Génkifejeződési vizsgálatok MTA Mezőgazdasági Kutatóintézete Növényi Molekuláris Biológia Osztály
A génkifejeződés A sejtmag géneket tartalmaz; (fehérjéket, RNSeket kódoló); A gének átíródnak mrns; Pre-mRNS vagy hn-rns szintetizálódik; RNS-utófeldolgozás vagy érés; Az RNS a citoplazmába szállítódik; Fehérjévé fordítódik a riboszómákon transzláció.
Génkifejeződés A kromatin szerkezet fellazulása DNS hn-rns Transzkripciós kontroll utófeldolgozás Transzkripciós faktorok: DNS kötő fehérjék jellegzetes motívumokkal Transzport kontroll mrns stabilitás Inaktív mrns Transzláció A fehérje poszt-transzlációs módosulása Aktív vagy inaktív fehérje
Az eukarióta, fehérjét kódoló gének szerkezete Promóter: 5 szabályozó szekvenciák 5 nem kódoló régió: 5 fehérjét és RNS-t nem kódoló szekvenciák Kódoló régió: fehérjék, rrns és trns kódjai (exonok, intronok) 3 nem kódoló régió: fehérjét és RNS-t nem kódoló régiók 3 STOP jel
Az eukarióta gének szerkezete Gén Átíródó régió Promóter/ A transzkripció megindulásának szabályozására Fehérjét kódoló szakaszok Terminátor
Az eukarióta struktúrgén szerkezete
Promóterek A transzkripció cisz elemei, a DNS molekula szabályozó szakaszai, amelyekhez az RNS polimeráz enzimek és a transzkripciós faktorok kapcsolódnak.
Promóterek típusai Konstitutív promóter: nem szabályozott promóter, amely a hozzátartozó gén folyamatos átírását biztosítja, állandó nemspecifikus génexpressziót eredményezve. Indukálható vagy induktív promóter: környezeti tényezők hatására aktiválódó promóterek.
A promóterek főbb típusai
Indukálható promóterek TetR: Tn10 kódolta Tet represszor; 35S CaMV: karfiol mozaikvírusból származó konstitutív promóter; Tc: tetraciklin
A génkifejeződés szabályozása géncsendesítéssel Először petúniában írták le Az antocianin-szintézisben szerepet játszó kalkon-szintáz génjét fejeztették ki fokozott mértékben a virág színének sötétítése céljából. Az eredmény pigmenthiány lett a koszupresszió jelensége miatt.
A géncsendesítés kis RNS-eken alapuló mechanizmusa (endoribonuclease) (RNA-induced silencing complex)
A környezeti és anyagcsere-változások hatása a génkifejeződésre Környezeti hatás Érzékelés (szignálpercepció) Jelátvitel (szignáltranszdukció) Anyagcsere változások Génexpresszió regulátorgének (transzkripciós faktorok) struktúrgének
A génkifejeződés szabályozása Környezeti hatás Fejlődés, növekedés Indukció Módosítás Lebontás Téglalapban A, B, C: cisz-elemek, Körben A, B, C: transzkripciós faktorok, Ub: Ubiquitin Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, Trends Plant Sci, 10:88-94, 2005 RNS-polimeráz Gén
A génkifejeződést szabályozó jelátviteli utak Szárazság Hideg ABA-független útvonal Ca ABA-függő útvonal ABA: abszcizinsav, AREB: ABRE-kötő fehérjék, ABRE: ABA-függő elemek, CBF: C-ismétlődést kötő elem, DRE/CRT: dehidrációra válaszoló elem, DREB: DRE-kötő fehérje, ICE: CBF-kifejeződés indukálója Shinozaki és mtsai, Curr. Op Plant Biol, 6:410-417, 2003
Módszerek a génexpresszió tanulmányozására Növényi kivonatokban végzett vizsgálatok egyes gének expressziójának vizsgálata Northern analízis RT-PCR transzkriptom-analízis több ezer gén expressziójának egyidejű vizsgálata array következő generációs, nagy hatékonyságú módszerek In situ vizsgálatok metszetekben vagy élő sejtekben és szövetekben hibridizáción alapuló közvetlen módszer látható terméken alapuló közvetett módszer
Génkifejeződés kivonatokban: Northern analízis Lépések: RNS-izolálás elválasztás agarózgélen átvitel Nylon-membránra hibridizáció jelölő próbával Időigényes: 1 hét Ca-kötő p. 26S rrna CS CS(Tsp5A) CS(Ch5A) 18/15 C 2/2 C 0 2 6 2 6 1 3 7 11 21 h h d 18/15 C 2/2 C 0 2 6 2 6 1 3 7 11 21 h h d 18/15 C 2/ 2 C 0 2 6 2 6 1 3 7 11 21 h h d A Ca-kötő fehérje génjének expressziós változásai a hidegkezelés során búzában Itt 32 P-vel jelölt nukleotiddal készült hibridizációs próbát használtunk Lehet nem-radioaktív próbát is használni pl. fluoreszcens jelölés
Normalizált mennyiség Normalizált mennyiség Génkifejeződés kivonatokban: valós idejű (real time) RT-PCR Lépések: Gyors: 2 nap RNS-izolálás cdns (másolat DNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) DNS-felszaporítás PCR-rel (polimeráz láncreakció) fluoreszcensen jelölt termék folyamatos detektálása a reakció közben adatelemzés a beépített programmal A Ca-kötő fehérje génjének expressziós változásai a hidegkezelés során búzában Rövid távú változások Hosszú távú változások 0,08 2.5 0,06 2 0,04 0,02 0 0 1 2 3 4 5 6 7-0,02-0,04 óra CS-C CS-2 CS(Tsp5A)-C CS(Tsp5A)-2 CS(Ch5A)-C CS(Ch5A)-2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 25-0.5 nap CS CS(Tsp5A) CS(Ch5A)
Génkifejeződés kivonatokban: array módszer transzkriptom-elemzés Array: sorrend; a hibridizációhoz használt cdns vagy oligonukleotid szekvenciákat sorokba rendezve viszik fel valamilyen hordozóra Transzkriptom-elemzés: az mrns-ek és a nem kódoló RNS-ek összeségének egyidejű elemzése Felhasználás: gének kiválasztására, az eredményeket más módszerrel (RT-PCR) meg kell erősíteni Csoportosítás: méret szerint: macroarray hordozó 8 12 cm-es Nylon-membrán, 30-40 g RNS szükséges hozzá, 10-15000 gén expressziójának egyidejű vizsgálatára alkalmas, radioaktív jelölés microarray hordozó tárgylemez, 1-2 g RNS szükséges hozzá, 40-50000 gén expressziójának egyidejű vizsgálatára alkalmas, fluoreszcens jelölés felvitt nukleotidszekvencia szerint: cdns-array baktériumokban klónozott, PCR-rel felszaporított, 400-500 nukleotidnyi EST (expressed sequenced tag szekvenált 400-500 nukleotid hosszú cdns, melyeket cdnskönyvtárakból határoznak meg) szekvenciákat visznek fel, kevésbé specifikus oligonukleotid-array adatbázisok szekvenciái alapján 50-60 nukleotidnyi oligonukleotidokat szintetizálnak és visznek fel, specifikusabb 3 végre tervezett Időigény: RNS-izolálás, cdns-szintézis, hibridizáció, fényképezés 2-3 hét adatelemzés minimum 2-3 hónap
Génkifejeződés kivonatokban: array módszer transzkriptom-elemzés A transzkriptom-elemzés mérföldkővei:
Génkifejeződés kivonatokban: cdns-macroarray módszer A búza 5A kromoszómájának hatása a transzkripciós mintázatra a 3 hetes hidegedzés során eltérő fagytűrésű búza genotípusokban Búza cdns hibridizálása árpa cdns macroarray-hez heterológ hibridizáció CS fagyérzékeny CS(Tsp5A) mérs. fagyérzékeny 191 26 184 84 76 58 303 A vizsgált 10297 egyedi gén közül 921 volt hidegfüggő, 174 kifejeződésére volt hatással az 5A kromoszóma CS(Ch5A) fagytűrő N. Stein, IPK, Gatersleben, Németo., 2005
CS CS(Tsp5A) CS(Ch5A) CS CS(Tsp5A) CS(Ch5A) CS CS(Tsp5A) CS(Ch5A) CS CS(Tsp5A) CS(Ch5A) Génkifejeződés kivonatokban: cdns-macroarray módszer Az 5A kromoszóma által befolyásolt és a hidegedzés elején nagy átmeneti expressziós növekedést mutató gének 0 1 7 21 nap (2 C) Glutation-S-transzferáz Hideg akklimatizációs fehérje Ca-kötő fehérje Szacharóz-szintetáz 1 -Amiláz Dehidrin 4 Dehidrin 6 Lektin prekurzor LEA 14A fehérje Embrió-specifikus fehérje -3 0 3 Log 2 (gén-központosított jelerősség) CS: Chinese Spring mérsékelten fagyérzékeny CS(Tsp5A): Chinese Spring (Triticum spelta 5A) fagyérzékeny CS(Ch5A): Chinese Spring (Cheyenne 5A) fagytűrő
Génkifejeződés kivonatokban: oligonukleotid-microarray módszer Homológ hibridizáció: búzachip búza cdns-sel, 15 0000 oligonukleotid Festés: kontroll zöld, kezelt piros fluoreszcens festék Első hibridizáció: kontroll, 1 nap 2 C; CS, Ch, CS(Ch5A), CS(Tsp5A) számos gén (antioxidánsok, Ca 2+ -kötő fehérje) esetében a cdns-macroarray-jel azonos az eredmény
Génkifejeződés kivonatokban: Transzkriptom-elemzés következő generációs, nagy hatékonyságú módszerekkel A következő generációs transzkriptom-elemzés szekvenáláson alapul. A szekvenáláson alapuló módszerek összehasonlítása: Genomi DNS cdns Sanger-féle dideoxinukleotidos módszer - drága A génexpresszió elemzése sorozatban direkt mérés, új szekvenciák detektálása Következő generációs módszerek véletlen elhelyezkedő rövid szekvenciák Adott szekvencia leolvasási gyakoriságából meghatározható a megfelelő gén kifejeződése Morozova et al. (2009), Annu. Rev. Genom.Human Genet., 10: 135-151
Génkifejeződés kivonatokban: Transzkriptom-elemzés következő generációs, nagy hatékonyságú módszerekkel
Génkifejeződés kivonatokban: Transzkriptom-elemzés következő generációs, nagy hatékonyságú módszerekkel
Transzkriptom-mintázatok elemzése - > Rendszerbiológia Cél: a rendelkezésre álló adattengerből értelmezhető tudás megszerzése automatizált módon, bioinformatikai eszközökkel Módszer: különböző kísérleti rendszerekből származó komplex adathalmazok megszerzése, integrálása, analizálása, az adatokból kölcsönhatási rendszerek, hálózatok létrehozása interdiszciplinális eszközökkel. Felhasznált tudományterületek: Infraindividuális rendszerbiológia szervezet, szövet, sejt szintű kölcsönhatások leírása Genomika: szervezet (szövet vagy sejt) szintű DNS-szekvenciák leírása Epigenomika: szervezet szintű, nem a genomban kódolt szabályozó folyamatok (DNS-metilálás) tanulmányozása Transzkriptomika: szervezet szintű génexpressziós mintázatok vizsgálat Interferomika: szervezet szintű korrekciós folyamatok (RNS interferencia) leírása. Proteomika: fehérje mintázatok tanulmányozása Metabolomika: anyagcseretermék mintázatok tanulmányozása (részterület: glikomika, lipidomika) Interaktomika: szervezet, szövet és sejt szintű kölcsönhatások leírása a molekulák közt Fluxomika: molekluláris dinamikai változások leírása Szupraindividuális rendszerbiológia - a fajjal és a magasabb rendszertani egységekkel foglalkozik Biomika: a Föld különböző éghajlatú, flórájú és faunájú területei közti kölcsönhatások leírása Hierarchikus rendszerbiológia: különböző szerveződésű szintek közti kölcsönhatások leírása molekula sejt szervezet faj populáció életközösség különböző fajokkal Alkalmazás: gyógyszertervezés, megelőző gyógyítás, rendszerelméletű természetvédelem és mezőgazdaság.
In situ génkifejeződés: hibridizáción alapuló közvetlen kimutatás metszetekben A leafy (leveles, virágmerisztéma differenciálódásáért felelős) gén kifejeződése (narancssárga szín) a virágkezdeményből és az embriózsákból készült metszeteken fluoreszcens festéssel (fast red) Arabidopsisban. Takechi et al. (1999), Plant Mol Biol Rep,, 17: 43-51
In situ génkifejeződés: közvetlen kimutatás RT-PCR-rel metszetekben 18S rrns kifejeződése a Zinnia elegans epikotil metszeteiben RT-PCR-rel. A PCR-reakcióhoz használt egyik nukleotidot fluoreszcensen jelölték. A nyilak a faedényekben jelzik a génkifejeződést. Pasquet et al. (2004) Plant J, 39: 947-959
In situ génkifejeződés: közvetlen kimutatás hibridizációval teljes növényben 32 P-tal jelzett vírus RNS kimutatása Arabidopsis levelekben Kong, Simon (1998): Arabidopsis protocols, p. 409-415, Humana Press, 9978-0-89603-391-7
In situ génkifejeződés: közvetett kimutatás teljes növényben Alapja valamely jól detektálható termék képződése, pl. zöld fluoreszkáló fehérje, luciferáz Példa: luciferáz gén összekapcsolása stressz által bekapcsolható promóterrel (DREB1::luc; DREB1: drought-responsive element binding factor1, stressz indukálható transzkripciós faktor; luc: luciferáz, luciferinből lumineszkáló terméket képez), Arabidopsis transzformálása vad típus transzformáns vad típus transzformáns vad típus transzformáns 12 h 0 C-on sötétben 5 h 300 mm NaCl 3 h 100 M ABS