Módszerfejlesztés emlőssejt-tenyészet glükóz tartalmának Fourier-transzformációs közeli infravörös spektroszkópiai alapú meghatározására Kozma Bence 1 Dr. Gergely Szilveszter 1 Párta László 2 Dr. Salgó András 1 1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 2 Richter Gedeon Nyrt., BTCH NIR Klub 2013. Április 18.
Kutatómunkánk témája Emlőssejt-tenyészet modellrendszer vizsgálata in-line Fourier-transzformációs közeli infravörös (FT-NIR) spektroszkópiával. Elsődleges cél: a NIR spektrumok és a referencia adatok alapján mennyiségi kalibráció készítése az oldat glükóz tartalmára, amelyet később a reaktoros rendszerbe átültethetünk. Egyéb vizsgálati irányok: a NIR alkalmazási határainak feltérképezése az emlőssejttenyészetekben és a kísérleti rendszerben, spektrális előkezelések optimálása, tenyészet fiziológiai paramétereinek hatása a NIR spektrumokra. 2
A Process Analytical Technology és az infravörös spektroszkópia PAT: az FDA új szemléletű gyógyszergyártásellenőrzési módszere. (2004) Az infravörös spektroszkópia ennek egyik lehetséges módja. Számos helyen már bizonyított a biotechnológia területén. Mérések elrendezési lehetőségei. 3
Kísérleti modellrendszerünk Rázatott lombikban, szakaszos, rátáplálásos módon tenyésztettünk sejteket, majd glükóz hígítási sort készítettünk kívülről hozzáadott glükóz oldattal. Ötvöztük az előnyeit az in-vivo (tenyésztés bioreaktorban) és in-vitro (sejtmentes glükóz oldat) rendszereknek, mert: sejtes rendszert, valódi tenyésztést, ezért hasonló mátrixot, kisebb térfogatot, ezért alacsonyabb költségeket értünk el, de utólag beállítottuk a glükóz-koncentrációt. 4
Bemutatásra kerülő kísérletek 2012.07.25. 1. lombik NOVA referencia Mérőlombik száma Beállított c glükóz [mm] Mért c glükóz [mm] 1 Nincs 8,0 2 10,0 11,0 3 15,0 15,3 4 20,0 22,3 5 30,0 32,3 6 40,0 36,4 7 50,0 47,2 2012.07.26. 2. lombik NOVA referencia DIA referencia Mérőlombik száma Beállított c glükóz [mm] Mért c glükóz [mm] Mért c glükóz [mm] 1 Nincs 9,6 10,1 2 15,0 16,3 16,2 3 20,0 20,9 21,4 4 30,0 31,6 32,3 5 40,0 37,8 43,2 6 50,0 47,2 54,2 Két lombik eltérő mennyiségű, de azonos minőségű táplálással. Különböző tenyésztési idők. Szaporítás végén glükóz-koncentráció beállítása a táblázatok szerint. Spektrumfelvétel és referencia mérések: Bruker Matrix-F fotométer, 11 988-4 297 cm -1, azaz 834,2-2 327,3 nm tartományban. INGOLD IN271P transzflexiós, bemerülő szonda, 2 mm-es optikai úthossz. NOVA StatStrip Xpress Meter és DIA-GM8 glükóz referenciák. 5
Értékeléshez használt számítógépes programok és matematikai előkezelések Programok: Unscrambler X 10.2 Microsoft Office Excel 2010 Matematika: Standard Normal Variate (SNV) Multiplicative Scatter Correction (MSC) Spektrumok első és második deriválása Savitzky Golay-algoritmussal 45 5 40 4 35 3 30 2 1 25 y 0 y' 20-1 15-2 10-3 5-4 0-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 2 40 1,5 35 1 30 0,5 25 y 20 0 y'' 15-0,5 10-1 5-1,5 0-2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 x (Az ábrák csak illusztrációk.) x 6
Mennyiségi kalibráció készítése és értékelése 7
3,5 3,5 2,5 2,5 A = log (1/T) A = log (1/T) Általános értékelés, spektrumok 1,5 1,5 0,5 0,5-0,5-0,5 830 1030 1230 1430 1630 1830 2030 830 2230 1030 1230 1630 1830 2030 2230 Hullámhossz [nm] Hullámhossz [nm] 120725. tenyészet 120726. tenyészet A = log (1/T) 0,62 0,61 0,6 0,59 0,58 0,57 0,56 0,55 0,54 0,53 0,52 A = log (1/T) 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 0,50 1640 1430 1660 1680 1700 1720 Hullámhossz [nm] 1740 1760 1640 1660 1680 1700 Hullámhossz [nm] 1720 1740 8
Szóráskorrekciókkal kapott legjobb eredményeket adó spektrumok kinagyítva 0,56 0,555 0,55-0,214-0,216-0,218 log(1/t) 0,545 0,54 0,535 0,53 SNV -0,22-0,222-0,224-0,226-0,228 0,525 1660 1670 1680 1690 1700-0,23 1670 1675 1680 1685 1690 1695 1700 Hullámhossz [nm] Hullámhossz [nm] 0,538 MSC log(1/t) 0,533 0,528 0,523 0,518 1680 1685 1690 1695 1700 Hullámhossz [nm] A spektrumban található két törés jelzi a glükóz jelenlétét. Ezekre alacsony hibával, jó illeszkedéssel készült kalibráció. 9
Első deriváltak és azok szóráskorrekciókkal kombináltjai A legjobb kalibrációs eredményeket szolgáltatták. Legpontosabb illeszkedés: R 2 = 0,998 Legkisebb hiba: RMSE = 1,3 mm 10
Második deriváltak és azok szóráskorrekciókkal kombináltjai Erős simító hatás figyelhető meg, de gyengébb kalibrációt eredményezett, mint az első deriváltak. 11
Egyesített spektrumok A tenyészetek spektrumainak összevonása, majd újabb kalibrációk készítése. A legjobban a szóráskorrekciókkal kezelt spektrumok teljesítettek. De így is elmaradtak a tenyészetenként különkülön készített kalibrációktól. R 2 = 0,993; RMSE = 2,4 mm 12
Független kereszt validálás 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 R 2 0,5 0,4 0,9878 0,4924 0,9026 0,9076 0,9454 0,9834 RMSEP [mm] SEP [mm] 30 25 20 15 17,97 27,73 PLS_25_S_D1_25 @ 26_S PLS_25_S_D1_25 @ 25&26_S PLS_26_MSC(a)_D1_21_N OVA @ 25_S PLS_26_MSC(a)_D1_21_N OVA @ 25&26_S PLS_25&26_MSC(f) @ 25_S PLS_25&26_MSC(f) @ 26_S 10 5 0 1,54 1,57 PLS_25_S _D1_25 @ 26_S PLS_25_S _D1_25 @ 25&26_S 6,10 5,44 PLS_26_M SC(a)_D1_ 21_NOVA @ 25_S 4,58 4,32 PLS_26_M SC(a)_D1_ 21_NOVA @ 2,20 2,25 PLS_25&2 6_MSC(f) @ 25_S 1,69 1,74 PLS_25&2 6_MSC(f) @ 26_S 10 8,98 8,18 8 6,28 A külön-külön készített kalibrációkból a legjobbakat kiválasztva készítettem a független validálásokat. RPD 6 4 2 0 0,77 2,26 3,02 Egy gyengébb predikció van, több ok miatt. PLS_25_S_D1_25 @ 26_S PLS_25_S_D1_25 @ 25&26_S PLS_26_MSC(a)_D1_21_N OVA @ 25_S PLS_26_MSC(a)_D1_21_N OVA @ 25&26_S PLS_25&26_MSC(f) @ 25_S PLS_25&26_MSC(f) @ 26_S 13
Eltérő predikciós képesség A = log (1/T) 0,595 0,585 0,575 0,565 0,555 0,545 0,535 0,525 1640 1660 hullámhossz 1680 (nm) 1700 1720 14
Összefoglalás, kitekintés Az FT-NIR alkalmas emlőssejt-tenyészetek glükóztartalmának vizsgálatára. A kísérleti rendszer további vizsgálati, kutatási munkát igényel a folyamatszabályozásba való átültetés előtt. Lehetőség van más anyagok (pl. egyéb kulcs metabolitok) vizsgálatára hasonló kísérleti rendszerben. 15
Köszönöm a megtisztelő figyelmüket!