FARMAKOBOTANIKA I. FÉLÉV / 1. GYAKORLAT
MIKROSZKÓPOS TECHNIKÁK, PREPARÁTUM KÉSZÍTÉS
Rögzítés nélküli minták vizsgálata Kézi metszetek frissen begyűjtött anyagból hisztokémiai vizsgálatok (keményítő, sejtfalanyagok, lipidek, alkaloidok szöveti lokalizációja) gyors, egyszerű többnyire keresztmetszet, viszonylag vastag A bőrszövet vizsgálata: epidermisz nyúzat tisztítás (hypo) festés
Levélderítés színanyagok és néhány szövet kioldása felszíni struktúrák (trichómák), sejtfalak, szállítószövet rendszer, kristályok megmaradnak vizsgálhatók Forralás: (1) desztillált víz (2) 10% alkohol : tömény KOH (7:3) (3) 5% H 2 O 2 (4) átöblítés desztillált vízzel (5) 96% alkohol (6) (festés)
A növényi rész feldarabolása
(1) forralás desztillált vízben
(2) 10 % alkohol és cc. KOH oldata
(3) 5 % H 2 O 2 -dal
(4) átöblítés desztillált vízzel (5) kezelés 96 % etanollal
kész derített levéldarab derített levél fénymikroszkópos képe
RÖGZÍTÉS (FIXÁLÁS) az életfolyamatok megszűnnek többé-kevésbé az élő állapotnak megfelelő rögzítés (tökéletes nincs) Rögzítő anyagok: sok és stabil keresztkötés kialakítása polipeptid láncok között jól penetrálnak : behatolnak a növényi szövetekbe
Rögzítő anyagok etil-alkohol: kézi metszetek fénymikroszkópos vizsgálatra konzervál is keményít jól metszhetővé tesz víztelenít, zsugorít ozmium-tetroxid (OsO 4 ): egyik legjobb rögzítőszer főleg TEM mérgező! sejtmag és citoplazma szerkezetét jól megtartja lassan hatol be a szövetekbe kis szövetdarabok rögzítése
Rögzítő anyagok rögzítő keverékek: alkoholos formalin TEM kettős fixálás: Prefixálás: - fehérjék gyors stabilizálása - monoaldehid (pl. paraformaldehid) vagy dialdehid (pl. glutáraldehid) segítségével; pufferrel oldat készítése, ph beállítása Mosás pufferrel Posztfixálás: ozmium-tetroxiddal KONZERVÁLÁS - pl. Strassburger-Flemming féle tartósító: 100% alkohol : glicerin : deszt. víz 1:1:1 arányú elegye - így hosszú ideig eltarthatók a minták
növényi minták fixálóban
TARTÓS PREPARÁTUMOK KÉSZÍTÉSE VÍZTELENÍTÉS átitató (beágyazó) anyagok: hidrofóbak elektronmikroszkóp vákuum csak vízmentes minták! (ne legyen fényvisszaverés pl.) vízelvonószer sorozat: etil-alkohol: 30, 50, 70, 90, 96 és 100% (felszálló sorozat) aceton 70, 90, 100% xylol I., II.
aceton 90 % aceton 100 % xilol I. xilol II. aceton 70 %
minták víztelenítése gézben
VÍZTELENÍTÉS SEM: kritikus ponton szárítás 1. nyomás- és hőmérséklet kombináció 2. mintában folyadék és felette gőz fázis sűrűsége nem különböztethető meg 3. a folyadék gőzként vonható el BEÁGYAZÁS - klasszikus: paraffin vagy paraplaszt (hidrofób) - előtte: intermedier anyag: benzol vagy xilol - beágyazás műgyantába: poliészter- és epoxigyanták (pl. Araldit, Durcupan, Technovit)
szilárd paraplaszt a termosztátban felolvadt paraplaszt a mintákkal
paraplaszt mintatartókba
minta behelyezése a felolvadt paraplasztba
megszilárdult paraplaszt (=blokk) kiemelése a mintatartóból kész blokk blokk faragása (= trimmelés)
Beágyazás műgyantába műgyantás mintatartó 10 db mintának
kész műgyantás blokk mintával
MIKROTOMOS METSZÉS Fénymikroszkópos vizsgálat: paraffin beágyazás szánka- / rotációs mikrotom: acél kés 1-2 20 m vastag műgyantás beágyazás félvékony metszetek Transzmissziós elektronmikroszkópia: műgyantás beágyazás ultramikrotom: üveg vagy gyémánt kés, a minta mozog 60-70 nm vastag (az üveg olcsó, de rövidebb életidejű)
szánkamikrotóm mintatartó satu
rotációs mikrotóm
A METSZETEK RÖGZÍTÉSE pl. zselatinnal vonjuk be a tárgylemezt (vagy glicerin tojásfehérje keveréke) félvékony metszetek melegítés tárgylemezre tapadnak 80-90 C-on TEM metszetek: gridre (fémrács) Fénymikroszkópos festékek: FESTÉS savanyú anilinfesték-oldatok: anilinkék, eozin, szudán III. és IV. bázikus anilinfesték-oldatok: malachitzöld, szafranin, toluidinkék (= leggyakoribb)
Hisztokémiai festékek: FESTÉS - frissen gyűjtött, élő anyagból készített metszeteken sósavas floroglucin: ruténiumvörös: szudán III.: vas(iii) - klorid: Dragendorff - reagens: kálium - jodidos jód: (Lugol-oldat) glicerin-zselatin kanadabalzsam ( lignin kimutatása pektintartalmú sejtfalak lipidek, (illó)olajok, viasz, kutin, szuberin csersavak, flavonoidok alkaloidok (vörös) amiloplasztok (kék), aleuron (barna) METSZETEK ÁLLANDÓSÍTÁSA kanadai balzsamfenyő)
festőkádak kész preparátumok
Kész festett preparátum (levél keresztmetszet)
Kész preparátumok kiértékelése (pl. morfológiai mérések) számítógépes programokkal
Morfológiai értékelés: pl. Image Tool 3.0 programmal
Morfológiai értékelés: Image Tool 3.0 programmal Mérhető morfológiai paraméterek pl.: - sejtek magassága / szélessége / hossza ( m) - egyes sejtrétegek vastagsága (pl. kutikula, parenchyma, m) - területek (pl. egy szövettájé, m 2 ) farkas kutyatej (Euphorbia cyparissias) nektárium hm. Ami a mérésekhez mindig szükséges: - min. 10 mérés átlagolni szórásértékeket feltüntetni - kalibrációs egység használata (10, 50, 100 m) Pl. kutikularéteg vastagsága (µm) 2.84 ± 0.62 sárkutyatej (Euphorbia esula) pollenszemek