A vér-agy gát szelektivitásának molekulaszerkezeti alapjai és nanotechnológiai hasznosításuk a permeabilitás elősegítésére.

Átírás

1 FARAGÓ ESZTER A vér-agy gát szelektivitásának molekulaszerkezeti alapjai és nanotechnológiai hasznosításuk a permeabilitás elősegítésére Diplomamunka Témavezetők: Dr. Kiss Éva és Prof. Dr. Kálmán Mihály ELTE TTK Fizikai-Kémiai Tanszék 2011

2 Köszönetnyilvánítás Dolgozatomat az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumában, illetve a Semmelweis Egyetem Anatómiai és Fejlődéstudományi tanszékén készítettem. Köszönetet szeretnék mondani témavezetőimnek Dr. Kiss Évának és Prof. Dr. Kálmán Mihálynak, akik lehetővé tették, hogy diplomamunkámat az általuk vezetett csoportokban végezhessem. Ezenkívül köszönettel tartozom a munkám során nyújtott hasznos tanácsaikért, útmutatásukért, áldozatos munkájukért. Szeretném megköszönni Dr. Hórvölgyi Zoltánné Pető Idának, Őz Andreának és Deák Szilviának a munkám során nyújtott sok segítséget. Köszönöm továbbá Pénzes Csanád Botond PhD hallgatónak az AFM mérések elvégzését, kiértékelését, Mahalek Judit és Sam Sadeghian orvostanhallgatóknak a műtétek elvégzése során nyújtott segítségét. Köszönettel tartozom Dr. Havancsák Károlynak és Dr. Varga Gábornak a pásztázó elektronmikroszkópos mérések elvégzéséért, amelyek az ELTE Anyag- és Élettudományi Szerkezetkutató Centrumában készültek. Köszönöm Dr. Jalsovszky Istvánnak, Cserép Balázs Gergelynek és Enyedi Kata Nórának, hogy rendelkezésemre bocsátották a fluoreszceineket és a kumarinokat, illetve Dr. Hegedűs Imrének, MTA MÜKKI munkatársának a flureszceinnel jelölt kompozit anyagokat. Köszönöm továbbá az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumának összes dolgozójának, illetve a Semmelweis Egyetem Anatómiai- és Fejlődéstudományi tanszékén Prof. Dr. Kálmán Mihály vezette csoport összes tagjának a támogatást és azt, hogy mindig jóindulatú segítőkészséggel álltak a kéréseimhez, kérdéseimhez. Végül, de nem utolsósorban köszönettel tartozom családomnak, akik mindig mellettem álltak, és mindenben támogattak. 2

3 Tartalomjegyzék: Rövidítésjegyzék Bevezetés Irodalmi összefoglaló A vér-agy gát fogalma, biológiai szerepe A vér-agy gát felépítésében résztvevő főbb sejtek Agyi endothelsejtek Asztrociták Periciták A vér-agy gát permeabilitása, transzport rendszerek Paracelluláris transzport Transzcelluláris transzport Receptor mediált transzport (RMT) Carrier mediált transzport Adszorptív mediált transzcitozis (AMT) Efflux transzporterek Multidrog rezisztens transzporterek A vér-agy gát állapota a központi idegrendszert érintő betegségek esetén Neurodegeneratív betegségek Alzheimer-kór Parkinson-kór Cerebrovaszkuláris betegségek Gyulladásos betegségek Fertőzés Sclerosis Multiplex (SM) Agytumor Stratégiák gyógyszerek központi idegrendszerbe juttatására Invazív technikák Nem invazív technikák, kolloidális gyógyszerhordozók Polimer micellák Liposzómák

4 Nanorészecskék Célkitűzések Kísérleti rész Felhasznált anyagok Nanorészecskék előállítása Nanoprecipitáció Az eljárás kidolgozása Fluoreszcens részecskék A részecskék jellemzése Dinamikus fényszóródásmérés Pásztázó elektronmikroszkópos mérések Atomi erő mikroszkópos mérések Fluorimetriás mérések Rediszpergálhatóság és stabilitás vizsgálata A biológiai vizsgálatoknál használt metodikák Kísérleti állatok és a műtét Feldolgozás Vér-agy gát vizsgálata Nissl-festés Immunhisztokémiai vizsgálat Eredmények A nanoprecipitációs eljárás során tapasztaltak Méret meghatározás dinamikus fényszóródásméréssel Fluoreszcens anyagok kapszulázása Pásztázó elektronmikroszkópos mérések Atomi erő mikroszkópia Rediszpergálhatóság és stabilitás Biológiai vizsgálatok Vér-agy gát vizsgálata ép agyban rhodaminnal Vér-agy gát vizsgálata ép agyban Evans-kékkel Vér-agy gát vizsgálata ép agyban fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt nanoméretű kompozitanyaggal

5 Vér-agy gát vizsgálata ép agyban fluoreszceinnel, illetve rhodamin B base-zel jelöltnanorészecskékkel Vér-agy gát vizsgálata fagyasztásos léziót követően Eredmények értelmezése A nanorészecskék előállítása és jellemzése során tapasztaltak értelmezése A biológiai vizsgálatok során tapasztaltak magyarázata Összefoglalás és kitekintés Summary Irodalomjegyzék

6 Rövidítésjegyzék ABC: ATP kötő kazetta (ATP-Binding Casette) AFM: atomi erő mikroszkóp AMT: adsorptive-mediated transcytosis AP: alkaline phosphatase ATP: adenozin triphosphate BBB: vér-agy gát (Blood Brain Barrier) DLS: dinamikus fényszóródásmérés (Dynamic Light Scattering) γ-gt: γ-glutamil transpeptidase GFAP: gliális savanyú fehéje (Glial Fibrillary Acidic Protein) GLUT 1: glükóz transzpoter 1 (glucose transporter 1) JAM: Junctional Adherens Molecule LDL: alacsony denzitású lipoprotein (Low Density Lipoprotein) MAb: monoklonális antitest (Monoclonal Antibody) MDR1: multidrog transzporter (Multidrug Resistance Protein 1) MRP: multidrog-rezisztens protein (Multidrug Resistance-associated Protein) OAP: ortogonálisan rendezett transzmembrán fehérjestruktúra () PLA: politejsav (PolyLactidAcid) PLGA:poli(D,L-tejsav-glikolsav) (Poly(D,L-Lactid Acid-Glyclic Acid)) PEO: polietilén-oxid PPO: polipropilén-oxid RHS: retikulo hisztocita rendszer (Reticulo Histocita System) RMT: receptor-mediated transport SEM: pásztázó nelektron mikroszkóp (Scanning Electronmicroscope) 6

7 1. Bevezetés A XIX. század vége óta ismert, hogy a központi idegrendszert a szervezet egészétől egyfajta gát választja el (a felfedezés Paul Ehrlich anilinfestéses kísérletéhez köthető), jelentőségét azonban csak hosszú évtizedek kutatómunkája nyomán ismerték fel. Ez a gát csak olyan anyagok számára átjárható, amelyek feltétlenül szükségesek az agy tápanyagellátása és homeosztázisának fenntartása szempontjából. Nemcsak az idegen, agy számára toxikus anyagokat tartja távol, hanem a szervezet immunanyagait is. A hagyományos gyógyszerek esetén sok esetben azzal a problémával kell szembesülnünk, hogy nem a célszervben fejtik ki hatásukat. Bár az irányított célba juttatás gondolata szintén Paul Ehrlich által már 1908-ban felmerült, sajnos ezt a gyakorlatba mind máig nem sikerült teljes mértékben átültetni, bár vannak biztató eredmények. Komoly problémát okoz ebből következően, hogy a szükségesnél nagyobb mennyiségben kell adagolni a gyógyszereket, így biztosítva az adott célszerv számára a megfelelő mennyiséget. Ez különösen a tumoros megbetegedések esetében okoz komoly gondot, ugyanis ilyen pácienseknél sok esetben erős citosztatikumokat alkalmaznak, így igen sok toxikus mellékhatás lép fel. Emellett számos más betegség kezelése során szintén számítanunk kell hasonló mellékhatásokra. A központi idegrendszert érintő kóros elváltozások esetében ezeken kívül meg kell birkóznunk egy másik feladattal is, miszerint át kell juttatni az adott hatóanyagot a szervezet egészét és az agyat elválasztó gáton, ugyanis az agy felé történő anyagáramlást a vér-agy gát korlátozza. A központi idegrendszert érintő kóros elváltozások igen nagy százalékában kimutatható a vér-agy gát károsodása. A károsodás egyaránt lehet a kór kiváltója vagy a betegség következménye. Komoly problémát okoz, mert így a védelmi funkciók megszűnnek, ezáltal az idegszövetet elárasztják a számára toxikus anyagok. Ez azonban terápiás lehetőségeket is rejt magában, hiszen ebben az esetben a hatóanyag molekulák is átjuthatnak a vér-agy gáton. Ebben az esetben azonban egy másik probléma merül fel, miszerint a gyógyszermolekulák nemcsak az agy károsodott területeire jutnak el, hanem az egészséges részek sejtjeihez is, ami komoly problémát okoz. Egy lehetséges megoldást nyújt a nanotechnológia. Az anyagtudomány fejlődése révén több olyan anyagot elő tudtunk állítani, amelyek 7

8 biokompatibilisek, biodegradábilisek, így az irányított terápia kulcsfontosságú elemei lehetnek. A nanotechnológiai eljárások révén pedig ezekből az anyagokból olyan méretű, és felületi tulajdonságú hordozórészecskéket állíthatunk elő, amelyek alkalmasak a gyógyszerek célba juttatására. Egyrészt, mert megakadályozzák az immunrendszer által történő kiürülést, másrészt anélkül lehet a hordozóegységet valamilyen carrier molekulával megjelölni, hogy a hatóanyagot bármilyen csekély mértékben is befolyásolnánk, harmadrészt nem kell a szervezetet feleslegesen terhelni a nagy dózisú gyógyszerekkel. Mindezek ismeretében azt mondhatjuk, hogy a gyógyszerkutatásban a nanoméretű, megfelelő felületi tulajdonságokkal rendelkező részecskék hordozóként való alkalmazása egy igen jelentős perspektíva lehet. 8

9 2. Irodalmi összefoglaló 2.1. A vér-agy gát fogalma, biológiai szerepe Az ún. vér-agy gátat (blood-brain barrier, BBB) a következőképp definiálhatjuk: Az azonos strukturális és funkcionális elemek összessége, amelyek behatárolják az általános szövetközti tér és agy állománya közti anyagforgalmat. Szerepe kettős egyrészt elhatárolja az agyat a szervezet többi részétől, kizárja azokat az anyagokat, amelyek károsak lehetnek a központi idegrendszer számára, másrészt biztosítja bizonyos anyagok átjutását. Mivel a vér-agy gát jelentősége kiemelkedő a szervezet egészének normális működése során, tulajdonságainak feltérképezésére több in vitro modell született, amelyek segítségével több feltételezést sikerült bizonyítani. (pl. Gliasejtek és endothelsejtek kapcsolata [1,7]) 2.2. A vér-agy gát felépítésében résztvevő főbb sejtek A vér-agy gát felépítését a három sejt modell segítségével szemléltethetjük [5]. Ennek tagjai: endothelsejtek, asztrociták és periciták [1,3,4,5]. (1.ábra) Az alábbiakban ezen sejttípusok jellemzése következik. 1. ábra: A vér-agy gátat felépítő három sejtféleség: endothelsejt, asztrocita és pericita elhelyezkedése 9

10 Agyi endothelsejtek Az endothelsejt az erek belső felületét borító rendkívül lapos sejtféleség. Kulcsfontosságú szerepet játszik érfal permeabilitásának szabályozásában [2]. A kapillárisok falát csak endothelium és annak lamina basalisa alkotja, amelynek támaszkodik mind az endothelsejt, mind pedig a gliasejt. Az agyi erek az agyállomány mélységében szinte kizárólag ilyen szerkezetűek. A különböző szerveket behálózó erek falát alkotó sejteket csupán néhány egyedi jellemzőjük különbözteti meg, elsősorban permeabilitásuk. Ez alapján három csoportra oszthatjuk a kapillárisokat: fenesztrált, diafragmával fenesztrált és nem fenesztrált kapilláris. Az utóbbi csoportba tartoznak az agyi erek endothelsejtjei, amelyek szabályozzák a véralvadást, receptoraik segítségével felveszik és lebontják az alacsony denzitású lipoproteineket (LDL) és a különböző glikoproteineket [1]. Az agyi endothelsejteket a szervezet más részén elhelyezkedő endothelsejtektől több speciális tulajdonságuk különbözteti meg (pl.befolyásolják az agyi keringést), amelynek révén a vér-agy gát funkció kialakul. A vér-agy gát funkció lényegében három összetevőből áll. Az egyik (a) a sejtek közötti inter- vagy paracelluláris átjutás gátlása ('tight junction'-ök által). A másik (b) transzcelluláris transzport gátlása, a harmadik (c) ezt kiegészítendő a szükséges anyagok átjutásának biztosítása. a) Az agyi endothelsejteket szoros zárókapcsolatok (zonula occludensek), tight junction-ök kötik össze, amelyek általában a hámszövetre jellemzőek. (2.ábra) 10

11 2.ábra: Az endothelsejtek közti szoros zárókapcsolat szerkezete A szoros zárókapcsolat által összekapcsolt endothelsejtek adják a vér-agy gát morfológiai alapját. Blokkolják a paracelluláris transzportot a vérből. Ez adja a gát-funkció kulcsát [1,3,4,6,7]. (2.ábra) A szoros kapcsolat szerkezeti alapját speciális fehérjék (occludin, claudin, JAM (junctional adhesion molecules)) alkotják, amelyek mint a varrás öltései tartják össze a két sejt membránját. Egy-egy occludin molekula négyszer éri át a membránt és két hurkot hoz létre, amelyek homofil módon kötődnek egy másik plazmamembránon hasonlóképp létrejött hurkokhoz [6,7]. Ily módon olyan közel kerülnek az endothelsejtek egymáshoz, hogy a paracelluláris transzport lehetősége igen csak lecsökken. A 'tight junction' felelős az agyi endothelsejtek polaritásáért is, amelynek az enzimek és transzportfehérjék aszimmetrikus elhelyezkedése köszönhető. Ez igen fontos tényező a vér-agy gát működésében. b) Az idegrendszeri működéshez nem szükséges, illetve az azt kifejezetten gátló anyagok kiszűrése, a szükséges anyagok mennyiségének szabályozása az efflux transzporter pumpák feladata. Ezek egyik családja az ATP-kötő kazetta (ABC)-transzporterek, amelynek a vér-agy gát felépítése szempontjából fontos tagja a P-glikoprotein vagy más néven multidrog transzporter (MDR1).(Részletesebben ld fejezetben.) Elsődleges ligandumjaik 11

12 xenobiotikumok, citosztatikumok, pl.:vinca-alkaloidok...stb [1,8]. Az ABC-transzporterek közül ki kell még emelnünk a multidrog-rezisztencia proteineket (MRP), amelyek főként glutation-konjugált vegyületeket pumpálnak vissza a vérbe [1,8]. c) Mindezek ismeretében érthető, hogy az idegrendszer sejtjeinek funkcionalizálásához elengedhetetlen tápanyagok átjuttatása speciális transzport-rendszerek segítségével történik. Ezek között megtalálhatjuk a receptorhoz kötött transzcitózist, illetve szállítófehérjékhez kötött átjutást is. Az előbbire példa a LDL vagy inzulin agyba jutása, az utóbbira pedig a glükóz-transzporter 1 (GLUT 1) vagy A- és L-típusú aminosavtranszporterek [1,4,5] Asztrociták Az idegszövet idegsejtekből és gliasejtekből épül fel. A két alkotóelem egymástól elválaszthatatlan, szerves egységet képez. A glia felelős nagyrészt az agy a szervezettől való elhatárolásáért. Ennek megfelelően számos funkciót képvisel, amiket a szervezet többi részében más sejtféleségek látnak el. A gliasejtek feladata az idegsejtek speciális anyagcseréjének a lebonyolítása (pl. K +, Ca 2+, NH 3, NO, glikogén...stb), illetve mielinhüvelyképző és támasztó funkció ellátása, ezenkívül a vér-agy gát funkciók kialakításában is döntő szerepük van [1,2,9]. Az idegsejtek és a gliasejtek közt különbséget tehetünk, miszerint az utóbbi esetében nem terjed tova az akciós potenciál, a gliasejt nem mutat hisztodinamikai aktivitást, és nincs főnyúlvány a nyúlványai közt. A gliát négy nagy csoportra osztjuk: asztrocitára, oligodendrogliára, mikrogliára és ependymára [9]. Az asztrocita sejtek közös tulajdonsága, hogy tartalmaznak egy specifikus fehérjét, ún. glial fibrillary acidic protein-t (GFAP) [9]. Az asztrocita csillag alakú, sűrű elágazódású sejt. Az idegszövet felszínén egységes réteget hoznak létre azáltal, hogy a gliatalpak mozaikszerűen összefekszenek, beborítják az ereket, hatással vannak az endothelsejtekre [2,3,7]. Az asztrociták hatására köztük erősebb a tight junction, fokozódik zárókapcsolatok fehérjéinek expressziója. Ezzel együtt pinocytosis és a permeabilitás lecsökken, kialakul a sejtek polarizációja. Ennek hatására a BBB specifikus transzport-rendszerek, illetve enzimek működése is fokozódik, így például GLUT 1, illetve γ-glutamil-transzpeptidáz [7, 9]. Azonban nemcsak a gliasejtek befolyásolják az endothelsejtek tulajdonságait, hanem az endothelsejtek is hatással vannak a gliasejtekre. Kimutatták, hogy az agyi endothelsejtek 12

13 serkentik az asztrociták és periciták proliferációját, befolyásolják azok működését, morfológiáját. A két irányú kommunikáció hipotézisét támasztja alá az az adat, miszerint a perivaszkuláris asztrocitákban az ortogonálisan rendezett transzmembrán fehérjestruktúra (OAP) (amelyet a víztranszportért felelős akvaporin csatornákkal azonosítanak [10]) és az endothelsejtek közötti tight junction -ök párhuzamosan alakulnak ki. (Mindkét struktúra eltűnik, ha külön-külön tenyésztjük a két sejtet [7,9].) Periciták A periciták az erek lamina basalisaban lévő sejtek, amelyek kontaktusban vannak az endothelsejtekkel [11,12]. Fontos szerepet játszanak az agyi angiogenesisben (in vitro modellben sikerült igazolni [14]), az endothelsejtek közti tight junction -ök kialakításában, a vér-agy gát differenciálódásában. Az erek simaizomsejtjeivel közös sejtvonalhoz sorolják őket, azonban elhelyezkedésük, morfológiájuk, bizonyos mértékig marker expresszió alapján megkülönböztethetjük őket, bár általánosan használható markert még nem sikerült találni [13]. Az eloszlásuk és az, hogy milyen mértékben borítják az endotheliumot, értípusonként változó. Számos fiziológiás és patológiás folyamatban szerepet játszanak. Megfigyelhető például, hogy hypoxia vagy agyi trauma esetén távolabb kerülnek az agyi mikroerektől, ami pedig hozzájárulhat a vér-agy gát permeabilitásának növekedéséhez. Hiányuk endotheliális hiperpláziát, abnormális morfogenezist idézhet elő az agyi erekben [12]. Bár a periciták jelentősége nyilvánvaló, azonosításuk nehézkes, mivel biokémiai, morfológiai, fiziológiai szempontból heterogének, így szerepükről még igen keveset tudunk A vér-agy gát permeabilitása, transzport rendszerek Mint már említettem az endothelsejteknél (ld fejezetben) kétféle transzport történhet: paracelluláris (vagy intracelluláris) és transzcelluláris (vagy intercelluláris). Köztük az az alapvető különbség, hogy a transzcelluláris transzport esetében a sejteken keresztül míg a paracelluláris transzport esetében a sejtek között jutnak át a molekulák az apikális oldalról a bazolaterális oldalra. A 3. ábra érzékelteti a transzport rendszerek elhelyezkedését. 13

14 3. ábra: A transzport rendszerek elhelyezkedésének és működési elvének a szemléltetése Paracelluláris transzport Paracelluláris transzportról beszélünk, ha a molekulák átjutása a szomszédos sejtek érintkezésén keresztül történik. Míg a transzcelluláris útvonal mind aktív mind passzív transzporttal bejárható, addig a paracelluláris úton csak passzív transzport révén juthatnak be a molekulák. Az utóbbi elektrokémiai, ozmotikus gradiens kialakulásával jár. A vér-agy gát esetében ez elvileg nem történhetne meg, hiszen az agyi erek endothelsejtjei közt szoros zárókapcsolatok vannak, azonban a tapasztalatok azt mutatják, hogy vannak olyan molekulák, amelyek paracelluláris úton jutnak be az agyba. A paracelluláris útvonalak vezetőképessége jól definiált érték, amely egyúttal meghatározza azt is milyen méretű és töltésű molekulák juthatnak át ezen az úton. A vér-agy gát paracelluláris permeabilitását az endothel citoszkeletonok közti összehúzó erő és az endothelsejtek közti, valamint a sejt-mátrix adéziós erők közti egyensúly biztosítja. Alapvetően egy igen dinamikus rendszerről beszélünk, ami a tight junction-öket felépítő molekulák kölcsönhatásainak dinamikus változásai révén a nyitott és zárt állapotok folyamatos cseréje történik, szigorúan szabályozott körülmények közt. Azonban a vér-agy gáton való átjutás esetében azt mondhatjuk, hogy a paracelluláris transzport szerepe nem jelentős. 14

15 Transzcelluláris transzport A transzcelluláris transzport folyamatokat energiaigény szempontjából két csoportra oszthatjuk: aktív és passzív transzportra. A passzív transzport, amelyet további két csoportra oszthatunk (facilitált és nem facilitált passzív transzport), fő jellemzője, hogy a koncentrációgradienssel egyező irányba történik az áramlás. Ide sorolhatók az ioncsatornák (pl. Na + - csatorna, Ca 2+ -csatorna). Ily módon jut be pl. a víz, a vízben oldott anionok, a kationok egy része..stb. A hidrofil, nagyméretű molekulák számára azonban passzív transzport gátolt. Az ilyen tulajdonságú anyagok aktív transzporttal juthatnak be. Aktív transzport esetén az áramlás a koncentráció-gradienssel ellentétes irányba történik. A legtöbb ilyen transzport energiaigényét közvetlenül az ATP terminális foszfátjának hidrolízise fedezi. Ezek az ún. elsődleges aktív transzportok. Ilyen pl. Na + K + - ATPáz. Vannak olyan transzportfolyamatok, amelyek nem közvetlenül kapcsolódnak az ATP hidrolíziséhez. A folyamat energiaigényét az elektrokémiai gradiensnek megfelelő irányba transzportáló anyag fedezi. Az ilyen transzportokat nevezzük másodlagos aktív transzportnak. Ilyen mechanizmussal történik pl. a glükóz és bizonyos aminosavak felszívódása a bélhámból. Morfológiai szempontból szintén két részre oszthatjuk a transzport folyamatokat: carrier mediált és vezikuláris transzport Receptor mediált transzport (RMT) A receptor mediált transzport mechanizmusának lényegét röviden úgy foglalhatjuk össze, hogy a keringésbe bekerült ligand összekapcsolódik az apikális membránban lévő receptorával, ezáltal egyfajta szignált indít el, amely indukálja az endocitózist. Ennek köszönhetően a receptor-ligand komplex egy klatrin nevezetű fehérje által burkolt intracelluláris vezikulába kerül. A RMT során a vezikula a bazolaterális oldalra kerül, ahol összeolvad a membránnal, így a ligand felszabadul. A receptor mediált transzport elsősorban a makromolekulák vér-agy gáton való átjuttatásában van nagy jelentősége. Ilyen módszerrel juthatnak be pl. különféle toxinok (diftéria, kolera), vírusok (szarkóma, adenovírus), fehérjék (transzferrin,ldl), hormonok (luteinizáló hormon), antitestek (Immunglobulin- G, -E). Fontos szerepet játszik a központi idegrendszer betegségeinek kezelésében, hiszen ebben az esetben meghatározó tényező, hogy az adott gyógyszer átjut-e a vér-agy gáton. Ha ezt az utat 15

16 célozzuk meg, akkor keresnünk kell olyan molekulát, amelynek van az endothelsejteken receptora (Klasszikus példák: inzulin receptor, transferrin receptor, LDL transzporterei). Ez a carrier lehet természetes eredetű vagy szintetikusan előállított pl. antitest vagy peptid. Ehhez konjugáljuk a bejuttatni kívánt hatóanyagot, így a gyógyszer a carrier molekulával együtt receptor mediált transzport segítségével átjut a vér-agy gáton [12,15-17] Carrier mediált transzport A carrier mediált transzport tulajdonképpen a RMT egyik fajtája. A folyamat során a sejtmembránban elhelyezkedő transzporter fehérjék segítségével történik a molekulák, ionok membránon való átjuttatása. A transzporter fehérjék jelen vannak mind az apikális mind a bazolaterális oldalon a BBB membránban, nagy sztereospecifitással rendelkeznek, így a molekulák szelektív transzportját könnyen meg tudják valósítani. Ilyen mechanizmussal jutnak el a központi idegrendszerhez a szükséges tápanyagok, például: aminosavak, glükóz, nukleozidok, szerves savak, vitaminok. A bejutás a koncentrációgradiensnek megfelelően (vérből agyba áramlás) facilitált diffúzióval történik [12,15-17] Adszorptív mediált transzcitózis (AMT) Az AMT alapja az elektrosztatikus kölcsönhatás a pozitívan töltött anyag és az agyi endothelsejtek felszínén lévő, negatívan töltött helyek között. A negatív töltés főként a savas glükoproteinek egyik alkotójának, a sziálsavnak tulajdonítható, de úgy tűnik sok esetben a heparán-szulfát jelenléte is szükséges a folyamat lejátszódásához [14,17,18]. A kölcsönhatás létrejötte után a bejuttatni kívánt molekula az endocitózis folyamatához hasonlóan egy vezikulába kerül. A vezikula vagy közvetlenül exocitózison esik át vagy a vezikuláris transzport valamelyik útvonalán halad tovább. Ha nem kerül lizoszómába a molekula, akkor végül az endothelsejt valamelyik oldalán exocitózissal kijut. Ezzel a módszerre főként a peptidek, proteinek jutnak be az agyba, így a központi idegrendszer betegségeinek gyógyítása esetén az aminosav alapú terápiás szerekkel ezt az útvonalat célozzák meg. 16

17 Efflux transzporterek Ahogy már korábban is említettem az efflux transzporterek az esetlegesen bejutó, sejtmembránon áthatoló, lipofil anyagok kívül tartásáért, a központi idegrendszer anyagcseretermékeinek kijuttatásáért, az agy homeosztázisának fenntartásáért felelősek. Alapvetően három csoportra oszthatjuk őket, amelyek a következőek: multidrog rezisztens transzporterek, monokarbonsav transzporterek, szerves ion transzporterek. [20] A legfontosabbak a multidrog-rezisztens transzporterek, így a következő részben ezeket mutatom be részletesebben Multidrog rezisztens transzporterek A multidrog rezisztens transzporterek egyik vér-agy gát szempontjából fontos tagja a P-glikoprotein (ABC transzporter vagy multidrog rezisztencia protein 1 (MDR1)). Az emberi szervezetben az agyi membránok luminális és abluminális oldalán egyaránt expresszálódik, így megfigyelhetők a periciták, asztrociták és mikroglia esetében is. A P-glikoprotein egy 150 kda-os fehérje, amely két homológ részből áll, közöttük a kapcsolatot egy flexibilis linker teremti meg. Az elektronmikroszkópos felvételeken jól látszik, hogy az MDR1 henger alakú membránfehérje, amely egy kb. 5 nm átmérőjű pórust alkot. [21] A P-glikoprotein működését nem ismerjük pontosan, több hipotézist találhatunk az irodalomban. A leginkább elfogadott az ún. pumpa-modell, amely szerint az ATP energiáját felhasználva történik a gyógyszerek, káros anyagok transzportja. Sokféle, sejtek számára toxikus anyagot pumpál ki, amelyek eltérő szerkezetűek lehetnek, de egy közös jellemzőjük van, mindegyik hidrofób karakterű. A P-glikoprotein fiziológiás jelentősége abban rejlik, hogy védi a sejteket a táplálékban és a környezetben előforduló toxikus anyagokkal szemben. Fontos tulajdonsága, hogy gátolható A vér-agy gát állapota a központi idegrendszert érintő betegségek esetén Mivel a gyógyszereket különböző megbetegedések esetén adjuk, ezért érdemes megvizsgálni, hogy a különböző kóros állapotok során milyen változások történnek a BBB integritásában, permeabilitásában. Általános tapasztalat, hogy a sérült agyszövetben a vér-agy 17

18 gát károsodott. Ez a károsodás vagy a betegség oka vagy pont ez okozza a kóros elváltozást. A jelenségnek nyilvánvaló negatív hatása mellett van egy nagy előnye: a gyógyszerek könnyen, szelektíven érik el a beteg területet. A következőkben áttekintem a központi idegrendszer fontosabb kórállapotait, és megvizsgálom, hogy ezzel párhuzamosan a vér-agy gát permeabilitása hogyan befolyásolja az adott állapot kialakulását, kezelését Neurodegeneratív betegségek Alzheimer-kór Az Alzheimer-kór az időskori dementia egyik formája, a kognitív képességek és az emlékezet progresszív hanyatlását idézi elő. A homloklebeny, halántéklebeny és hippokampusz kolinerg neuronjainak degenerációját, az említett szervek sorvadását okozza. A megbetegedés kialakulásában a vér-agy gát károsodása, megnövekedett permeabilitása jelentős szerepet játszik. Megfigyelték, hogy a kóros területen amyloid felszaporodás történik. A β-amyloid egy heterogén, aminosavból álló peptid. [22] A lerakódás oka ismeretlen, egyik elmélet szerint a β-amyloid eleve az agyban keletkezik. Egy másik elmélet szerint a β-amyloid a keringési rendszerből származik, és ha átjut a vér-agy gáton neurotoxikus hatást vált ki. Ahogy már említettem több peptid és proteinreceptor-mediált transzport (lásd ) segítségével jut át a vér-agy gáton és kerül a központi idegrendszerbe [23]. A β-amyloid is ilyen mechanizmussal jut be az agyba. A betegség kezelése jelenleg kolin-észteráz gátlókkal történik Parkinson-kór A Parkinson-kór az Alzheimer-kórhoz hasonlóan lassan előrehaladó, degeneratív betegség. A kór a középagy dopaminerg neuronjainak károsodását okozza, ennek következtében dopamin hiány alakul ki a striatumon. A betegséget kiváltó ok többnyire ismeretlen, idegrendszeri fertőzések, más degeneratív betegség, gyógyszerek, pszichoszomatikumok egyaránt előidézhetik. A Parkinson-kór kialakulása mögött azonban az esetek nagy többségében a P-glikoproteinhez kötött transzport rendszer csökkent efflux-funkciója áll, ami azt jelzi, hogy a BBB nem tudja ellátni maradéktalanul a feladatát [25]. A kezelés az agy dopamin szintjének növelését célozza meg. 18

19 Cerebrovaszkuláris betegségek Cerebrovaszkuláris megbetegedésekről akkor beszélünk, ha bizonyos okból (pl. agyi trombózis, agyi embólia, agyvérzés) az agyban részben vagy egészben csökkent mértékű vagy teljesen leáll a keringés. A vér-agy gát integritása az agyi ereket érintő megbetegedésekben több okból kifolyólag változatos. Például hipoxiás állapot kialakulása esetén nő a BBB permeabilitása, ezzel együtt az agyi erekben véráram drasztikusan lecsökken, ami a citokinek (interleukin 1 és tumornekrosis faktor (TGF β1)) aktivitásához vezet. A citokinek megjelenése a sejtadhéziós molekulák túlszabályozását eredményezi. A reperfúzió következménye, hogy a limfociták át a vér-agy gáton, és felszabadíthatnak az agyban proteázokat (metalloproteázokat), amelyek a vér-agy gát kinyílását indukálják [21]. A betegség kezelése a kiváltó októl függ. Általában azonban elmondható, hogy a plakkok kialakulásának gátlását célozzák meg a terápiás módszerek Gyulladásos betegségek Fertőzés A központi idegrendszer fertőzés lehet bakteriális, virális, gombás vagy parazita eredetű. A mikrobák központi idegrendszerbe való bejutásának, vér-agy gáton át történő penetrációjának a mechanizmusa nem teljesen ismert. Alapvetően három lehetséges útról beszélhetünk. 1) Transzcelluláris penetráció: Ennek során a fertőző ágensek átjutnak a véragy gáton anélkül, hogy annak a permeabilitását megváltoztatnák. Így jut be az agyba a például az Escheria coli, a Streptococcus pneumonie, a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). A mechanizmust tekintve történhet az átjutás vakuoláris transzporthoz hasonlóan vagy receptor-mediált endocitózissal. A HIV-1 vírust gp120 fehérje borítja, amely adszorptív mediált endocitózist indukál, és így jut be a HIV-1 vírus az agyszövetekbe. 2) Paracelluláris útvonalak: Egy agyi fertőző ágens nagyon gyakran a vér-agy gát permeabilitásának megváltoztatásával (növelésével) jut be a központi idegrendszerbe. Általában elmondhatjuk, hogy a fertőzésre adott immunválasz következtében különböző mediátorok (citokinek, kemokinek, sejtadhéziós molekulák, mátrix metalloproteázok) szabadulnak fel a fertőzés helyén. Ez a folyamat a központi idegrendszerben azzal jár, hogy megváltozik a vér-agy gát szerkezete, funkciója. A 19

20 citokinek és a mátrix metalloprotázok például hozzájárulnak a vér-agy gát kinyílásához. Mindez pedig például a Streptococcus pneumonie és a HIV-1 vírus vér-agy gáton át történő penetrációját eredményezi [21]. 3) Trójai ló mechanizmus: Ennek során egy fertőzött makrofág aktiválja az agyi endothelsejteket és ezáltal a fertőzött makrofágot mint mikroglia sejtet fogják a központi idegrendszerbe bejuttatni. Az endothelsejtek és az immunsejtek a szükségesnél jóval nagyobb mennyiségben termelik az adhéziós molekulákat, amely azt eredményezi, hogy a keringésben lévő immunsejtek kötődnek az agyi erekhez, ami az immunsejtek vér-agy gáton keresztüli útjának az első lépése lehet. Így a virális részecskék igen könnyen bejutnak az agyba, a fertőzött immunsejteket mintegy Trójai faló -ként használva. Például a HIV-1 vírus ilyen módszerrel is átjuthat a vér-agy gáton Sclerosis Multiplex (SM) A sclerosis multiplex az egyike a központi idegrendszert leggyakrabban érintő fertőző betegségeknek. A kór lefolyása során a beteget saját immunrendszere támadja meg, az idegsejt nyúlványait, myelinhüvelyeit károsítja, roncsolja. Ennek következtében az ingerületvezetésben hiba lép fel, lassabban vagy egyáltalán nem működik. A szervezet megpróbálja kijavítani a rost burkolatán lévő hiányosságokat a rendelkezésre álló támasztószövettel, ennek következtében kemény gócok alakulnak ki. A vér-agy gát szerepe a betegség kialakulásában a következő. Bár nincsen egyértelmű magyarázata a betegség kialakulásának, mindegyik elméletben kulcsfontosságú elemnek tartja a T- sejtek BBB-n való átjutását, illetve elismeri a gliasejtek szerepét kór lefolyásában. A kezelés során elsősorban a gyulladás megszüntetését célozzák meg, különböző gyulladás csökkentő szerekkel Agytumor Emberben a gliomák a leggyakoribbak az elsődleges, központi idegrendszert érintő tumorok között. A különböző típusú gliomákat megkülönböztethetjük a szövettani tulajdonságokat tükröző sejtvonalak alapján. Így beszélhetünk asztrocitomáról, oligodendrogliomarol, és oligoasztrocitomáról. A tumorok vérellátása alapvetően meghatározza a további fejlődésüket. Az agyi erek falának megvastagodás együtt jár az endothelsejtek hiperplaziájával, amely megnöveli a nem-szelektív 20

21 transzendotheliális transzport lehetőségét, vagyis a vér-agy gát nem tudja ellátni a feladatát. Gliomák esetében nyitott szoros zárókapcsolatok az egyik legfontosabb abnormalitás. Asztrocitómák esetén ez az abnormalitás az occludin expressziója során jelentkezik, ugyanis vagy megakadályozzák vagy olyan formában exprimálják, amely nem tudja ellátni a funkcióját. A gliomák kezelése nagyon nehézkes, ugyanis a kemoterápiára igen gyenge választ adnak, sok esetben rezisztensek a terápiás gyógyszerekre. (Utóbbi a rákos sejt módosult biokémiai folyamatainak köszönhető.) Ezt minél inkább elkerülendő az antitumor hatású gyógyszerek igen toxikusak mind az egészséges, mind a rákos sejtek számára, ezért a kemoterápia az igen komoly mellékhatások miatt gyakran csak korlátozott mértékben alkalmazható. [15, 21] Ezek alapján nyilvánvaló, hogy a gyógyszerek központi idegrendszerhez való eljuttatása mind normál, mind patológiás állapotban korlátozott mértékben mehet végbe. Ahhoz, hogy sikeres lehessen a központi idegrendszert érintő betegségek kezelése, különböző, új stratégiákat kell bevetni a gyógyszerek célba juttatására. 2.5 Stratégiák gyógyszerek központi idegrendszerbe juttatására A gyógyszerek diffúziója a vérből az agyba elsősorban azon múlik, hogy az adott biológiailag aktív molekula képes-e átjutni a lipidmembránon. Az ehhez elengedhetetlen tulajdonságok a következők: hidrofób jelleg és kis méret. Számos gyógyszer azonban nem rendelkezik ezekkel a tulajdonságokkal, így különböző stratégiákat kell alkalmazni annak érdekében, hogy eljussanak a célszervbe (jelen esetben az agyba). Alapvetően kétfajta technikát különböztetünk meg: invazív és nem invazív. A következőkben ezeket fogom jellemezni Invazív technikák A vér-agy gát funkció kijátszására már 50 évvel ezelőtt is voltak technikák. Az első erre irányuló módszer Neuwelt nevéhez fűződik [26]. Az eljárás során mannitol oldatot fecskendeztek a páciensek nyaki artériáiba. A normálishoz képest igen magas cukormennyiség az agyi erekben azt eredményezte, hogy az endothelsejtekből kiáramlott a víz, így megnyíltak 21

22 a 'tight junction'-ök. Ez a hatás percig tart, ami alatt azok a gyógyszerek, amelyek normál esetben nem jutnának át a vér-agy gáton most szabadon beáramoltathatnak az agyba. Általában akkor alkalmazzák ezt a kezelési módot, ha a betegnek rosszindulatú gliomája, agyi limfómája van. Habár igen sok mellékhatással jár ez a technika (pl. fizológiai stressz, megnövekedett intracranialis nyomás, nem kívánt anyagok bejutása az agyba, a gyógyszerek normál szövetekbe való eljutása), ezen a kóros állapotok mérséklésére hatékonyan alkalmazható [22,26]. Egy másik lehetőség a vér-agy gát permeabilitásának növelésére vazoaktív molekulák (pl. bradykinin, leukotrien, cereport) alkalmazása [27]. Ennek az az előnye, hogy csak az agy tumoros részén növeli meg a kapillárisok áteresztő képességét, az egészséges részen nem, így az antitumor hatású gyógyszerek csak a rákos szövetekhez juthatnak el, az egészségesekhez nem. Ennek a jelenségnek az a biokémiai alapja, hogy az egészséges agyi kapillárisokban a bradykinin receptorok teljes mértékben hiányoznak, ami azt eredményezi, hogy a bradykinin penetráció korlátozott. Ennek köszönhetően a gyógyszerek az egészséges szövetekhez nem jutnak el [22,27]. Egy más terápiás módszer, amellyel a klinikumban próbálkoznak, a közvetlen gyógyszer adagolás. Ennek során a szubkután a skalpba implantálnak egy műanyag eszközt, amelyen keresztül közvetlenül az agyba juttatják be a hatóanyagot. A módszer azonban sok problémát vet fel. Egyrészt az emberi agyban a liquor és a gyógyszer célterülete igen közel lehet egymáshoz (néhány cm). Mivel a gyógyszerek esetében penetrációra és diffúzióra is számíthatunk, így előfordulhat, hogy kisebb mennyiségben jut el a kóros részre [28] Nem invazív technikák, kolloidális gyógyszerhordozók A kolloidális gyógyszerhordozó rendszereket az elmúlt évtizedben széleskörűen alkalmazták a hatóanyagok irányított, hatékony célba juttatására. Ez annak köszönhető, hogy a nanorészecskék csökkentik az immunreakciók lehetőségét, ezáltal a hatóanyagok nagyobb hatásfokkal jutnak el a célszövethez, így határozottabban érvényesülhet gyógyító hatásuk. Azonban mindehhez a hordozó rendszereket kontrollálni kell tudni, vagyis pontosan ismernünk kell a részecskék méretét, felületi tulajdonságait, stabilitását, hatóanyag-tartalmát Polimer micellák A polimer micellák olyan gyógyszer szállító rendszerek, amelyek egy amfifil 22

23 kopolimerből épülnek fel. Ez a kopolimer kétféle monomerből áll, amelyek közül az egyik hidrofil (héj), a másik hidrofób (mag). Azért előnyös ez a struktúra, mert a kétféle monomer arányát változtatva, a célszervtől függően választhatjuk meg a részecskék fizikai-kémiai és farmakológiai tulajdonságait. A hidrofil héj nagyban hozzájárul ahhoz, hogy a polimer micellák gyógyszerhordozóként alkalmazhatóak legyenek, ugyanis a hidrofil felszín biztosítja a micellák diszpergálódását, valamint a sztérikus stabilizáció révén csökkenti a nem kívánt kölcsönhatásokat a gyógyszer és a sejtek, fehérjék közt. Védik a hatóanyagot a biológiai környezet okozta inaktiválódástól, így az anyag biológiai szempontból hozzáférhetőbb lesz és a fokozatos hatóanyag leadásnak köszönhetően jóval tovább marad a szervezetben, így nem szükséges többszöri gyógyszer bevétel [29]. Előnyös tulajdonságuk, hogy vizes közegben termodinamikailag és kinetikailag stabilak. Méretük nm-es mérettartományban helyezkedik el, amely megfelel a vér-agy gáton való átjuttatás méretkövetelményének [16]. Említésre méltó eredmény Kabanov és munkatársai észrevétele miszerint a poloxamer polimerből készült micellákat antitestekkel konjugálva lényegesen javul a haloperidol agyi disztribúciója, így jelentősen megnőtt a gyógyszer hatékonysága [30] Liposzómák A liposzómák kisméretű vezikulák, amelyek unilamelláris vagy multilamelláris foszfolipid kettősrétegből állnak. Általában biokompatibilis és biodegradábilis lipidek építik fel, amelyek nagyon hasonlóak a biológiai membránokhoz. A biofizikai sajátságaik nagyon különbözőek lehetnek. Előnyös tulajdonságaik közé tartozik, hogy a szervezetben az eloszlásukat kontrollálhatjuk, befolyásolhatjuk a kémiai sajátságaik módosításával kölcsönhatásukat a különböző sejtekkel, ezáltal a gyógyszerszállítás módját változtathatjuk. A liposzómát, mint gyógyszerhordozót a központi idegrendszer sokféle kóros elváltozása ellen lehet alkalmazni, mivel a kémiai sajátságaik a terápiásnak célnak megfelelően módosíthatók. A következők szakaszban néhány fontosabb példát mutatok be. A polietilénglikollal (PEG) bevont liposzómák rendelkeznek azzal a nagy előnnyel, hogy felületük hidrofilebb volta miatt hosszabb időt töltenek a vérkeringésben, és a retikulo hisztiocita rendszer (RHS) is kevésbé támadja meg őket. 23

24 Mindez lehetővé teszi, hogy szelektíven a tumoros vagy gyulladásos területen adják le az általuk hordozott hatóanyagot. Napjainkban elsősorban a rákos megbetegedések kifejezetten glioblastoma és metasztázis esetén, kezelése során alkalmazzák, a hatóanyag pedig doxorubicin, ami az egyik leggyakrabban alkalmazott hatóanyag rákos betegedések kezelésénél [33]. (Caelyx néven kereskedelmi forgalomban kapható.) A gyógyszerek liposzómák segítségével történő aktív célba juttatás ötlete a múlt évtizedben merült fel elsőként a kutatókban [31,33]. Az ötlet gyakorlatilag a Trójai faló elven alapszik, miszerint ha a liposzómák kis hatékonysággal vagy egyáltalán nem jutnak be a célsejtbe, akkor konjugáljuk olyan antitesttel vagy ligandummal, amelyeknek van receptora az adott sejten. Ez az elképzelés pl. a vér-agy gáton való átjutást olyan részecskék számára teszi lehetővé, amelyek egyébként nem lépnének be az agyba. Ha például monoklonális antitesthez (MAb) konjugáljuk a PEGgel borított liposzómát, a konjugátum a képes a MAb vér-agy gát felszínén lévő receptorjához kötődni és így receptor mediált endocitózis segítségével bejutni az agyba. A MAb mint a Trójai faló segít átjutni a liposzómáknak a biológiai gátakon, így azok elérhetik a célsejtet, és ott kifejthetik terápiás hatásukat [32,33] Nanorészecskék Az utóbbi évtizedekben egyre inkább nyilvánvalóvá vált, hogy a gyógyszerek célba juttatásának az egyik leghatékonyabb és legelőnyösebb módszere, hogy gyógyszerhordozóként biokompatibilis nanorészecskéket alkalmazunk. Nanorészecskének nevezzük azokat a szerves (általában polimer) vagy szervetlen anyagból felépülő carrier rendszereket, amelyek mérete legfeljebb 200 nm. A nanorészecskék belsejébe gyógyszereket és egyéb szervezetbe bejuttatandó molekulákat zárhatunk. A gyógyszerhordozók az esetek többségében polimerből készülnek, amelyek széles skálája áll rendelkezésünkre. Például: polikaprolakton, poliszacharid, politejsav (PLA), poliglikolsav (PGA), kitozán. Ezek közül azok a legelőnyösebbek, amelyek biokompatibilisek és biodegradábilisek is. Ilyen a politejsav és a poli(d,l-tejsavglikolsav) kopolimerek [21]. Az utóbbi időben egyre nagyobb figyelem irányul a politejsavra és a tejsav/glikolsav különböző arányú, random kopolimerjére. Ennek elsősorban az az oka, hogy ezek az anyagok teljesítik a gyógyszerhordozóktól elvárt két alapkövetelményt 24

25 miszerint legyenek biokompatibilisek és biodegradabilisek. A PLGA poliészter molekula, amely könnyen hidrolizál, és a szervezetben természetes körülmények között is megtalálható tejsavra és glikolsavra bomlik. Szerkezetét a 4. ábrán tüntettem fel. 4. ábra: A PLGA szerkezete A másik nagy előnye, hogy szabályozott hatóanyag leadást biztosít. Ennek megfelelően a központi idegrendszert érintő betegségek esetében is gyógyszerhordozó jelöltek közt van. Ebben az esetben a sikeres hatóanyag célba juttatás elsődleges feltétele a vér-agy gáton való átjutás. Fontos a megfelelő méret, felületi tulajdonságok, biokompatibilitás, stabilitás a vérben, célszervhez való affinitás. A méret azért lényeges, mert egy bizonyos átmérő felett sztérikus okokból nem juthat be a részecske. A felületi tulajdonságoknak elsősorban a fehérje abszorpció, illetve lipidoldékonyság miatt van jelentősége. Ugyanis ha hidrofób egy objektum felülete, megtapadnak rajta a fehérjék, és a mononukleáris fagocita rendszer aktivizálódik. Ennek következtében az anyag kiürül a véráramból, és a májba vagy a lépbe jut. Mindkét jelenség komoly befolyásoló tényező a vér-agy gáton való átjutást illetően. A biokompatibilitást is elvárjuk egy gyógyszerhordozótól, hiszen ha az anyag nem összeegyeztethető a szervezettel, vagyis immunreakciókat vált ki, kikerül a véráramból, így eleve nem érheti el a hatóanyag a célszervet. Összefoglalva, a következők tulajdonságokkal kell rendelkeznie egy gyógyszerhordozónak: a részecskék mérete legyen kisebb, mint 100 nm ne legyen toxikus, sokkal inkább biodegradábilis és biokompatibilis legyen stabil a vérben ne aggregálódjon a RHS ne távolítsa el hosszú legyen a vérben a tartózkodási ideje 25

26 költséghatékony, egyszerű előállítási módszerrel készüljön [14, 33]. Az elvárt feltételeket ezidáig egy anyag sem tudta önmagában teljesíteni. Sok esetben az a probléma, hogy az előállítás, konjugálás során mások az elvárások, mint a szervezetbe, célszervbe való bejuttatás, hatóanyag leadás során. Ennek az az egyszerű megoldása, hogy a nanorészecskék felületét módosítják. A PLGA esetében ez hidrofilebbé tételt jelent, amelyet különböző biokompatibilis polimerekkel (pl. PEG, poliszorbát, Pluronic ) lehet megvalósítani. Elsősorban a fehérjeabszorpció megelőzésében van nagy szerepük. Az intravénásan adagolt gyógyszerekre először a RHS reagál. Ennek köszönhetően a kívánatosnál gyorsabban kiürülnek a véráramból és májban, lépben, csontvelőben halmozódnak fel. Ha azonban a felületmódosítással csökkentjük a fehérjeabszorpciót, a RHS számára nem lesz elérhető a részecske, így hosszú ideig a vérben maradhat, eljuthat a célszervhez [33]. A felületaktív anyagnak az előállítás és tárolás során is meghatározó szerepe van, ugyanis megakadályozza a részecskék aggregálódását, elősegíti diszpergálódásukat. A részecskék felületének módosítása tehát a fehérje abszorpció és ezzel együtt a véráramból való gyors kiürülés kiküszöbölése miatt szükséges. Ezzel ellentétes tény viszont, hogy a sejtmembránon való átjutáshoz hidrofób tulajdonság szükséges. Az ideális felszín tehát nem teljesen hidrofil, csupán csak annyira, hogy a fehérjék ne tapadjanak meg rajta. A gyógyszerhordozók felületének hidrofilebbé tételét különböző polimerek segítségével érhetjük el. Erre alkalmas pl. a polietilén-oxid. Egyik lehetőség, hogy beépítjük a részecskét alkotó polimerbe, így blokk-kopolimer alakul ki. Ennek a szerkezetnek az a hátránya, hogy a PEO akadályozza a fehérje természetű anyagok felszabadulását a nanorészecskéből. Ezt kiküszöbölhetjük, ha valamely PEO-tartalmú vegyületet adszorbeáltatunk a gyógyszerhordozó felületére, így a molekula hidrofób része rögzíti a részecske felületén a polimert. A polimer PEO-t tartalmazó része pedig a közegbe nyúlik, így hidrofilebbé teszi a felületet [34-36]. A céljainknak a Pluronic felelt meg a legjobban, így ezt használtam a PLGA nanorészecskék felületének módosítására. A Pluronic egy blokk-kopolimer, amely polipropilénoxid (PPO) és polietilénoxid (PEO) részekből épül fel. A felület hidrofil jellege, ahogy az előbb említettem, a felületi rétegben lévő PEO mennyiségétől függ. Szerkezete az 5. ábrán látható. 26

27 5.ábra: Pluronic F127 szerkezete A nanorészecskék többféle módszerrel előállíthatók. A módszereket három nagy csoportba sorolhatjuk: gőz-, szilárd- és folyadékfázisú technikák. Ezek közül a szerves nanorészecskék előállítására leggyakrabban használatos a folyadékfázisú technika. Többféleképpen alkalmazhatjuk, így pl. ismerünk emulziós módszereket: olaj/víz (O/W), víz/olaj (W/O), olaj/víz/olaj (O/W/O), nanoprecipitáció, Graham-módszer, beoltásos módszer, redukciós módszer. Mivel a kísérletek során nanoprecipitációs eljárással állítottam elő a nanorészecskéket, így a továbbiakban ezt a módszert jellemzem. A nanoprecipitációs eljárás megegyezik a klasszikus oldószer kicseréléses technikával. Az eljárás során két fázist hozunk létre: az egyik egy vizes fázis (ebben van oldva a felületaktív anyag), a másik egy vízzel elegyedő szerves fázis (ebben van oldva polimer). A vizes fázishoz óvatosan, keverés közben, cseppenként adagoljuk a polimeroldatot. Mivel a polimer vízben oldhatatlan, így nanoméretű részecskék formájában kicsapódik az oldatból. A folyamat végeredményeként nm-es mérettartományba eső részecskékből álló nanoszuszpenziót kapunk [37,38]. Az eljárás nagy előnye, hogy könnyen, gyorsan megvalósítható, nem igényel szonikálást, egy mágneses keverő elegendő hozzá, nem szükséges magas hőmérséklet, nincs olaj/ víz határfelület, amely sok esetben roncsolja a fehérjéket. A méretcsökkentést az irodalomban talált eredmények alapján terveztük meg [40,41]. Ezek alapján úgy tűnt, hogy a vizes fázis térfogatarányának növelése, illetve a polimer koncentrációjának csökkentése mindenképpen szükséges a 100 nm alatti méret eléréséhez. Ez a további munka során egy korábbi közleményben leírt eredménynek köszönhetően [42] a szerves fázis összetételének változtatásával egészült ki. Az előállított nanorészecskék jelölésére fluoreszcens festékeket alkalmaztam. Ezeket irodalmi előzmények alapján választottam ki [42,43]. A továbbiakban ezeket fogom jellemezni. 1. Fluoreszceinek: Az egyik leggyakoribb biológiai jelölőanyag, ftaleinek családjába tartozó fluorofor 27

28 festék. Szerves oldószerekben jól oldódik, vízben viszont alig. Izotiocianát formában alkalmazzák általában, ugyanis a tiocianát csoporton keresztül könnyen lehet kötni különféle molekulákhoz. A vér-agy gáton nem jut át, mivel a szervezetben fehérjék kötődnek hozzá. A fluoreszcein, fluoreszcein Na-sója és karboxi-fluoreszcein festékeket használtam a vizsgálatok során. Szerkezetük a 6. ábrán látható. 6.ábra: a) fluorescein, b) karboxi-fluorescein szerkezeti képlete 2. Rhodaminok: A rhodaminok szintén fluoreszcens jelzőanyagok. Több fajtájuk ismeretes, amelyek csak néhány kémiai csoportban különböznek egymástól. (7. ábra) Ezek közül a leggyakrabban használt a rhodamin B. A rhodamin B egy olyan fluoreszcens anyag, amely szerkezetéből adódóan ugyan bejut az endothelsejtekbe, de onnan egy aktív efflux pumpa (MDRP-k irányítják) hatására ki is ürül. Így intakt érszerkezet esetén nem jelenik meg az agyban. Sérült érszerkezet esetén azonban kiáramlik és megfesti a sérült területet. 7.ábra: a) rhodamin B, b) rhodamin B base, c) rhodamin 6G szerkezeti képlete 28

29 3. Célkitűzések Az ELTE Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriumában már korábban is folytak kutatások a PLGA nanorészecskék gyógyszerhordozóként való alkalmazásával kapcsolatban. A részecskéket PLA és PLGA polimerekből, nanoprecipitációs eljárással állították elő, Pluronic -ot alkalmazva felületmódosításra. Ennek során a szerves fázis/vizes fázis aránya 1:4-nek adódott, a polimer oldószere pedig aceton volt. A PLGA egy biokompatibilis, biodegradábilis kopolimer, amelyből egyszerű eljárással nanorészecskét lehet előállítani. A felülete könnyen hidrofilebbé tehető, amely még kedvezőbbé teszi a gyógyszerhordozóként való hasznosítását. Stabil rendszert alakíthatunk ki, ugyanis a Pluronic nemcsak a felület hidrofilizálása miatt szükséges, hanem gátolja az aggregációt is. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy a PLGA hordozók alkalmasak lehetnek a központi idegrendszert érintő betegségek kezelésében hatékony gyógyszerformulák kialakítására. Munkám során egyik célom az volt, hogy kidolgozzak egy olyan hordozórendszert, amely megfelel a vér-agy gáton való átjutás feltételeinek, vagyis a részecskék mérete 100 nm alatti, felületük hidrofil, Pluronic -kal borított, biokompatibilis, és megfelelő fluoreszcens jelölő anyagot tartalmaz. A munkám másik célja a vér-agy gát permeabilitásának in vivo vizsgálata, különböző festékekre és hordozórendszerekre, ép és sérült állatokban. A vizsgálatokhoz Wistar, albínó, felnőtt patkányokat használtunk. 29

30 4. Kísérleti összefoglaló: 4.1.Felhasznált anyagok: PLGA 50/50, tejsav/glikolsav random kopolimer, tejsav-glikolsav arány 1:1, M = g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Pluronic 12700, Mw = g/mol, poli(etilén-oxid)-poli(propilén-oxid)-poli(etilén-oxid) (PEO-PPO-PEO) blokk-kopolimer, BASF Hungaria Kft., Magyarország Aceton alt., M = 58,08 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Dializáló csövek, Cellulóz észter membrán, M = g/mol, Float-A-Lyzer, Spectra/Por, Hollandia Kétszer desztillált víz (felületi feszültsége nagyobb, mint 71,5 mn/m) Fluoreszcein (C20H12O5) M= g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Fluoreszcein Na-sója (C20H10Na2O5 ), M= g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Karboxifluoreszcein (C21H12O7 ), M= g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Rhodamin 6G (C28H31N2O3Cl ), M= 479,01 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Rhodamin B (C28H31ClN2O3 ), M= 479,01 g/mol, Sigma-Aldrich, Németország Rhodamin B base (C28H30N2O3),M= g/mol, Sigma-Aldrich, Németország 4.2. Nanorészecskék előállítása Nanoprecipitáció A nanorészecskék előállításához nanoprecipitációs módszert alkalmaztunk. A nanoprecipitációs eljárás a következő lépésekből áll. Elsőként két oldatot (szerves és vizes fázist) készítünk. A szerves fázisban, ami lehet etilacetát, etilformiát, dimetil szulfoxid, aceton stb feloldjuk a polimert, amelyből szeretnénk a nanorészecskéket kialakítani. A vizes fázisban, amely általános esetben négyszerese a szerves fázisnak, pedig egy felületaktív anyag kerül feloldásra. Esetünkben a szerves oldószer az aceton volt, ebben oldottuk a PLGA-t 2 g/l koncentrációban, a vizes fázisban lévő felületaktív anyag pedig a már említett Pluronic A következő lépés a szerves oldat a vizes oldatba való csepegtetése volt. Ennek során a vizes fázist egy főzőpohárba öntöttük, és mágneses keverővel kevertettük. Ezután a szerves és a vizes fázis egyesítése következik, amelyet egy fecskendő segítségével cseppenként történt. Mivel az eljáráshoz használható polimerek hidrofób tulajdonságúak, így vízbe csepegtetve nanoméretű, gömb alakú részecskék formájában kicsapódnak. A vízzel elegyedő szerves fázist keverés mellett eltávolítjuk. Ezt mi fülke alatti elpárologtatással oldottuk meg. Majd az 30

31 esetlegesen kicsapódott, nagyobb polimer részecskéket asztali centrifuga segítségével eltávolítottuk, így a folyamat végére egy vizes nanoszuszpenziót kaptunk. (Ez megegyezik a klasszikus szollal.) Az eljárás kidolgozása Ha az előbb említett általános recept alapján dolgozunk, akkor kb nm átmérőjű részecskéket kapunk. Ezt szerettük volna lecsökkenteni nm-re a folyamat különböző paramétereinek módosításával. Elsőként a szerves és vizes fázis térfogatarányának változtatásával próbálkoztam. Az eredeti 1:4 arányt először egységenként 1:10-ig, majd nagyobb lépésekben 1:40-ig változtattam. A kísérletek körülményeit az 1. táblázat mutatja. Minta száma Szerves fázis Vizes fázis A szerves/vizes V / ml c(plga) / gl -1 V / ml c(f127)/ gl -1 fázis aránya : : : : : : : : : : : : : : : :40 1. táblázat: A PLGA nanorészecskék előállításának körülményei Másodsorban a (szerves fázisban lévő) PLGA-koncentráció csökkentésének részecskeméretre gyakorolt hatását vizsgáltam. A szerves fázisban a PLGA koncentrációját 10 g/l és 1 g/l között változtattam. A kísérleti körülmények az előző esethez hasonlóak voltak. A rendszerek előállításának körülményeit a 2. táblázatban szemléltettem. 31

32 Minta száma V / ml Szerves fázis Vizes fázis c(plga) / gl -1 V / ml c(f127)/ gl -1 A szerves/vizes fázis aránya : : : : :10 2. táblázat: A PLGA koncentráció csökkentése során alkalmazott kísérleti körülmények Az irodalomban kutatva találtam egy eljárást, amelyet ugyan másfajta, nanorészecske előállítására használatos módszer során alkalmaztak, de úgy gondoltuk hasznos lehet, ha kipróbáljuk [41]. Ez pedig a következő volt; a szerves fázishoz 15% etanolt adtak a részecskék képződésének elősegítése miatt. Többféle módon, többféle mennyiségben próbálkoztam etanol hozzáadásával. Ezek során növeltem az arányát a szerves fázisban, illetve a vizes fázishoz adtam különböző mennyiségekben. A kísérletek során a szerves és vizes fázis aránya minden esetben 1:10 volt. A kísérleteket jellemző adatokat a 3. táblázatban foglaltam össze. Szerves fázis Vizes fázis V(EtOH) / μl V(Aceton) / μl c(plga) / gl -1 V(EtOH) / ml V(Víz) / ml c(f127)/ gl táblázat: Etanol hozzáadásával előállított rendszerek Fluoreszcens anyagok A célkitűzésekben megfogalmazott feladatok megoldása végett jelölni kellett a részecskéket. Mivel a felületüket nem akartam megváltoztatni (kovalens kötés kialakítása a részecske és a festék között pedig ezzel járhatna), ezért a részecske belsejébe minden egyéb kötődés nélkül akartam bezárni a molekulákat. Ez azért is volt előnyös, mert jól modellezi a későbbi, gyógyszermolekulával történő munkát is. Az irodalmi előzmények segítségével választottam ki a használt fluoreszcens festékeket [42]. A legtöbb festéket eddig a jelölni kívánt molekulához kapcsoltan alkalmazták. A fluoreszcens anyagot a szerves fázisban oldottam. Az irodalomban talált mennyiségi adatok alapján úgy látszott, hogy a PLGA koncentrációjának 1%-a elegendő az in vivo vizsgálatokra is alkalmas fluoreszcens jelölés eléréséhez [43]. Ezt kétféleképpen alkalmaztam. 32

33 A kutatócsoportunk korábbi tapasztalatai alapján a sikeres kapszulázás érdekében a szerves fázisban kell lennie a bezárni kívánt anyagnak. Így elsőként azokat a festékeket használtam, amelyek inkább hidrofób tulajdonságúak voltak, így oldódtak az acetonban. Majd kipróbáltam a hidrofilebb festékek vízben való oldása esetén milyen hatásfokkal történik meg a kapszulázás. Minden esetben 2 mg/ml-es, acetonos PLGA oldat volt a szerves fázis, illetve 2 mg/ml volt a F 127 koncentráció a vizes fázisban. Így a festékek koncentrációja 0,02 mg/mlnek adódik, amelyet töményebb oldatukból való hígítással értem el. Az esetlegesen be nem záródott molekulákat dialízissel távolítottam el, amelyet fluorimetriás mérésekkel követtem. A dialízis során cellulóz észter membrán dialízis csöveket alkalmaztam. Az egyik végét lezártam egy madzaggal, a másik végére egy üveg gyűrűt rögzítettem, majd felakasztottam egy lombik fogóra. A szuszpenziót beletöltöttem, majd a csövet desztillált vízbe merítettem. A dializáló vizet fél óránként cseréltem. A legtöbb esetben másfél óráig tartott a dialízis, a dializáló térfogat 250 illetve 300 cm 3 volt. A fluorimetriás méréseket a Varian Cary Eclipse típusú fluoreszcens spektrofotométeren végeztem el Scan módban, az első mérés előtt Prescan-t futtatva A részecskék jellemzése Dinamikus fényszóródás mérés Ha egy részecskét fénnyel besugárzunk, a fény szóródik a tér minden irányába (Rayleigh-szórás). A szórt fény intenzitása pedig információt hordoz a részecske méretéről. A besugárzó fény és a szórt fény frekvenciája a Doppler-effektusnak köszönhetően különbözik, amelynek az a következménye, hogy a szórt fény interferenciájának mértéke folyamatosan változik. Ez az interferencia-fluktuáció hordozza számunkra az információt, amelyet a térerő autokorrelációs függvénnyel (g(τ))jellemezhetünk. g(τ) = Aexp( Γτ) ahol 1/Γ a relaxációs idő, τ pedig a korrelációs idő. Γ = Dq 2, ahol D a kollektív diffúziós állandó q pedig a szórási vektor: 4πn Θ q= sin λ 2 ahol n a közeg törésmutatója, λ a lézer fényforrás hullámhossza, θ a szórási szög. 33

34 A kollektív diffúziós állandót a következőképp számolhatjuk ki: D=D 0 (1+kc) A kollektív diffúziós állandóból az Einstein-Stokes egyenlet segítségével számíthatjuk ki a részecskék méretét feltételezve, hogy a részecskék gömb alakúak és a szórt fény intenzitás- fluktuációja a transzlációs diffúzió következménye. D 0 = kt 3πηd ahol k a Boltzmann-állandó T a hőmérséklet, η a közeg viszkozitása, d a részecske átmérője. A méréseket Brookhaven típusú fényszóródásmérő berendezéssel (8. ábra) végeztem el vizes közegben az alábbi beállítások mellett: λ lézer =488 nm, t mérési = 1 perc, T=25 C. Amennyiben a minta a méréshez túl töménynek bizonyult, 2-3-szorosára hígítottam fel. 8. ábra: A fényszóródásmérő berendezés elvi vázlata [Forrás: Borsos Attila: Elektromosan töltött nanogélek vizsgálata, TDK dolgozat, 2007] 34

35 Pásztázó elektronmikroszkópos mérés (SEM) A pásztázó elektronmikroszkópia egy olyan képalkotó módszer, amely segítségével a minták felszínéről kapunk információt. A műszer működési elve röviden: a vizsgált tárgy egy meghatározott területét elektronnyalábbal végigpásztázzuk, és az elektronnyaláb és a minta kölcsönhatásából származó jeleket egy detektor érzékeli, és képpé alakítja. Ezzel a módszerrel nemcsak a minta morfológiája határozható meg, hanem számos más tulajdonság is vizsgálható vele. (Pl. kémiai sajátságok.) A számunkra elsősorban érdekes felszíni topográfia tanulmányozása során a felszínről visszaszóródó, nagy energiájú elektronok és a néhány nm mélységből származó szekunder elektronok bírnak jelentőséggel. A műszer vázlatos felépítése az 9. ábrán látható. A méréseket FEI Quanta 3D típusú nagy felbontású kétsugaras készüléken végeztük. Néhány mintáról készült SEM kép, amely alapján méretet, illetve méreteloszlást határoztam meg. A minta előkészítés során egy speciális mintatartóra szénszalaggal (kétoldalú ragasztóként, illetve elektromos vezetőként funkcionált) nagy tisztaságú, sima grafit (HOPG, Highly Ordered Pyrolytic Grafite) réteget rögzítettem, és erre csöppentettem fel 5 μl mintát, amelyet ezután levegőn beszárítottam. A mintákat szén- és arany bevonat nélkül vizsgáltuk. Kipróbáltunk olyan mintát is, amely üveglapra lett felcseppentve és vékony aranyréteg volt rápárologtatva. Ebben az esetben is speciális mintatartóra rögzítettük szintén szénszalaggal az üveglapot. 9. ábra: A SEM vázlatos felépítése 35

36 Atomi erő mikroszkópos (AFM) mérés Az atomi erő mikroszkóp a pásztázó tűszondás mikroszkópok családjába tartozik, amelyek közös tulajdonsága, hogy a kép a mikroméretű szonda és a minta kölcsönhatásának következményeként jön létre. Az AFM szondája egy, a végén elvékonyodó tű, amely általában szilíciumból vagy szilícium-nitridből készül. A tűhöz kapcsolódik egy laprugó, amelynek meghajlásából következtethetünk a minta és a tű között fellépő erő nagyságára. A tűt és a laprugót egy piezoelektromos szkenner mozgatja, amely (ideális esetben) a tér mindhárom irányába atomi pontossággal tér ki. A tű és a felszín közt a távolság függvényében különböző vonzó és taszítóerők lépnek fel, amelyek információt hordoznak a minta felszíni érdességéről. Az AFM mérés során tulajdonképpen a laprugó elhajlását detektáljuk. Ez optikai módon történik a következőképpen: a laprugó tükröződő hátoldalát megvilágítjuk egy lézerrel. A lézerfény a tű és az ezzel együtt a rugó mozgását követve verődik vissza a négyosztatú detektorra, amelyen a visszavert fény pozíciójából következtethetünk a rugó elmozdulására, így a felszín morfológiájára. A készülék vázlatos felépítését a 10. ábrán láthatjuk. A méréseket Park System Xe-100 (Dél-Korea) típusú készülékkel, nem-kontakt módban NCS15-ös tűvel (Mikromasch, Észtország) (erőkonstans 40 N/m) 1-0,5 Hz szkennelési sebességgel végeztük el. A kiértékeléshez XEI es szoftvert használtunk. A méréseket egy olyan rendszerről készítettük, amely fluoreszcein Na-sójával volt jelölve, és nem tartalmazott Pluronic-ot. 10. ábra: AFM sematikus felépítése 36

37 Fluorimetriás mérések A fluoreszcens spektroszkópia alapjelensége a lumineszcencia egyik fajtája: a fluoreszcencia. A lumineszcenciának nevezzük az elektrongerjesztési állapotban történő fénykibocsátást. Ha az elektron termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba (két szingulet állapot közti átmenet), akkor fluoreszcenciáról, ha több, különböző multiplicitású állapoton keresztül jut el az alapállapotba a molekula, akkor foszforeszcenciáról beszélhetünk. A fény abszorpciós és emissziós folyamatait a Jablonskidiagramon (11. ábra) követhetjük nyomon. 11. ábra: Jablonski-diagram A kapszulázott fluoreszcens anyagokat, illetve a dializáló vizet spektrofotometriásan jellemeztem. A mintákat a Varian Cary Eclipse típusú fluoreszcens spektrofotométeren mértem. Az alábbi mérési módszert alkalmaztam: először meghatároztam az abszorbciós spektrumot, majd ez alapján a számítógép automatikusan kiválasztotta a besugárzó hullámhosszt, illetve a detektorfeszültséget. A fluoreszcens spektrofotométer vázlatos felépítése a 12. ábrán látható. 37

38 12.ábra: A fluoriméter elvi felépítése Rediszpergálhatóság és stabilitás vizsgálata A stabilitásvizsgálathoz kiválasztottam egy rendszert. Ez a fluoreszcein Na-sóját tartalmazta, és a mérete kisebb volt a többi festékkel készült részecskéknél. Bizonyos idő (1h, 1 nap, 1 hét...stb) elteltével mindig ugyanolyan körülmények közt elvégeztem a DLS mérést. A mérések között a mintát hűtőben, - 4 C-on tároltam. A rediszpergálhatósági vizsgálat kivitelezésére a nanoszuszpenziót liofilizáltuk. Ennek során az anyagot lefagyasztottuk, majd egy nagyvákuumot létrehozó készülékre tettük, amely az oldószert eltávolította a mintáról. (Gyakorlatilag szublimáció történik.) Így a folyamat végén a nanorészecskék szilárd por formájában álltak rendelkezésre. Ezt a port diszpergáltattuk ugyanolyan térfogatú kétszer desztillált vízben, mint amelyben készült. A rediszpergálhatóság vizsgálatára is a fluorescein Na-sóját tartalmazó rendszert választottuk ki A biológiai vizsgálatnál használt metodikák Kísérleti állatok és a műtét Kísérleteinkhez albinó kifejlett Wistar patkányokat használtunk ( grammos, hím és nőstény vegyesen), egy-egy anyaghoz 2-3 állatot. A narkózist ketaminnal (20 mg/ testtömegkg) és xilazinnal (80 mg/ testtömegkg) hoztuk létre. 38