Peptid hordozók és alkalmazásuk

Peptid hordozók és alkalmazásuk Mező Gábor Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport 50. éves jubileumi ünnepsége Budapest 2011. december 9.

Elágazó láncú polipeptidek (XAK) polilizin gerinc Szekerke Mária oligo-dl-alanin AK Z-Xxx-OPcp optikailag aktív aminosav Hudecz Ferenc XAK Hudecz F., Szekerke M.: (1985) Coll. Czech. Chem. Comm. 50, 103-113

Elágazó láncú polipeptidek javított szintézise polilizin gerinc Szekerke Mária oligo-dl-alanin AK Z-Xxx-OPcp/HOBt optikailag aktív aminosav Mező Gábor XAK Mező G. és mtsai.: (1988) Coll. Czech. Chem. Comm. 53, 2843-2853

Elágazó láncú polipeptidek (AXK) polilizin gerinc oligo-dl-alanin AK X i K optikailag aktív aminosav XAK AXK Mező G. és mtsai.: (1993) Biopolymers 33, 873-885

Polilizin-gerincű elágazó láncú polipeptidek NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 HOOC HOOC Szerkezet befolyásoló hatása: tartózkodás a szervezetben biodisztribúció NH 2 NH 2 HOOC HOOC NH 2 NH 2 Kiürülés a vérből (24 óra): EAK (6%) > SAK > ALK > AK (0%) AK EAK Tartózkodás a szervezetben (24 óra): NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 ALK(36%) > EAK > SAK > AK (15%) HO HO Akkumuláció szervekben: ALK: 18% lépben 12% májban HO HO NH 2 NH 2 SAK NH 2 NH 2 ALK ALK kiválasztott hordozó Leishmania donovani kezelésére Hudecz F. és mtsai: (1990) Bioconjugate Chemistry 1, 425-430 és (1999) Bioconjugate Chemistry 10, 781-790 Mező G. és mtsai: (1993) Biopolymers 33, 873-885 és (1997) Biopolymers 42, 719-730

Metotrexát (Mtx) ALK konjugátum NH NH 2 25% szubsztitúció NH NH 2 Kóczán György Leishmania donovanival fertőzött egér makrofágok in vitro kezelése: Mtx, ALK-Mtx, (parazita szám/makrofág 72 órás kezelés) Kontroll 3,8 ± 0,7 Mtx 2,8 ± 0,3 ALK 3,2 ± 0,3 ALK-Mtx 1,8 ± 0,2 ALK + Mtx 2,8 ± 0,2 Kóczán Gy. és mtsai: (2002) Bioconjugate Chemistry 13, 518-524 Leishmania donovanival fertőzött egerek parazitaszám csökkenése májban Mtx és ALK-Mtx kezelés hatására (a paraziták száma/100 sejtben) Kontroll 115,2 ± 4,5 Mtx 66,2 ± 14,6 ALK 103,7 ± 5,5 ALK-Mtx 6,0 ± 1,9 ALK + Mtx 75,6 ± 4,1

Cisz-akonitil daunomicint tartalmazó elágazó láncú polipeptid konjugátumok Hudecz Ferenc Reményi Judit 10 mg Dau tartalom/kg >60 napos túlélés L1210 leukémiás egerek esetén cad-eak cad-sak Gaál D, Hudecz F. : (1998) Eur J Cancer 34, 155-161 Reményi J. és mtsai.: (2003) Biochem Biophys Res Commun. 303, 556-561 Reményi J. és mtsai: (2006) Biochim Biophys Acta 1758, 280-289

GnRH-antagonista (MI-1544) - Ac-EAK konjugátum NHCO Ac-NH HOOC Ac-NH Mező Gábor NHCO HOOC Mező Imre Ac-NH Ac-NH MI-1544: Ac-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH 2 Fokozott tumor növekedést gátló hatás (in vitro és in vivo) Jelentősen csökkent az ovuláció gátló hatás az antagonista hatású hormon peptidhez képest (tumor szelektivitás fokozása) Jelentős túlélést eredményezett emlő tumoros egereken Mező G. és mtsai: (1996) Bioconjugate Chemistry 7, 642-650

Anionos elágazó láncú polipeptidek sejtbe jutása scavanger receptorokon keresztül CH 3 CO-NH CH 3 CO-NH HOOC-(CH 2 ) 2 -CO-NH NH-CO-(CH 2 ) 2 -COOH HOOC HOOC HOOC HOOC Szabó Rita HOOC HOOC HOOC HOOC CH 3 CO-NH CH 3 CO-NH HOOC-(CH 2 ) 2 -CO-NH NH-CO-(CH 2 ) 2 -COOH Ac-EAK < Succ-EAK A típusú scavanger receptorok szerepet játszhatnak anionos karakterű polipeptidek sejtbe jutásában, így alkalmas célpontok fertőzött makrofágokba történő hatóanyag célba juttatására. Szabó R. és mtsai: (2005) Bioconjugate Chemistry 16, 1442-1450

Cisztein tartalmú peptidek kapcsolása elágazó láncú polipeptidekhez diszulfidhíd kialakításával Herpes simplex vírus gd1 epitóp peptidek: 9 LKMADPNRFRGKDL 22 Mihala Nikolett 276 SALLEDPVG 284 NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 9-21-Ahx-Cys-276-284 NH 2 NH NH 2 NH NH 2 -Cys(Npys)-CO Npys: 3-nitro-2-piridinszulfenil Ahx: 6-amino-hexánsav Mező G. és mtsai: (2000) Bioconjugate Chemistry 11, 484-491 NH 2 -Cys-CO S S 9-21-Ahx-Cys-276-284

Ciszteint tartalmazó peptidek kapcsolása elágazó láncú polipeptidekhez kemoszelektív ligációval HS O H 2 N Ligeti Melinda O HN HN NH NH O N H NH Szabó Ildikó O N H O c[rgdfc] O OH c[rgdfc] ClCH 2 -CO-NH NH 2 S-CH 2 -CO-NH NH 2 HO HO HO HO c[rgdfc] - HCl HO HO HO HO ClCH 2 -CO-NH NH 2 S-CH 2 -CO-NH NH 2 c[rgdfc] Markó K., és mtsai: (2008) Bioconjugate Chemistry 19, 1757-1566

Mezenhimális őssejtek letapadása bevont és bevonatlan titán szövetre bevonat nélküli titán háló fibronektin bevonat SAK bevonat SAK-c[RGDfC] bevonat

Tuftsin és tuftsin analógok Thr-Lys-Pro-Arg (humán) Thr-Lys-Pro-Lys (kutya) g-globulin: a szekvencia 289-292 régiója Hatások: Analógok: fagocitózis stimulálás immunmodulátor hatás kemotaktikus aktivitás monocitákon tumorellenes hatás TNF termelés növelése Thr-Lys-Pro-Arg-Thr-Lys-Pro-Arg (TKPRTKPR, dituftsin) fokozott hatás a Lys-Pro-Arg antagonista keletkezésének hiányában Thr-Lys-Pro-Arg-Gly (TKPRG) fokozott immunstimuláló hatás Thr-Lys-Pro-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg (TKPKTKPR) szarkóma vírus által okozott tumor növekedésének gátlása Fridkin, M., Najjar, V. (1989) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 1

Oligotuftsin hordozó (OT20) Oligotuftsin hordozó, Ac-[TKPKG] 4 -NH 2 Ac-TKPKG TKPKG TKPKG TKPKG-NH 2 Reményi Judit Nagyon jó oldékonyságú, higroszkópos peptid Kalászi Adrián Nem toxikus egér lépsejteken Peptid Inkubációs idő (óra) Kontroll OT20 1 98,7±0,58 4 96,5±2,18 Koncentráció (mg/ml) 0,0015 0,015 0,05 98,1±1,18 98,5±1,05 98,3±2,93 91,7±3,56 93,7±2,04 92,2±1,83 Mező G. és mtsai: Biopolymers (2004) 73, 645-656

titer PFC/10 6 lépsejtek kontrollhoz viszonyított mennyisége (%) Oligotuftsin hordozó (OT20) Oligotuftsin hordozó, Ac-[TKPKG] 4 -NH 2 Ac-TKPKG TKPKG TKPKG TKPKG-NH 2 Nem immunogén 100 IgM 80 IgG 60 40 300 250 200 150 Immunstimuláló hatás 20 0 1 2 Immunizáció 100 50 0 10 1.0 0.1 10 1.0 0.1 10 1.0 0.1 mg/kg Tuftsin TKPKG OT20 Dózis-hatás összefüggés: immunválasz SRBC antigén ellen BDF1 egerekben

Ciklikus HSV gd-1 epitóp peptid kapcsolása oligotuftsin hordozóhoz kemoszelektív ligációs technikával Ac-[TKPKG] 4 -NH 2 ClCH 2 -CO- OT20(ClAc) 4 -HCl Ac-CGFLG CH 2 CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH 2 Jakab Annamária Ac-[TKPKG] 4 -NH 2 CH 2 -CO- Ac-CGFLG- -CH 2 CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH 2 112 aminosav (46 kapcsolási ciklus + 2 ligációs lépés): 12902 Da Jakab A. és mtsai: (2009) Bioconjugate Chemistry 20, 683-692

Konjugáció követése HPLC-vel és tömegsektrometriával (MS) t = 5 perc Intens. x10 6 4 4+ 665,7 3 1.2 1.0 28,3 2 3+ 887,1 0.8 1 MW calc. : 2659,22 MW exp. : 2658,60 Abs 220 nm 0.6 0.4 19,5 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z 0.2 0.0 Intens. x10 7 4+ 603,7 10 20 30 40 50 Idő (perc) 4 3 2 3+ 804,5 1 2+ 1206,0 MW calc. : 2410,48 MW exp. : 2410,60 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z

25,6 26,9 27,5 Intens. x10 7 1.25 29,4 t = 3 óra 1.0 1.00 0.75 MW calc. :10279,76 MW exp. :10279,50 11+ 12+ 935,5 857,6 Abs 220 nm 0.8 0.6 0.4 27,8 28,4 0.50 13+ 791,8 10+ 1028,9 0.2 0.25 0.00 14+ 735,3 9+ 1143,1 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z 0.0 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Idő (perc) Intens. x10 6 7+ 720,1 Intens. x10 7 3.0 10+ 766,6 2 epitóp kópiát - tartalmazó konjugátum 8 2.5 6 6+ 839,9 2.0 11+ 697,1 9+ 851,7 4 8+ 630,2 1.5 1.0 2 5+ 1007,7 MW calc. : 5034,24 MW exp. : 5033,50 0.5 12+ 639,1 8+ 958,0 MW calc. : 7657,00 MW exp. : 7656,30 0 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 0.0 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

28,4 29,4 27,8 t = 24 óra Intens. x10 7 12+ 1076,2 2.0 1.8 1.6 2.5 2.0 1.5 MW calc. : 12902,52 MW exp. : 12902,20 13+ 993,5 11+ 1173,9 1.4 1.0 Abs 220 nm 1.2 1.0 0.8 0.6 0.5 0.0 15+ 861,2 14+ 922,6 10+ 1291,1 9+ 1434,5 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z 0.4 0.2 0.0 10 20 30 40 50 Idő (perc) Intens. x10 7 1.0 7+ 760,4 6+ 887,0 0.8 0.6 0.4 8+ 665,5 5+ 1064,1 0.2 0.0 9+ 591,6 MW calc. : 5316,42 MW exp. : 5315,80 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

A tisztított OT20-HSV epitóp konjugátum jellemzése 1.2 1.0 27,8 Intens. x10 7 12+ 1076,2 1.5 0.8 Abs 220 nm 0.6 0.4 1.0 13+ 993,6 11+ 1173,9 0.2 0.0 10 20 30 40 50 Idő (perc) 0.5 15+ 861,2 14+ 922,7 10+ 1291,2 MW calc. : 12902,52 MW exp. : 12902,70 0.0 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z Ellenanyag felismerés (A16 mab; kompetíciós ELISA) Ac-[TKPKG] 4 -NH 2 CH 2 CO Ac-CGFLG H-LKMADPNRFRGKDL-NH 2 CH 2 CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH 2 7,2 pmol 4,2 pmol

Herpes simplex vírus elleni szintetikus vakcina Ciklikus B-sejt epitóp Ciklikus B-sejt epitóp K Hordozó Ciklikus B-sejt epitóp Ciklikus B-sejt epitóp Promiscuous T-sejt epitóp Tetanus toxoidból: 593-599 szekvencia (YSYFPSV) 127 aminosav: 14762 Da

Chemotactic Drug Targeting Bai Katalin Boglárka drog Irányító molekula Irányító molekula Kőhidai László K Hordozó drog Irányító molekula Irányító molekula Kemoattraktáns hatású irányító peptidek: For-Met-Leu-Phe For-Nle-Leu-Phe For-Thr-Lys-Pro-Arg Ac-Thr-Lys-Pro-Lys-Gly Thr-Lys-Pro-Arg Thr-Lys-Pro-Lys-Gly Mező G. és mtsai: (2006) J. Pept. Sci. 12, 328-336 Bai K.B. és mtsai: (2008) Bioconjugate Chemistry 19, 2260-2269

Metotrexátot tartalmazó oligotuftsin alapú biokonjugátumok Mtx-GFLGC-NH 2 CH 2 CO-K(CH 2 CO)-[TKPK(H-TKPKG)G] 4 -NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2 CH 2 CO-K(CH 2 CO)-[TKPK(Ac-TKPKG)G] 4 -NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2 CH 2 CO-K(CH 2 CO)-[TKPK(H-TKPR)G] 4 -NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2 CH 2 CO-K(CH 2 CO)-[TKPK(For-TKPR)G] 4 -NH 2 Mtx-GFLGC-NH 2

ctx.ind.% ctx.ind.% ctx.ind.% ctx.ind.% Metotrexát tartalmú oligotuftsin konjugátumok kemotaktikus aktivitása THP-1 monocitákon 250 (Mtx-GFLGC) 2 -K-OT20(TKPKG) 4 250 (Mtx-GFLGC) 2 -K-OT20(Ac-TKPKG) 4 200 200 150 150 100 100 50 50 0-11 -10-9 -8-7 -6 lg c [M] 0-11 -10-9 -8-7 -6 lg c [M] 250 (Mtx-GFLGC) 2 -K-OT20(TKPR) 4 x 250 (Mtx-GFLGC) 2 -K-OT20(For-TKPR) 4 200 200 150 150 100 100 50 50 0 0-11 - 10-9 - 8-7 - 6-11 - 10-9 - 8-7 - 6 log c [M] log c [M] Korreláció a kemotaktikus aktivitás, a sejtfelvétel és a citosztatikus hatás között.

ELTE PKCS TKI Köszönjük! OOI KOKI SOTE Creative Cell MikroVákuum MetriMed Soft Flow Bay Zoltán Intézet Universities: (Konstanz, Barcelona, Oxford, Ioannina, Palermo, Groningen, Nottingham) Bose Institute, Calcutta