Fehérje O-glikoiláció tömegspektrometriás visgálata Darula Zsusanna MTA Segedi Biológiai Kutatóköpont Proteomikai Laboratórium
Fehérjeanalitika 6-as évektől: 9-es évektől: Edman sekvenálás Tömegspektrometria (ESI, MALDI) (de novo és DNS adatbáisok alapján) Post-translációs módosítások visgálata!
Post-translációs módosítások Fosforiláció Sulfatálás Disulfid híd Acetileés Metileés Glikoiláció Ubikvitin Lipid Proteolíis SUMO Serkeet, stabilitás, lokaliáció, aktivitás
Extracelluláris glikoiláció Fukó (Fuc) Siálsav (SA) Galaktó(Gal) Mannó (Man) GalNAc GlcNAc O-glikán N-glikán Lumen/extracelluláris citosól www.neb.com C-glikoiláció: Trp + Mannó (1994) O-glikoiláció: Tyr-on is!!! (211) S-glikoiláció: Cys + GlcNAc (216)
Mucin-típusú (GalNAca) O-glikán magserkeetek a O Ser / Thr Core 1 a O Ser / Thr Core 3 6 a O Ser / Thr Core 2 6 a O Ser / Thr Core 4 a O Ser / Thr Core 5 6 a O Ser / Thr Core 7 6 a O Ser / Thr Core 6 a3 a O Ser / Thr Core 8 GalNAc Gal GlcNAc
Biológiai funkció Általános Fehérje serkeet, oldhatóság, stabilitás Sejt-sejt kommunikáció Sejtadhéió Fehérje / helyspecifikus IgA nefropátia familial tumoral calcinosis (FGF23 hormon) Proprotein konvertá Rák, autoimmun betegségek glikoilációs mintáat megváltoik Felhasnálható a betegség kimutatására?
Anderson N L, Anderson N G Mol Cell Proteomics 23;2:5-5 23 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology Komplex minták (vérsérum): Dúsítás + LC-MS analíis
További nehéségek Dúsítás: kis glikán: módosítatlan peptidekhe hasonló fiiko-kémiai tulajdonságok MS/MS: ütköéses aktiválás: cukor lerepül ECD/ETD: glikán résről limitált információ hatékonyság Automatiált adatkiértékelés megbíhatóság?
MS/MS (ütköéses aktiválás, CID HCD) módosítatlan peptid 1661_3 #313 RT: 22.87 AV: 1 NL: 6.16E5 T: FTMS + c NSI d Full ms2 96.11@hcd3. [1.-2.] 1 y 23 82.386 TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER +3 9 8 7 6 5 pr 96.115 y 23 123.76 4 3 2 1 K b 2 199.18 294.182 b 3 312.192 a 2 b 4 49.246 y 4 54.278 y 9 y 6 716.358 y 22 y 24 y 8 928.439 y22 1154.55 y 2 y 18 b 2 y 21 y 24 1259.617 y 15 b 16 1558.739 1343.647 INT INT 2 4 6 8 1 12 14 16 Glikopeptid : peptid sekvencia? glikán (serkeet)? módosítás helye?
HS Jacalin4.65 5/2 13412_13 #2279 RT: 15.75 AV: 1 NL: 2.25E4 T: ITMS + c NSI d w Full ms2 736.3@cid35. [19.-2.] x5 1 8 6 4 585. 639. 2 776.2 876.9 274.2 366.1 957.9 292.3 517.3 572.9 877.8 451. 858.8 958.8 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 13412_37 #2736 RT: 15.82 AV: 1 NL: 1.7E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 736.3@hcd35. [1.-2.] 1 HexNAc 8 6 4 2 a 2 24.1 171.1 HexHexNAc SA H 2 O SA 274.1 -SAHexHexNAc y 4 y 13 2+ y 14 2+ 724.4 724.9 -SAHex y 8 89.5 1125.6 675.9 471.3 SA 774.9 81.5 226.1 91.5 292.1 y 639.3 138.6 12 1253.7 1548.9 -SA y 9 y 1 y 11 -SAHexHexNAc 775.3 J4J -SAHex y 13 135.7 -SA peptid Peptid (MW:1549) + HexNAcHexSA CID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 13412_37 #2737 RT: 15.82 AV: 1 NL: 1.16E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 736.3@etd66.67 [5.-2.] x2 x5 x2 736.4 1 pr 3+ 8 6 pr-sa 2+ 958.3 c 3 c 5 5 6 7 pr-ac 2+ 4 568.8 c 528.8 698. 949.8 182.8 313.5 4 639.9 2 c 1 441.6 1469.7 9 c 9 1639.5 1 3 1568.4 195.3 1679.5 941.4 11 c 12 869.3 176.4 358.8 528.1 656.9 1767.6 1849.7 737.2 122.2 1411.5 1552.5 192.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2
HS Jacalin4.65 5/2 13412_13 #2279 RT: 15.75 AV: 1 NL: 2.25E4 T: ITMS + c NSI d w Full ms2 736.3@cid35. [19.-2.] x5 1 8 6 4 HexHexNAc SA H 2 O SA -SAHexHexNAc -SAHex 585. -SA 639. 2 776.2 876.9 274.2 366.1 957.9 292.3 517.3 572.9 877.8 451. 858.8 958.8 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 -SAHexHexNAc 775.3 J4J -SAHex -SA Peptid (MW:1549) + HexNAcHexSA CID 13412_37 #2736 RT: 15.82 AV: 1 NL: 1.7E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 736.3@hcd35. [1.-2.] 1 HexNAc 8 6 4 2 a 2 24.1 171.1 274.1 y 4 y 13 2+ y 14 2+ 724.4 724.9 89.5 1125.6 675.9 471.3 SA 774.9 81.5 226.1 91.5 292.1 y Y 639.3 138.6 12 1253.7 1548.9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 13412_37 #2737 RT: 15.82 AV: 1 NL: 1.16E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 736.3@etd66.67 [5.-2.] x2 x5 x2 736.4 1 pr 3+ y 8 y 9 y 1 y 11 y 13 135.7 TPPQSQTPGALPAKR + HexNAcHexSA HCD 8 6 pr-sa 2+ 958.3 c 3 c 5 5 6 7 pr-ac 2+ 4 568.8 c 528.8 698. 949.8 182.8 313.5 4 639.9 2 c 1 441.6 1469.7 9 c 9 1639.5 1 3 1568.4 195.3 1679.5 941.4 11 c 12 869.3 176.4 358.8 528.1 656.9 1767.6 1849.7 737.2 122.2 1411.5 1552.5 192.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2
HS Jacalin4.65 5/2 13412_13 #2279 RT: 15.75 AV: 1 NL: 2.25E4 T: ITMS + c NSI d w Full ms2 736.3@cid35. [19.-2.] x5 1 8 6 4 HexHexNAc SA H 2 O SA -SAHexHexNAc -SAHex 585. -SA 639. 2 776.2 876.9 274.2 366.1 957.9 292.3 517.3 572.9 877.8 451. 858.8 958.8 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 -SAHexHexNAc 775.3 J4J -SAHex -SA Peptid (MW:1549) + HexNAcHexSA CID 13412_37 #2736 RT: 15.82 AV: 1 NL: 1.7E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 736.3@hcd35. [1.-2.] 1 HexNAc 8 6 4 2 24.1 171.1 274.1 724.4 724.9 89.5 1125.6 675.9 471.3 SA 774.9 81.5 226.1 91.5 292.1 y 639.3 138.6 12 1253.7 1548.9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 13412_37 #2737 RT: 15.82 AV: 1 NL: 1.16E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 736.3@etd66.67 [5.-2.] x2 x5 x2 736.4 1 8 6 a 2 c 3 c 5 y 4 pr 3+ y 13 2+ 5 6 7 y 14 2+ y 8 pr-sa 2+ 958.3 y 9 y 1 y 11 pr-ac 2+ 4 568.8 c 528.8 4 698. 949.8 182.8 c 313.5 639.9 1 2 441.6 1469.7 9 c 9 1639.5 1 3 c 6 195.3 1568.4 1679.5 941.4 11 c 12 869.3 176.4 358.8 528.1 656.9 1411.5 1552.5 1767.6 1849.7 737.2 122.2 192.7 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 y 13 135.7 TPPQSQTPGALPAKR peptid + HexNAcHexSA TPPQSQTPGALPAKR l HexNAcHexSA HCD ETD
RPLC-MS: HCD és ETD adatok Kiértékelés: adatbáis Sérumfehérjék O-glikoilációs visgálata Dúsítás: lektin affinitás kromatográfia Jacalin (Gal1,3GalNAca) + ERLIC (hidrofilicitás, savasság) + miex + Jacalin Búacsíra agglutinin (WGA) + Jacalin
Bitos jó, amit a adatbáis kereső mond? Humán sérum triptikus eméstmény Kétkörös lektin affinitás dúsítás (WGA) Váratlan glikán serkeetek? HexNAcHexFuc??? Peptide RT(min) Score Expect Peptid 1 89.4311 3 TFVLS(511.19)ALQPSPTHSSSNTQR 15.617 34.4.85 Peptid 2 938.7789 3 TFVLSALQPS(656.23)PTHSSSNTQR 39.583 41.7 8.9E-5 Peptid 3 973.1314 3 TFVLSALQPS(759.29)PTHSSSNTQR 35.433 29.9.23 HexNAcHexSA???
E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #6948 RT: 39.59 AV: 1 NL: 9.41E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 939.11@hcd35. [1.-2.] y 12 1298.69 1 249.123 a 2 b 2 9 8 7 274.92 TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexSA 6 5 4 3 2 1 186.76 b 3 348.192 y 12 649.88y 13 75.328 y 1 y 17 y 16 y 1 y 11 y 13 y y 16 14 y y 17 15 557.764 779.371 151.691 849.417 1114.528 1426.662 1697.819 y 389.181 17 1539.757 121.55 1811.99 Y y 12 G 2 4 6 8 1 12 14 16 18 1389_3 #6949 RT: 39.6 AV: 1 NL: 8.87E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 939.11@etd66.67 [5.-2.] x2 x2 x5 x2 1 9 8 939.3 TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexSA (Ser1 Thr12) 7 6 5 4 3 2 1 -SA 91.5 1349.4 59.5 53.4 677.4 1254.5 1879. 764.4 9.5 974.7 389.3 1169.9 c 12 52.3 172.7 14.1 288.3 54.3 636.4 73.8 765.2 156.1 11 1329. 1659.4 1761.6 1956. 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 1262.6 2 4 5 19 6 3 8 7 c -Ac 9 16
E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2371 RT: 15.62 AV: 1 NL: 1.91E3 T: FTMS + c NSI d Full ms2 89.76@hcd35. [1.-2.] 1 138.55 9 8 7 6 5 4 3 2 1 24.87 1298.615 257.113 377.153 199.977 359.144 151.677 649.81 395.166 y y 863.97 1 13 Y 75.331y 955.994 557.769 7 y 1 484.313 779.37 1114.54 1426.692 1866.4 2 4 6 8 1 12 14 16 18 1389_3 #2372 RT: 15.62 AV: 1 NL: 1.13E4 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 89.76@etd66.67 [5.-2.] x2 x2 x5 x2 1 9 8 7 6 5 a 2, b 2, b 3??? y 12 89.7 891.3 7 8 4 1752.1 3 4 6 726.6 764.5 91.5 53.4 677.6 157.9 2 889.8 171.7 3 17 c 11+ 5 1314.1 1416.9 1563.7 197.9 92.6 1278. 52.3 141.7 1692.1 1 389.4 59.5 857.7 976.5 1221.8 188.6 229.2 322.1 485.4 522.3 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 1138.4 1187.2 X TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexFuc? 1336. y 12 y 13 y 12 NEM TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexFuc, Hanem VLSALQPSPTHSSSNTQR + 759.3 Da glikán??? c 7 1485. G y 18 Peptide RT(min) Score Expect Peptid 1 89.4311 3 TFVLS(511.19)ALQPSPTHSSSNTQR 15.617 34.4.85 Peptid 2 938.7789 3 TFVLSALQPS(656.23)PTHSSSNTQR 39.583 41.7 8.9E-5 Peptid 3 973.1314 3 TFVLSALQPS(759.29)PTHSSSNTQR 35.433 29.9.23 178.7 Y! X
E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2371 RT: 15.62 AV: 1 NL: 1.91E3 T: FTMS + c NSI d Full ms2 89.76@hcd35. [1.-2.] 1 138.55 VLSALQPSPTHSSSNTQR + 759 8 24.87 1298.615 6 4 2 377.153 199.977 257.113 649.81 151.677 395.166 863.97 955.994 484.313 557.769 779.37 1114.54 1426.692 1866.4 Y 2 4 6 8 1 12 14 16 18 1389_3 #6948 RT: 39.59 AV: 1 NL: 9.41E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 939.11@hcd35. [1.-2.] 249.123 1 8 274.92 A HCD spektrumok meglehetősen hasonlítanak 6 348.192 valósínűleg 649.88 4 186.76 nem a peptid, hanem a GLIKÁN HORDOZZA A MÓDOSÍTÁST 75.328 557.764 779.371 151.691 2 849.417 1114.528 1426.662 1697.819 389.181 121.55 1539.757 1811.99 1298.69 2 4 6 8 1 12 14 16 18 1389_3 #624 RT: 36.7 AV: 1 NL: 1.85E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 973.47@hcd35. [1.-2.] 25 2 974.581 Y TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + 656 TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + 759 15 1 5 186.76 249.124 1298.61 348.192 377.156 179.555 151.684 3.155 75.326 1337.6 488.249 619.348 779.365 957.56 1184.63 1426.681 1663.758 2 4 6 8 1 12 14 16 18 Y 181.917 191.895
E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2372 RT: 15.62 AV: 1 NL: 1.13E4 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 89.76@etd66.67 [5.-2.] 25 89.7 VLSALQPSPTHSSSNTQR + 759 2 15 1 5 889.8 1138.4 1187.2-394 Da 1336. 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 1389_3 #6949 RT: 39.6 AV: 1 NL: 8.87E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 939.11@etd66.67 [5.-2.] 25 939.3 TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + 656 2 15 1 5 -SA 1262.6 -Ac 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 1389_3 #625 RT: 36.8 AV: 1 NL: 4.81E4 T: ITMS + c NSI d sa Full ms2 973.47@etd66.67 [5.-2.] 25 973.5 TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + 759 2 15-394 Da 1 5 975.4 1262.5 1297.4 14.9 146.4 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 ~394 Da siálsav-serű módosítás: ~13 Da additív tömeg
E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2371 RT: 15.62 AV: 1 NL: 1.91E3 T: FTMS + c NSI d Full ms2 89.76@hcd35. [1.-2.] 1 138.1 8 6 4 2 126.1 168.1 186.1 24.1 377.2 215.1 257.1 359.1 144.1 185.2 b2 395.2 239.1 282.1 3.2 272.2 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 1389_3 #6948 RT: 39.59 AV: 1 NL: 9.32E4 T: FTMS + c NSI d Full ms2 939.11@hcd35. [1.-2.] 1 8 6 4 2 221.1 249.1 348.2 186.1 24.1 126.1 185.2 254.1 275.1 138.1 222.1 167. 197. 272.2 292.1 213.2 242.1 349.2 366.1 389.2 274.1 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 1389_3 #624 RT: 36.7 AV: 1 NL: 2.14E3 T: FTMS + c NSI d Full ms2 973.47@hcd35. [1.-2.] 1 b 3 SA 249.1 8 186.1 24.1 348.2 6 138.1 221.1 126.1 377.2 4 185.2 359.1 395.2 121.8 144.1 168.1 215.1 257.1 3.2 488.2 11.1 239.1 276.1 2 321.2 461.2 335.1 366.1 398.6 147.1 2.1 299.1 39.2 234.1 36.1 412.3 431.2 456.3 477.6 497.3 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 a 2 a 2 a 2 b 2 b 2 SA SA + 13 Da b 3 SA + 13 Da 456.3 484.3
Milyen reagenseket hasnáltunk a mintaelőkésítés során? Affinitás kromatográfia Tris pufferben MW: 121.1 Da rest of sialic acid unit O O C O O Tris ph=7.5 adjacent sugar unit CH 2 OH HOH 2 C rest of sialic acid unit HOH 2 C O O NH C HO O adjacent sugar unit
Tanulságok PTM analíis - adatkiértékelő softverek további fejlestésre sorulnak A eredmények manuális validálása egyelőre megkerülhetetlen
Kösönetnyilvánítás Dr. Tóth Géa, Dr. Dirk Tourwe MTA SBK Proteomikai Laboratórium Dr. Medihradsky Katalin Hunyadi-Gulyás Éva, Klement Éva Alapítvány a Magyar Peptid- és Fehérjekutatásért Soros Alapítvány Magyar Állami Eötvös Östöndíj MTA Bolyai János Kutatási Östöndíj OTKA