Linc Gabriella A FISH technika alkalmazása az előnemesítésben Czuczor Gergely Bencés Gimnázium és Kollégium Győr, 2016. április 13. www.meetthescientist.hu 1 26
- 1997-98 vendégkutató - növény genetikai és génbanki kutatások www.meetthescientist.hu 2 26
www.meetthescientist.hu 3 26
Kansas-i képek www.meetthescientist.hu 4 26
Áttekintés kutatási háttér bemutatása molekuláris citogenetikai technikák: FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció) FISH technológia alkalmazása a termesztett búza és rokonsági körében MTA Agrártudományi Kutatóközpont, Mezőgazdasági Intézet, Martonvásár www.meetthescientist.hu 5 26
A termesztett búza genetikai variabilitása Prebreeding előnemesítés Klímaváltozás: abiotikus (hő, só, és szárazságtűrés), valamint biotikus(betegségrezisztencia) stresszekkel szemben ellenállóbb genotípusok idegen fajú addíciók, szubsztitúciók és transzlokációk előállítása www.meetthescientist.hu 6 26
Kromoszómák A sejt genetikai információit hordozó DNS általában kromoszómának nevezett makromolekulákba van csomagolva kromoszómák génekből épülnek fel gének DNS-ből állnak 8 April 2016 Linc Gabriella
Kromoszómák morfológiája www.meetthescientist.hu 8 26
Faj- és nemzetségkeresztezések miért fontos? kedvező agronómiai tulajdonságok átvitele a rokon fajokból a termesztett búzába az utódokban a beépített kromoszómák (szegmentumok) kimutatása molekuláris citogenetikai módszerekkel www.meetthescientist.hu 9 26
Molekuláris citogenetika a molekuláris genetika és a citogenetika társtudománya a kromoszómák szerkezetét, genetikai funkcióját vizsgálja molekuláris szinten alapja a nukleinsav hibridizáció (DNS, RNS) Linc Gabriella 2016.04.08.
Molekuláris citogenetikai technikák in situ hibridizáció (ISH) sejten, szöveten belül tudunk komplementer nukleotid szakaszokat hibridizáltatni jelölt próbákkal www.meetthescientist.hu 11 26
Az ISH alapvető lépései 2016.04.08. www.meetthescientist.hu 12 26
Próba jelölési módok rádioaktív (P 32, S 35, I 125, H 3 ) nem használjuk nem- rádioaktív - indirekt: Digoxigenin (Digitalis purpurea, steroid) Biotin (vitamin H1) (próbákat hapténnel jelölik, amihez fluorokróm kapcsolható) - direkt: fluorokrómok (fluorogreen-11-dutp, fluorored-11-dutp) www.meetthescientist.hu 13 26
Enzimatikus jelölés Nick Transzláció 1. DN-áz I enzim kis, random bevágásokat (nick) ejt a DNS szálain 2. DNS-polimeráz I a bevágástól indulva a sorban következő nukleotidokat kivágja, és a reakcióelegyhez adott jelölt nukleotidokat építi be www.meetthescientist.hu 14 26
Hibridizáció - elemzés Hibridizációs kamra high sensitivity charge-couple device (CCD) kamera www.meetthescientist.hu 15 26
Nagy felbontású FISH a növényi kutatásban Metafázis - hibridizációs jelek száma, kromoszóma azonosítás - genomazonosítás - alacsony felbontás 2.5 µm Pachytén kromoszómák azonosítása heterokromatin és eukromatin megkülönböztethető - kedvezőbb felbontás 37 µm DNS fiber felbontás ~ 1 kb kimutathatóság < 700 bp DNS szekvencia 2.5 3.5 bp / µm pontossággal elemezhető nincs kromoszóma szerkezet 120 µm www.meetthescientist.hu 16 26
ISH mitótikus kromoszómákon az első FISH kísérleteket mitotikus kromoszómákon végezték kromoszómák morfológiai tulajdonságai pontosan megfigyelhetők (centroméra, teloméra, szatellit) kondenzált kromatin szerkezet alacsony és limitált kimutathatósági tartomány és detektálási érzékenység www.meetthescientist.hu 17 26
Humán spektrális kariotipizálás www.meetthescientist.hu 18 26
GISH (genomikus in situ hibridizáció) idegen eredetű DNS kimutatására a búza genomban Barley DNA Barley DNA www.meetthescientist.hu 19 26
GISH és FISH idegen eredetű DNS kimutatására és azonosítására a búza genomban Afa family psc 119.2 pta 71
Az Ae. cylindrica Host.(2n=4x=28,D c D c C c C c ) faj genomjainak elkülönítése (GISH és FISH) Ae. caudata L. (2n=2x=14, C c C c ) Ae. tauschii Coss. (2n=2x=14, D c D c ) frost resistance, disease resistance, drought tolerance C c labelled with fluorescein-11-dutp D c unlabelled conterstained with PI Linc et al. 1999. Genome www.meetthescientist.hu 21 26
Búza/T. elongatum 6E diszómás addíciós vonal azonosítása FISH GISH GAA T.elongatum Linc et al. 1012. CGR www.meetthescientist.hu 22 26
Pachytén-FISH Meiózis v. számcsökkentő osztódás profázisának 3. alfázisa www.meetthescientist.hu 23 26
Pachytén-FISH alkalmazási lehetőségei Lolium Festuca Lolium x Festuca fajhibrid meiotikus párosodásának tanulmányozása, leírása és alkalmazása egyetemi oktatásban Lukaszewski, Kopecky, Linc G: Meiosis with labeled parental genomes. University of California, Riverside, USA http://www.plantbiology.ucr.edu/faculty/ www.meetthescientist.hu 24 26
Pachytén-FISH BAC-FISH festés búza árpa búza rozs Cen www.meetthescientist.hu 25 26
DNS fiber-fish sejtmagok izolálása levélből, gyökércsúcsból tisztítás szűréssel (20-50 m) DNS kiszabadítása a sejtmagokból (lízis puffer) fiber szálak nyújtása és fixálása jelölt próba hibridizálása, detektálása www.meetthescientist.hu 26 26
Mennyi plusz információt nyerhetünk fiber-fish alkalmazásából? F9H3 T1J1 T32N4 www.meetthescientist.hu 27 26
A pachytén- és fiber-fish kombinációjával T1J1 T32N4 F9H3 NOR F9H3 T32N4 T1J1 F9H3 T32N4 T1J1 LER Fransz P, Linc G et al. Chromosome Research (2005) www.meetthescientist.hu 28 26
3D-FISH - megőrzött térbeli szerkezetű sejtmagokon 3D-mikroszkópiával Próba jelölés kombinálva lehetővé teszi a 3D megjelenítést egyes génlókuszok, szubkromoszómális tartományok és akár egész kromoszómák egyes Sikeres 3D szakaszaira FISH kísérletek a sejtciklus megvalósításához minden szakaszában két fontos feltételnek kell teljesülni: optimálisan jelölt DNS próbák nukleáris morfológia megőrzése, sejtek permeábilitása www.meetthescientist.hu 29 26
3D FISH 3D-ben D-Cen Ht 100.3 www.meetthescientist.hu 30 26
Köszönöm a figyelmet! www.meetthescientist.hu 31 26