Fluorogén azido-benztiazol származékok szintézise

Tudományos Diákköri Dolgozat FODOR ANNA ESZTER Fluorogén azido-benztiazol származékok szintézise Témavezető: Dr. Kele Péter, Demeter Orsolya MTA TTK, Szerves Kémiai Intézet, Kémiai Biológia Kutatócsoport Belső konzulens: Dr. Novák Zoltán ELTE TTK, Szerves Kémiai Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2016.

TARTALOMJEGYZÉK FLUOROGÉN AZIDO-BENZTIAZOL SZÁRMAZÉKOK SZINTÉZISE... 1 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 3 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK... 4 I. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 5 1. Bevezetés... 5 2. Fluoreszcencia a kémiai biológiában... 5 3. Bioortogonális reakciók... 7 4. Fluorogenicitás a bioortogonális kémiában... 10 II. CÉLKITŰZÉS... 13 III. SAJÁT EREDMÉNYEK... 14 1. Az Azido-kumarin-benztiazol szintézise... 14 2. Az azido-benztiazol-kumarin szintézise... 15 IV. SPEKTROSZKÓPIAI TULAJDONSÁGOK VIZSGÁLATA... 17 V. SZINTÉZISEK... 20 IRODALOMJEGYZÉK... 28 2

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőim, Dr. Kele Péter és Demeter Orsolya felé nem csak a gyakorlatban, hanem az elméleti problémák megoldásában nyújtott támogatásukért. Köszönöm irányomban tanúsított türelmüket, folyamatos és kitartó bizalmukat. Köszönöm, hogy a Dr. Kele Péter által vezetett kutatócsoportban dolgozhattam, és ezúton köszönöm a kutatócsoport minden munkatársának a laboratóriumban végzett munkám során nyújtott rengeteg segítséget. Köszönetet mondok az MTA Természettudományi Kutatóközpont Szerves Kémiai Intézet igazgatójának, Dr. Soós Tibornak, hogy lehetővé tette számomra az Kutatóközpont infrastruktúrájának használatát. 3

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK DCM DMSO EtOAc EtOH Hex MeCN MeOH MS NMR diklórmetán dimetil-szulfoxid etil-acetát etanol hexán izomerelegy acetonitril metanol tömegspektrometria magmágneses rezonancia 13 C-NMR 13-as szén izotóp NMR 1 H-NMR proton NMR Rf TEA THF VRK retenciós faktor trietil-amin tetrahidrofurán vékonyréteg kromatográfia 4

I. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. Bevezetés A kémiai biológia a kémia és a biológia határterületén kialakult tudomány, melynek eszköze a biológiai rendszerek kis, szintetikus molekulákkal történő manipulációja. E kémiai módosítások segítségével az elő rendszerekben lejátszódó komplex folyamatokat is tanulmányozhatjuk, és azokat jobban megismerhetjük. Az elmúlt évtizedekben a biomolekulák kémiai módosítását és ezáltal a sejtben lezajló folyamatok megértését számos eljárás célozta meg, ezek között kiemelkedően fontosak a fluoreszcencián alapuló jelölések. A fluoreszcens detektálás népszerűsége azzal magyarázható, hogy nagy felbontást (akár nm) és gyors válaszidőt (akár fs) biztosít. A fluoreszcencia mérésére alkalmas műszerek könnyen beszerezhetőek, a jelzővegyületek szerkezetének finomhangolásával pedig széles, gyakorlatilag szabadon variálható emissziós spektrum fedhető le. 1 A módszer fontosságát az is bizonyítja, hogy a Kémiai Nobel Díjat 2008-ban a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) felfedezéséért Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien kutatóknak, 2 2014-ben pedig a szuperfelbontású fluoreszcens mikroszkópia kifejlesztéséért adományozták Eric Batzig, Stefan Hell és William Moerner kutatóknak. 3 2. Fluoreszcencia a kémiai biológiában A fluoreszcencia a lumineszcencia egyik fajtája, melynek során egy foton abszorpcióját a vörös tartomány felé eltolt fotonemisszió követi, azonos multiplicitású állapotok közt (S 1 S 0 ). Az emittált sugárzás alacsonyabb energiájú, azaz nagyobb hullámhosszú. A gerjesztő és emissziós hullámhosszak közötti különbséget Stokes-eltolódásnak nevezik. Egy fluorofórt a gerjesztő (λexc), illetve emissziós hullámhosszak (λem) mellett jellemez továbbá a kvantumhasznosítási tényező ( F, az elnyelt fotonokra eső emittált fotonok aránya), az extinkciós koefficiens ( és az utóbbi két paraméter szorzata, a fényesség (B). 4 A fluoreszcencián alapuló technikák népszerűek a kémia biológiában, köszönhetően annak, hogy gyorsak, jó idő- és terbeli felbontással rendelkeznek és az esetek többségében 5

hozzáférhető, egyszerű műszereket igényelnek, szemben a szintén népszerű radioaktív jelzővegyületekkel. A felsorolt előnyök mellett természetesen a fluoreszcens jelölésnek hátrányai is vannak, például a fluorofórok esetleges toxikussága, (foto)labilitása, vagy az, hogy méretükből adódóan megzavarják a jelölt biopolimert funkciója betöltésében (pl GFP). Továbbá, fluoreszcens jelölés során detektálás érzékenységet ronthatja az autofluoreszcencia, a fotostabilitás hiánya és a háttérfluoreszcencia is. Az autofluoreszcencia a biológiai rendszerben lévő természetes vegyületek (pl triptofán, NADH) foton kibocsátásból származik, ez különösen alacsony hullámhosszokon történő gerjesztésnél lép fel, tehát általában célszerűbb a spektrum vörös régiójában gerjeszthető és emittáló festékek használata. A háttérfluoreszencia az el nem reagált és mosással el nem távolítható jelzővegyületek jelenlétéből adódik. Erre a problémára jelenthetnek megoldást az ún. fluorogén jelzővegyületek. 1 Ezek alapállapotban nem, vagy csak minimálisan emittálnak, de megfelelő reakció során fluoreszcenssé válnak. Mivel csak a jelölési reakcióban részt vevő jelzővegyület fog fluoreszcens jelet adni, így a háttérfluoreszcenciával nem kell számolni, azaz fluorogén festékek használatával jelentősen növelhető a jel/zaj arány detektálás során. A fluoreszcencián alapuló mikroszkópiás eljárások egyre nagyobb teret nyernek, mert más képalkotó technikákkal összehasonlítva, segítségükkel minden korábbinál behatóbban tanulmányozhatóak a élő biológiai rendszerek. Az, hogy a mikroszkópia optikai, műszeres és szoftveres fejlődése párhuzamosan zajlott az alkalmazható fluorofórok és fluoreszcens fehérjék körének folyamatos bővítésével, magyarázza a technológia fejlődését. A hagyományos fluoreszcens mikroszkópia felbontóképességének határt szab a diffrakciós limit (~200 nm), ezt a problémát küszöbölte ki a szuperfelbontású mikroszkópiás technikák megjelenése. Ezeken keresztül olyan térbeli felbontás érhető el, amelyet nem korlátoz a diffrakciós limit, ezáltal a biopolimerek szerkezete nanométeres skálán tanulmányozható és interakcióik valós időben, akár in vivo is követhetőek. Az erre a célra alkalmazható fluorofórok szintetikus köre azonban tovább bővíthető olyan új festékekkel, amelyekkel szemben az az elvárás, hogy fotostabilitásuk kiemelkedő legyen, rendelkezzenek magas extinkciós koefficienssel és kvantumhasznosítási tényezővel, valamint membránpermeabilitásuk és vízoldhatóságuk legyen megfelelő. 6

3. Bioortogonális reakciók A bioortogonális kémia a kémiai biológia egyik legfiatalabb és egyre jelentősebb területe, mely az antigén - jelölt antitest alapú jelölési technikákkal szemben lehetőséget arra, hogy élő rendszereket is tanulmányozhassunk akár intracellulárisan is. További előnye, hogy míg a fúziós fehérjék alkalmazásával kizárólag fehérjék jelölhetők, a bioortogonáis jelölési eljárások gyakorlatilag bármilyen biomolekula jelzésére alkalmasak. A bioortogonális ligáció kifejezést Bertozzi 5 vezette be biológiai rendszerek olyan kémiai módosítására, melyek során exogén módon juttatják a sejtbe a jelzővegyületet. Ezek szervezetidegen funkciós csoporttal rendelkező, kisméretű, biokompatibilis vegyületek, amelyek fiziológiás körülmények között csak egymással, kovalens kötés kialakítása közben reagálnak, nem toxikus termékek képződése közben. Egy bioortogonális reakciónak gyorsan és alacsony koncentrációtartományban kell lejátszódnia, a termék könnyű detektálhatósága mellett. A fenti kritériumoknak több reakció is megfelel, azonban az utóbbi évek irodalmi eredményei alapján a következő típusok a legalkalmasabbak bioortogonális ligációra (1.ábra): 1. Staudinger-ligáció 2. tetrazinok inverz elektronigényű Diels Alder cikloaddíciója (IEDDA) 3. tetrazolok és olefinek fotoindukált cikloadíciója 4. rézkatalizált azid alkin cikloaddíció (CuAAC) 5. gyűrűfeszültség által kiváltott azid-alkin cikloaddíció (SPAAC) Staudinger-ligáció A Staudinger-redukció során egy azid csoportot tartalmazó fluoreszcens jelzővegyület reagál egy foszfán származékkal, a termék foszfán-oxid. A víz jelenlétében, a közbenső aza-ilid termék spontán hidrolizál és primer amin, valamint a megfelelő foszfán-oxid keletkezik. A foszfán és az azid akár vízben is, szobahőmérsékleten és nagy konverzióval reagálnak. Ezen a reakció alapul a Staudinger ligációs eljárás,ahol foszfán vegyület egy észter csoportot is tartalmaz, mely amid kötés kialakítása közben reagál a keletkező aza-iliddel. 7

Az eljárás előnye, hogy biológiai rendszerekkel való kompatibilitás, hátránya viszont a lassú reakciósebesség és a foszfán csoport spontán oxidációra való hajlama. 6 1. ábra. A legjelentősebb bioortogonális reakciók Tetrazolok és olefinek fotoindukált cikloaddíciója A reakció során egy fluoreszcens pirazolin származék keletkezik. A tetrazolt UV fénnyel sugározzák be, ekkor N2 kilépést követően 1,3-nitriliminal alakul ki, ami reagál az alkénnel és létrejön a pirazolin gyűrűs vegyület. Széleskörű felhasználhatóságának gátat szab az UV fény használata. Tetrazinok inverz elektronigényű Diels-Alder cikloaddíciója (IEDDA) Tetrazin-alapú diének és különböző dienofilek, transz-ciklooktének, ciklopropének, feszült gyűrűs ciklooktinek között lejátszódó inverz-elektronigényű Diels-Alder reakció a 8

leggyorsabban lejátszódó biortogonális ligáció, (transz-ciklooktén és 3,6-di(2-piridil)-stetrazin között k2=1000 M -1 s -1 ). A gyorsasága miatt kis koncentrációban is alkalmas fehérjejelölésre. Nagy konverzióval megy végbe mind szerves, mind vizes közegű reakcióelegyekben. Ezen túl további előny az is, hogy a tetrazingyűrű jelenléte FRET vagy TBET mechanizmusok mentén letöri a kapcsolódó festék fluoreszcenciáját, azaz a tetrazinfluorofór konjugátumok megfelelően tervezett molekulák esetében hatékony fluorogének. Hátránya a nehezen szintetizálható, kevésbé stabil kiindulási anyagok. 7 FRET során az energiaátadás a téren át történik, akkor, ha tetrazin és a fluorofór között egy olyan linker helyezkedik el, ami nem rendelkezik konjugált kötésrendszerrel. TBET-rendszer esetében a fluorofór és a fluoreszcencia kioltásáért felelős csoportok között a linker konjugált, de elektronikusan nem kapcsolt π-elektronrendszer. Réz katalizált azid-alkin cikloaddíció (CuAAC) és gyűrűfeszültség által indukált azid-alkin cikloaddíció (SPAAC) A Huisgen által leírt 1,3-dipoláris cikloaddícióval szemben (mely magas hőmérséklet igényel és triazolok regioizomerjeinek elegyét adja) a Meldal és Sharpless nevéhez fűződő rézkatalizált azid-alkin cikloaddíció kizárólag 1,4-diszubsztituált triazolokat eredményez, enyhe reakciókörülmények között, szobahőmérsékleten, akár vizes környezetben is. Az aktív Cu(I) iont, mely a cikloaddíciót katalizálja, Cu(I) sók (leggyakrabban jodid) formájában juttatják a reakcióelegybe, vagy in situ generálják Cu(II) sókból nátrium-aszkorbáttal. Jellemző az is, hogy olyan ligandumokat juttatnak a rendszerbe, amelyek stabilizálják a Cu(I) iont, ilyen például a trisz-(benzoiltriazolilmetil)amin (TBTA). Finn és munkatársai festéket kapcsoltak a homoki bab mozaikvírusához, és ezáltal elsőként alkalmaztak CuAAC-t biokonjugációs stratégia részeként. A cikloaddíciót gyorsasága és nagyfokú funkciós csoport-toleranciája értékes bioortogonális reakcióvá teszi, de a réz toxikus jellege megakadályozza azt, hogy élő rendszerekben is alkalmazható legyen. Bertozzi és munkatársai nevéhez fűződnek az első kísérletek, amelyek a rézkatalízis mellőzésére irányulnak, így fokozva a cikloaddíció biokompatibilitását. A kísérletek alapja Wittig és Krebs 1960-ban publikált munkája volt, amely leírja, hogy a szubsztituálatlan ciklooktin hevesen, melléktermék képződése nélkül reagál fenilaziddal. 8 Bertozzi nevéhez fűződnek azok a kamelyek az alkint nem rézzel aktiválják, hanem olyan 9

gyűrűrendszerekbe építik, amelyek szerkezete feszült, de kellőképpen stabil. Ennek a kritériumnak a megfelelnek a ciklooktin-származékok. Az első ciklooktin-alapú [3+2] cikloaddíciók sebessége nem volt nagyobb a Staudinger-ligáció esetében mértnél (k2=10-3 M - 1 s -1 ). A reakciósebesség gyorsítása érdekében számos ciklooktinszármazékot fejlesztettek ki az elmúlt évtizedben (2. ábra), amelyekben elektronszívó csoportok, például fluoridok 2. ábra. Gyakran alkalmazott ciklooktinszármazékok beépítésével (pl. DIFO) 9 vagy konjugált gyűrűrendszerek alkalmazásával (pl DIBO 10 BARAC 11, COMBO 12 ) növelik a ciklooktingyűrű reaktivitását. Az egyik leggyakrabban használt ciklooktin, melynek a genetikai kódolhatósága mára már rutinszerű, a BCN. 13 Az alkin reakciópartnere, az azid csoport kiemelkedő jelentőséggel bír a bioortogonális kémia terén, mivel nem toxikus, kisméretű, viszonylag könnyen beépíthető biopolimerekbe és fiziológiás körülmények között többnyire stabil. Az egyik legfontosabb előnye azonban az, hogy fluorofórok aromás vázához közvetlenül kapcsolódva letöri azok fluoreszcenciáját, így az azido-fluorofórok többnyire hatékony fluorogén festékek. 10 4. Fluorogenicitás a bioortogonális kémiában Az előzőekben már említett törekvés a kémiai biológián belül az, hogy akár fluoreszcens mikroszkópia területén is alkalmazható fotostabil, nem toxikus és specifikus jelölésre

alkalmas fluoreszcens festékeket szintetizáljanak. Az előnyös fotofizikai tulajdonságok mellett fontos az is, hogy a festék nagy szelektivitással kötődjön a tanulmányozni kívánt biopolimerhez. Ilyen nagyfokú szelektivitás elérésére alkalmasak például a kétpontos kötődésre képes biszarzén-típusú fluorogén festékek (FlAsH, ReAsH, AsCy3), 3. ábra. Ezek a festékek az önjelölő peptidszakaszokon ( self-labeling tags ) belül megfelelő távolságra elhelyezkedő tetracisztein-motívumokhoz kapcsolódnak, a vegyület pedig csupán akkor válik fluoreszcenssé, ha a reakció megtörtént. A biszarzén jelzővegyületek membránpermeábilisak, ezért sikeresen használják in vivo fehérjejelölési eljárásokban. Ez azért is lehetséges, mert rövid inkubációs idő alatt (kevesebb, mint 1 óra) specifikusan kötődnek a sejthez és csak rövid mosási eljárásra van szükség a jelölést követően. Továbbá a GFP-hez képest jóval, alacsonyabb molekulatömeggel és mérettel rendelkeznek. 14 3. ábra. FlAsH-(EDT) 2 szerkezete és működési mechanizmusa. A fluorofór emissziós képessége a tetraciszteinmotívumhoz való kapcsolódás után aktiválódik. E festékek segítségével a fehérjék feltekeredését 15, denaturációját is nyomon követhetik; például FLAsH-EDT2 segítségével a retinsav kötőfehérje konformációs változását figyelték meg. 16 11

Emellett azonban számos hátrányuk is van, például az, hogy a kötődésük során több mellékreakció is kedvezményezett lehet, valamint a diszulfidhidak kialakulásának elkerülése végett folyamatosan reduktív közeget kell biztosítani. A fentiekből kiindulva kutatócsoportunkban célul tűztük ki kétpontos kötődésre alkalmas fluorogén biszazid-vegyületek előállítását, amelyek elsőként ötvözik a kétpontos kötődés előnyeit a bioortogonális kémiával (4. ábra, AbQBtz). 17 4. ábra. Az AbQBtz szerkezete Az előállított jelzővegyület két azid csoportot tartalmaz, ezáltal képes lehet kétpontos kötődésre két ciklooktinnal, két, egymás után lejátszódó SPAAC reakció révén. Másrészt előző munkáinkból tudjuk, hogy egy azid csoport jelenléte a fluoreszcens vázon letöri a fluoreszcenciát 18, 19 ezért valószínűsíthető, hogy két azid csoport esetében a fluoreszcenciakioltás még jobban érvényesül. A festéket reakcióba vittük két ciklooktint tartalmazó rövid oligopeptiddel, és azt tapasztaltuk, hogy a fluoreszcencia-intenzitás a sokszorosára növekedett, ciklikus peptid-festék konjugátumok kialakulásával párhuzamosan. Az irodalmi példák közül is kiemelkedően jónak számító fluoreszcencia-serkentés (140-150) elméletünk szerint a két azid csoport együttes jelenlétének köszönhető. Ennek az elméletnek az igazolására azonban mindenképp szükséges lenne az 4. ábrán látható festék két monoazid-származékának előállítása, és azok fluoreszcenciájának tanulmányozása, összehasonlítás céljából. Kutatómunkám során e vegyületek előállítását és vizsgálatát tűztem ki célul. 12

II. CÉLKITŰZÉS Az előzőekben említett kétpontos kötődésre képes festék (4. ábra, AQBtz) kiemelkedő fluorogén tulajdonságainak magyarázata azon a feltevésen alapul, hogy az aromás vázon jelenlévő két azid csoport együttes jelenlétének köszönhető a kiemelkedő fluorogenicitás. Ezt bizonyítandó, munkám célja volt az AQBtz két monoazid-származékának előállítása (5. ábra, mabtzq és maqbtz) és spektroszkópiai tulajdonságainak vizsgálata. A kísérleteim során választ kívántam kapni arra, hogy az mabtzq és maqbtz rendelkezik-e fluorogén jelleggel, illetve, hogy az egyes azidcsoportok milyen mértékben járulnak hozzá a fluoreszcencia kioltásához. Ezt a két előállított festék bisz-ciklooktinil-peptidekkel való reakciójának követésével terveztem megvalósítani. 5. ábra. A célmolekulák szerkezete 13

III. SAJÁT EREDMÉNYEK 1. Az Azido-kumarin-benztiazol szintézise A maqbtz előállítását azido-szalicilaldehid és 5-számú benztiazol-származék összekapcsolásával terveztem, báziskatalizált kondenzációs reakción keresztül. A céltermék két aromás részletének szintézisét a 6. ábra alapján terveztem elvégezni. 6. ábra. a maqbtz szintézise A kereskedelmi forgalomban kapható 1 számú vegyületből indultam ki, amit két lépésben alakítottam át a 2 számú azidofenollá. A klasszikus, diazotálás/azidcsere eljárás során végig hűtöttem a reakcióelegyet és mindkét lépés alatt fénytől védtem. A hűtés a kezdetben kialakuló diazóniumsó elbomlását gátolta, a lombik fénytől való védelmére pedig azért volt szükség, mert az azid vegyületek bomlanak fény hatására. A feldolgozás után jó termeléssel jutottam a kívánt azidofenolhoz. Ezután egy formil csoport kialakítására volt szükség a 2 vegyület orto-pozíciójában. Ezt paraformaldehiddel (PFA) való reakcióval végeztem el, MgCl2 jelenlétében, vigyázva arra, hogy a használt oldószerek és reagensek vízmentesek legyenek, mivel előkísérleteim során azt tapasztaltam, hogy nem kellőképpen vízmentes körülmények között a reakció alig, vagy 14

nagyon csekély termeléssel játszódik le. A feldolgozás során sósavval semlegesítettem a TEA-t, majd oszlopkromatográfiás tisztítással kaptam meg a sárga, por halmazállapotú terméket. A célmolekula másik aromás részletének kialakításához az aminotiofenolt benztiazollá alakítottam etil-cianoacetáttal. Azt tapasztaltam, hogy a reakció során fontos a nitrogén atmoszféra, az aminotiofenol levegőn bekövetkező oxidációjának elkerülése miatt. A nyersterméket ezúttal is oszlopkromatográfiával tisztítottam. A 6 és 5 vegyületek báziskatalizált kondenzációs reakcióját katalitikus mennyiségű piperidin jelenlétében végeztem el. Rövid melegítést és keverést követően a céltermék kivált a reakcióelegyből, a szűrést követő HPLC-MS mérés azt mutatta, hogy nincs szükség további tisztításra. 2. Az azido-benztiazol-kumarin szintézise A második festék szintézise során az alábbiak alapján terveztem a szintézist: 7. ábra. a mabtzq szintézise A kereskedelmi forgalomban kapható szubsztituálatlan benztiazolt (8), a gyűrű 6-os pozíciójában, hagyományos nitrálási körülmények között, kénsav és salétromsav keverékében nitráltam. Irodalmi példákból ismert a benztiazol-származékok nitrálásának regioszelektivitása a 6-os pozícióra, így esetemben is egyetlen izomer keletkezett kiváló hozammal, melyet átkristályosítással tisztítottam, jó termeléssel eredményezve a terméket. 15

A következő lépésben a benztiazol-gyűrű felnyitását végeztem el hidrazinnal. Egy éjszakán át tartó reakció után a kapott vörös szuszpenziót folyamatos jeges hűtés közben lassan semlegesítettem savval, az aminotiofenol dimerizációjának elkerülése miatt. Ezt a reakciót többször ismételtem, mivel a nem megfelelő hűtés vagy a túl gyors savadagolás miatt könnyen előfordulhat a kén-kén hidat tartalmazó dimer kialakulása. A kapott vegyület szaga erőteljes, tiolokra jellemző. Ezután a nitro-aminotiofenol és etil-cianoacetát gyűrűzárási reakcióját végeztem el. Ez a lépés, bár közel 50%-os konverzióval (LC-MS alapján) ment végbe, mégis gyenge termeléssel eredményezte a terméket, mert a célvegyület nehezen válaszható el a reakció során keletkező melléktermékektől, és az ismételt tisztítási folyamatok során bomlást is tapasztaltam. A molekula kumarin-részletének kialakítását szalicilaldehiddel való kondenzációval végeztem, ahol a benztiazolil acetát deprotonálását piperidin bázissal oldottam meg. A 12 vegyület aminná történő redukcióját először vasas Bechamp-redukció alkalmazásával próbáltam, mely azonban számos mellékterméket eredményezett, melyektől nem sikerült elválasztani a 13 számú vegyületet. Ezért az SnCl2 használata mellett döntöttem, ami rosszabb hozammal, de tisztább terméket eredményezett. A végterméket a 13 azidálásán keresztül állítottam elő, amit két lépésben kiviteleztem, ugyancsak diazotálás azidcsere reackciósorral. A 14-es számú végtermék kivált az oldatból, LC-MS vizsgálatok alapján további tisztítást nem igényelt. 16

IV. SPEKTROSZKÓPIAI TULAJDONSÁGOK VIZSGÁLATA A fentiek alapján előállított festékek fluoreszcens tulajdonságainak vizsgálata során az volt a célunk, hogy vizsgáljuk az irodalmi részben említetett biszazid fluorogén festék, AQBtz erős fluorogén jellegéhez milyen mértékben járulnak hozzá az egyes azidcsoportok, valamint a ciklikus termék kialakulása. A két monoazid esetében gyengébb fluorogenicitást vártunk, hiszen itt mindkét festék esetében egyetlen azid csoportra hárul a fluoreszcencia letörése gerjesztés után, és ciklizációra sincs lehetőség a bisz-cikloktinilezett peptidlánccal. (8. ábra) 8. ábra. az AQBtz, az alkalmazott bisz-cikloktinil-peptidlánc és a lehetséges reakcióutak. 17

Ennek megfelelően megmértem a két festék fluoreszcenciáját, majd reakcióba vittem őket a 8. ábrán látható peptidlánccal, melyet együttműködés keretein belül Dr. Mező Gábor (MTA- ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport) állított elő. A fluoreszcencia mérések során a következőképpen jártam el. Mindkét általam előállított monoazid-festékből feloldottam 320 µg-ot 2 ml DMSO-ban, az így elkészített festéktörzsoldatok koncentrációja 500 µm volt. Mindkét festék esetében a törzsoldatokat két-két 1 ml-es részre osztottam. Az egyik részlethez hozzáadtam 1 ml 500 µm-os koncentrációjú DMSO-s oldatát a (BCN)KAEAAK(BCN) peptidnek. Ezt az oldatot, amely a peptidet és a festéket 1:1 arányban tartalmazta, szobahőmérsékleten 12 órán keresztül kevertettem, fénytől védve. A festék törzsoldatának másik részletéhez 1 ml tiszta DMSO-t adtam, majd ugyancsak 12 órán át kevertettem, szintén fénytől védve. A fluoreszcencia-mérések során ez szolgált kontrolkísérletként, hogy kizárhassam annak esélyét, hogy a mért fluoreszcens jel esetleg a festék bomlásának, és nem a SPAAC reakciónak az eredménye. A fluoreszcenciamérésekhez JASCO spektrofluorimétert használtam, standard, 1 cm oldalhosszúságú kvarcküvettával. Mind a négy elegyből 20 µl-nyi mintát vettem, és ezt 2 ml PBS-hez adtam, így a mérési koncentráció 0,25 µm volt. Mindkét festék esetében 410 nm volt a gerjesztési hullámhossz. A fluorogenitás az emissziós maximumokon vett fluoreszcencia-intenzitások aránya kontrolkísérlet és a reakcióelegyek között. A kontrolkísérletek esetében a reakciók indításakor és a tizenkét óra múlva felvett spektrumok között nem találtam jelentős eltérést, ami arra utal, hogy a festék stabil maradt. A lejátszódó reakció egy gyűrűfeszültség által hajtott azid-alkin cikloaddíció (SPAAC) a peptidlánc egyik ciklooktinje és a festékek azid csoportja között, a termékek pedig triazolgyűrűn keresztül kapcsolt nem-ciklikus festék-peptid konjugátumok. Az AQBtz gyakorlatilag detektálhatatlan fluoreszcenciájával ellentétben mindkét monoazidszármazék esetében mérhető intenzitású fluoreszcenciát tapasztaltam már a reakció előtt is. Követve a két festék reakcióját a 8. ábrán látható bisz-ciklooktinilezett peptiddel, két óra reakciódő után hasonló, 5 (mabtzq), illetve 5,5 (maqbtz) fluoreszcencia-serkentést mértem, ahogy 9. és a 10. ábra mutatja. 18

Fluoreszcencia-intezitás [a.u.] Fluoreszcencia-intenzitás [a.u.] 1,2 1 0,8 mabtzq mabtzq + (BCN)KAEAAK(BCN) 0,6 0,4 0,2 0 400 450 500 550 600 Hullámhossz [λ] 9. ábra. az mabtzq fluoreszcenciája és peptiddel való reakció után mért fluoreszcencia 1 0,8 maqbtz 0,6 0,4 0,2 0 400 450 500 550 600 Hullámhossz [λ] 10. ábra. az maqbtz fluoreszcenciája és peptiddel való reakció után mért fluoreszcencia 19

V. SZINTÉZISEK A szintéziseim során kereskedelmi forgalomban kapható reagenseket és oldószereket használtam, főként Alfa-Aesar, Merck, és Sigma-Aldrich és Fluorochem termékeit, azokat tisztítás nélkül alkalmaztam. Az ezektől eltérő eseteket külön feltüntettem. A reakciókat vékonyréteg kromatográfiásan követtem Kieselgel 60 F254 márkájú VRK lapok használatával, UV detektálással. A futtató elegyek összetételét külön feltüntettem minden szintézis során. A kitermelés meghatározása előtt a szilárd termékeimet nagy vákuum alatt szárítottam tömegállandóságig. Az előállított vegyületek szerkezetét NMR spektroszkópiával határoztam meg. A mintákat általánosságban D2O, CDCl3 és DMSO-d6 oldatban mértem meg Varian Inova 500 MHz-es NMR készüléken, a kémiai eltolódások (δ) pedig ppm-ben szerepelnek az adott oldószer jelét felhasználva referenciának. A csatolási állandók (J) Hz-ben vannak megadva. Felhasadások rövidítése: s (szingulett), d (dublett), t (triplett), q (kvartett), quin (kvintett), m (multiplett). 3-azidofenol [2] 3-aminofenolt (2,5g; 22,5mmol) 2 M HCl oldattal (50ml) kevertetem és jeges vizes hűtés közben szuszpenziójához NaNO2oldatot (1,895g, 27,45 mmol, 7,5 ml vízben) csepegtettem. Fél óra várakozás után NaN3oldatot (2,25g,34,5 mmol, 17,5 ml vízben) csepegtettem hozzá. A hozzáadás után a reakciót szobahőmérsékleten egy éjszakán át tovább kevertettem. A reakcióidő lejárta után vizet adtam a rendszerhez, majd a vizes fázist etil-acetáttal extraháltam (2x75 ml). Az egyesített szerves fázisokat mostam 1M NaCO3 oldattal (100ml) és MgSO4-on szárítottam. A szűrés és oldószer eltávolítása után barna olajat kaptam (2,722g,86%). Rf:0,45(hexán:EtOAc 10:1) 1 H NMR (250 MHz, CDCl3) δ = 7.18 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 6.66 6.56 (m, 2H), 6.50 (t, J = 2.2 Hz, 1H). 13 C NMR (250 MHz, CDCl3) δ= 157.03, 141.99, 131.17, 112.62, 111.85, 106.73. LC-MS (ESI): 136 m/z, [M+H] +, 100 % 20

4-azido-2 hidroxibenzaldehid [3] 3-azidofenolhoz (2,722g, 20,17mmol), PFA-t (4,257g; 141,19mmol) és MgCl2-ot (3,8g,40,34mmol) adtam. N2 atmoszféra alatt absz. MeCN-t (20 cm 3 ) majd pár perc után absz. TEA-t csepegtettem hozzá (80,68mmol,10,6 ml), és 80 C-on kevertettem egy éjszakán át. A reakcióidő letelte után 2N HCl oldatot (40 ml) és etil-acetátot (40 ml) adtam a rendszerhez. A fázisokat elválasztottam, majd a vizes fázist (2x40 ml) etil-acetáttal ráztam ki, az egyesített szerves fázisokat MgSO4-on szárítottam. Az oldószer eltávolítása után a terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam (SiO2, Hexán:EtOAc 10:1). A termék halványsárga szilárd anyag (1,105g,30 %) Rf: 0,4 (Hex:EtOAc 10:1) LC-MS(ESI): 164 m/z [M+H + ] 1 H NMR (250 MHz, DMSO) δ 11.03 (s, 1H), 10.13 (s, 1H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 8.3, 1.9 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.0 Hz, 1H). 13 C NMR (250 MHz, DMSO) δ 190.32, 162.32, 147.46, 131.41, 120.05, 111.18, 107.04. etil-2-benztiazol-2-acetát [5] 2-aminotiofenolt (600 l,5,54mmol) és etil-2-cianoacetátot (580 l,5,54mmol) kevertettem 120 C-on 3 órán keresztül. A reakcióidő letelte után 2N HCl-t (20 ml) és etil-acetátot (20ml) adtam a rendszerhez majd elválasztottam a fázisokat. A vizes fázist etil-acetáttal (2x20ml) extraháltam. Az egyesített szerves fázisokat MgSO4-on szárítottam. 21

Az oldószer eltávolítása után a terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam (SiO2, Hexán:EtOAc 10:1). A szűrés és bepárlás után sárgás olajat (m=1,049g,85,56%) kaptam. Rf: 0,32 (hexán:etoac 10:1) 7-azido-3-(benz[d]tiazol-2-il)-2H-kromén-2-on[7] Etil-2-benztiazol-2-acetátot (1,0477g,0,0047 mol), 4-azido-2-hidroxibenzaldehidhez (0,7g,1ekv,0,0043mol) csepegtettem, majd piperidint (80 l,0,3ekv) és etanolt (10 ml) adtam az elegyhez. 1 órán át 60 C-on kevertettem fénytől védve. Pár perc után narancssárga csapadék vált a ki. A szűrés után narancssárga szilárd anyagot kaptam. Rf:0,8 (Hex:EtOAc 10:1 ) LC-MS(ESI): 321 m/z [M+H + ] LC-MS(ESI): 344 m/z [M+Na + ] 1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.24 (s, 1H), 8.19 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.10 (dd, J = 11.3, 8.4 Hz, 2H), 7.59 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.49 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.25 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H) 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ 159.79, 159.26, 154.53, 151.93, 145.15, 141.61, 135.83, 133.22, 131.77, 126.67, 125.37, 122.43, 122.23, 117.94, 116.74, 115.99, 106.64. 22

6-nitrobenztiazol [9] Benztiazolhoz (1 ekv., 3,64ml,34mmol) és kénsavhoz (9,2ml) jeges hűtés közben salétromsavat csepegtettem (3,64ml). A salétromsav hozzáadása után még 15 percig kevertettem 0-5 C között,majd szobahőmérsékletre hagytam melegedni és még 2 órán át kevertettem. Ezután az elegyet jeges vízre öntöttem, majd leszűrtem. A terméket etanolból (90ml ) kristályosítottam át. Rf: 0,59 (Hex:EtOAc 1:1 ) LC-MS: 181 m/z [M+H + ] Mp = 176-178 ⁰ C 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 9.28 (s, 1H), 8.92 (d, J=2.2 Hz, 1H), 8.42 (dd, J=9.3, 2.2 Hz, 1H), 8.26 (d, J=9.3 Hz, 1H). Etil 2-(6-nitrobenzo[d]tiazol-2-yl) acetát [11] 2-nitro-5-amino-benztiol (446mg,2,62mmol,1ekv.) és etil-cianoacetátot (1,113ml,4ekv,10,46mmol) egy estén át 120 C-on inert atmoszféra alatt kevertettem. A reakcióidő letelte után a nyersterméket oszlopkromatográfián tisztítottam (SiO2, Hexán:EtOAc 10:1 ). A termék narancssárga olaj (0,536g,76,62%) Rf: 0,69 (Hex:EtOAc 1:1) LC-MS: 267 m/z [M+H + ] LC-MS: 288 m/z [M+Na + ] 23

1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.35 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.28 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.23 (s, 2H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13 C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 164.16, 162.93, 151.47, 131.65, 118.54, 116.60, 113.34, 57.58, 34.90, 9.33. 3-(6-nitrobenzo[d]tiazol-2-il)-2H-kromén-2-on[12] etil 2-(6-nitrobenzo[d]tiazol-2-il)acetátot (166 mg,0,624mmol,1eq.) feloldottam 3 ml absz. EtOH-ban egy csepp piperidin jelenlétben majd szalicilaldehidet (76,128mg,0,624mmol,66,5 l,1eq.) adtam hozzá. Az elegyet 1 órán át 90 C kevertettem. A nyersterméket cellitre rotáltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (SiO2,Hex:EtOAc 3:1) A termék sárgás szilárd anyag (83 mg,41%). Rf : 0,7 (DCM:MeOH 20:1) LC-MS(ESI): [M+H + ] LC-MS(ESI): [M+Na + ] 3-(6-aminobenzo[d]thiazol-2-il)-2H-kromén-2-on[13] 3-(6-nitrobenzo[d]thiazol-2-yl)-2H-chromen-2-one(83 mg,0,256mmol,1eq.) feloldottam 5 ml absz. EtOH-ban (5 ml ) majd SnCl2 2 H2O (288,768 mg,1,28mmol,5eq.) adtam és cc. HCl-t (250 l ) adtam hozzá. Ezután a reakcióelegyet 1 órán 90 C on refluxáltattam. 24

A reakcióidő letelte után, vizet és EtOAc-t adtam az elegyhez és elválasztottam a fázisokat. A vizes fázis 3x10 ml EtOAc-tal extraháltam, az egyesített szerves fázist MgSO4-on szárítottam. A nyersterméket cellitre rotáltam, majd oszlopkromatográfiával tisztítottam(sio2,dcm:meoh 100:1 ), az oszlopot fénytől védtem. A termék piros szilárd anyag (0,035mg,46,5 %) Rf: 0,28 (DCM:MeOH 100:1) 1 H NMR (500 MHz, DMSO) δ 9.03 (s, 1H), 8.00 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.71 7.65 (m, 1H), 7.50 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.46 7.39 (m, 1H), 7.12 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 5.60 (s, 2H). 13 C NMR (126 MHz, DMSO) δ 174.64, 159.81, 153.42, 147.88, 144.59, 139.97, 138.68, 133.26, 130.18, 125.55, 123.51, 120.45, 119.53, 116.57, 116.36, 103.50. LC-MS (ESI): 294.65 m/z, [M+H] + 3-(6-azidobenzo[d]thiazol-2-il)-2H-kromén-2-on[14] Az amint (30 mg,0,102 mmol,1 eq.) feloldottam 6 M HCl-ban(2 ml ) majd lassan NaNO2(7,74mg,0,112mmol,1,1eq) és víz(500 l ) elegyét csepegtettem hozzá. Eközben a lombikot fénytől védtem és a hőmérsékletet 5 C alatt tartottam és elegyet 1 órán át kevertettem így. Ezután NaN3(9,945mg,0,153mmol,1,5eq) és víz(500 l) elegyét csepegettem hozzá. Pár perc után sárga anyag vált ki az oldatból, ekkor megszüntettem a hűtést és további 2 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. A reakcióidő letelte után az elegyhez vizet és dietil-étert adtam, majd elválasztottam a fázisokat. A vizes fázist még 3x10 ml dietil-éterrel extraháltam és az egyesített szerves fázist MgSO4-on szárítottam. 25

Az étert rotációs vákuumbepárlóval távolítottam el és sárga szilárd terméket kaptam. (11mg,33,7%) Rf : 0,7 (Hex:EtOAc 1:1) 1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.21 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.02 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.62 7.41 (m, 1H), 7.30 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H). 13 C NMR (101 MHz, DMSO) δ 159.58, 159.41, 153.32, 149.53, 141.80, 137.60, 136.96, 133.66, 130.22, 125.22, 123.66, 119.30, 118.92, 118.81, 116.24, 112.17. 26

KÖVETKEZTETÉSEK Munkám során sikeresen előállítottam két monoazid fluorofórt (maqbtz és mbtzq). Ezek a festékek a kutatócsoporton belül előállított biszazid festék (AQBz) monoazid analógjai, melyekre azért volt szükség, hogy segítségükkel teljesebb képet kapjunk a biszazidflurogének működéséről, az azid csoportok fluorogenicitáshoz való hozzájárulásáról. A két előállított monoazid festék, szemben az AQBtz-vel, gyengén fluoreszcens. Az AQBtz szerkezetére specifikus (BCN)KAEAAK(BCN) bisz-ciklooktin peptiddel reagálva mindkét monoazid hasonló, 5 és 5,5 fluoreszcencia-serkentést mutatott, szemben az AQBtz esetében mért 150-szeres értékkel. Ennek a nagy különbségnek az okai az alábbiak lehetnek: 1) az egyes azidcsoportok körülbelül ugyanolyan mértékben járulnak hozzá a fluoreszcencia tompításához, függetlenül attól, melyik aromás magon helyezkednek el, de a két aromás magból álló fluorofórok fluoreszcenciájának teljes letöréséhez nem elég egyetlen azidcsoport, függetlenül annak helyzetétől 2) a monoazidok szerkezetükből adódóan nem képesek a feszült peptid-festék ciklikus konjugátum kialakítására. Ezek a feszült gyűrűs szerkezetek tovább növelnék a konjugátum fluoreszcenciájának intenzitátását, a lecsökkent vibrációs szabadsági fokoknak köszönhetően, így mivel a monoazidok esetében nem alakultak ki ilyen ciklikus szerkezetek, a nagymértékű fluorogenicitás-különbség az AQBtz-hez viszonyítva a nem teljesen kioltott fluoreszcencia mellett ennek is köszönhető. 27

IRODALOMJEGYZÉK 1 G. B. Cserép, A. Herner, P. Kele, Methods Appl. Fluoresc., 2015, 3(4), 042001. 2 T. N. P. i. C. 2008 Nobel Media AB https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ 3 T. N. P. i. C. 2014 Nobel Media AB https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/press.html 4 J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3 ed., 2016, Springer, Heidelberg, 1-5. 5 H. C. Hang, C. Yu, D. L. Kato, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci., 2003, 100, 14846-51. 6 C. R. Bertozzi, E. Saxon, Science, 2000, 287, 2007-10. 7 M. L. Blackman, M.Royzen, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(41), 13518-13519. 8 Wittig G, Krebs A. Chem Ber 1961, 94, 3260. 9 M. J. Baskin, J. A Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A. Miller, A. Lo, J. Codelli, C. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104(43), 16793-7. 10 K. Chenoweth, D. Chenoweth, W. A. Goddard, Org. Biomol. Chem., 2009, 7(24), 5255. 11 J. C. Jewett, E. M. Sletten, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(11), 3688-90. 12 B. R. Varga, M. Kállay,K. Hegyi,Sz. Béni, P. Kele, Chem. Eur. J., 2012, 18(3), 822-8. 13 J. Dommerholt, O. van Rooijen, A. Borrmann, C. F. Guerra, F. M. Bickelhaupt, F. L. van Delft, Nat. Commun., 2014, 13, 5378. 14 A. Krężel, A. Promorski, Chembiochem., 2011, 12, 1152-67. 15 R. A. Scheck, M. A. Lowder, J. S. Appelbaum, A. Schepartz, ACS Chem. Biol., 2012, 7(8), 1367-1376. 16 Z. Ignatova, L. M. Gierasch, Proc. Natl. Acad. Sci., 2004, 101, 523. 17 O. Demeter, E. A. Fodor, M. Kállay, G. Mező, K. Németh, P. Szabó, P. Kele, Chem. Eur. J., 2016, 22(18), 6382-88. 18 A. Herner, G. E. Girona, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele, Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370-74. 19 A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 3297-3306. 28