Fehérjék stabilitása: stabilitási fázisdiagram, extrém körülmények, termofil és iezofil enzimek Smeller László Destabilizáló környezeti araméterek Fizikai magas hőmérséklet alacsony hőmérséklet nyomás Kémiai urea (nagy koncentrációban GuHCl [guadinium klorid] (nagy konc. hermohiles, a tye of extremohile, roduce some of the bright colors of Grand Prismatic Sring, Yellowstone National Park he first extremohile to have its genome sequenced was Methanococcus jannaschii, a microbe that lives near hydrothermal vents,6 meters below sea level, where temeratures aroach the boiling oint of water and the ressure is sufficient to crush an ordinary submarine. Image credit: NOAA htt://ocean.si.edu/ocean-videos/hydrothermal-vent-creatures
Fizikai araméter: hőmérséklet Kétállaotú modell: natív (N és denaturált (D ΔH(=H D (-H N ( ΔH = ΔC ΔS ΔH ( = ΔH ( + ΔC d Δ = Δ + Δ C S( S( d ΔC = Válasszuk -t úgy, hogy -3n: G N ( =G D ( ΔG( =G D ( -G N ( = (Azaz egy denaturációs hőmérséklet. ΔG( =ΔH D ( - ΔS N ( = ha C független a hőmérséklettől: ( = ΔH ( + ΔC d = ΔH ( + ( ΔH ΔC ΔC ΔS( = ΔS( + d = ΔS( + ΔC ln ( = ΔH ( + ΔC d = ΔH ( + ( ΔH ΔC ΔH( ΔS( ΔH( ΔS( ΔG( = ΔH( ΔS( = = ( ( ΔC ΔS( ΔC ln = ΔG( H ΔC ΔS( = ΔS( + d = ΔS( + ΔC ln H c
DENAURÁL NAÍV DENAURÁL w D ΔG / R w N = e ΔG( ΔG max SABILIÁS c c Hideg denaturáció Gyakran C alatt Méréstechnikai roblémák Megoldás: más denaturáló ágens használata: destabilizáció, c emelkedik. a víz fázisdiagramjának kihasználása: nyomás alatt akár - C-ig le lehet menni
Mioglobin PGK A víz fázisdiagramja A nyomás-hőmérséklet fázisdiagram
Miért érdekes a nagy nyomás? Miért ne? termodin. aram.,,.. A bioszférában =1 bar 1 kbar echnikailag nehéz =1 bar-os atmoszférában élünk 77 metres down in the Pacific Ocean's Jaan trench Olyan adatok nyerhetők amelyek 1bar-on is értelmezhetőek 1 bar =,1 MPa 1 kbar = 1 MPa 1 kbar = 1GPa 1Mbar=1GPa htt://ocean.si.edu/ocean-videos/hydrothermal-vent-creatures Milyen nagy nyomás? emberi élet 1 bar 1 kpa max. nyomás a bioszférában:1 kbar (mélytengerek fehérje szerkezetváltozások 5-1 kbar 1 Ma.5-1 GPa a víz megfagy szobahőm.-en 1 kbar 1GPa a bolygók közontjában ~ Mbar 1 GPa a laboratóriumban elért néhány Mbar n.1 GPa
Milyen hatása van a nyomásnak? Le-Chatelier-Braun-elv nyomás <-> térfogat nyomás nyomás <-> térfogat V 1 V nyomás ΔG ln K = R = ΔV V 1 V ΔV ln K = + konst. R Milyen hatása van a nyomásnak a fehérjékre? Nyomásdenaturáció: lizozim Nyomásdenaturáció Fehérje oldatok Amide II 75mg/ml back to.1 MPa amide I 9 MPa.1 MPa V rotein =V atom +V void +ΔV hydration
Nyomásdenaturáció: lizozim A nyomás-hőmérséklet fázisdiagram Amide I max. osition [cm -1 ] 1/ =6.95 kbar =695 MPa @3 C Amide II intensity [a.u.] 1/ =5.83 kbar =583 MPa @3 C A hőmérsékleti és nyomásdenaturáció egységes termodinamikai leírása A kétállaotú modell: N <-> D ΔG(=G D (-G N ( Egy referenciaontból indulva integráljuk ki a d(δg= -ΔSdt+ΔVd mennyiséget a, ontig: ΔG(, = ΔG + ΔSdt + ΔVd ΔG = Δβ ( ΔC ln 1 + + ΔV ( ΔS ( + Δα( ahol: β = ( V / α = ( V / = ( S / C = ( S / ( + ΔG az ún. komresszibilitási faktor, a hőtágulási együttható, az állandó nyomáson mért fajhő
esetén: ( 1 ln + ( ( ( ( ( ( G S V C G + Δ Δ + Δ Δ + Δ Δ = Δ α β Ha Δα > ΔC Δβ /,akkor a ΔG (, = ontok a síkon egy elliszist határoznak meg A denaturációs ontokon: ΔG = Másodfokú -ben is és -ben is! Mennyire igaz ez a kétállaotú modell a valódi fehérjékre, fehérjeoldatokra? Csak egy denaturált állaot létezik? Intermolekuláris kölcsönhatások?
Kísérleti eredmények - fázisdiagramokra Mioglobin: FIR sektroszkóia hideg hő nyomás Mioglobin Lizozim Mioglobin: fázisdiagram Lizozim: FIR Sektroszkóia 75mg/ml Amide II back to.1 MPa amide I 9 MPa.1 MPa
Lizozim: nyomásdenaturáció Lizozim: hődenaturáció Amide I max. osition [cm -1 ] Amide II intensity [a.u.] 1/ =6.95 kbar =695 MPa @3 C 1/ =5.83 kbar =583 MPa @3 C P=1.5 kbar [C] Lyzozim: - fázisdiagram Nyomás-hőmérséklet fázisdiagram: a valóság ΔG = ΔG ΔS Δ ˆ β + ( ΔC ( + Δ ˆ( α ( + ΔV ( ( +... + P nyomás ΔS= ΔV= intermolekuláris kh.: aggregáció (conc! nyomás- és hidegdenaturáció: ΔV hődenaturáció: ΔS hideg C hő A
P C Aggregációra hajlamos intermedierek keletkezése nyomáskezelés hatására mioglobin Absorbance 158 16 16 164 166 168 17 17.3..1 ν [cm -1 ] Nyomáskezelt kontrol Intermolekuláris kölcsönhatások és a nyomás 1 3 4 5 6 7 8 9 1 11 [ C] heat Intermolekuláris kölcsönhatások és a nyomás Aggregátumok disszociációja nyomással élda: mioglobin tiikus nyomás kbar ( MPa
Aggregátumok disszociációja nyomással élda: mioglobin Aggregátum és Fibrillum Day 1: (a AFM (b amide I band of R15 115 at.1 MPa (full line, 55 MPa (broken line and.1 MPa after decomression (dotted line. Day 4: (c AFM (d amide I band of R15 115 fibrils at.1 MPa (lower, 1.3 GPa (middle and.1 MPa after decomression (uer. From Dirix et al A harmadik (negyedik dimenzió H, [GuHCl], [U]
A nagy nyomás technikája vastag falú edény kis térfogató gyémántcella Nagyon vastag és szilárd falú edény (bomba A nagy nyomás technikája kb 1 cm minta 1 mm 3 otikai ablak A nagy nyomás technikája DAC diamond anvil cell Nagyon kicsi felület (ill. térfogat,5mm (~1 nl
Alkalmazások ermofil és iezofil fehérjék Extremofil mikroorganizmusok Nyomáskezelt izza az egyik nagynyomásos konferencián Nyomáskezelt élelmiszerek egy jaán áruházban extrém hőmérsékleten (>1 C extrém nyomáson (több 1 bar extrém kémiai körülmények (savas v. lúgos között élnek. (Pl. a tenger mélyén, hőforrások közelében, stb. Ezekből izolálhatók a termofil és iezofil fehérjék
Nyomással növelt enzimaktivitás hermohiles, a tye of extremohile, roduce some of the bright colors of Grand Prismatic Sring, Yellowstone National Park he first extremohile to have its genome sequenced was Methanococcus jannaschii, a microbe that lives near hydrothermal vents,6 meters below sea level, where temeratures aroach the boiling oint of water and the ressure is sufficient to crush an ordinary submarine. Image credit: NOAA l.: α-kimotriszin,1 MPa => C 48 MPa 6,5x olifeniloxidáz,1 MPa => 5 MPa +4% α-amiláz 59 C atm.. => 64 C 15 MPa +5% esin,1 MPa => 3 MPa 7x Hogyan változik a fázisdiagram? Példa: SHSP16,5 fehérje a Methanococcus jannaschii-ból
Nyomástűrés Nem túl nagy kihívás: bioszférában max. 1 kbar normál fehérjestabilitás kb 5 kbar. Mélytengeri élőlények Irodalom Privalov PL. Cold denaturation of roteins. Crit Rev Biochem Mol Biol. 199;5(4:81-35. Meersman, F., Smeller, L., Heremans, K (5 Extending the ressure-temeratura state diagram of myoglobin Helv. Chim. Acta 88, 546-556 ölgyesi, F., Böde Cs., Smeller, L., Kim, K. K., Heremans, K., Fidy, J. (4 Pressure activation of the chaerone function of small heat-shock roteins Cell. Mol. Biol. 5, 361-369. F. Meersmann, L. Smeller, K. Heremans ( A comarative study of cold-, ressure- and heat-induced unfolding and aggregation of myoglobin Biohys. J. 8 635-644. L. Smeller ( Pressure-temerature hase diagram of biomolecules Biohys. Biochim. Acta 1595 11-9. L. Smeller, P. Rubens, K. Heremans (1999 Pressure effect on the temerature induced unfolding and tendency to aggregate of myoglobin Biochemistry 38 3816-38. Smeller László: A fehérjék konformációs és dinamikai tulajdonságai. Új eredmények nagy nyomással kombinált infravörös és fluoreszcencia sektroszkóiai módszerekkel. MA doktori értekezés Ly-Nguyen B, Van Loey AM, Smout C, Verlent I, Duvetter, Hendrickx ME. Effect of Mild-Heat and High- Pressure Processing on Banana Pectin Methylesterase: A Kinetic Study J Agric Food Chem. 3 Dec 31;51(7:7974-9. htt://bartlettlab.ucsd.edu/research.html htt://ocean.si.edu/ocean-videos/hydrothermal-vent-creatures htt://www.hierbaric.com/en Dirix, C; Meersman, F; MacPhee, CE; Dobson, CM; Heremans, K High hydrostatic ressure dissociates early aggregates of R15-115, but not the mature amyloid fibrils J. Mol Biol. 347 (5 93-99 Eisenmenger, Michael J.; Reyes-De-Corcuera, Jose I. High ressure enhancement of enzymes: A review Enzmye Microbial echnol. 45 (9 331-347