Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék Kapilláris elektroforézis alkalmazása búzafehérjék érésdinamikai és fajtaazonosítási vizsgálataira c. PhD értekezés Készítette: Scholz Éva okleveles vegyész Témavezető: Prof. Salgó András Tanszékvezető egyetemi tanár Konzulens: Baranyáné Dr. Ganzler Katalin Osztályvezető Készítmény Fejlesztési Főosztály Fejlesztési Analitikai Osztály Richter Gedeon Rt. 2004
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS... 1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 2 2.1. KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS... 2 2.1.1. A kapilláris elektroforézis kialakulásának története... 2 2.1.2. A kapilláris elektroforézis elmélete... 3 2.1.3. A kapilláris elektroforézis készülékek általános felépítése... 8 2.1.4. A kapilláris elektroforézis módozatai... 10 2.1.4.1. Kapilláris zónaelektroforézis (CZE)... 10 2.1.4.2. Kapilláris gélelektroforézis (CGE)... 10 2.1.4.3. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC)... 13 2.1.4.4. Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF)... 13 2.1.4.5. Kapilláris izotachoforézis (CITP)... 14 2.1.4.6. Kapilláris elektrokromatográfia (CEC)... 14 2.2. A TARTALÉKFEHÉRJÉK JELENTŐSÉGE A BÚZA ÉRÉSE FOLYAMÁN ÉS A BÚZAFAJTÁK AZONOSÍTÁSÁBAN... 15 2.2.1. A búza és tartalékfehérjéi... 15 2.2.2. A búza tartalékfehérjéinek változásai az érés folyamán... 17 2.2.3. Búza fajtaazonosítás... 20 2.3. LISZTÉRZÉKENYSÉG ÉS A BM180 FEHÉRJE... 23 2.4. BÚZAFEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZISSEL... 25 2.4.1. Zónaelektroforézis... 25 2.4.1.1. Borát pufferrendszer... 25 2.4.1.2. Fordított töltésű rendszer... 25 2.4.1.3. Foszfát pufferrendszer... 26 2.4.1.4. Izoelektromos pufferrendszer... 29 2.4.2. Gélelektroforézis... 31 2.4.3. Alkalmazások... 33 3. CÉLKITŰZÉS... 37 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 38 4.1. ANYAGOK... 38 4.1.1. Vegyszerek, kapillárisok... 38 4.1.2. Búzaminták... 38 i
4.2. MINTAELŐKÉSZÍTÉS... 39 4.2.1. Osborne frakcionálás érésdinamikai vizsgálatokhoz... 39 4.2.2. Mintaelőkészítés búza fajtaazonosításhoz... 40 4.2.3. Molekulastandard gélelektroforézis vizsgálatokhoz... 40 4.2.4. BM180 fehérje kinyerése... 41 4.2.5. Búzaminta előkészítése a BM180 fehérjével való összehasonlító vizsgálathoz... 41 4.3. AKRILAMID-DEXTRÁN BEVONATÚ KAPILLÁRIS KÉSZÍTÉSE... 42 4.4. KAPILLÁRIS ELEKTROFORETIKUS MÓDSZEREK... 42 4.4.1. Érésdinamikai vizsgálatok a manuális készülékkel... 42 4.4.2. Érésdinamikai vizsgálatok és fajtaazonosítás az automata készülékkel.. 43 4.4.3. BM180 fehérje vizsgálata... 44 4.5. ALKALMAZOTT ÉRTÉKELŐ ÉS STATISZTIKAI MÓDSZEREK... 45 5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK... 46 5.1. A KAPILLÁRIS ELEKTROFORETIKUS MÓDSZERFEJLESZTÉSEK EREDMÉNYEI... 46 5.1.1. Gélelektroforézis... 46 5.1.2. Zónaelektroforézis... 51 5.2. BÚZA OSBORNE FÉLE FEHÉRJE FRAKCIÓINAK VIZSGÁLATA AZ ÉRÉSDINAMIKAI FOLYAMATOK SORÁN... 62 5.3. BÚZA FAJTAAZONOSÍTÁS KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZISSEL... 76 5.3.1. Fajtaazonosítási eredmények statisztikai kiértékelése... 76 5.3.2. Fajtaazonosítási eredmények kiértékelése a PQS (Polar Qualification System) program segítségével... 79 5.3.3. Fajtaazonosítási eredmények vizuális kiértékelése... 83 5.4. BM180 FEHÉRJE VIZSGÁLATA KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZISSEL... 94 5.4.1. Gélelektroforézis... 94 5.4.2. Zónaelektroforézis... 97 6. ÖSSZEFOGLALÁS... 101 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 105 8. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK... 106 9. IRODALOMJEGYZÉK... 109 FÜGGELÉK KÖZLEMÉNYEK ii
1. BEVEZETÉS Az elválasztástechnika jelentősége nem csupán a tudományos világban, de a mindennapokban is óriási, a tudományos eredmények gyakorlati alkalmazásai mindennapjaink szerves részét képezik. Az elválasztástechnikában régóta nagy szerepet játszó hagyományos elektroforézises és kromatográfiás elválasztások mellé az utóbbi néhány évtizedben felsorakozott a kapilláris elektroforézis is. Ez utóbbi módszer nem csak biopolimerek elválasztására alkalmazható, amire a hagyományos elektroforézist régóta használják, hanem egyéb területeken is, ahol elektroforézist eddig nem alkalmaztak. Egyre szélesebb körben elterjedt módszer az élelmiszeranalitika, kriminalisztika, klinikai kémia, biokémia, gyógyszeripar, idegtudomány, molekuláris biológia, orvosbiológia, környezetvédelem, stb. területén. Az élelmezés szempontjából kiemelkedő jelentőségű búza a világ egyik legértékesebb és legnagyobb területen termesztett gabonaféléje. Sok faja, fajtája és változata létezik, amelyek jó alkalmazkodóképességüknek köszönhetően tág éghajlati határok között terjedtek el, illetve termeszthetők. A búza felhasználhatósága igen sokrétű. Élelmiszeripari célokra elsősorban kenyérsütésre, illetve más sütő- és tésztaipari, puffasztásos, extrúziós termékek készítésére vagy alapanyagaként használják fel. A búza takarmány alapanyagként, illetve nem élelmezési célú alapanyagként vagy termékként való alkalmazása szintén elterjedt. A búza fehérje-összetételét régóta kutatják különféle elválasztástechnikai módszerekkel. A kapilláris elektroforézis e területen való alkalmazása olcsó, gyors elválasztásokat tesz lehetővé; illetve reményt ad a fehérjék finomszerkezetének kutatására, a fehérjék kölcsönhatásainak tisztázására. A finomszerkezet vizsgálata fontos információkat nyújt az érés során bekövetkező változásokról; illetve jól alkalmazható fehérje alapú fajtaazonosításra, ami a gabonavizsgálati területen általánosan felmerülő analitikai igény. Munkámmal a kapilláris elektroforetikus módszerek gabonakémiai területen való alkalmazásához kívántam hozzájárulni. 1
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS 2.1.1. A KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS KIALAKULÁSÁNAK TÖRTÉNETE Az elektroforézis területén az első nagy áttörés 1937-ben történt, amikor a svéd Tiselius i [1] az ún. mozgó határfelületek módszerével a mintakomponensek részleges elválasztását érte el. Módszerének továbbfejlesztése volt a hordozóanyagot alkalmazó kötött-, vagy zónatechnika: a papír- (a hordozó szűrőpapír), a vékonyréteg- (a hordozó szilika, cellulóz, cellulóz-acetát), ill. a gélelektroforézis (a hordozó agaróz, keményítő, poliakrilamid). A gélelektroforézis poliakrilamiddal végzett formája, a PAGE ii (poliakrilamid gélelektroforézis), illetve a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) a mai napig széles körben használt elektroforetikus módszer. A hordozóanyag nélküli elválasztásra irányuló további kísérletek vezettek végső soron a kapilláris elektroforézis kifejlődéséhez. 1967-ben Hjertén [2] 1-3 mm-es belső átmérőjű csőben végzett elektroforézist. 1974-ben Virtanen iii [3], majd később Mikkers és munkatársai [4] alkalmaztak kisebb (200-500µm) belső átmérőjű kapillárisokat. Az igazi áttörés 1981-ben történt, amikor Jorgenson és Lukacs [5] tovább csökkentette a kapilláris belső átmérőjét, és leírta a kapilláris elektroforézis elméleti alapjait [5, 6]. A módszernek csakhamar különböző módozatai is megjelentek. 1983-ban Hjertén [7] adaptálta a nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid-gélelektroforézist kapilláris elektroforézis körülményeire. A hidrofób molekulák elválasztására 1984-ben kidolgozott micelláris elektrokinetikus kromatográfia Terabe [8] nevéhez fűződik. A kapilláris izoelektromos fókuszálást Hjertén és Zhu vezette be 1985-ben [9]. A kapilláris elektrokromatográfia a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) tölteteit alkalmazza, és egyesíti a két módszer előnyeit [10]. A kapilláris elektroforézis különböző módozatainak további fejlesztése azóta is tart, és az egyes módozatok alkalmazási területei is egyre bővülnek. i http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1948/tiselius-bio.html ii A dolgozatban szereplő rövidítések jegyzéke a 8. fejezetben található iii http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1945/virtanen-bio.html 2
2.1.2. A KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS ELMÉLETE A kapilláris elektroforézissel és elméletével kézikönyvek és cikkek foglalkoznak részletesen [10, 11, 12, 13, 14, 15], ezért jelen fejezet csak a fontosabb alapfogalmak összefoglalását tartalmazza. Kapilláris elektroforézis során az elválasztás a kapillárisban lévő háttérelektrolitban megy végbe, az elválasztás a mintakomponensek eltérő vándorlási sebességén (v [m s -1 ]) -vagyis különböző töltés/tömeg arányukon- alapul. A vándorlási sebesség egyenesen arányos az elektroforetikus mozgékonysággal (µ e [m 2 V -1 s -1 ]) és az elektromos térerősséggel (E [V m -1 ]): v = µ e E = µ e (U / L) (2-1) ahol U [V] az alkalmazott feszültség, L [m] a kapilláris teljes hossza Az elektroforetikus mozgékonyság (mobilitás) egyenesen arányos a részecske töltésével (q [C]), és fordítottan arányos a részecske hidrodinamikai sugarával (r [m]), és a közeg viszkozitásával (η [Pa s]): µ e = q / 6πηr (2-2) A kapilláris rendkívül kis átmérőjének (20-100 µm) következtében megnő a felület/térfogat arány, ami a felületi jelenségek előtérbe kerülését okozza. A nagy felület jó hőelvezetést biztosít, így nagy feszültség alkalmazható. Ez lecsökkenti az analízis idejét, csökken a csúcsszélesedés mértéke és nő az elméleti tányérszám. A módszer hatékonysága szempontjából alapvető az is, hogy a kis átmérő következtében az elektroozmotikus áramlás során a kapillárisban levő folyadékoszlop dugószerűen mozdul el, ami jelentős mértékben hozzájárul a nagy elméleti tányérszám eléréséhez. A töltött felületen adszorbeálódó ellenionok elektromos kettősréteget hoznak létre, ami az ún. zétapotenciál (ξ [V]) kialakulásához vezet. Egyenfeszültség hatására a diffúz kettősréteg elmozdul, ez az elektroozmotikus áramlás (EOF) (1. ábra). A régóta ismert jelenséget Jorgenson és Lukacs [5, 6] használta ki először a hidrodinamikaihoz képest kedvezőbb áramlási profil létrehozásához, hiszen kis belső átmérő esetén a 3
hidratált ellenionok elmozdulása az összoldószer dugószerű elmozdulását eredményezi (2. ábra). Kvarc kapilláris esetén a szilanolcsoportok (Si-OH) disszociációja negatív felületet eredményez, az EOF tehát a katód ( ) felé irányul. Az EOF nagysága függ az elektromos térerősségtől, a hőmérséklettől, a puffer összetételétől, viszkozitásától, ionerősségétől, ph-jától. (A ph-függés jellegét a 3. ábra mutatja) v EOF 1. ábra ELEKTROOZMOTIKUS ÁRAMLÁS (EOF) A B 2. ábra KAPILLÁRIS ELEKTROFORETIKUS (A) ÉS KROMATOGRÁFIÁS (B) ÁRAMLÁSI PROFIL EOF mobilitás [10-3 cm 2 /Vs] ph 3. ábra AZ ELEKTROOZMOTIKUS ÁRAMLÁS PH-FÜGGÉSÉNEK JELLEGE KVARC KAPILLÁRIS ESETÉN 4
Az elektroozmotikus áramlás sebessége a következőképpen írható fel: v EOF = εξe / 4πη= µ EOF E [m s -1 ] (2-3) ahol ε [F m -1 ] az oldat dielektromos állandója, ξ [V] a kapillárisfal zétapotenciálja és η [Pa s] az oldat viszkozitása Az elektroozmotikus áramlást befolyásolhatjuk a térerősség, a ph, az ionerősség, a hőmérséklet változtatásával, szerves oldószer vagy szerves módosítók alkalmazásával. Elvégezhetjük a fal kémiai módosítását, használhatunk polietilén vagy teflon kapillárist. Mivel az EOF nagysága kb. egy nagyságrenddel nagyobb, mint a legtöbb ion elektroforetikus mozgékonysága, ezért minden részecske az ozmotikus áramlásnak megfelelő irányba halad. Az elektroozmotikus áramlást is figyelembe vevő látszólagos (apparent) mozgékonyság (µ a [m 2 V -1 s -1 ]) tehát a részecske elektroforetikus mozgékonyságának és az elektroozmotikus áramlásnak a vektori eredője: µ a = µ e + µ EOF (2-4) Az elektroforetikus mozgékonyság az elektroferogram adataiból a következő egyenlet alapján számítható: µ ai = l L / t i U (2-5) ahol t i [s] és µ ai az adott komponens migrációs ideje és látszólagos mozgékonysága, U [V] az alkalmazott feszültség, L [m] a kapilláris teljes hossza, l [m] pedig a detektorig mért kapillárishossz Egy elválasztó rendszer hatékonyságát az elérhető elméleti tányérok N számával fejezhetjük ki: N = µ e U l / 2DL = µ e E l / 2D (2-6) ahol µ e [m 2 V -1 s -1 ] a részecske elektroforetikus mozgékonysága, U [V] az alkalmazott feszültség, l [m] a detektorig mért kapillárishossz, D [m 2 s -1 ] a részecske diffúziós együtthatója, L [m] a kapilláris teljes hossza, E [V m -1 ] az elektromos térerősség Ha a detektor a kapilláris végén helyezkedik el (l L), akkor a hatékonyság az alkalmazott feszültség függvénye. A feszültség emelésének viszont határt szab a termelődő Joule hő. Az egyenletből látható, hogy a kis diffúziós együtthatóval rendelkező biomolekulák elválasztása esetén nagyobb elméleti tányérszámok érhetők el. 5
Az elektroferogram alapján kísérletileg meghatározható elméleti tányérszám: N = 16 (t/w) 2 (2-7) N = 5,54 (t / w 1/2 ) 2 (2-8) ahol t [s] az adott komponens migrációs ideje, w [s] az alapvonalon, w 1/2 [s] pedig a jel félmagasságában mért csúcsszélesség Kapilláris elektroforézisnél N értéke általában 10 5-10 6, szemben a HPLC-nél megszokott 10 3-10 4 -nel. Az elválasztóképesség vagy felbontás (R) az elektroferogramról leolvasható adatokkal, illetve a mozgékonyságokkal a következőképpen írható fel: R = 2 t/ w 1/2 = t /4σ (2-9) R = (¼) N ½ ( µ / µ) (2-10) ahol σ [s] a csúcs standard deviációja (szórása): a csúcs inflexiós pontjánál vett szélesség fele, µ a két komponens elektroforetikus mozgékonyságának különbsége, µ pedig az átlaga Elektroozmózis jelenlétében R = (¼) N ½ ( µ / µ+µ EOF ) (2-11) Két komponens elválasztásában tehát µ és µ EOF viszonya is szerepet játszik. Ha µ és µ EOF azonos irányú, akkor R kisebb, mint ha ellentétes irányú. EOF növelésével az elválasztás gyorsabb lesz, a csúcsok élesebbek, viszont a csúcsfelbontás csökken. A zónaszélesedés (diszperzió) -ami az elméleti tányérszámmal jellemezhető- a kromatográfiához képest kedvezően alakul, mert a dugószerű áramlás miatt csak a hosszirányú diffúzióval kell számolni. A (2-6) egyenletből következően minél kisebb egy molekula diffúziós együtthatója, annál nagyobb lehet az elért elméleti tányérszám. Ezért különösen alkalmas a módszer biopolimerek elválasztására, hiszen ezeknek kicsi -növekvő molekulamérettel csökkenő- diffúziós együtthatójuk van. DNS molekulákkal még nagyobb elméleti tányérszámok érhetők el, mint fehérjékkel. A zónaszélesedéshez a hosszirányú diffúzión kívül hozzájárulnak termikus, elektrodiszperziós és adszorpciós hatások. 6
A feszültség hatására átfolyó áram a kapillárisban hőmérsékletgradienst, és így viszkozitásgradienst hoz létre. E hatás minimális értéken tartására kis átmérőjű kapillárist, kis vezetőképességű puffert (ikerionos vegyületek alkalmazása előnyös) és kis térerőt kell alkalmazni, és gondoskodni kell a kapilláris megfelelő hűtéséről. Állandó feszültséggel történő elválasztás esetén az áramerősség változása jól használható a hőelvezetés hatékonyságának nyomon követésére, mert értéke az elválasztás elején egy egyensúlyi állapot és egy állandó hőmérsékletgradiens kialakulásáig emelkedik, majd jó hőelvezetés esetén állandó értéken marad. Elégtelen hőelvezetés esetén a pufferoldat hőmérséklete és az áramerősség folyamatosan növekszik [15]. A puffer és a mintakomponensek vezetőképessége közötti nagy különbség a csúcsok torzulásához vezet. Teljesen szimmetrikus csúcsot csak a puffer és a mintakomponensek azonos vezetőképessége esetén kaphatunk. Ez határt szab a puffer vezetőképessége csökkentésének. A kapilláris falára történő adszorpciót, amely leginkább fehérjeminták vizsgálatakor lép fel, meg kell akadályozni, mert nem csupán anyagveszteséget okoz, de az EOF lokális megváltoztatásán keresztül a mérés reprodukálhatatlanságához vezet. (A mintaadszorpció ellen védekezhetünk extrém ph-n (ph<3, ph>9) végzett elválasztással, adalékanyagok alkalmazásával (sóvegyületek, aminok, poliaminok, semleges polimerek), vagy a kapilláris falának kovalens módosításával. Míg a polimerek alkalmazásával elért dinamikus kapilláris bevonat könnyen kivitelezhető, addig a kovalensen módosított belső felületű kapillárisok érzékenyebbek, élettartamuk rövidebb, de az elektroozmotikus áramlás kiküszöbölésére hatékonyabban alkalmazhatók. Egyes dinamikus módosítók idővel kovalens kötést létesítenek a kapillárisfallal [16]. Mindezen módszerek ellenére elmondható, hogy a fehérjék kapillárisfalra történő adszorpcióját csökkenteni lehet, de egyelőre teljesen kiküszöbölni nem [17]. ) 7
2.1.3. A KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS KÉSZÜLÉKEK ÁLTALÁNOS FELÉPÍTÉSE Fényforrás Anód Katód Puffer Puffer Fotoreceptor Számítógép HV 4. ábra KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS KÉSZÜLÉK SEMATIKUS FELÉPÍTÉSE Kapilláris. Fontos a kémiai és elektromos inertség, az UV áteresztő képesség, a hajlékonyság és a fizikai stabilitás. Leginkább a poliimid réteggel bevont kvarc kapilláris terjedt el, bár lehet polietilén vagy teflon anyagú is. A kapilláris belső átmérője 10-100 µm. Mintafelvitel. Történhet hidrodinamikusan (nyomáskülönbség hatására) vagy elektrokinetikusan (elektromos áram hatására). Az injektált mintatérfogat általában 1-50 nl. Termosztálás. Automata készülékek esetén a kapilláristér legtöbbször Peltier elemmel szabályozott lég-, vagy folyadékhűtéses. Tápegység. Az alkalmazott egyenfeszültség általában 10-30 kv. (Jóval nagyobb feszültség esetén speciális elektromos árnyékolásra van szükség [18].) Az áramerősség maximuma 200-300 µa. Legáltalánosabb az állandó feszültségen való elválasztás, de nem megfelelő hőmérséklet kontroll esetén előnyös lehet az állandó áramerősség alkalmazása. Automata készülékeknél lehetőség van a feszültség lépcsőzetes vagy gradiens-szerű változtatására is. Detektálás. Leginkább az UV/VIS és a lézerrel indukált fluoreszcencia (LIF) detektálás terjedt el, bár a legtöbb detektálási módszer alkalmazhatósága technikailag 8
megoldott. Néhány detektálási mód jellemzője az 1. táblázatban szerepel [13]. A CE tömegérzékenysége igen jó, de koncentrációérzékenysége csak közepes. A mennyiségi meghatározások sajátos problémákat vetnek fel kapilláris elektroforézis esetén [14]. Csúcsmagasság alapján kis koncentrációk esetén szabad kiértékelni, csúcsterület alapján végzett kiértékelésnél pedig korrekcióra van szükség (pl. vándorlási idővel osztott görbe alatti terület), mivel minden komponens sebessége más és más. A detektálás érzékenysége növelhető származékképzéssel [19]; on-line prekoncentrálással [11, 20]; elektromos erősítéssel, zajszűréssel; megnövelt fényúttal rendelkező cella alkalmazásával. Frakciószedés. A kapilláris kimeneti vége alatt egy hordozót elmozgatva [21], egy figyelő rendszer segítségével új pufferedénybe léptetéssel, vagy a minta nagyon kis térfogatba összegyűjtésével oldható meg [10]. 1. táblázat CE ESETÉN ÁLTALÁNOSAN ALKALMAZOTT DETEKTÁLÁSI MÓDOK KIMUTATÁSI HATÁR MÓDSZER mol (mol/dm 3 ) (10nl-es mintatérfogat esetén) UV/látható elnyelés ELŐNYÖK/HÁTRÁNYOK 10-13 -10-16 10-5 -10-8 univerzális a diódasoros detektálás spektrális információkat is nyújthat fluoreszcencia 10-15 -10-17 10-7 -10-9 érzékeny általában származékképzésre van szükség lézer-indukált fluoreszcencia 10-18 -10-20 10-14 -10-16 nagyon érzékeny általában származékképzésre van szükség drága amperometria 10-18 -10-19 10-10 -10-11 érzékeny szelektív, de csak elektroaktív molekulákra alkalmazható speciális elektronikai egység és módosított kapilláris szükséges vezetőképességmérés tömegspektrometria indirekt UV, fluoreszcencia, amperometria 10-15 -10-16 10-7 -10-8 univerzális speciális elektronikai egység és módosított kapilláris szükséges 10-16 -10-17 10-8 -10-9 érzékeny szerkezeti információkat nyújt nem vizes közeg esetén előnyös [22] 10-100x kisebb, mint a direkt módszeré főleg szervetlen ionok kisebb érzékenység, mint a direkt módszereknél 9
2.1.4. A KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS MÓDOZATAI A kapilláris elektroforézisnek különböző módozatai léteznek, melyek összefoglaló jellemzése a 2. táblázatban található. A kapilláris elektrokromatográfia szorosan véve nem tartozik a kapilláris elektroforetikus módszerek közé, mivel a folyadék kromatográfia és a kapilláris elektroforézis ötvözeteként jött létre. Mivel a két technika azonos műszerezettséget alkalmaz, talán mégis hasznos az elektrokromatográfia vázlatos ismertetése jelen fejezet végén, a 2.1.4.6. alfejezetben. 2.1.4.1. KAPILLÁRIS ZÓNAELEKTROFORÉZIS (CZE) A kapilláris zónaelektroforézis módszerének pontosabb megnevezése lenne a szabad oldatos kapilláris elektroforézis, hiszen nem ez az egyetlen módozat, ahol az elválasztás a zónaelektroforézis elvén alapszik. Az irodalomban ennek ellenére mégis leginkább ez az elnevezés terjedt el, ezért dolgozatomban én is ezt használom. A kapilláris zónaelektroforézis elméleti alapjait a 2.1.2. fejezet foglalja össze. Az elválasztás alapja a töltés/tömeg arány különbözősége. Ebből adódóan hátránya, hogy a semleges, illetve azonos fajlagos töltéssel bíró (pl. DNS) molekulák egymástól nem választhatók el. Kvarc kapillárisban az elválasztott molekulák sorrendje: kationok, semleges molekulák, anionok. Az elválasztáshoz leggyakrabban foszfát, borát, citrát puffert alkalmaznak. Fontos a puffer kis UV-elnyelése és kis mozgékonysága (nagy méret, kis töltés). Biológiai pufferek (pl. Trisz, CAPS, stb.) alkalmazása előnyös, mert kicsi a Joule-hő fejlődés, de hátrányuk, hogy jelentős UV-elnyelésük van. A CZE adalékanyagok [23] alkalmazásával igen sokoldalúvá tehető. A kapilláris elektroforézis esetén általánosan használt adalékanyagokat és hatásukat a 3. táblázat foglalja össze [11, 12]. 2.1.4.2. KAPILLÁRIS GÉLELEKTROFORÉZIS (CGE) A gélelektroforézis is a zónaelektroforézis elvén alapul, de az elválasztás egy molekulaszűrő hatással rendelkező gélben vagy polimer oldatban megy végbe. Az elválasztást befolyásolja a molekula mérete, töltése, alakja. Az elektroozmotikus áramlás kiküszöbölendő, ezért általában kovalensen módosított belső felületű kapillárisok használatára van szükség. 10
2. táblázat A KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS KÜLÖNBÖZŐ MÓDOZATAI ÉS AZOK FŐBB JELLEMZŐI Kapilláris zónaelektroforézis (CZE) Elválasztás alapja töltés/tömeg arány Elválasztó közeg vizes puffer (pl. foszfát, borát, citrát) Kapilláris gélelektroforézis (CGE) töltés, molekulatömeg, alak; SDS-CGE esetén a molekulatömeg kémiai gél (pl. térhálós poliakrilamid, agaróz); fizikai gél (pl. lineáris poliakrilamid, dextrán, metil-cellulóz, polietilén-glikol, hidroxipropil-metilcellulóz) Kapilláris kvarc kvarc vagy kémiailag módosított kapillárisfal (pl. poliakrilamid bevonat) Alkalmazási területek töltéssel rendelkező molekulák fehérjék, oligo- és polinukleotidok Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC) hidrofób tulajdonságok (két fázis közti megoszlás) micellákat tartalmazó pufferoldat kvarc elsősorban semleges kismolekulák Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) izoelektromos pont amfolit hordozók segítségével létrehozott phgradiens kémiailag módosított kapillárisfal vagy dinamikus módosítók alkalmazása fehérjék és peptidek Kapilláris izotachoforézis (CITP) mozgékonyság heterogén pufferrendszer kémiailag módosított kapillárisfal anionok, kationok Kapilláris elektrokromatográfia (CEC) megoszlás és ionos tulajdonságok kromatográfiás állófázist tartalmazó puffer kvarc semleges molekulák 11
3. táblázat ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT ADALÉKANYAGOK KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS ESETÉN ADALÉKANYAG PÉLDA ALKALMAZÁS CÉLJA Felületaktív SDS, CTAB, EOF módosítása anyagok (anionos, Brij, Tween kationos: a kapillárisfal töltését befolyásolja kationos vagy hidrofób anyagok oldatba vitele semleges) ionpárképzés Ikerionos vegyületek Lineáris hidrofil polimerek Szerves módosítók Királis szelektorok MES, TRIS, CAPS Metil-cellulóz, poliakrilamid, polietilénglikol metanol, acetonitril, TFA ciklodextrinek, koronaéterek, epesavak MEKC a c CMC felett Ionerősség növelése a vezetőképesség növelése nélkül Fehérjéknél megváltoztatja a szelektivitást EOF csökkentése minta adszorpció csökkentése (kis koncentrációban) CGE (nagy koncentrációban) EOF megváltoztatása (általában csökken) oldhatóságot növelheti MEKC és királis elválasztás esetén megváltoztatja a szelektivitást királis elválasztás hidrofób anyagok oldatba vitele Fémionok K +, Na +, Cu 2+, Li + MEKC és CGE esetén megváltoztatja a szelektivitást csökkenti az adszorpciót Hidrogénkötést létesítő / Oldódást segítő anyagok Komplexképző pufferek Aminok Urea szétbontja a dupla szálú DNS-t CGE-nél oldatba viszi a fehérjéket megváltoztatja a szelektivitást MEKC esetén borát szénhidrát elválasztás trietilamin, lefedi a szabad szilanolcsoportokat trietanolamin Kvaterner aminok diaminopropán ionpárképzés EOF megfordítása Szervetlen só fehérje konformációja változik Ionpárképző szulfonsav ionpárképzés A kis kapilláris-átmérő előnye, hogy kapillárisban lineáris polimerekkel is lehet elválasztást véghezvinni. Fontos a gél hőmérséklet stabilitása, a megfelelő pórusméret és az UV-átlátszóság. A gél (vagy helyesebben polimer hálózat ) lehet kovalensen keresztkötött (pl. térhálós poliakrilamid), hidrogén kötéseket tartalmazó (pl. agaróz); vagy molekulaszűrő hatással rendelkező lineáris polimer (pl. lineáris akrilamid, dextrán, metilcellulóz, polietilénglikol, hidroxipropil-metil-cellulóz) [12]. 12
2.1.4.3. MICELLÁRIS ELEKTROKINETIKUS KROMATOGRÁFIA (MEKC) A Terabe [8] nevéhez fűződő micelláris elektrokinetikus kromatográfia a hidrofób tulajdonságok különbözőségén alapszik, így alkalmas semleges molekulák vizsgálatára is. A módszer lényege, hogy a detergensmolekulák a kritikus micellaképződési koncentrációjuknál (c CMC ) töményebb oldatban micellákat képeznek. Az elválasztás alapja a vizes oldat és a micella belseje között létrejövő megoszlás. Töltött micellával az ionos mintakomponensek ionpárt is képezhetnek. Vízben nem oldódó anyagok elválasztására alkalmazható a mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfia (MEEKC) [24, 25]. Ekkor az apró olajcseppek és a vizes pufferoldat között jön létre a megoszlás. Minőség szerint megkülönböztetünk anionos (pl. nátrium-dodecilszulfát, SDS), kationos (pl. cetil-trimetil-ammónium-bromid, CTAB), ikerionos és nemionos detergenseket. Kationos detergens alkalmazásakor az EOF iránya megváltozik. A MEKC elsősorban kismolekulák elválasztására alkalmas, de fehérjék is kapcsolatba léphetnek a micellákkal hidrofób, ionos vagy elektrosztatikus kölcsönhatásokon keresztül [26]. A szelektivitást befolyásolhatjuk a hőmérséklet változtatásával, a megfelelő detergensek kiválasztásával (epesav-micella, keverék micella [27]), vagy adalékanyagok (ciklodextrinek, ionpárképzők, urea, szerves oldószerek, fémsók, királis molekulák) alkalmazásával. 2.1.4.4. KAPILLÁRIS IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS (CIEF) A kapilláris izoelektromos fókuszálást leginkább fehérjék és peptidek elválasztására használják [28]. Az elválasztás amfolit hordozók (ikerionos, poliamino-polikarbonsav típusú vegyületek keverékei) segítségével létrehozott ph-gradiensben megy végbe. Itt a molekulák addig vándorolnak, amíg el nem érik az izoelektromos pontjuknak (pi) megfelelő ph értéket, ahol össz-töltésük nulla. Az amfolit elnyelése miatt az UV detektálás 280 nm-nél történik. Az elektroozmotikus áramlás a ph-gradienst torzítja, ezért azt a kapillárisfal kémiai módosításával vagy dinamikus módosítók segítségével ki kell küszöbölni. Az izoelektromos ponton a fehérjék oldatban tartására glicerin, karbamid, detergensek, cukrok, ikerionos vegyületek, vagy ezek keveréke használható [29]. A fókuszált sávokat mobilizálhatjuk elektroforetikusan, hidrodinamikusan, vagy alkalmazhatunk dinamikus mobilizálást. 13
2.1.4.5. KAPILLÁRIS IZOTACHOFORÉZIS (CITP) Az izotachoforézis sem igényel elektroozmotikus áramlást, a pufferrendszer heterogén, az elválasztás a kiszorításos elektroforézis elvén alapul. Anionok és kationok (nem egyidejű) vizsgálatára alkalmas. Anionok elválasztása esetén az anódpuffer egy gyorsan mozgó, a katódpuffer egy lassan mozgó aniont tartalmaz, a minta mozgékonysága pedig a kettő közötti érték, a kation ilyenkor azonos. Az egyensúly beállta után kialakuló ion-vonatban (Kohlrausch nyomán) a mintakomponensek tiszta zónákban, mozgékonyságuk sorrendjében helyezkednek el. A zónák érintkeznek, minden zóna azonos sebességgel halad, és a zónában a potenciálesés a mozgékonyságtól függ. A mintakomponens mennyiségére tehát nem a zóna koncentrációja, hanem a hossza jellemző. A módszer jól használható a fő komponens mellett nyomnyi mennyiségben jelenlevő szennyező kimutatására, vagy CZE előtti minta-bekoncentrálásra. Leggyakoribb detektálási módok a vezetőképesség mérés vagy az UV detektálás. 2.1.4.6. KAPILLÁRIS ELEKTROKROMATOGRÁFIA (CEC) A kapilláris elektrokromatográfia a kapilláris elektroforézis és a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia ötvözeteként jött létre: a puffert tartalmazó kapilláris megfelelő szemcseméretű kromatográfiás állófázissal töltött [30, 31]. A folyadékot a kapillárisban nem a nyomás, hanem az elektroozmotikus áramlás tartja mozgásban, ezért igen kis szemcseméretű (3 mikron vagy az alatti) állófázis alkalmazható. Mivel az áramlás hajtóereje az elektroozmózis, az áramlási profil dugószerű (bár a részecskék miatt nem teljesen egyenes), így igen jó elválasztás érhető el nagy elméleti tányérszámmal, és a módszer rendkívül szelektívvé tehető a sokféle kromatográfiás állófázisnak köszönhetően. Az elválasztás kevert mechanizmusú, hiszen megoszlás jön létre az állófázis és a mozgó fázis (a puffer) között, ugyanakkor elektroforézis is történik. Az elektroozmotikus áramlás a szemcsék között lép fel, a szemcsékben nem. A puffer ph-ja általában magas, hogy gyors legyen az elektroozmotikus áramlás, és szerves oldószert is tartalmaz, ami segíti a nem vízoldható minták analízisét. 14
2.2. A TARTALÉKFEHÉRJÉK JELENTŐSÉGE A BÚZA ÉRÉSE FOLYAMÁN ÉS A BÚZAFAJTÁK AZONOSÍTÁSÁBAN Az élelmiszerekben előforduló fehérjék szerepének fontosságát nem szükséges hangsúlyozni. Jelentőségük részletezése meghaladja a disszertáció kereteit, ezért jelen fejezetben csak a kísérleti munkámhoz közvetlenül kapcsolódó területről ejtenék szót: az emberi táplálkozásban jelentős szerepet játszó egyik gabonaféle, a búza fehérjéiről, éréséről és fajtáinak azonosításáról. 2.2.1. A BÚZA ÉS TARTALÉKFEHÉRJÉI A búza a pázsitfűfélék /Poaceae/ családjába és a búzanemzetségbe /Triticum/ tartozó lágyszárú növény. A legfontosabb és legelterjedtebb búzafaj a világon a közönséges búza /Triticum aestivum L./. A minősített búzafajták az érési idő alapján korai, közép- és középkésői érésű csoportokba sorolhatók. A búza termése egymagvú szemtermés. A szem három fő része a héj, az albumen és a csíra (embrió). Az albumen külső része a hialinréteg, belső része az endoszperm szövet. Az endoszperm külső, vékony szövete az aleuronréteg, belső, fő tömege pedig a liszttest vagy keményítős szövet, amely a tartalékfehérjék nagy részét tartalmazza [32]. A 5. ábra A BÚZASZEM SZERKEZETE [32] búzaszem szerkezete az 5. ábrán látható. A búzaszem fehérjéit több szempont szerint csoportosíthatjuk. Biokémiai szempontból funkcionális (enzimek, membránfehérjék, riboszomális-, szabályozó- és védő fehérjék) és tartalék fehérjéket különböztethetünk meg. Morfológiailag csíra-, aleuron- és endoszperm fehérjékről beszélhetünk. Az Osborne féle oldhatóság szerint [33] vízoldható albuminok, sóoldható globulinok, alkohololdható gliadinok, sav-, illetve lúgoldható gluteninek és ezen oldószerekben oldhatatlan maradék fehérjék alkotják együtt a búza fehérjéit [34]. Az aminosav szekvencia, illetve annak ismétlődő és nem ismétlődő szakaszai alapján -Shewry szerint [35, 36, 37, 38]- a búzafehérjéket kénben szegény, kénben gazdag és nagy molekulatömegű prolaminokra oszthatjuk. 15
A biokémiai és az oldhatóság szerinti csoportosítás nem azonos fehérje csoportokat eredményez, bár a gliadinok és a gluteninek nagyrészt megfeleltethetők a tartalék fehérjéknek, a többi fehérje pedig a funkcionális fehérjéknek; és az Osborne frakcionálás nem veszi figyelembe az összetett fehérjéket, bár a lipo- és glikoproteinek nagyon fontos szerepet játszanak a sütőipari termékek tulajdonságainak kialakításában. Mindezen hátrányok ellenére az Osborne frakcionálás, és annak változatai széles körben elterjedtek. Adott frakció fehérje-összetételét mivel az egyes Osborne frakciók között átfedés van [39] leginkább a frakcionálás lépéseivel lehet definiálni. A búza endoszperm tartalék fehérjéiből képződik a megfelelő minőségű sütőipari termékek kialakulásában olyan fontos szerepet játszó sikér. A sikérkomplexet alkotó glutén fehérjék kétféle molekulatípusba sorolhatók. A gliadinok kis molekulatömegű (M W = 10 4-10 5 Da), egy polipeptidláncból felépülő -monomer jellegű- globuláris molekulák, amelyeket intramolekuláris diszulfidkötések tartanak össze. Kevés hélixes és több rendezetlen szakaszt tartalmaznak. A láncok hidrogénkötéseken és hidrofób kölcsönhatásokon keresztül kapcsolódnak össze. A gliadinkomponenseket csökkenő elektroforézises mozgékonyságuk sorrendjében α, β, γ, és ω frakciókra osztják. A gluteninek nagy molekulatömegű (M W = 10 4-10 7 Da), több polipeptidláncból felépülő -polimer jellegű- lineáris molekulák, a láncokat intermolekuláris diszulfidkötések tartják össze. Megkülönböztetnek kis molekulatömegű (LMW) és nagy molekulatömegű (HMW) glutenineket. A nagy méretű gluteninmolekulák vízben nem oldhatók, aminek fontos szerepe lehet csírázáskor a tartalékfehérje-felhasználás szabályozásában [40]. Míg a gliadinok és gluteninek fehérjéinek aminosav összetételére egyaránt jellemző, hogy nagy a glutaminsav (glutamin)- és prolintartalmuk, kicsi a lizin-, treonin- és jelentős a cisztein- és cisztintartalmuk, addig a glutenineknél a bázikus aminosavak nagyobb részaránya, a gliadinoknál pedig nagyobb prolin, leucin, izoleucin és fenilalanin tartalom figyelhető meg [34]. A Shewry féle felosztás kénben szegény prolaminjai monomerekből állnak, és az ω-gliadinoknak; HMW prolaminjai polimerekből állnak, és a HMW glutenineknek felelnek meg. A kénben gazdag prolaminok monomer és polimer fehérjéket egyaránt tartalmaznak, és az α-, β-, γ- gliadinok, illetve az LMW gluteninek tartoznak közéjük [35]. N-terminálisuk prolinban és glutaminban gazdag ismétlődő szakaszokból áll, a C-terminálisuk pedig nem ismétlődő, de szinte az összes ciszteint tartalmazza [36]. 16
6. ábra A GLUTÉN SZERKEZETI MODELLJE [37] A glutén szerkezetében (6. ábra) a HMW glutenin alegységek alkotják a szerkezet rugalmas gerincét: pálcika alakúak; a pálca két vége (az N- és C-terminális) gombolyag alakú, α-hélix és rendezetlen szerkezetű részek építik fel; a szára pedig hosszú, elnyújtott formájú, ami β-spirál szerkezetből áll [37]. A HMW gluteninek a terminális régióknál diszulfidkötésekkel kapcsolódnak össze, és így kapcsolódnak hozzájuk az LMW glutenin alegységek is, a váz elágazásai. A gliadinmolekulák nem kovalens kötésekkel kapcsolódnak a HMW-gluteninek szárához, és így elsősorban a viszkozitást befolyásolják. A glutenin alegységek közötti nem kovalens kötések (elsősorban a hidrogén-kötések) fontos szerepet játszanak a rugalmasság kialakításában [37]. 2.2.2. A BÚZA TARTALÉKFEHÉRJÉINEK VÁLTOZÁSAI AZ ÉRÉS FOLYAMÁN A búzalisztből készülő sütőipari termékek minőségét alapvetően a sikérfehérjék mennyisége és minősége szabja meg, e paraméterek ismerete tehát nélkülözhetetlen az adott sütőipari terméknek leginkább megfelelő lisztminőség kiválasztásához. Az érés során a sikérfehérjék minőségében és mennyiségében bekövetkező változások vizsgálata ezért fontos mind a legkedvezőbb aratási idő meghatározásához, mind a környezeti tényezőktől kevésbé függő fajták kiválasztásához. Az alábbiakban az irodalomban a búza tartalékfehérjéinek az érés folyamán bekövetkező változásaival kapcsolatban fellelhető -egymásnak néha ellentmondani látszó- eredményeinek rövid összefoglalását ismertetem. A víz- és sóoldható frakciók mennyisége az érés során -a tartalékfehérjékkel ellentétben- csökken [41, 42, 43, 44], majd állandósul [45]; a HMW-albuminok diszulfid-híd kötő képességük révén [46] beépülnek a tartalékfehérjék polimerláncába [47]. 17
A gliadinok korán -kb. a virágzás után 2 héttel [42]- jelennek meg, majd mennyiségük folyamatosan nő [41, 42, 43, 44]. Körülbelül a virágzás utáni 3 hét alatt történik a legtöbb változás [45], később már nincs minőségi változás, csak a mennyiség és az összetevők aránya változik [48]. Kénhiányos körülmények esetén a gliadin mennyiségének növekedését tapasztalták [49]. Az egyes gliadin komponensek megjelenési sorrendjét tekintve RP-HPLC-vel az ω-gliadinokat detektálták először, és a γ- gliadinokat utoljára [50]. Monoklonális antitesttel vizsgálva az érés folyamatát, ennek pont az ellenkezőjét tapasztalták: a γ-gliadinok előbb jelentek meg, mint az ω-gliadinok [49]. A gluteninek mennyisége is nő az érés során [41, 42, 44], de a felhalmozódás dinamikája tekintetében már kevésbé egybehangzóak az egyes szerzők eredményei. A gluteninek mennyisége a különböző szerzők szerint folyamatosan nő [51]; először nő, aztán csökken [43]; először lassan, majd gyorsan, végül ismét lassan nő [52]. A gluteninek kis mennyiségben már korán jelen vannak, de csak a virágzás után 3-4 héttel kezd el mennyiségük jelentősen emelkedni [42]. Leginkább a csúcsok relatív mennyisége változik az érés során [48]. A glutenint felépítő alegységek tekintetében is többféle eredmény született. Egyes szerzők a HMW/LMW arány növekedését tapasztalták [53], mások esetében fajtától függően eltérő eredmények születtek [45]. Mindkét alegységcsoport mennyiségének -különböző dinamikával történőnövekedésére is találhatunk utalást (HMW: nő-stagnál-nő, LMW: nő) [52]. RP-HPLCvel a HMW alegységek mennyiségi arányának növekedését (15 30%), az LMW alegységek csökkenését (75 60%) tapasztalták, a közepes méretű alegységek aránya állandó volt (10%) [50]. SE-HPLC vizsgálatok szerint viszont a HMW alegységek aránya állandó maradt (30-35%), míg az LMW alegységek aránya nőtt (40 55%) [48]. Több szerző szerint azon fehérjék egy része, melyek mennyisége az érés folyamán csökken, átalakul más fehérjefrakciók részévé [54, 55], de jelent meg publikáció, amely szerint minden polimer molekula a kezdetektől jelen van, és szintetizálódik [45]. A monomer és polimer tartalékfehérjék relációját tekintve a legtöbb szerző szerint a gliadinok előbb jelennek meg, mint a gluteninek, az érés kezdeti szakaszára inkább a gliadin akkumuláció jellemző, későbbi szakaszára pedig a gluteninek felhalmozódása [51, 52, 56]. Skerritt és munkatársai szerint a gluteninek a gliadinok előtt jelennek meg, és kénhiány esetén lesz a szintézis sorrendje gliadin, majd glutenin [49]. Az érés során a glutenin/gliadin arányban bekövetkező változásokról szinte minden variációra lehet példát találni az irodalomban [41, 43, 44, 48, 55, 57, 58]. 18
Az érés elején csak polipeptidek, kis fehérjék vannak jelen, a tartalékfehérjék később jelennek meg, és akkor gyorsan, 1 hét alatt szintetizálódnak [59]. A magfejlődés kezdeti szakaszában a gliadin és glutenin fehérjék egymástól független fehérje testekben tárolódnak a sejtben; ezek a fehérje testek csak később olvadnak össze, és kezdődik meg az aggregáció folyamata [60]. A polimerizációs folyamatot egyes szerzők szerint bizonyos fehérje koncentráció elérése [53], míg mások szerint a vízvesztés indítja be [61]. A fehérje szintézis során sok SH csoport képződik, melyek száma az érés végső szakaszában rohamosan lecsökken, ahogy beindul a polimerizáció folyamata, és kialakulnak a diszulfid-hidak [59]; bár egyes szerzők jelentősebb mennyiségű SH csoport jelenlétét tapasztalták az érett magban [61]. Az intramolekuláris diszulfid-hidak kialakulása igen gyors, az intermolekulárisaké egyre lassabb, ahogy előrehalad a polimerizáció folyamata [62]. A fejlődő szemben felhalmozódó glutenin szerkezete nem végleges, leginkább a polimerek méreteloszlása változhat meg a diszulfidkötések megváltozásának következtében (az érés folyamán, ha esőt kap az érett mag, rovarok hatására, a tárolás folyamán, stb.) [63]. A nitrogén-ellátottság érésdinamikára gyakorolt hatásáról különböző kísérleti eredmények láttak napvilágot [43, 64, 65, 66, 67], de volt, hogy a felhalmozódás dinamikája a nitrogén-kezelésektől független volt [68], vagy csak a nitrogén-adagolás idejének volt számottevő hatása [69]. Az időjárási viszonyok is befolyásolják az érés folyamatát, a virágzást követő hűvösebb, csapadékosabb időjárás hatására felgyorsul a fehérje szintézis [70]. Egyes szerzők szerint csapadék hatására előbb következik be a polimerizáció, de a hőmérséklet emelése nem változtat ezen az időponton [68]. Különböző fajták eltérő érésdinamikával rendelkeznek [45], de a fent említett okok miatt ugyanazon fajta érésdinamikája évente eltérő lehet, bár az érett magok fehérjealegységszerkezetében nem feltétlenül van szignifikáns különbség [52]. A mag fehérjealegységszerkezete azonban nem csak az érettségi állapottól függ, hanem pl. a kalászban való elhelyezkedéstől és a virágzás idejétől is [48]. AZ IRODALOMBAN TALÁLHATÓ EREDMÉNYEK ÖSSZEHASONLÍTÁSA igen nehéz. Ennek oka nem csak az, hogy az egyes szerzők különböző fajtákat, más-más évben és eltérő agrotechnikai jellemzők mellett vizsgáltak, hanem az is, hogy eltérő a mintaelőkészítés (más a fehérje frakciók tényleges összetétele) [51], különböző analitikai technikákat alkalmaztak [45], és eltérő a detektálás érzékenysége [49]. Ezen túl az oldhatósági osztályok az érett magra vonatkoznak, és egyes szerzők szerint kétséges, 19
hogy éretlen mag esetén ezek mennyire alkalmazhatók, illetve, hogy milyen következtetések vonhatóak le az így kapott eredményekből [49]. Ebből a rövid összefoglalóból is látszik, hogy a sokféle és szerteágazó kísérleti eredmények ellenére az érésdinamikai kutatások területén még bőségesen van felfedeznivaló. 2.2.3. BÚZA FAJTAAZONOSÍTÁS A fajtaazonosítás egyaránt szükséges és hasznos a nemesítők, a kutatók, a termelők és a végfelhasználók számára. Sokféle módszer alkalmazható fajtaazonosításra, a legmegfelelőbb kiválasztása az elérendő cél és a rendelkezésre álló lehetőségek függvényében történhet. A fajtaazonosításra nincsen egységesen kidolgozott rendszer és elfogadott módszer. Sőt, az egyes országok között igen nagy különbségek léteznek a szabályozás tekintetében is. Az Európai Unión belül csak a regisztrált fajták kerülhetnek piacra, amelyek egyediek, megfelelően egységesek, és generációról generációra stabilak tulajdonságaikat tekintve [71]. Ezzel szemben az Amerikai Egyesült Államokban nincsenek hivatalos előírások és vizsgálatok [72]. A fajtaazonosítás történhet morfológiai vagy biokémiai tulajdonságok alapján. Azok a morfológiai tulajdonságok alkalmasak fajtaazonosításra, amelyek különféle környezeti feltételek mellett is azonosan fejeződnek ki. Sajnos ez az ideális eset a valóságban ritkán áll elő. A változó környezeti feltételek hatása kisebb mértékű a biokémiai, mint a morfológiai tulajdonságok vizsgálatánál. A fajták növekvő száma és a szigorodó előírások is pontosabb -biokémiai tulajdonságokon alapuló- méréstechnikák alkalmazását teszik szükségessé. Egyszerűségük és olcsóságuk miatt azonban a morfológiai vizsgálatokat sok helyen még napjainkban is rutinszerűen alkalmazzák. A morfológiai vizsgálatok közül a magvak vizuális vizsgálata, a patogénekkel szembeni ellenálló képesség vizsgálata, a fenol teszt és a digitális képanalízis emelhető ki. A magvak vizuális vizsgálata meglehetősen sok tapasztalatot és gyakorlatot feltételez. A kenyérsütésre jól használható kemény búza textúrája áttetsző, a süteményekhez 20
használatos "soft" búzáé pedig porszerű. A textúra tulajdonságainak mennyiségi kiértékelése is megoldott [73]. A patogénekkel szembeni ellenálló képesség vizsgálata néhány hetet vesz igénybe. A fenol teszt során az egyes búzaszemeket fenoltartalmú oldatba teszik, és a színváltozást vizsgálják. A módszer hátránya, hogy csak 3-4 színfokozatot képes megkülönböztetni [74]. A digitális képanalízis a mezőgazdasági ágazatokban is teret hódított [75, 76]. Digitális kép sokféle energiaforrás segítségével előállítható (látható fény, lézer, röntgen, infravörös, ultrahang, rádiófrekvencia, mágneses), de jelenleg még a látható fénnyel történő képalkotás az elterjedt. A technika alkalmas az egyes gabonamagvak jellemző paramétereinek (méret, alak, szín, textúra, csíra és növény morfológiai jellemzői) meglehetős pontossággal történő mennyiségi kiértékelésére. Hátránya az egységes vizsgálati szempontok hiánya, valamint a fajtaazonosításra való korlátozott alkalmazhatósága a környezeti hatások miatt és közeli genetikai rokonság esetén [77]. A biokémiai módszerek fehérje vagy DNS alapúak lehetnek. Ezeknél a vizsgálatoknál előny, hogy nagyobb felbontás érhető el, ez az előny azonban hátránnyá válhat, ha a módszer az egy fajtán belüli biotípusokat -bizonyos fokú heterogenitás (polimorfizmus) egyes fajtáknál természetes [78]- is megkülönbözteti egymástól. Ez a hatás kiküszöbölhető teljes őrlésű búza vizsgálatával (amennyiben az egyes biotípusok aránya állandó). A fehérje-alegységszerkezet meghatározásán alapuló fajtaazonosításra alkalmas módszerek közül a gélelektroforézist, a fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiát és az immunológiai vizsgálatokat emelném ki. A hagyományosan alkalmazott technika a tartalékfehérjék gélelektroforetikus vizsgálata [79]. A tartalékfehérjék alegységszerkezete a környezeti tényezőktől kevésbé függ, ezért alkalmazhatók (főképp a gliadinok) fajtaazonosítás céljára [80], adatbázisok alapján [81, 82, 83, 84]. Kezdetben keményítő géleket használtak, majd ennek helyét átvette a poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE). Manapság leginkább a savas PAGE (A-PAGE), a nátrium-dodecil-szulfát detergens jelenlétében végzett PAGE (SDS- PAGE) és az izoelektromos fókuszálás (IEF) az elterjedt. Az SDS-PAGE eredményeképpen kapott fehérje mintázat az A-PAGE-hoz viszonyítva összetettebb. Az 21
IEF inkább kutatási célokra terjedt el, mint rutin vizsgálatokra: nagyon érzékeny, nagy felbontású, magas költségigényű módszer. Az elektroforetikus technikák mellett a fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia is bevezetésre került, majd egyre inkább elterjedt fajtaazonosítási célokra [85, 86, 87, 88]. Az immunológiai vizsgálatok is hasznosnak bizonyultak a gabonafehérjék eloszlásának és szerkezetének vizsgálatában [89]. Nem elsődlegesen számba jövő módszer fajtaazonosításnál, de jól alkalmazható korlátozott számú genotípus megkülönböztetésekor. A tartalékfehérjék sokkal nagyobb fajtaheterogenitást mutatnak, mint a nem tartalék fehérjék, ezért az ellenük termelt antitestek felhasználhatók fajta meghatározásra [90]. Az aminosav szekvencia nagyfokú homológiája hátrányos a módszerre nézve, de még az egyes antitestek keresztreakciói ellenére is lehet immunológiai vizsgálatokkal fajtameghatározást végezni [91]. Nukleotidok meghatározásakor közvetlenül az örökítőanyag vizsgálható, így a környezet hatásával nem kell számolni, de a tesztek jelenleg elég munka- és költségigényesek. A "restriction fragment length polymorphism" (RFLP) a leginkább elterjedt módszer állati és növényi egyedek fajtájának meghatározására. Ennél a módszernél restrikciós endonukleáz által hasított DNS darabok elválasztását végzik el elektroforetikusan azok relatív hossza alapján, majd nejlon membránra viszik át őket. A megfelelő fragmenseket jelölt DNS próbákkal teszik láthatóvá [92]. 22
2.3. LISZTÉRZÉKENYSÉG ÉS A BM180 FEHÉRJE A gabonafélék igen fontos szerepet töltenek be az emberi táplálkozásban. Jelentős energia-, fehérje-, vitamin-, ásványi anyag- és komplex szénhidrát források, élelmi rost tartalmuk is nélkülözhetetlen. Az emberek egy csoportjánál azonban néhány gabonaféle (búza, rozs, árpa, zab, triticale, esetenként a hajdina, köles, cirok) fogyasztása egészségügyi problémákhoz vezet, mert ezen gabonafélék prolaminjának fogyasztása súlyos vékonybél-károsodással jár. A betegség lényege a fehérjére, zsírra és szénhidrátra vonatkozó komplex felszívódási zavar, amit glutén szenzitív enteropathiának (cöliákia) vagy lisztérzékenységnek nevezünk. A táplálékban található gliadinok bizonyos szekvenciáinak hatására fellépő abnormális immunválasz során károsodik a vékonybél nyálkahártyája, és ez okozza a felszívódási zavarokat [93]. A lisztérzékenység genetikai eredetű autoimmun betegség, de kialakulásában környezeti faktorok is szerepet játszanak. A betegség elsősorban Európában elterjedt. Sajnos a lisztérzékenység felismerését megnehezíti, hogy tünetei nem elég jellegzetesek, és a diagnózis felállítása sokszor csak a betegség előrehaladott állapotában sikerül. Tünetei között a hasmenés, étvágytalanság, elmaradt fejlődés, kimerültség szerepel. A felszívódási zavar következtében a beteg tápanyagfelvétele korlátozott, ami további betegségek és szövődmények, akár daganatos megbetegedések kialakulásához is vezethet. A nem kezelt cöliákia átmeneti laktóz intoleranciát okozhat [94]. Egyetlen gyógymódnak egyelőre a glutén-mentes diéta adódik, de a betegek teljes életet élhetnek, amennyiben a gluténmentes étrendet megtartják. Ez nem könnyű feladat, mert nem csupán a glutén tartalmú gabonaféléket, de a belőlük készült termékeket (pl. keményítő) is eliminálni kell a táplálkozásból. A fogyasztható gabonafélék a kukorica, a rizs és esetleg a köles. Még ma sem ismertek pontosan a toxicitásért felelős fehérje frakciók, illetve szekvenciák. Az biztos, hogy toxikus az α-gliadin, és kevésbé toxikus a β-gliadin. A γ- és ω-gliadinról eltérőek az eredmények. Az is ismert, hogy a toxikusnak vélt gliadin alegységekkel teljesen megegyező szekvenciájú peptidek találhatók a glutenin frakcióban is, amelyek diszulfid hidakkal kötődnek a gluteninhez [95]. Bár a nyálkahártya károsodásáért bizonyítottan a gliadin felelős, az még nem tisztázott, hogyan is alakul ki a felszívódási zavar, és miként jön létre a nyálkahártya károsodása. A toxikus hatás magyarázatára többféle elmélet is született [96]. Egyesek 23
szerint enzimhiány, mások szerint a felszívó hámsejtek áteresztőképességének megváltozása vagy immunológiai eltérések lehetnek a betegség kialakulásának hátterében. Genetikai tényezők és vírusfertőzés egyaránt szerepet játszhatnak. A lisztérzékenység autoimmun betegséggé válása részleteiben még szintén nem tisztázott folyamat. Az egyik magyarázat szerint nem csak a lisztérzékenységben, de a Sjörgen's szindrómában (száraz szem betegség) is kulcsfontosságú szerepet játszik egy 180 kda-os bazális membránfehérje (BM180) [97]. Ez a fehérje három 60 kda-os alegységből áll [98], N-terminális szekvenciája α-gliadin homológ és gliadin ellen termelt antitestek képesek felismerni [97]. Mindezek a tulajdonságok azt látszanak megerősíteni, hogy ez a fehérje egy autoantigén ezekben a betegségekben. Egészséges testi sejtekben a BM180 koncentrációja nagyon alacsony, de egér EHS (Engelberth- Holm-Swarm) tumorból viszonylag nagyobb koncentrációban kinyerhető. A BM180 fehérje mind vizes, mind alkoholos közegben oldódik. A gliadinoktól eltérő oldhatóság oka valószínűleg a fehérjék eltérő glikoziláltságában keresendő. A fehérje izolálása és további vizsgálata a lisztérzékenység jobb megismeréséhez és gyógyításához szolgáltat fontos információkat. 24