A SERTÉSEK VÁLASZTÁSI HASMENÉSÉBŐL SZÁRMAZÓ 2173-AS ENTEROTOXIKUS ESHERICHIA COLI (ETEC) TÖRZS VIRULENCIA PLAZMIDJAINAK ANALÍZISE Doktori értekezés tézisei Fekete Péter Zsolt Eötvös Lóránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola vezető: Prof. Dr. Erdei Anna, MTA levelező tagja Klasszikus és molekuláris genetika doktori program vezető: Prof. Dr. Orosz László, MTA levelező tagja Témavezető: Prof. Dr. Nagy Béla, MTA rendes tagja MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete Budapest, 2004.
BEVEZETÉS A sertések és szarvasmarhák kólibaktériumok okozta enterális fertőzései között az enterotoxikus Escherichia coli (ETEC) által előidézett megbetegedések a legelterjedtebbek, de gyakran szerepelnek ETEC törzsek humán hasmenéses esetek okozójaként is. A választott malacok hasmenését okozó ETEC baktériumok fimbriális adhezinjeik (F4, F18) révén a vékonybél hámsejtjeinek mikrobolyhaihoz képesek tapadni, ugyanakkor enterotoxinokat (STa, STb és/vagy LT)termelnek, melyek közvetlenül a felszívó bélhámsejtek folyadékszekrécióját erőteljesen serkentik.. Az ETEC virulencia tényezők (adhezinek és enterotoxinok) termelését többnyire plazmidokon található gének, géncsoportok irányítják. Az első leírt plazmidkódolt virulencia gének a humán-, sertés-, és szarvasmarha eredetű ETEC virulenciafaktor gének voltak. A patogén kólibaktériumok horizontális evolúciójában, változatosságának kialakításában több mobilis virulencia-elem: patogenitási sziget (PAI), bakteriofág, plazmid és transzpozon vesz részt. Az ETEC törzsek evolúciójának fontos tényezője, hogy a hőstabil enterotoxinok génjei többnyire transzpozonok (STa Tn1681; STb Tn4521) részei, valamint LT toxin esetében is leírtak a toxingén átvitelét segítő, IS elem közvetítette folyamatot. Szemben a Shigella és Yersinia törzsek virulenciaplazmidjaival, ETEC plazmidokon eddig nem írtak le olyan 10-30 kb méretű nagyobb DNS szakaszokat, melyek több virulenciafaktorral járulnak hozzá a patogenitáshoz. A plazmidok fennmaradását két fontos tényező határozza meg: hány példányban van jelen (kópiaszám) és milyen más plazmidokkal együtt képes fennmaradni a citoplazmában (inkompatibilitás). Egyesek (pl. virulenciaplazmidok) akár csak egy kópiában vannak jelen, míg a nagy kópiaszámúakból baktériumsejtenként akár több száz is lehet. A patogenitási sziget meghatározás létrejöttéhez azon megfigyelés vezetett, hogy patogén baktériumok virulenciához köthető génjei a kromoszóma meghatározott részén a horizontális terjedést lehetővé tevő génekkel együtt külön régiót alkotnak. Patogenitási szigeteket (PAI) először extraintesztinális (közelebbről uropatogén) E. coli törzsekből írtak le, később azonban több enterális patotípusról, valamint egyéb baktérium fajról is kiderült, hogy a virulenciagénjeik ilyen patogenitási szigeteket alkotva helyezkednek el, többnyire a kromoszomán. A patogenitási szigetek olyan virulencia faktor géneket hordozó nagy méretű (10 kb-tól egészen 200 kb) DNS szakaszok melyek hiányoznak az ugyanazon vagy rokon baktériumfaj nem-patogén tagjaiból. G + C tartalmuk, kodon használatuk gyakran különbözik a környező régiókétól. Először kromoszomális elhelyezkedésben írták le, de egyre több adat szól amellett, hogy virulencia plazmidok egyes részei is patogenitási szigetként határozhatóak meg. A patogenitási szigeteket határoló direct repeat (azonos irányultságú) DR elemek a gazda genomba való rekombinációs 1
beépülés során képződnek, s az újabb átvitelt segítik. A patogenitási szigetek többnyire trns génekhez kapcsolódnak Gyakran hordoznak kriptikus vagy működő mobilitási faktor géneket: integrázokat, transzpozázokat, IS elem részeket. A patogenitási szigetek instabil régiók: átvitelük és/vagy deléciójuk könnyen bekövetkezhet a direct repeat végek, vagy más mobilis genetikai elemek segítségével. A választott malacok ETEC okozta hasmenése elleni védekezés terén igéretes új irányzatot képviselnek az élő orális vakcinák, Ahhoz, hogy egy orálisan alkalmazható vakcina sikeres legyen, szükséges, hogy a vakcina törzs a kórokozó törzsekhez hasonlóan a bélcsatornában jól el tudjon szaporodni (megtelepedjen), és hogy toxikus, vagy egyéb (bélboholy károsító) virulencia faktoroktól mentes legyen. Ilyen vakcina-jelölt törzsek előállításához pedig feltétel az ún. vad (virulens) törzsek virulencia génjeinek és az azokat hordozó mobilis genetikai elemek részletes ismerete. CÉLOK Munkám általános célja volt a 2173-as (O147:NM, Hly, F18ac, STa, STb) ETEC törzs (Nagy, B és mtsai 1990. J. Clin. Microbiol. 28, 651-653) valamint más, választott sertések hasmenését okozó ETEC és ödéma betegséget okozó verotoxin-termelő Escherichia coli (VTEC) törzsek virulencia plazmidjainak analízise. Ezen belül célok voltak: 1. Az F18 fimbria géneket hordozó plazmidok jellemzése és genotipizálása az ún. replikontipizálás módszerével. 2. A 2173 törzs sta és stb enterotoxin génjeit valamint egy tetb tetraciklin rezisztenciagént hordozó ptc jelű plazmidjának genetikai analízise: elsősorban a ptc replikációs origójának és környezetének szekvenálása és molekuláris biológiai analízise. 3. A ptc plazmid sta és stb enterotoxin génjei közötti kapcsolat vizsgálata: annak felderítése, hogy rendelkezeik-e a ptc plazmid egy nagyobb -több virulenciagént magába foglaló- mobilis elemmel, amely a kromoszomálisan elhelyezkedő patogenitási szigetekhez mutat hasonlóságot? ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A nem részletezett molekuláris biológiai módszereket Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, Cold Spring Harbor, New York, szerint végeztük. 2
F18 fimbriát kódoló plazmidok jellemzése és replikontipizálása A választási hasmenés vagy ödéma betegség következtében elhullott malacból származó 17 E. coli törzs kettő kivételével magyarországi izolátum volt. (Nagy és mtsai. 1990, 1997). A két külföldi törzs közül a 107/86 jelűt H. Bertschinger (Svájc), a 2228-as törzset pedig A. O Brien (USA) bocsátotta rendelkezésünkre. A törzsek patotípusát, O szerocsoportját valamint enterotoxin-, vero- (Shiga-) toxin génjeit és F18 fimbriáit Nagy és munkatársai (1990, 1997) határozták meg. Módosított Kado-Liu plazmid izolálás után a minták 40µl-ét 0,5% TAE garaóz gélben 40 V feszültségen legalább 16 óra elektroforetizáltuk. Elektroforézis után 0.25 M HCl oldattal 15 depurináltuk majd denaturálás (0,4 M NaOH és 0,6 M NaCl) és neutralizálás (0,1 M TRIS és 1,5 M NaCl ph=7) következett. Az előkészített gélt PHARMACIA gélszárító berendetéssel 10 alatt mintegy 2 mm vastagságúra szárítottuk a hibridizációt a szárított gélben végeztük. Előhibridizálást (15 ml 20x SSC, 1 ml (10mg/ml) heringsperma DNS, 1 g sovány tejpor, 0.5 ml 20% SDS 100 ml desztillált vízben) 1 órán keresztül 60 Cº-on végeztünk, majd ehhez az oldathoz adtuk hozzá a rep-próbákat (PHARMACIA Ready to Go DNA Labelling Kit -tel P 32 tartalmazó dctp-vel jelölve) és éjszakán át 60 Cº-on hibridizáltattuk. -Hibridizáció után a gélt desztillált vízzel öblítettük, majd röntgenfilmen (AGFA) 24 (48 illetve 72) órán keresztül -80 Cº-on exponáltunk. A 2173 ETEC törzs F18 fimbria plazmidjának konjugációs vizsgálata Az F18ac fimbria plazmid konjugációjakor a 2173 ETEC törzs NB 2/11 jelű származéka szolgált donorként. Recipiensként az XL1blue jelű K12 E. coli törzset használtuk. A donor és recipiens törzseket LB táplevesben egy éjszakán át növesztettük, majd mindkét tenyészetből 100-100 µl-t LB agar lemezre cseppentve szélesztettünk és egy éjszakán át 37C o on növesztettük. A kinőtt baktériumszőnyeget lemezenként 5ml steril fiziológiás sóoldattal kémcsőbe átmosva és hígitási sort készítve szelektív LB agar lemezekre szélesztettünk. A transzkonjugánsokat tetraciklin tartalmú 5% juhvér tartalmú lemezeken szelektáltuk. A 2173 ETEC törzs ptc plazmidjának konjugációs vizsgálata TG1, HB101 és S17-1 E. coli K12 baktériumokat transzformáltunk CaCl 2 -os módszer szerint a ptc plazmiddal a konjugációs képességének vizsgálata céljából. A HB101 sem plazmid-mobilizációs sem plazmid átviteli funkciókat nem kódol, a TG1 kromoszómáján F plazmidot hordoz, konjugációs képesség hiányával, az S17-1 pedig a plazmid-mobilizációs funkciókért felelős géneket a kromoszómájára beépülve hordozza. Recipiens törzsekként a 2173 ptc mentes derivátumait (NB- 1/36, 2/2 és 2/11) használtuk. A transzkonjugánsokat tetraciklin tartalmú minimál (GTS) táptalajon szelektáltuk. 3
A ptc plazmid replikációs origójának klónozása A replikációs origó meghatározásához a ptc plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztettük, majd az így nyert fragmenteket megtisztítva véletlenszerűen a paw302 plazmid szintén BamHI. enzimmel kivágott cat (kloramfenikol acetiltranszferáz) génjéhez ligáltuk. Az így nyert deléciós ptc származékokat TG1 K12 törzsbe transzformáltuk. A transzformáns baktériumok csak abban az esetben szaporodtak, ha a cat gén a ptc replikációs origóját hordozó szakaszhoz kapcsolódott. A kloramfenikol tartalmú LB agaron nőtt telepből plazmid DNS-t tisztítottunk; a plazmidkonstrukció a ppfe1 jelölést kapta. Restrikciós enzimekkel végzett fizikai térképezés után megkezdtük az origót tartalmazó fragment szekvenálását. A megszekvenált 4761 bp-nyi szakasz nukleotid sorrendjét az EMBL Nucleotide Sequence Database adatbázisban AJ627566 szám alatt helyeztük el. A ptc plazmid stabilitásának vizsgálata Plazmid-szegregációs kisérleteink során HB101 baktériumokat transzformáltunk cole1 típusú replikációs origóval rendelkező plazmidokkal az alábbi kombinációk szerint: pembl19 (Amp R ), pfol5 (Cm R ) ptc (Tc R ), pembl19 (Amp R ), pfol5 (Cm R ) ppfe2 (Km R ), pembl19 (Amp R ), pfol5 (Cm R ) ppfe2 (Km R ), ptc (Tc R ), pembl19 (Amp R ) A plazmidokat tartalmazó baktériumok egy-egy telepét LB levesbe oltottuk, majd 5-ször 37C o -os éjszakán át tartó tenyésztés után továbboltottuk. Az adott plazmidot hordozó telepek számát minden passzálási lépés után meghatároztuk (antibiotikumtartalmú LB agar lemezeken). A plazmidokra jellemző antibiotikum-rezisztencia mintázat eltűnését szegregációs eseményként értelmeztük. Toxin specifikus lókusz (TSL) meghatározása a ptc plazmidon DNS szekvencia meghatározást mind a ptc-, mind a pakr2 plazmid esetében a (QIAGEN Plasmid Maxi kit segítségével tisztított) emésztetlen teljes plazmidon végeztünk ABI PRISM 310 Genetic Analyzer valamint LI-COR DNA Sequencer model 400 automated sequencer készülékek felhasználásával primer walking módszerrel. Szekvencia analízisre az NCBI BLAST szoftvercsomag blastx (BLAST Nucleotide query - Protein db), blastn (standard nucleotidenucleotide BLAST) és BLAST 2 Sequences similarity search szoftvereket használtunk. A szekvenálási adatokból a TSL ptc konszenzus szekvenciáját a BioEdit 5.0.9 szoftver csomag CAP Contig assembly illetve ClustalW programjaival állítottuk össze. Nyílt leolvasási keretek (ORF) keresésére valamint a 9872bp hosszú TSL ptc fizikai térképének megszerkesztésére a Vector NTI6 programot használtuk. A TSL ptc teljes nukleotid sorrendjét az EMBL Nucleotide Sequence Database adatbázisban AJ555214 szám alatt helyeztük el. A TSL ptc transzpozíciójának vizsgálata Kisérleteink során TG1 K12 törzset transzformáltunk előbb a ptc (cole1 replikációs origó) majd a pacyc177 (p15 replikációs origó) plazmiddal. A Tc R, Amp R, Km R fenotípust mutató telepek közül 4
egyet 3ml LB levesbe oltva azt rázatás nélkül 37C o -on egy éjszakán át inkubáltuk, mely időtartam alatt a két plazmid közötti véletlenszerű transzpozíciós esemény bekövetkeztét vártuk. A konjugációs donorként használt hibrid -plazmidokat is tartalmazó TG1 törzset ampicillin és kanamicin tartalmú, valamint a recipiens J5-3 egy éjszakás tenyészetének 100-100 µl-ét antibiotikummentes LB agar lemezen összecsöppentve szélesztettük, majd 37 C -on egy éjszakán át növesztettük. A kinőtt baktérium szőnyeget 5ml fiziológiás sóoldattal lemostuk, majd ebből 10-1 - 10-6 közötti hígitásokat készítettünk. A hígitási lépések 100-100 µl-ét ampicillin, kanamicin és rifampicin tartalmú LB agar lemezekre szélesztettük. Egy éjszakás 37 C -os növesztés után az Amp R, Km R, Rif R telepeket vizsgálva azok között tetraciklin érzékeny (Tet S ) fenotípusúakat kerestünk. A további vizsgálatokra az AKR1, AKR2, AKR3 jelű telepeket találtuk alkalmasnak. A pakr2 transzpozíciós termék részleges szekvenálásával (AO1 ill. OK2 primerek alkalmazásával) a 40kb-nyi mobilis genetikai elem mindkét végén IS10 elemet azonosítottunk, jelezvén, hogy a vizsgált elem végeit IS10 inszerciós szekvenciák határolják. Ezen adataink alátámasztják azon feltételezésünket, hogy a TSL ptc egy nagyobb (40kb) patogenitási sziget része. A TSL ptc elterjedésének vizsgálata F4(K88 + ) és F18 + ETEC törzsekben A TSL stb gén és annak 5 határoló régiójának vizsgálatára az is1rev és stbrev jelű primerpárt alkalmaztuk. A vizsgált törzsek részben Magyarországról és Ausztriából (12) részben az Amerikai Egyesült Államokból (12) származtak EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁS Patogén E. coli baktériumok számos virulencia génjét az F inkompatibilitási komplexbe tartozó univagy multireplikon plazmid kódolja. Az F18 fimbriát termelő enterotoxikus valamint verotoxikus E. coli törzsek adhéziós faktor génje plazmidokon található, de ezen plazmidok replikációs tulajdonságait még kevéssé vizsgálták. Vizsgálatainkal megerősítettük a F18 gének plazmidon történő kódolását, és első ízben határoztuk meg replikációs origójukat. A vizsgált törzsek többsége 3 nagy molekulatömegű plazmidot hordozott. Minden esetben egy nagy (>36 kb) plazmid sáv hibridizált a 107/86 törzsből PCR-el felerősített és radioaktívan jelölt (P 32 ) F18 próbával, jelezve, hogy mind az ETEC (F18ac) mind a VTEC (F18ab) törzsek adhezinjének génjét plazmidok hordozzák, beleértve a 107/86-os F18ab referencia törzset is. Az F18ab és F18ac plazmidok mérete nem volt egyforma. A különböző szerocsoportokba tartozó ETEC törzsek F18ac plazmidjaira hasonló méret volt jellemző (150 kb körül), mely hasonlóság felveti ezen adhezin plazmidok klonális eredetét, horizontális terjedésének lehetőségét. Ezzel szemben a VTEC törzsek adhezin plazmidjainak mérete ugyanazon szerocsoporton belül is 63-150 kb között változott, jelezve, hogy a horizontális terjedés során esetenként nem teljes plazmidok, hanem csak az F18ab operont hordozó 5
egyes szakaszok juthattak át ezen törzsek különböző őshonos plazmidjaira. A replikontipizálási eredmények, melyek szerint az adhezin plazmidok a RepFI (vagy ezzel rokon) csoportba sorolhatók, az F18ac plazmidok közös eredetét támasztották alá. Az NB2/11 törzzsel végzett konjugációs vizsgálatok eredményei szerint a többnyire kromoszomális elhelyezkedésben vizsgált α-hemolizint az F18ac operonnal kapcsolva ugyanazon a nagy méretű, és kisérleteink szerint konjugatív plazmidon találtuk meg. Amíg a 2173 adhéziós tulajdonságáért valamint a hemolízisért az pf18 plazmid felelős, a választási hasmenést kialakító sta és stb enterotoxin géneket ezen ETEC törzs másik (ptc) jelű 120kb méretű virulenciaplazmidja hordozza. A ptc plazmid megismeréséhez szükséges volt megvizsgálni, hogy mennyire stabilan marad fenn a 2173 baktériumban, illetve, hogy stabilitásában milyen plazmidkompatibilitási mechanizmusok érvényesülnek. Ezért a ptc-ből két plazmid konstrukciót állítottunk elő: a ppfe1-et valamint a ppfe2-t. A ptc replikációs origóját a ppfe1 plazmidon szekvenáltuk, és megállapítottuk, hogy az módosult cole1 típusú, melynek Rom (szabályozó) fehérje génjében deléció van. Feltételezve, hogy a ptc origójának ezen rövidülése szerepet játszik a 2173 plazmid-háztartásának fenntartásában, szegregációs kisérletekkel vizsgáltuk a ptc, a ppfe2 illetve más, hibátlan cole1 origójú plazmidok (pembl19, pfol5) fennmaradását a HB101-es K12 törzsben. A baktériumtelepek rezisztenciaképe alapján összehasonlítva a teljes Rom fehérjét kódoló hagyományos cole1 origójú plazmidokkal, mintegy 50 osztódás után a ptc illetve kanamicin rezisztenciát kódoló ppfe2 származéka volt többségben. A ptc erősebb inkompatibilitási hatást mutatott: a telepek 97,55%-a a ptc-re jellemzően tetraciklin rezisztens volt. A ppfe2 plazmid esetében enyhébb az inkompatibilitási hatás. Mindazonáltal még így is a cole1 ptc origót hordozó plazmid maradt fenn, bár alacsonyabb számban. Ha a pembl19 mellé mindkét cole1 ptc origójú plazmidot bejuttattuk, akkor érdekes módon a ptc és ppfe2 együttes fennmaradását tapasztaltuk a pembl19 elvesztése mellett. Ez a úgy értelmezhető, hogy a ptc plazmidon található replikációt szabályozó gének termékei a ppfe2 origóját is, mint saját, ptc origót ismerik fel, s annak replikációjában mint transz regulátorok vesznek részt. Feltételezésünket, hogy a ptc nagyfokú stabilitását a rom génben észlelt deléció okozhatja, további kisérletekkel lehetne bizonyítani. Mint ismeretes az STa enterotoxin génje a Tn1681 jelű transzpozon része, az STb enterotoxin génje pedig a Tn4521 transzpozon része. Korábbi megfigyeléseink alapján, -ahol egyazon ETEC törzs STa és STb enterotoxint is termelt- feltételezhető volt a genetikai kapcsolat a két toxin gén, továbbá a toxin- és az adhezin géneket hordozó plazmidok között. Ezen genetikai kapcsolatra példa a ptc plazmid enterotoxin génjeinek szekvenálása során meghatározott 10kb méretű TSL ptc. A 9872 nukleotidnyi TSL szakasz szekvencia analízise alapján az sta és stb gének szekvenciája majdnem teljesen megegyezik a korábban leírtakkal. mindkét oldalán az irodalmi adatoknak megfelelően 6
Tn1681 transzpozonra specifikus szakaszokat találtunk, ezzel szemben az stb gént határoló szekvenciák teljesen különböztek a korábban megismertektől, mivel a TSL ptc stb génjének környezetében a Tn4521 transzpozonra jellemző defektív IS2 inszerciós elemekre utaló szekvenciákat nem találtunk. Az stb géntől upstream irányban közvetlenül teljes IS1 elem helyezkedik el, mely szoros kapcsoltság arra utal, hogy a TSL ptc stb génje egy IS1-alapú virulencia-transzpozon része, szemben a Tn4521 transzpozonnal. Vizsgálatainkkal a tetraciklin rezisztenciáért felelős tetb gén és a TSL között funkcionális kapcsolatot nem találtunk. Az stb től downstream irányban deléciós phev gén van, mely trns gén részleges deléciója utal a patogenitási szigetek integrációjakor végbemenő rekombinációra. Az sta és stb géneket hordozó TSL ptc szerkezete alapján szembetűnik a virulenciagéneket mindkét oldalról határoló több (teljes illetve defektív) mobilis genetikai elem melyek korábbi interbakteriális génkapcsolatokra utalnak. Ezek eredményeként a TSL szerkezete a patogenitási szigetek szerkezetével hasonlítható. A TSL-ben pl. más E. coli patotípusból illetve más Enterobacteriaceae fajból eredő gének is találhatók: az 536 UPEC törzs PAI I 536 patogenitási szigetének bizonyos részeivel és EHEC törzsek po157 virulenciaplazmidjának fragmentjeivel homológ szakaszok valamint Shigella flexneri sena génjének downstream szekvenciáival valamint a pwr100 virulencia plazmiddal homológ szakaszok. A ptc plazmid stb génjének analízise két pontmutációt tárt fel: a termelődő STb molekula 35. (az aktiv STb 12. -) aminosav pozíciójában hisztidin helyett aszparagin, valamint a 46. (az aktiv STb 23. -) helyén a lizin helyett izoleucin állna. Bár a 2173 törzs mutatja az STb-re jellemző toxinhatást, e két mutáció a toxin aktivitását befolyásolhatja. E pontmutációk toxin aktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálatára együttműködést kezdtünk az STb molekula receptorát szulfatid molekulaként meghatározó kanadai kutatócsoporttal. Mobilzálási kisérleteink során a ptc plazmid mintegy 40 kb-nyi szakaszát sikeresen transzponáltuk pacyc177 plazmidra és a transzpozíciós termék (pakr2) hordozta a TSL ptc t. A TSL sikeres transzpozíciója megerősítette feltevésünket, hogy a ptc enterotoxin génjei mobilis genetikai elemen helyezkednek el,. Vizsgálataink szerint a TSL egy nagyobb, mintegy 40 kb nagyságú elem részeként helyeződött át a pacyc177-re. Ez a szakasz nemcsak az sta, stb enterotoxin gént, valamint a phev gént tartalmazta, hanem a cole1 replikációs origót és a plazmid mobilizációért felelős mob régiót is. A 40kb méretű fragment mobilitását viszont a két végét alkotó IS10 szekvenciák magyarázzák. Ennek alapján igazolható feltevésünk, miszerint a TSL ptc -t hordozó elem egy új enterotoxikus plazmidon kódolt patogenitási sziget (PAI I 2173 ). A 40 kb PAI I 2173 szekvenciájának meghatározása mely a vizsgálataink következő lépése lesz minden bizonnyal további ismeretekkel szolgál majd annak horizontális terjedését és jelentőségét illetően is. 7
Feltevésünk igazolására több, malacok választott hasmenéséből izolált, különböző földrajzi eredetű (Magyarország, Ausztria, Egyesült Államok), F4(K88) fimbriát hordozó ETEC, F18 fimbriát hordozó ETEC valamint F18 fimbriát hordozó ETEC/VTEC törzset vizsgáltunk, hogy az stb gén mely mobilis virulencia elem (Tn4521 vagy a TSL ptc ) részeként található meg bennük? Azt tapasztaltuk, hogy a Tn4521 stb-transzpozon (a földrajzi származástól függetlenül) inkább az F4(K88) fimbriált törzsekre volt jellemző, míg az F18 fimbriát expresszáló ETEC illetve ETEC/VTEC törzsek többnyire (11/13) a TSL részeként hordozták az stb gént. PCR vizsgálataink szerint a Tn4521 az F4(K88) fimbriát hordozó törzsek több mint a felénél (6/10) jelen volt. Mindkét csoportban néhányszor tapasztaltuk nem specifikus amplikonok megjelenését is. Tekintettel arra, hogy ismereteink szerint az F18 és K88 fimbria gének eltérő tulajdonságú plazmidokon találhatóak, eredményeink nem csak egy új, plazmidkódolt, enterotoxikus patogenitási szigetre mutatnak rá, hanem az enterotoxin és fimbria géneket hordozó plazmidok közötti kapcsolatok feltételezését is megengedik. Munkánk során a vakcinafejlesztésben is felhasználható információkat nyertünk az ETEC törzsek virulencia plazmidjairól, a virulencia gének működéséről. KÖVETKEZTETÉSEK - TÉZISEK 1. Plazmid analízis- és replikontipizálási vizsgálataink során megállapítottuk, hogy Magyarországi választott sertések hasmenése- ill. ödéma betegségének eseteiből izolált ETEC ill. VTEC törzsek jellegzetesen 2-3 nagy (>30 kb) plazmidot hordoznak. A törzsek F18 fimbria (és hemolizin) géneket hordozó ún. F18 plazmidjai az FIc inkompatibilitási csoporton belül annak FIIa vagy I1 alcsoportjába tartoznak, s ilyen szempontból az eddig megismert ETEC virulencia plazmidokra csak részben hasonlítanak. Az ETEC törzsek jellegzetes képviselőjeként kiválasztott 2173-as törzs F18ac plazmidját >200 kb molekulatömegűnek határoztuk meg. 2. A 2173-as ETEC törzs enterotoxin génjeit (sta, stb) egy 120kb méretű plazmidon azonosítottuk, mely egyúttal tetraciklin rezisztenciát (tetb) is kódolt (ptc). A ptc plazmid replikációs origóját megszekvenálva, azt az enterotoxin plazmidokra is jellemző, cole1 típusúnak találtuk, melynek mob régiójában azonban egy kb. 400 bp-nyi deléció van. 3. Az ptc plazmid sta és stb génjeinek kapcsolatát valamint környezetüket vizsgálva leírtunk egy 40 kb plazmidon kódolt enterotoxikus, patogenitási szigetet (PAI I 2173 ), azon belül egy ún. toxin specifikus lókuszt (TSL ptc ), melynek mobilizálását és részletes jellemzését is elvégeztük. 4. Megállapítottuk, hogy a TSL a választott malacokra nézve hatékony hőstabil toxin (sta és stb) géneknek egy újabb közös vektora lehet. Ezen belül az sta gént a korábbi leírásnak megfelelő Tn1681 transzpozonon, az stb gént viszont az eddig ismert Tn4521 transzpozontól eltérő 8
szekvencia környezetben találtuk. Vizsgálataink alapján úgy tűnik, hogy a TSL a horizontális géntranszfernek az eddig megismert transzpozonok mellett egy ugyancsak széles geográfiai elterjedtségű, az F18 + ETEC törzsekre jellemző eszköze. 5. A 2173 törzs (az F18 és ptc plazmidokról szerzett ismereteinken alapuló) atoxikus variánsa kiegészítve K88 fimbriát kódoló plazmiddal, egy, a sertések választási hasmenésének megelőzését célzó vakcinatörzs jelölt létrehozásának kiindulópontja lehet. TÉZISEK ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK Fekete, P. Z., Gerardin, J., Jacquemin, E., Mainil, J. G., Nagy, B., 2002. Replicon typing of F18 fimbriae encoding plasmids of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli strains from porcine postweaning diarrhoea and oedema disease. Vet. Microbiol. 22, 275-284. (IF: 1,65) Fekete, P. Z., Schneider, G., Olasz, F., Blum-Oehler, G., Hacker, J. H., Nagy, B. 2003. Detection of a plasmid-encoded pathogenicity island in F18+ enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli from weaned pigs. Int. J. Med. Microbiol. 293(4), 287-298. (IF: 1,362) Olasz, F., Feketel, P. Z., Blum-Oehler, G., Boldogkői, Z., Nagy, B. 2005. Characterization of an F18+ enterotoxigenic Escherichia coli strain from post weaning diarrhoea of swine, and of its conjugative virulence plasmid ptc. FEMS Microbiol. Lett. nyomtatás alatt (IF: 1,932) A DOLGOZAT TÉMÁJÁBAN MEGJELENT EGYÉB PUBLIKÁCIÓK Nagy, B., Fekete, P. Zs., 1999. Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals. Vet. Res. 30, 259-284 (IF: 1.49) TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZETEK Nagy, B., Tóth, I., Fekete, P. Zs. 2005. Adhesins and receptors for colonisation by different pathotypes of Escherichia coli in calves and young pigs. In: Holzapfel, W. and Naughton P. eds.: Microbial ecology of the growing animal. 2005 Elsevier Science, Amsterdam, The Netherlands, megjelenés alatt SZABADALOM Élő, szájon át adható Escherichia coli vakcina készítésére alkalmas törzs a sertések választási hasmenésének megelőzésére és a törzs készítésére alkalmas eljárás. Lajstromszám: 221 664 (P 99 00836 ügyszámú bejelentés alapján) Szabadalmi bejelentés napja és az oltalmi idő kezdete: 1999 március 31. Szabadalom jogosultja: MTA Állatorvostudományi Kutatóintézete, Budapest. Feltalálók: dr. Nagy Béla, Budapest 50%; Olasz Ferenc, Gödöllő, 30%; Fekete Péter Zsolt, Dunaharaszti, 15%; Tóthné Szekrényi Márta, Budapest 5% 9
A strain suitable for producing a live, orally applicable Escherichia coli vaccine for the prevention of post-weaning diarrhoea in pigs, and the procedure suitable for producing that strain. Nemzetközi Szabadalom leadva 2000 március 29-én, PCT/HU00/00026 szám alatt KONFERENCIA KIADVÁNYOK Fekete, P. Zs., Olasz, F., Szeverényi, I., Nagy, B., 1997. Az EC2173 enterotoxikus E. coli törzs ptc plazmidjának jellemzése, előadás, Magyar Mikrobiológiai Társaság 1997. évi nagygyűlése előadásainak és posztereinek összefoglalói, Szekszárd, p23 Fekete, P. Zs., Olasz, F., Szeverényi, I., Blum-Oehler, G., Nagy, B., 1998. ptc (EC2173) deléciós plazmidszármazékok vizsgálata, poszter, Magyar Mikrobiológiai Társaság 1998. évi nagygyűlése előadásainak és posztereinek összefoglalói, Miskolc, p32 Fekete, P. Zs., Gerardin, J., Mainil. J. G., Nagy, B., 2000. Hazai F18 fimbriát hordozó enterotoxikus és verotoxikus E. coli törzsek plazmidjainak jellemzése és replikontipizálása Magyar Mikrobiológiai Társaság 2000. évi nagygyűlése előadásainak és posztereinek összefoglalói, Szekszárd, p34 Fekete, P. Zs., Bluhm-Oehler, G., Hacker, J., Nagy, B., 2001. Plazmidon lokalizált enterotoxikus patogenitási sziget részleges jellemzése. Magyar Mikrobiológiai Társaság 2001. évi nagygyűlése előadásainak és posztereinek összefoglalója, Balatonfüred, p49 Fekete, P. Z., Schneider, G., Olasz, F., Blum-Oehler, G., Hacker, J. H., Nagy, B. 2003. Detection of a plasmid-encoded pathogenicity island in F18 + enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and verotoxigenic E. coli (VTEC) from weaned pigs. Scientific program & abstracts of the 11 th European Conference on Bacterial Protein Toxins (ETOX11), Čelakovice, Czech Republic,Poster Abstract number: P46 FEMS 2003 Fekete, P. Z., Schneider, G., Olasz, F., Blum-Oehler, G., Hacker, J. H., Nagy, B. 2003. Plasmid borne pathogenicity island of F18 + enterotoxic Escherichia coli. Abstract book of the 1st FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, P13-5 Nagy, B., Olasz, F., Fekete, P. Zs., Blum-Oehler, G., Hacker, J. 2004. Peculiarities of virulence plasmids of F18 + enterotoxigenic Escherichia coli causing postweaning diarrhoea. Proceedings of the 18 th IPVS Congress, Hamburg, Germany, 2004 Volume 1. p.259 IDÉZETTSÉG (2004. június 30.) Fekete Péter Zsolt tudományos közleményeire való hivatkozások száma SCI folyóiratokban: 30 10