Hőhatásnak kitett emlőssejtes tápoldatporok vizsgálata infravörös spektroszkópiai-és preparatív, lombikos minősítési módszerekkel Szabó Éva, Gergely Szilveszter, Párta László, Zalai Dénes BME Alkalmazott Biotechnológia és ÉlelmiszertudományiTanszék Richter Gedeon Nyrt., Biotechnológiai Osztály
Fehérje alapú biotechnológiai gyógyszerhatóanyagok Csoportosítás farmakológiai hatás szerint: enzimatikusvagy szabályozó aktivitású fehérjék speciális célzott aktivitással rendelkező fehérjék vakcinációsproteinek diagnosztikai felhasználású fehérjék mab (monoclonal antibody) monoklonális antitest tumoros- és autoimmun kórképek, (fertőzés profilaxis) poszttranszlációsmódosítások emlős sejtvonalak CHO (Chinese hamster ovary) kínaihörcsögpetesejt egér mielóma sejtvonalak (NS0, Sp2/0) SzabóÉva NIR Klub 20. 0. 06. 2
Emlős sejtes fermentációknál felhasznált tápoldatporok Szérummentes tápoldatok pontosan definiált összetétel fertőzés kockázatának csökkentése végtermék könnyebben kinyerhető 0-80 kismolekulás komponens optimalizálása idő-és alapanyag igényes Tápoldatporok stabil ( 8 C) minőségellenőrzés preparatív módszerekkel lassú, alapanyag igényes eltérés okáról nem szolgáltat információt Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06.
PAT QbD (qualitybydesign) minőségközpontú fejlesztés minőségügyi koncepció folyamat tudományos megértése, szabályozás PAT (processanalyticaltechnologies) folyamatelemző technológiai eljárások rendszer tervezés, elemzés, ellenőrzés kritikus paraméterek monitorozása Kiemelkedő analitikai módszerek: infravörös spektroszkópia Raman-spektroszkópia fluoreszcens spektroszkópia Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06.
Infravörös spektroszkópia Gyors mérés Roncsolásmentes, a mintaigény kicsi Folyamatos monitorozás megvalósítható Komplex információhordozó spektrumok VIS-NIR FT-NIR FT-IR Foss NIRSystems600 RCA 00 098 nm (VNIR) 00 298 nm (NIR) Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. PE Spectrum00 NIRA 0000 000 cm PE Spectrum00 UATR 000 60 cm
Célkitűzések Előkísérlet, kísérlettervezés Sejttenyésztés lombikokban Sejtkoncentráció, mab koncentráció Tápoldatporok hőkezelése Mennyiségi meghatározás Infravörös spektroszkópia Minőségi meghatározás Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 6
Kísérletterv Két faktor (hőmérséklet, időtartam) tartomány megállapítása -a fizikai változások enyhék -az oldódási képesség megmarad - szint 9 mérési pont centrumponti mérés + kezeletlen kontroll Hőmérséklet ( C) 90 70 0 0 0-7 9 Idő (h) Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 7
Referencia eredmények tömegváltozás,,0 Plot of Marginal Means and Conf. Limits (9,%) DV: tömegváltozás [%] Design: 2 -level factors, Blocks, 22 Runs óráthőkezelt 7óráthőkezelt óráthőkezelt tömegváltozás [%] 0, 0,0-0, -,0 -, Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 0 0 70 T [ C] 8
Referencia eredmények sejtkoncentráció 7E6 Plot of Marginal Means and Conf. Limits (9,%) Design: 2 -level factors, Blocks, Runs 6E6 Élősejt-koncentráció [sejt/ml] E6 E6 E6 2E6 0 0 70 Hőmérséklet [ C] óráighőkezelt 7óráighőkezelt óráighőkezelt Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 9
Referencia eredmények mabkoncentráció Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Relative IgG 2 -level factors, Blocks, Runs; MS Residual=,000278 (2)Time(L) -6,8676 Lby2L -0,766 ()Term(L) -7,708 Term(Q) 6,770 Qby2L,9266 Qby2Q 2,29 Lby2Q,08098 Time(Q),00689 p=,0 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 0
Referencia eredmények kontroll csoport Kontrasztanalízis 0 C, óra kezeletlen kontroll minták Sejtkoncentráció: mab koncentráció: nem szignifikáns szignifikáns Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06.
Spektroszkópiai eredmények 0,6,0 VIS-NIR 0, FT-NIR 0,9 0,8 0, 0,7 A A 0,6 0, 0, 0,2 0, 0, 0, 0,2 0,0 00 700 000 00 600 900 2 200 0, 0 000 2 00 9 000 8 000 Hullámhossz (nm) Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 6 000 000 000 Hullámszám (/cm) 00,0 FT-IR 90,0 80,0 %T 0 C, h 0 C, 7 h 0 C, h 0 C, h 0 C, 7 h 0 C, h 70 C, h 70 C, 7 h 70 C, h Kontroll 7 000 70,0 60,0 0,0 0,0 000 00 000 2 00 2 000 Hullámszám (/cm) 00 000 00 2
Spektroszkópiai eredmények 0, Szín 0, 00-800 nm 0, FT-NIR Nedvességtartalom 600-2000 nm 0,2 0, (A) (A) 0,2 0 C, h 0 C, 7 h 0 C, h 0 C, h 0 C, 7 h 0 C, h 70 C, h 70 C, 7 h 70 C, h Kontroll 0,6 VIS 0,0 0,0 0,8 0,09 0,6 0,08 0,07 00 0 00 0 600 60 700 70 0, 600 800 60 700 Hullámhossz (nm) 0,0 70 800 80 900 90 2 000 Hullámhossz (nm) E-0 Szemcseméret Nedvességtartalom E-0 0,09 E-0 0,00002 0,08 A A 0,0000 0,07 0-0,0000-0,00002 0,06 NIR 800-00 nm 0,0 800 82 80 87 Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 900 92 90 97 Hullámhossz (nm) 000 02 00 07 00 -E-0 -E-0 FT-NIR 2. deriv. 600-2000 nm -E-0 600 60 700 70 800 80 Hullámhossz (nm) 900 90 2 000
Spektroszkópiai eredmények klaszteranalízis NIR 2. derivált ( pt) 0,000 Single Linkage Euclidean distances 0,0000 0,0002 Linkage Distance 0,00020 0,000 0,0000 0,0000 0,00000 70._b 70._c 70._a 70.07_b 70.07_c 70.07_a 70.0_c 70.0_b 70.0_a 0._a 0._c 0._b 0.07_c 0.07_b 0.07_a 0.0_c 0.0_b 0.0_a 0._c 0._b 0._a 0.07a_c 0.07a_b 0.07a_a 0.07c_a 0.07b_c 0.07b_b 0.07c_c 0.07c_b 0.07b_a 0.0_c 0.0_b 0.0_a Kc_b Kb_c Kb_a Kc_a Kb_b Ka_c Kc_c Ka_b Ka_a Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 0 C 70 C 0 C Kontroll
Spektroszkópiai eredmények PCA NIR kezeletlen spektrum 2,0,,0 alapvonal eltolódás szemcseméret 0, Factor 0,0-0, -,0 -, -2,0 200 00 600 800 2000 2200 200 nm 0,06 0,0 O-H 0,0 0,0 0,02 O-H Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. + 0 C, h 0 C, 7 h 0 C, h + 0 C, h 0 C, 7 h 0 C, h + 70 C, h 70 C, 7 h 70 C, h Ø Kontroll Factor 2 0,0 0,00-0,0-0,02-0,0-0,0 C-H 200 00 600 800 2000 2200 200 nm
Spektroszkópiai eredmények PCA 0,00008 FT-NIR + Savitzky Golayderivált 0,00006 0,0000 0,00002 Factor 2 0,00000-0,00002-0,0000-0,00006-0,0000-0,00002-0,0000-0,0000 Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 0,00000 0,00002 0,0000 0,0000 Factor + 0 C, h 0 C, 7h 0 C, h +0 C, h 0 C, 7h 0 C, h +70 C, h 70 C, 7h 70 C, h ØKontroll 6
RMSE (cells/ml) 700000 600000 00000 00000 00000 200000 00000 Spektroszkópiai eredmények PLS (sejt VNIR) 0 22920 280 S R Pearson-féle korrelációs koefficiens 27700 2970 270 2900 2770 80 28600 0990 2 2 2 2 SNV D_pt D_pt 20 297690 2060 28820 2690 279980 Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 290 27260 D_pt D_7pt RPD relatív tapasztalati szórás D_9pt D_pt RPD 2680 62800 D2_pt 8 7 6 2 0 260 8260 D2_pt 2,72 2,7 S R 2 260 29870 D2_pt 2,2 2,29 0,9 0,8 0,7 0,6 0, 0, 0, 0,2 0, 27970 900 290770 2900 0670 720 26980 2920 2 2 2 2 D2_7pt 2, 2,29 0,86 0,82 S D2_9pt 2,7 2,0 0,8 0,8 D2_pt 0,8 0,8 0,8 0,76 970 22080 SG_pt SG_2p 0,8 0,79 2 2 2 2 SNV 2, 2,8 2 2 2 2 SNV D_pt D_pt 2,9 2,27 D_pt 2,6 2, D_pt 0 9 8 7 6 2 0 2,68 2,2 0,8 0,8 Faktor 0,86 0,82 0,86 0,8 0,86 0,8 D_pt 2,70 2,6 D_pt D_7pt D_9pt D_pt D_7pt,2,08 D_9pt 2,60,77 D_pt 2, 2,0 0, 0, D2_pt 2,6 2,2 0,8 0,68 D2_pt 2,27 2,0 0,8 0,76 D2_pt 2, 2,02 0,82 0,78 0,8 0,77 0,78 0,76 0,8 0,82 2 2 2 2 D2_7pt 2, 2, 2 2 2 2 D2_9pt,9 2,80 D2_pt 0 9 8 7 6 2 0 0,9 0,87 SG_pt SG_2p RMSE átlagos hiba négyzetösszeg D2_pt D2_pt D2_pt D2_7pt D2_9pt D2_pt SG_pt SG_2p Faktor 0 9 8 7 6 2 0 7 Faktor
RMSE (mg/l) 0 0 2 20 0 Spektroszkópiai eredmények PLS (mab VNIR) 0,77,0 2 S,0 7,72 SNV,09 7,0 2,8 6,6,7,70,08 6,8,7,68,,6,, 2 2 2 2 2 2 D_pt D_pt D_pt D_7pt D_9pt D_pt RPD,88, D2_pt 8 7 6 2 2,9 20,0 D2_pt,2,6 2 R 2 2,7 0,9 0,8 0,7 0,6 0, 0, 0, 0,2 7,09 0,9 0,90 2 S 7,9 20,92 0,88 0,8 SNV 8,28 20,7 0 0 Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 8 S 9,69 D2_pt 2,89 2,9 SNV 0,7 D2_7pt,0 2,69 2 2 D2_9pt,9 2,76 D2_pt, 2,92 0,9 0,86,9 6,2 0,92 0,87 0,90 0,88 0,89 0,88 0,89 0,88 0,89 0,89 0,90 0,89 2 2 2 2 2 2 D_pt 9 6,97,90 SG_pt SG_2p 2,97 2,8,0 2,92 D_pt 0 9 8 7 6 2 0,08 2,98 D_pt Faktor,2,0 2 2 2 2 2 2 D_pt D_pt D_pt D_7pt D_9pt D_pt D_7pt,22, D2_pt D_9pt,6 2,29 D2_pt D_pt,2 2, D2_pt 0,90 0, D2_pt 6, 0, D2_7pt 0,92 0,8 D2_pt 2, 2,9 0,92 0,82 D2_pt 2, 2,2 2 2 D2_9pt D2_pt 0,97 0,90 0 D2_7pt,7 2,79 0,8 0,79 0,8 0,80 2 2 D2_9pt 6,2 9,0 SG_pt SG_2p D2_pt 0 9 8 7 6 2 0,9 0,87 0,98 0,9 9 SG_pt SG_2p Faktor 0 9 8 7 6 2 0 Faktor
Összefoglalás Hőkezelés Sejt Hatás Tápoldatpor Igény Megfelelőség: igen/nem PLS PCA Klaszter-analízis Spektrumok Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 9
Kitekintés További terveink: rátápláló tápoldatporokvizsgálata eltérő sarzsok hőkezelés (zárt edény) időbeli változás referencia (reaktoros tenyésztés, HPLC-MS/MS) Módszerfejlesztés (PAT) nagy mintaszám több sarzs Szabó Éva NIR Klub 20. 0. 06. 20
Köszönöm a figyelmet! 2
VNIR NIR FT-NIR FT-IR RCA RCA NIRA UATR 00 098 nm 00 298 nm 0000 000 cm 000 60 cm (000 200 nm) (200 8 nm) 0 adatpont 700 adatpont 00 adatpont adatpont W-halogén izzó W-halogén izzó W-halogén izzó Védjegyzett MIR-FIR ff. Holografikus rács Holografikus rács Michelson-interf. Michelson-interferométer Si detektor PbSdetektor InGaAs detektor DTGS detektor
NIR kezeletlen PCA 2,0,,0 0, 0,06 97,89 % 0,0,6 % 0,0 0,0 0,02 Factor 0,0 Factor 2 0,0-0, 0,00 -,0-0,0-0,02 -, -0,0-2,0 200 00 600 800 2000 2200 200-0,0 200 00 600 800 2000 2200 200 nm nm 0,06 0,0 0,02 0,2 % 2,0, 0,00 0,008,0 0,006 0, Factor 0,00 0,002 0,000-0,002 0,0-0, -0,00-0,006 -,0-0,008 -, -0,00-0,02 200 00 600 800 2000 2200 200 nm -2,0 200 00 600 800 2000 2200 200 nm Factor Factor 2 Factor