerrel is, melyben olyan plazmidot használtunk, ami tetraciklin rezisztenciát hordoz és képes replikálódni agrobaktériumban. Kíváncsiak voltunk, hogy ezzel a rendszerrel lehet-e transzkonjugánsokat kapni, és ha igen, milyen hatásfokkal. Ehhez a PP211-es helper törzset és a PP2815-ös donort használtuk, ami egy P1 inkompatibilitási csoportba tartozó konjugatív plazmid. Ugyanúgy növesztettük fel és készítettünk belőlük szuszpenziót, mint az eredeti keresztezésnél. Hogy növeljük a siker esélyét, az AT1-ből töményebb szuszpenziót készítettünk és háromszor nagyobb mennyiséget vittünk fel belőle a konjugatív lemezre a keresztezéshez. Ezt is 28 C-on inkubáltuk egy napig. Ennél a kísérletnél a szelektív TA mellett GTS (minimál) lemezeket is használtunk. A lemezeket 3 napig inkubáltuk 28 C-on. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza: 6. táblázat: A kontroll keresztezések eredményei Recipiens sejtszám (sejt/ml) A. tumefaciens C58 A. vitis AT1 GTS 4,7*10 9 5,6*10 7 TA Rif 4,2*10 9 1,8*10 7 Transzkonjugánsok száma (sejt/ml) GTS Km 1,862*10 8 1,62*10 5 TA Rif Tc 2,012*10 8 20 27

A keresztezés érdekes eredményt hozott. Keletkeztek transzkonjugáns telepek az AT1 és a C58 esetében is, ami bizonyítja, hogy lezajlott a konjugáció és a bejutott plazmid nem degradálódott az AT1 törzsben sem. A C58-as törzsbe a plazmid jó hatásfokkal bejut. Az adatokból kiszámolható, hogy minden 20-25-ik sejt transzkonjugáns lesz. Táptalaj szempontjából nincs jelentős különbség a GTS és a TA között. Az AT1-es törzsnél feltehetően a gyengébb növekedés miatt megfigyelhető a jóval (két nagyságrenddel) alacsonyabb recipiens sejtszám, a C58-hoz viszonyítva, mindkét táptalajon. Transzkonjugánsok legfeljebb elenyésző számban számolhatók TA táptalajon, míg GTS-en számottevő számú telepet kaptunk, bár ez a mennyiség két nagyságrenddel kevesebb a recipiens sejtszámnál. Azt nem értjük, hogy miért van ez; elméletileg egyforma nagyságrendben kellene telepeket kapnunk a TA és GTS lemezeken is. Talán a rifampicin és a tetraciklin együttes hatása okozza az eltérést. Sajnos idő hiányában nem tudtunk alaposabban utánajárni. Számításaink szerint a GTS táptalajon körülbelül minden 345-ik sejt lesz transzkonjugáns. Egy esetleges restrikciós rendszer jelenléte nem bizonyított, hiszen akkor sok nagyságrendes csökkenést kellene tapasztalnunk. Ez az eredmény arra ösztönzött minket, hogy újra megpróbáljuk az eredeti keresztezést és a mutáns AT1-es előállítását, ezúttal GTS táptalajon. Ennek eredményeit a 7. táblázat tartalmazza. 7. táblázat: A keresztezések adatai A. vitis AT1 Recipiens sejtszám (sejt/ml): GTS 4,96*10 8 TA Rif 3,44*10 8 Transzkonjugánsok (sejt/ml): GTS Km 0 TA Rif Km 0 Ez a keresztezés sem sikerült, nem kaptunk egyetlen transzkonjugáns telepet, még a valamivel magasabb recipiens sejtszám dacára sem. Ebben a keresztezésben a konjugáció után még egy homológ rekombinációnak kell történnie, aminek kis valószínűsége újabb nagyságrendekkel redukálja a baktériumok számát. Az AT1-es relatíve alacsony sejtszáma, a transzfer rosszabb hatásfoka és a homológ rekombináció lezajlásának kis valószínűsége együtt olyan alacsonyra csökkenti a transzformáns sejtszámot, amit az alkalmazott módszerekkel nem tudtunk kimutatni. 28

Feltételezhetően ahhoz, hogy rekombinánst kapjunk, legalább két nagyságrenddel növelni kellene a recipiens sejtszámot. Ehhez több dolgot is meg lehet próbálni: - megváltoztathatjuk a donor/recipiens arányát, - megnyújthatjuk az inkubációt a konjugatív, nem szelektív táptalajon, - átvizsgálhatunk több baktériumot, több tucat petricsészét alkalmazva. 29

5. Összefoglalás Az Agrobacterium vitis egy növénypatogén talajbaktérium, mely sebzési helyen fertőzi a szőlőt. A szőlő genetikai módosításon esik át, melynek során a baktérium Ti-plazmidjából a T-DNS beépül a növényi genomba. Ehhez kromoszómális és a Ti-plazmidon kódolt virulencia gének is szükségesek. A folyamatot a sebzett növényi sejtből felszabaduló fenolvegyületek, monoszacharidok és az alacsony extracelluláris ph érzékelése indítja el. Az érzékelési folyamat központi eleme a VirA nevű integráns membránfehérje, mely autofoszforilációs aktivitással rendelkezik. A T-DNS növényi genomba juttatásának teljes folyamatát ez a fehérje indítja el, így kulcsfontosságú avirulens törzsek létrehozásában. Munkánk során először a rokon Agrobacterium törzsekből származó vira génszekvenciákban konzerválódott részeket kerestünk és primert terveztünk rájuk. Két törzsből (A. vitis AT1 és Tm4) sikerült vira szekvenciarészletet felsokszoroznunk. Ezeket klónoztuk, majd meghatároztuk a bázissorrendjüket és összehasonlítottuk közeli rokon fajokkal. Kiderült, hogy a Tm4 jelű törzs szekvenciája nagyon nagymértékben azonos az A. vitis S4 törzsével (melynek teljes genomszekvenciája ismert és az interneten szabadon hozzáférhető). A másik törzs, az A. vitis AT1 esetében láthattuk, hogy az izolált vira szekvencia kevésbé azonos az ismert törzsek vira szekvenciájával. Az A. tumefaciens AB2/73 törzsben található szekvenciával 76% azonosságot találtunk. A kisebb hasonlatosság miatt ezt a törzset választottuk további munkára. Annak érdekében, hogy vizsgálhassuk a vira gén funkcióját és megismerhessük a gén teljes szekvenciáját, célul tűztük ki a gén elrontását egy kanamicin-rezisztencia gén beépítésével. Munkánkhoz először primereket terveztünk, melyekkel bevihettünk egy új restrikciós hasítóhelyet a korábbi munkánk során izolált génszekvencia-részletbe. A kanamicinrezisztencia gén beépítése után a konstrukciót homológ rekombinációval terveztük visszajuttatni az AT1 törzsbe. Azonban ez nem sikerült többszöri próbálkozásra sem. Ekkor egy másik konjugációs rendszert próbáltunk ki, hogy ellenőrizzük, le tud-e egyáltalán zajlani a konjugáció. Ez a másik plazmid bejutott a baktériumba és fenn is maradt, vagyis a konjugáció le tud zajlani, bár kisebb valószínűséggel és a bejutott DNS-t nem degradálta semmilyen restrikciós enzim. A mutáns baktérium előállítása talán lehetséges a kísérlet egyes paramétereinek megváltoztatásával. 30

6. Irodalomjegyzék BANTA LM, JOERGER RD, HOWITZ VR, CAMPBELL AM, BINNS AN. 1994. Glu-255 outside the predicted ChvE binding site in VirA is crucial for sugar enhancement of acetosyringone perception by Agrobacterium tumefaciens. J. Bacteriol. 176:3242 49 BARON C, and ZAMBRYSKI PC. 1995. The plant response in pathogenesis, symbiosis and wounding: variations on a common theme? Annu. Rev. Genet. 29:107 29 BINNS, A., and THOMASHOW, M. 1988. Cell Biology of Agrobacterium infection and transformation of plants. Annu. Rev. Microbiol. 42:575-606. BRAUN AC. 1952. Conditioning of the host cell as a factor in the transformation process in crown gall. Growth 16:65 74 BRENCIC A, XIA Q, WINANS SC. 2004. VirA of Agrobacterium tumefaciens is an intradimer transphosphorylase and can actively block vir gene expression in the absence of phenolic signals. Mol. Microbiol. 52:1349 62 BRENCIC A. and WINANS S. 2005. Detection and response to signals involved in host-microbe interactions by plant-associated bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 69:155 94 BULLOCK WO, FERNENDEZ JM, SHORT JM. 1987. Xl1-blue: A high efficiency plasmid transforming RecA Es. Biotechniques 5: 376-9 BURR, T. J., REID, C. L., YOSHIMURA, M., MOMOL, E. A., and BAZZI, C. 1995. Survival and tumorigenicity of Agrobacterium vitis in living and decaying grape roots and canes in soil. Plant Dis. 79:677-682. BURR, T. J., BAZZI, C., SULE, S., and OTTEN, L. 1998. Crown gall of grape: biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Dis. 82:1288-1297. BURR, T. J., and OTTEN, L. 1999. Crown gall of grape: biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37:53-80. CANGELOSI GA, ANKENBAUER RG, NESTER EW. 1990. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6708 12 CHANG CH. and WINANS SC. 1992. Functional roles assigned to the periplasmic, linker, and receiver domains of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein. J. Bacteriol. 174:7033 39 CHANG CH. and WINANS SW. 1996. Resection and mutagenesis of the acid ph-inducible P2 promoter of the Agrobacterium tumefaciens virg gene. J. Bacteriol. 178:4717 20 31

DIXON RA, ACHNINE L, KOTA P, LIU CJ, REDDY MSR, WANG L. 2002. The phenylpropanoid pathway and plant defense a genomics perspective. Mol. Plant Pathol. 3:371 90 FARRAND, S.K., VAN BERKUM, P.B., and OGER, P., 2003. Agrobacterium is a definable genus of the family Rhizobiaceae. Int. J. System. Evol. Microbiol., 53, 1681 1687. GAO R. and LYNN DG. 2005. Environmental ph sensing: resolving the VirA/VirG two component inputs for Agrobacterium pathogenesis. J. Bacteriol. 187:2182 89 HOLMES, B., and ROBERTS, P., 1981. The classification, identification and nomenclature of agrobacteria. J. Appl. Microbiol., 50, 443 467. INOUE, H., NOJIMA, H. and OKAYAMA, H. (1990): High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Genetics, 96, 23-28. ISH-HOROVICZ D, and BURKE JF. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 2989-98 JIN S, ROITSCH T, ANKENBAUER RG, GORDON MP, NESTER EW. 1990. The VirA protein of Agrobacterium tumefaciens is autophosphorylated and is essential for vir gene regulation. J. Bacteriol. 172:525 30 KERSTERS, K., and DE LEY, J., 1984. Genus III, Agrobacterium, in: Krieg, N.R., Holt, J.G. (Eds.), Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1, The Williams & Wilkins Co., Baltimore 244 254. KLEE HJ, WHITE FF, IYER VN, GORDON MP, NESTER EW. 1983. Mutational analysis of the virulence region of an Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. J. Bacteriol. 153:878 83 KRIMI Z, PETIT A, MOUGEL C, DESSAUX Y, NESME X. 2002. Seasonal fluctuations and longterm persistence of pathogenic populations of Agrobacterium spp. in soils. Appl. Environ. Microbiol. 68:3358 65 LEE K, DUDLEY MW, HESS KM, LYNN DG, JOERGER RD, BINNS AN. 1992. Mechanism of activation of Agrobacterium virulence genes: identification of phenol-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8666 70 LEE YW, JIN S, SIM WS, NESTER EW. 1995. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12245 49 LEE YW, JIN S, SIM WS, NESTER EW. 1996. The sensing of plant signal molecules by Agrobacterium: genetic evidence for direct recognition of phenolic inducers by the VirA protein. Gene 179:83 88 32