Az ischaemia tolerancia növelésének lehetőségei a májsebészetben

Átírás

1 Az ischaemia tolerancia növelésének lehetőségei a májsebészetben Doktori értekezés Dr. Szijártó Attila Semmelweis Egyetem Multidiszciplináris (patológia) Doktori Iskola Témavezetők: Dr. Schaff Zsuzsa D.Sc., egyetemi tanár Konzulens: Dr. Kupcsulik Péter D.Sc., egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Oláh Attila Ph.D.., egyetemi magántanár Dr. Glasz Tibor Ph.D., egyetemi adjunktus Dr. Bursics Attila Ph.D., egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Fehér János D.Sc., egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Bálint András egyetemi docens, Ph.D. Dr. Forgács András osztályvezető főorvos, Ph.D. Budapest 2006

2 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 2 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS Kirekesztések Részleges kirekesztések Pringle manőver, Báron féle műfogás Hemihepatic vascular occlusion Ballon katéter szelektív okklúzió Teljes kirekesztés Total hepatic vascular occlusion Ex situ májresectio, májtranszplantáció A máj vérellátása, szövettani szerkezete Klasszikus májlebenyke (lobulus hepatis) Portalis lebenyke (lobulus portalis) Rappaport féle májacinus Az ischaemiás reperfúziós károsodás Ischaemiás sejtkárosodás Az ischaemiás károsodás sejtszintű mechanizmusa Hypoxia jelpálya, a HIF 1 szerepe A (paradox) reperfúziós károsodás Ischaemia reperfúzió mikrocirkuláció endothel dysfunctio Arteriolák Kapillárisok Venulák A reperfúzió dinamikája Az ischaemiás reperfúziós károsodás effektor mechanizmusai Oxidatív és nitrózatív stressz Szabadgyökök keletkezése Szabadgyökök eliminációjáért felelős mechanizmusok A lokális gyulladásos reakció résztvevői Leukocyták Kupffer sejtek Citokinek Nitrogén monoxid endothelin egyensúly Sejthalál: necrosis vagy apoptózis Necrosis ischemiás reperfúziós károsodások kapcsán Az apoptózis A hepatocellularis apoptózis mechanizmusa Az apoptózis kimutatása, szöveti reakciók Az apoptózis májszöveti ischaemia reperfúzió során Necrapoptózis Az IP és az apoptózis A PARP fiziológiás és patológiás szerepe az I R károsodásban PARP szerepe a DNS károsodások kijavításában A PARP szerepe a szignáltranszdukcióban, és a génexpresszióban A PARP szerepe a sejthalálban oldal

3 1.7. Glutamin szerepe az I R károsodásban Az I R károsodás csökkentésének lehetséges módszerei Ischaemiás preconditionálás (IP) IP sal szerzett evidenciák meleg ischaemiában IP sal szerzett evidenciák hideg ischaemiában IP sal szerzett evidenciák izolált hepatocyta kultúrán IP feltételezett patomechanizmusa IP dinamikája IP szerepe a klinikai gyakorlatban PARP inhibitorok Glutamin Kémiai és fizikai módszerek Szöveti áramlásmérés és a mikrocirkuláció jellemzése Szöveti áramlásmérés alapjai Direkt áramlásmérési technikák Direkt katéteres áramlásmérések Plethysmographia Transzlumineszcenciás vizsgálatok Flowmeterek Elektromágneses flowmeter Ultrahangon alapuló áramlásmérés Laser Doppler flowmérés Hőmérsékletváltozáson alapuló technikák Indirekt technikák CÉLKITŰZÉS Célkitűzés A témaválasztás indoklása MÓDSZEREK A máj mikrocirkulációjának mérése laser Doppler flowmeterrel Szövettan Immunhisztokémia TUNEL Aktív kaszpáz 3 immunhisztokémia Poli (ADP ribóz) immunhisztokémia TNF α szint TNF α szint vitalitás próbával TNF α ELISA Laboratóriumi paraméterek Oxidatív stressz vizsgálata Luminometriás össz scavanger kapacitás mérés Redukálóképesség meghatározása Hidrogén donor aktivitás meghatározása Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása Biológiai minták fehérjetartalmának meghatározása Kísérleti elrendezés, műtéttechnika Törvényi háttér Csoportbeosztás I. Kísérlet: Ischaemiás preconditionálás ischaemia reperfúzió oldal

4 II. Kísérlet: Kémiai előkezelések ischaemia reperfúzió Az operáció Az I és II. kísérlet operáció közös részei I. kísérlet részletes leírása II. kísérlet részletes leírása Statisztikai feldolgozás EREDMÉNYEK I. kísérlet eredményei Haemodinamikai paraméterek Mikrocirkuláció Szövettani feldolgozás A nem preconditionalt I R csoport TNF α szintek Laboratóriumi vizsgálatok: sebi, ALT, LDH Túlélés a 7. posztoperatív napon II. kísérlet eredményei Haemodinamikai paraméterek Mikrocirkuláció Szövettani feldolgozás Hematoxilyn eosin festés TUNEL reakció Aktív kaszpáz 3 immunhisztokémia Poli(ADP ribóz) (PAR) immunhisztokémia TNF α szintek Laboratóriumi vizsgálatok: AST, ALT Antioxidáns státusz Luminometriás össz scavanger kapacitás Redukálóképesség Hidrogén donor aktivitás Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása Májlebenyek tömegei MEGBESZÉLÉS KÖVETKEZTETÉSEK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS oldal

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A szövegben ismétlődő rövidítések megjelenésük sorrendjében: a. arteria ADP Adenozin Bifoszfát AIF Apoptózisindukáló Faktor ALT Alanin Aminotranszferáz APAF 1 Apoptosis Activating Factor 1 ASE Aszkorbinsav ekvivalens AST Aszpartát Aminotranszferáz ATP Adenozin Trifoszfát DAB Diaminobenzidin DAG Diacetil Glicerol DNS Dezoxiribonukleinsav enos Endothelialis NOS ET Endothelin Gln Glutamin GSH Redukált Glutation GSSG Oxidált Glutathion H 2 O 2 Hidrogén Peroxid HIF 1 Hypoxia Inducible Factor 1 HRE Hypoxia Responsible Element HSP / HSPs Heat Shock Protien / Proteins = Hősokk Fehérje / Fehérjék IAP Inhibitor Apoptózis Protein IC Intracellularis ICAM Intracellular Cell Adhesion Molecula = Intercelluláris Sejtadhéziós Molekula IL Interleukin inos Indukálható NOS IP Ischaemiás Preconditionálás IP3 Inozitol Trifoszfát I R Ischaemia Reperfúzió LDF Laser Doppler Flowmeter LDH Laktát Dehidrogenáz LTB 4 Leukotrién B 4 MAPK Mitogén Aktivált Protein Kinázok MPTP Mitochondrial Permeability Transition Pore MPTP Mitochondrial Permeability Transition Pore NAD Nikotinamid Adenin Dinukleotid NADP Nikotinamid Adenin Dinukleotid Foszfát NFκB Nuklearis Faktor κb NO Nitrogén Monoxid NOS Nitrogén Oxid synthase = NO Szintáz O 2 Szuperoxid Anion ODFR Oxigen Derived Free Radicals OH Hydroxil Gyök 5. oldal

6 ONOO Peroxynitrit PAF Platelet Activating Factor PAR Poli(ADP Ribóz) PARP Poli(ADP Ribóz)Polymeráz PGI 2 Prosztaciklin PKC Protein Kináz C PKG Protein Kináz G PLC Foszfolipáz C PM Plató Maximum PTCA Percutanous Transluminal Coronary Angioplasty RLU Relative Light Unit RMI Reperfúziós Maximális Idő ROS Reactive Oxigen Species RT Reperfúziós Terület SOD Szuperoxid Dizmutáz TNFR I & II Tumor Necrosis Faktor Receptor I & II TNF α Tumor Necrosis Faktor alfa TUNEL Terminal Deoxyribonucleotidyl Transferase Mediated Dutp Digoxigenin Nick End Labeling TxA 2 Tromboxán A 2 UW Univesity Of Wisconsin v. véna VEGF Vascular Endothel Growth Factor XO Xantin Oxidáz Megjegyzés: A dolgozatban az idegen szavak latinos és magyaros írásmódja Fábián Péter és Magasi Péter szerkesztette Orvosi helyesírási szótár [Akadémia Kiadó, Országos Információs Intézet és Könyvtár, 1992] elveit követik. 6. oldal

7 1. BEVEZETÉS A májresectiók kapcsán az ischaemiás reperfúziós károsodás minden beavatkozás során megjelenik, ahol a máj afferens ereinek időleges okklúziójára van szükség, mivel a parenchyma sérülése jelentős vérvesztéshez vezethet. A vérvesztés mértéke különösen portális hypertensio esetén életet veszélyeztető lehet. Hasonló problémával kell számolnunk májtraszplantáció kapcsán is. A műtéti és posztoperatív halálozás, illetve a posztoperatív szövődmények megjelenése szoros összefüggést mutat az ischaemiás idővel, a vérvesztés mértékével, illetve a posztoperatív transzfúziók mennyiségével. A posztoperatív halálozás major májresectiót követően, egészséges máj esetén, 3,2 7%. Ezen érték akár 32% ig is emelkedhet cirrhosis kapcsán. [1] Az okklúziós technikát hagyományosan kirekesztés nek nevezzük, melynek számos típusa alakult ki az évek során. Kirekesztési eljárások használatára van szükség tompa hasi sérülést követő májruptura sebészi ellátása esetén, májtranszplantáció illetve nagy májresectiók során. A fentebb felsorolt műtéti beavatkozások mindegyikében közös, hogy a máj több kevesebb ischaemiás, hypoxiás károsodást, majd a vérellátás helyreállásával paradox módon egy másodlagos, további sejtkárosodát kiváltó reperfúziós hatást szenved. Az ischaemia reperfúzió (I R) során megjelenő celluláris és subcelluláris mechanizmusok aktiválódása nagyban meghatározza a máj ischaemiás toleranciáját és a posztoperatív regenerációját, és ezzel a betegek életkilátásait. A károsodás csökkentése fontos sebészi cél. Mind hazai [2 4], mind nemzetközi [5 8] kutatások hosszú évtizedeken át számtalan, a mindennapos napi klinikai gyakorlat számára alkalmas vegyületet, illetve módszereket vizsgáltak, melyek az I R károsodás mértékét csökkenteni tudták. Ugyanakkor sokáig senki nem gondolt arra, hogy éppen ischaemiával és reperfúzióval mérsékelni lehet az I R károsodást. Murry és munkatársai 1986 ban publikálták korszakalkotó felismerésüket, amire egy ischaemiás toleranciát vizsgáló kísérlet meglepő eredményeként jutottak. Tapasztalataik szerint rövid ischaemiás epizódok alkalmazásával a myocardium toleránsabbá tehető egy hosszabb ischaemiás állapottal szemben [9]. A jelenség ischaemiás preconditionálás ként (IP) vált ismertté. Az ischaemiás preconditonálásban rejlő potenciális lehetőségek számos kutatást indítottak el. Hatását nem csak szíven, hanem májon, vesén, vázizmon, bélen és a központi idegrendszeren is vizsgálták. Későbbiekben a molekuláris mechanizmusok tisztázása került az érdeklődés középpontjába, melyek megismerése farmakológiai 7. oldal

8 beavatkozási pontokra világít rá. A preconditionálás egyik kulcspontja a később részletezendő subcelluláris jelátviteli mechanizmusok aktiválódása, illetve transzlációs folyamatok megindulása. A kaszkádok, molekuláris utak pontos ismerete a kémiai előkezelés, esetleg preconditionálás lehetőségét vetik fel, ami megoldást jelenthet olyan kórállapot esetében is, ahol az ischaemiás preconditionálás technikailag nem, vagy nehezen kivitelezhető. Az IP akkor alkalmazható ideálisan, ha az ischaemiás állapotot tervezetten hozzuk létre. Ennek a feltételnek jelenleg sebészi beavatkozások felelnek meg, így az IP vascularis kirekesztéseknél és transzplantációknál jelenthet hatékony eszközt az I R károsodás csökkentésére. A következőkben kísérleteim problémafelvetésének, illetve eredményeinek és a levonható következtetések könnyebb megértéséhez az alapvető háttér információk kerülnek felsorolásra, az elmúlt évek irodalmi adatainak összefoglalásával Kirekesztések Az ép emberi máj pontos ischaemiás tűrőképessége nehezen ítélhető meg. Leginkább retrospektív adatokból következtethetünk a tűrőképességre. Jelentős egyéni különbségek is megfigyelhetőek, amelyek leginkább a májszövet aktuális állapotától függnek (steatosis hepatis, cirrhosis hepatis stb.). Habár beszámoltak már rutinszerűen alkalmazott egy órás kirekesztésről is [10], a gyakorlatban mégis a következő eljárás használatos: a máj egyszeri, biztonságos kirekesztésének tartama 30 perc, majd 5 10 perc keringés helyreállítás után 30 percre ismét vértelenné tehető a máj. [11;12] Ilyen intermittáló kirekesztéssel több órás teljes okklúzió érhető el. Az intermittáló kirekesztések okozta patofiziológiai folyamatokat, illetve annak klinikai hatásait tanulmányok részletesen vizsgálták. [13;14]. Igaz, hogy a teljes vascularis kirekesztéssel jelentős vérvesztés megelőzhető, ugyanakkor az anheptikus fázis kiszámíthatatlan haemodinamikai változásokat eredményezhet, mely a morbiditás és mortalitás növekedéséhez vezet [13]. Prospektív vizsgálatok alapján elmondható, hogy májresectiók kapcsán az intermittáló kirekesztés korai és késői hatásái kedvezőbbek, mint a teljes vascularis okklúzió hatásai. Az intermittáló kirekesztések hatására a posztoperatív időszakban mérsékeltebb heptocellularis károsodás, transzamináz enzim, illetve [15], bilirubin szint emelkedés volt megfigyelhető, ugyanakkor az intraoperatív vérvesztés szignifikánsan magasabb volt [14;15]. Ugyanakkor a májparenchyma 8. oldal

9 ischaemia toleranciája a megnövekedett vérvesztés és az esetlegesen hosszabb műtéti idő ellenére is nőtt. Az ideális protektív stratégia a májműtétek kapcsán a vértelenségben, illetve vérvesztés nélkül végezhető parenchymális transsectiok lennének, olyan körülmények közt, ahol az ischaemia tolerancia maximális. Teoretikusan az ischaemiás preconditionálás vagy ezen protektív védelmi rendszert felépítő kémiai anyagok biztosíthatják a megnyúlt ischaemiás tolerancia felépülését, ezzel az egyszeri kirekesztések ideje megnyújtható Részleges kirekesztések Részleges kirekesztésnek nevezzük a vena portae, arteria hepatica időleges okklúzióját, nem érintve a vena hepatica kat. Az alábbi lehetőségek tartoznak ide [16;16]: Pringle manőver, Báron féle műfogás Az eljárás a ligamentum hepatoduodenale ideiglenes okklúzióját jelenti. (1. ábra) Így a vena portae és az arteria hepatica propria elzárásával a máj afferens vérellátása 1. ábra: Prigle manőver: a ligamentum hepatoduodenale képleteinek okklúziója időlegesen megszakad. Az eljárást a elsőként talán a magyar Báron Sándor alkalmazta ( Báron féle műfogás ) a huszadik század elején, azonban a nemzetközi szakirodalomban, a Pringle manoeuvre elnevezés terjedt el, tekintve, hogy Báronnál néhány évvel korábban a skót Pringle és munkatársai is leírták ezt a technikát, amit traumás májruptura kapcsán alkalmaztak először. While small lacerations of the liver substance may be, and no doubt are, recovered from without operative interference: if lacerations be extensive and vessels of any magnitude are torn, haemorrhage will, owing to the structural arrangement of the liver, go on continuously. [17] Az eljárás előnye, hogy gyorsan, és egyszerűen kivihető. Hátránya, hogy befolyásolja a szervezet haemodinamikáját: vérnyomás, pulzusemelkedés, cardiac output csökkenés, splanchnikus pangás. 9. oldal

10 Hemihepatic vascular occlusion Ezen kirekesztés során a lig. hepatoduodenale képleteinek oszlás feletti izolálása után a rezekálandó terület érképleteinek szelektív, intermittáló leszorítása történik. Gyenge általános állapotú betegeknél, illetve cirrhoticus máj esetén alkalmazott eljárás. Használatával csökkenthető a haemodinamikai változás, a splanchnikus pangás és a máj ischaemiának kitett területeinek nagysága. Technikai kivitelezése nehéz Ballon katéter szelektív okklúzió A katéter a v. portae n keresztül kerül bevezetésre és így az oszlás utáni kisebb érág szelektív okklúziójára van lehetőség a ballon felfújásával. Kivitelezése hasonlóan nehéz, mint az előbb említett technika alkalmazása, továbbá az a. hepatica ágaiból vérzés állhat elő. Előnyös azonban, mert csökkenthető a splanchnikus pangás, a haemodinamikai változások és az ischaemiás májterület Teljes kirekesztés Teljes kirekesztésnek nevezzük a vena portae, arteria hepatica, illetve a vena hepaticae egyidejű okklúzióját. A gyakorlatban az alábbiak alkalmazhatóak [16]: Total hepatic vascular occlusion A módszer a vena cava inferior infra és suprahepaticus szakaszának leszorítását, és a portális erek okklúzióját jelenti. (2. ábra) Nehéz kivitelezése miatt csak a májparenchyma cava inferior körülvevő részét, érintő, illetve a vena cava inferiort infiltráló tumorok sebészi megoldásánál terjedt el. Ugyanakkor előnyös tulajdonsága a technikának, hogy a műtéti terület vérzése gyakorlatilag nulla, és a légembolizáció esélye is csökken. Ennek az eljárásnak egy kibővített változata az in situ hypothermiás májperfúzió, teljes vascularis kirekesztéssel. Az eljárás használata veszélyei és viszonylag bonyolult kivitelezése miatt korlátozott azokra az esetekre, amikor a máj major resectiójára, a vena portae és a vena hepatica disszekciójára majd rekonstrukciójára van szükség. A vena portaen keresztül bevezetett katéteren keresztül 4 o C os Ringer laktát oldatot perfundálunk, amelyet a vena cavaból visszanyerünk, vagy veno venosus extrakorporális bypass technikát alkalmazunk. Előnyei, hogy akár 4 órás ischaemia is fenntartható különösebb károsodás nélkül, ill. ilyen technika alkalmazása 10. oldal

11 mellett a légembólia és a vérzés veszélye minimális. Hátránya, hogy a rendszer nagyon 2. ábra: Total hepatic vascular occlusion sematikus képe bonyolult és drága. A teljes vascularis okklúzió haemodinamikai hatásai igen jelentősek, így szoros megfigyelés mellett is nehéz lehet a megfelelő haemodinamikai stabilitás fenntartására. Hatását, a Pringle manőverrel összehasonlítva az intraoperatív vérvesztés, és az intraoperatív transzfúziók számának csökkenésében figyelték meg, ugyanakkor gyakrabban jelentkeztek pulmonalis szövődmények, és subphrenicus folyadék Ex situ májresectio, májtranszplantáció A Pichlmayr [18] által leírt komoly jártasságot és felszereltséget igénylő műtét során az érellátás teljes megszakítása után a májat eltávolítják. Ezután alacsony hőmérsékletű prezerváló oldat extrakorporális keringtetésével a szervet lehűtik, majd a testüregen kívül az érintett májsegmentumot rezekálják, végül a máj re/autotranszplantációjára kerül sor. A májtranszplantáció során a graft vérellátás nélküli állapotba kerül mindaddig, amíg a recipiens szervezetbe beültetve nem kap újra vért. A májgraftokat általában alacsony hőmérsékletű UW (Univesity of Wisconsin) vagy Viaspan konzerváló oldattal lehet átmosni az aortán vagy a v. portaen keresztül A máj vérellátása, szövettani szer kezete Két ér táplálja a szervet: a lig. hepatoduodenale útján éri el a májat a v. portae és az a. hepatica propria. A perctérfogat jelentős mennyisége a szerv ellátására fordítódik, a májon percenként kb ml vér áramlik keresztül, melynek átlag 75% a származik a vena portaeból, a maradék részét az arteria hepatica propria biztosítja. A máj keringésének állandóságát a két keringés dinamikus, reciprok szabályozása biztosítja, mely nem minden esetben következetes. Ugyanakkor egyes irodalmi adatok szerint az arteria hepatica és vena portae intraoperatív ultrahangvezérelt áramlásmérése nem minden esetben követi ezen szabályszerűséget. A vizsgálatban, míg a vena porta szelektív okklúziója növelte az artériás beáramlást, addig nem ismert okoknál fogva 11. oldal

12 az arteriás kirekesztést nem követte portalis flow növekedés [19;20]. A probléma hátterében vélhetően a Lautt [21;22] által leírt adenosin washout theory áll. A két ér keringését befolyásoló intrinsic és extrinsic mechanizmusok főként az a. hepatica keringését befolyásolják. A máj kiáramlási erei, a három v. hepatica a máj hátsó felszínén, vagy a máj állományában futó v. cava inferiorba ömlik. Goldsmith és Woodburne (1957) tanulmányai alapján a máj a vena portae oszlása és a v. hepatica k elhelyezkedése szerint osztható szegmentumokra [23]. A három vena hepatica négy szektorra tagolja a májat, és minden szektor egy egy portális főágat is kap egy ún. biliovascularis nyélen keresztül. Egy egy bilio vascularis rendszer mindkét májfélben négynégy szegmentumba hatol be, amelyeket egytől nyolcig római számokkal jelölünk. A máj ma általánosan elfogadott szerkezeti modelljét a francia Couinaud (1954) dolgozta ki korróziós preparátumok alapján [24]. A máj mikroszkópos felépítésének meghatározó tényezője, hogy a máj parenchymájának 78 80% át alkotó hepatocyták és a kis érképletek (v. centralis, a. interlobularis, v. interlobularis, kis epeutak) májsejt csoportokba, lebenykébe (lobulusokba) rendeződnek. A kis lebenykék egy olyan háromdimenziós hálórendszerben helyezkednek el, melynek hálószemeit, a májat körülvevő tömött rostos kötőszövetnek a szerv mélyébe törő finom kötőszöveti rostjai alkotják. Funkcionális és patológiai megfontolások alapján több májlebenyke felosztást ismerünk, a májsejteknek az erekhez viszonyított helyzete alapján, melyek áttekintése az ischaemia által okozott szövettani elváltozások megértéséhez elengedhetetlen Klasszikus májlebenyke (lobulus hepatis) A leggyakoribb felosztás, ami a májlebenyke központjába a v. centralist helyezi. A körülbelül 1 1,5 mm átmérőjű, és 2 mm hosszú képződmény átmetszetben hatszögletű, ennek szögleteiben halad a portális, vagy más néven Glisson triász (egyes könyvek szerint portalis triád). A képződmény térbeli alakja körtéhez hasonló. A portális triász három alkotórésze az a. hepatica propria kis ága az a. interlobularis, a v. portae kis végága a v. interlobularis, és az epeductulus (ductus biliferi interlobularis). A májlebenykében a v. centralis, mint centrum körül radier helyzetű, 1 2 sejtvastagságú, lyukacsos májsejtgerendák vannak. A májsejtgerendák közeit a máj különleges mikrovaszkuláris rendszere, a májsinusok rendszere tölti ki. A sinusok többségükben szintén radier helyzetűek, azonban a gerendák hézagjain keresztül egymással közlekedő, 12. oldal

13 összefüggő rendszert hoznak létre. A sinusok falát nem folytonos, átlyuggatott endothelsejtek alkotják, az anyagkicserélődés intenzitása ezáltal fokozottabb. Az endothelsejtek alatt normális élettani körülmények között nem található bazális membrán, ez a könnyebb anyagkicserélődés szolgálatában áll. A sinusok széli részébe ömlik az arteria és véna perilobularis vére. Az a. perilobularis oxigéndús vére az arteria hepaticából származik. A v. perilobularis (v. portae ága) a bélből származó, tápanyagban gazdag vért, és a lépből, pancreasból származó vért szállítja a májsejtekhez. A máj mikroszkópos vizsgálatai alapján látható, hogy a beáramló vér, és az általa szállított szubsztrátok a sinusokon keresztül, mintegy körbeveszik a hepatocyták alkotta májsejt gerendákat. A hepatocyták a vérben úszva látják el metabolizáló, felszívó, és szekretoros feladataikat. A sinusokból ezután a v. centralisba, később a v. sublobularisba, v. hepaticába, és végül a v. cava inferiorba kerül a vér Portalis lebenyke (lobulus portalis) A lobulus portalis (4. ábra) az a. és v. interlobularis ellátási területe. A lebenyke háromszög alakú, melynek központjában a Glisson triász, a szögleteiben a v. centralisok találhatók Rappaport féle májacinus Számos szerző patológiai és biokémiai megfigyelések alapján a májacinust fogja fel, mint a máj funkcionális egységét. A májszövet ischaemiás/hypoxiás, illetve toxikus károsodása is ezen modell segítségével magyarázható a legjobban. A májacinus az a. perilobularis (a. hepatica ága), és a v. perilobularis (v. portae ága) ellátási területe. A rombusz alakú lebenyke kisebbik átlójában húzódik ez a két kis ér, és rendre minden második csúcsát a v. centralis illetve a Glisson triász alkotja. Funkcionális szempontból így a májlebenykében három zónát különböztethetünk meg, amelyek elektronmikroszkópos, és kórélettani megfigyelések alapján különböznek egymástól. A lebenykét a friss vér az a. és v. perilobularisok felől éri el, ennek megfelelően a májsejtek oxigén és tápanyag ellátottsága az erektől távolodva fokozatosan csökken (3. ábra). Az I. zóna sejtjei jutnak a legnagyobb tápanyag és oxigénkoncentrációjú vérhez. A III. zóna a v. centralishoz közeli májsejtekből áll, amelyek tápanyagban és oxigénben jóval szegényebb vérhez jutnak, mivel a vért a májacinus centrálisan elhelyezkedő 13. oldal

14 sejtjei már részlegesen kimerítették. A II. zóna sejtjei az I. és III. zóna közötti átmenetnek felelnek meg. A zonális felosztás jól egybeesik a májlebenyke sejtszerkezeti, és biokémiai felépítésével. Jól ismert, hogy az egyes zónák másként, és más más sorrendben reagálnak a tápanyaghiányra, ischaemiás károsodásra és a toxikus károsodásokra. Emellett a zónákat alkotó sejtek enzimösszetétele is jól korrelál a zonális felosztással. Az egyes zónák sejtjeinek felépítésbeli és enzimaktivitásbeli különbségeit a 3. ábra: Májlebenykék főbb típusai 4. ábra: A májlebenykék vérellátása következőekben foglalhatjuk össze: Az I. zóna sejtjei rendelkeznek a legjobb vérellátással, sejtjeinek anyagcseréje ezért a zónák sejtjei közül a legélénkebb. A sejtek enzimösszetételét vizsgálva dominálnak az oxidatív anyagcsere, és a glükoneogenezis enzimjei. Étkezés után ebben a zónában szaporodik fel leggyorsabban a glikogén, ugyanakkor a cukor leadása ebből a zónából történik utoljára. Oxigénmentes állapotban ezen zóna sejtjei pusztulnak el legkésőbb, és regenerálódnak a leggyorsabban, ugyanakkor toxikus károsodáskor (gyógyszerek, mérgek, baktériumtoxinok) e zóna sejtjeinek pusztulása a legszembetűnőbb. A II. zóna közepes vérellátottságú. Sejtjei mind működésben, mind enzimprofilban átmenetet képeznek az I. és III. zóna között. A III. zóna vérellátása a legrosszabb. Ennek megfelelően a glikolízis és a glukoneogenezis enzimjei az uralkodóak a sejtek enzimprofiljában. Szubsztrát túlkínálat esetében, ebben a zónában is igen nagy mennyiségű glikogén halmozódhat fel. Éhezésben ebből a zónából mobilizálódik először a glükóz. A sejtek elektronmikroszkópos vizsgálatánál szembetűnő a sima felszínű endoplazmás retikulum nagy mennyisége, melynek enzimjei a xenobiotikumok transzformációjában (pl.: 14. oldal

15 konjugációs enzimek), és a lipidszintézisben vesznek részt (pl.: koleszterinszintézis). Ischaemia esetén a III. zóna sejtjei pusztulnak el leghamarabb, és regenerációs képességük is a legalacsonyabb. A mérgező anyagok károsító hatásának azonban jobban ellenállnak ennek a zónának a sejtjei, mint az I. zóna sejtjei, mivel a károsító ágensek koncentrációja a III. zóna környezetében már alacsonyabb. Összefoglalásként elmondható, hogy a máj vérellátásának megszakítása során a Rappaport féle májacinus III. zónájában található sejtek károsodnak leginkább, illetve az I. zóna sejtjeinek regenerációs képessége a legjobb Az ischaemiás reperfúziós kár osodás Ischaemiás sejtkárosodás Ischaemiának nevezzük a vérellátás akadályozottságát, hypoxián az oxigénellátás elégtelenségét, anoxián pedig annak teljes hiányát értjük. A hypoxia/anoxia előállhat ischaemia hatására is, azonban megjelenhet akkor is, ha a vér O 2 szállító kapacitása lecsökken (anaemia). A sejtműködéshez szükséges ATP glikolízis, illetve az ADP oxidatív foszforilációja kapcsán keletkezhet. Hypoxia esetén a sejt a glikolízis révén is termelhet energiát, ez azonban rendkívül rossz hatásfokú energianyerés, és az ischaemia miatt a szükséges szubsztrát utánpótlás is nehezített. Az ischaemia okozta szerkezeti és működésbeli károsodások egy határig helyreállíthatóak, a károsodás reverzibilis, ha a vérellátás spontán, vagy terápiás beavatkozás (pl.: PTCA, portalis érképletek kirekesztésének megszüntetése) hatására helyreáll (reperfúzió). Más esetben az ischaemia hosszabb fennállásakor a károsodás fokozatosan irreverzibilissé válik ( point of no return ). Az irreverzibilis károsodást okozó ischaemia időtartam hosszát döntően befolyásolja, hogy az ischaemia egészséges, vagy már károsodott szövetet érint. Ezzel magyarázható pl. a steatotikus és cirrhotikus máj csökkent ischaemiás tűrőképessége. Paradox módon az ischaemiás szakaszt átvészelő sejtek a reperfúzió során szenvednek el olyan mértékű károsodást, ami a sejtek pusztulásához vezethet. Ebben a reperfúziós károsodásban kulcsfontosságú az oxigén tartalmú reaktív szabadgyökök (ODFR) jelenléte, melyek az oxigenizáció helyreállítása után nem enzimatikus láncreakciók hatására keletkeznek (ld fejezet). 15. oldal

16 Az ischaemiás károsodás sejtszintű mechanizmusa A májsejtek elhalásának (necrosis/apotózis) folyamata részleteiben a 1.5 fejezetben kerül bemutatásra. Követezőkben az ischaemia okozta celluláris, subcelluláris fontosabb eltéréseket sorolom fel, melyek végül necrosishoz vezetnek [25]. A máj ischaemiás károsodásai leginkább a III, azaz centrilobularis, pericentralis zónában észlelhetőek. Az ischaemia hatására csökken a sejt ATP tartalma, ezzel párhuzamosan csökken a membránok Na + /K + ATP áz aktivitása, károsodnak a transzmembrán fehérjék. Fokozódik a K + kiáramlás, ioneloszlási zavarok jönnek létre. A mitochondriális mátrix felhígul, vesicula dilatáció és kismértékű cytoskeleton átrendeződés figyelhető meg. A sejtmag ekkor még sértetlen. Felerősödik a glikolízis, a ph csökkenni kezd és a sejt kifejezetten hypoxiássá válik. A fokozódó Na + és Ca 2+ beáramlás miatt radikálisan megváltozik a sejt ionháztartása. A növekvő víztartalom miatt a sejtek duzzadni kezdenek. Csökken az RNS szintézis, eltűnnek a membrán finomszerkezetei, a sejt vázában aktinfilament keresztkötések alakulnak ki, melyek a cytoskeleton megroppanását eredményezik. A mag szerkezetében megjelennek az első visszafordíthatatlan reakciók. Ezt követően a membránok irreverzibilis károsodását, kilyukadását követő fokozott Ca 2+ és vízbeáramlás, valamint Mg 2+ vesztés jellemző. Megszűnik a proteinszintézis, a sejtek fehérjéi koagulálódnak, a cytosolban emelkedik a zsírsav koncentráció. Az irreverzibilis károsodások miatt a sejtpusztulás elkerülhetetlen (point of no return). Megváltoznak a sejtfelszíni antigének, a sérült lysosomákból kiáramló emésztőenzimek szétrombolják a makromolekulákat. Megkezdődik a piknózis és a kariolysis, a sejtmag feloldódik ( eltűnik ). A sejt szerkezete szétesik és beáll a sejthalál. A nekrózis morfológiai jelek alapján koagulációs típusú. Végeredményben az intracitoplazmatikus anyagok, enzimek (ALT, AST, LDH stb.) kikerülnek az intercelluláris térbe. Kísérletesen is igazolt, hogy ezen enzimek szérum és szöveti megjelenése egy szintig arányos az ischaemiás károsodás mértékével [26 29]. A fenti folyamatot követi a gyulladásos sejtek megjelenése, érfalhoz való kitapadása. A nekrotizált hepatociták környezetében a máj fagocita funkcióval bíró sejtjei, a Kupffer sejtek aktivációja következik be. A Kupffer sejtek amellett, hogy eliminálják a degenerálódott sejtmaradványokat, gyulladásos faktorok termelésével és szecernálásával erősítik a lokális gyulladásos folyamatot. 16. oldal

17 Hypoxia jelpálya, a HIF 1 szerepe Hypoxia hatására a sejtben fellépő számos biológiai válasz egyike az angiogenesis. A daganatos szövetek kísérletes vizsgálatánál figyeltek fel az úgynevezett O 2 szenzitív gének jelentőségére. A daganatok növekedése olyan gyors ütemű, hogy a szövetet ellátó erektől egyes daganatsejtek távol kerülnek, így azokban relatív hypoxia alakul ki. A sejtekben átíródó O 2 szenzitív gének termékeinek szerepe kettős: 1. az angiogenesis serkentése (VEGF = vascular endothel growth factor) 2. metabolikus adaptálódás az oxigénmentes állapothoz: az anaerob glikolízis enzimjeinek, és az LDH termelődése nő, illetve nő GLUT 2 glukóz transzporterek száma. Jelen megközelítésben számunkra ezen utóbbi hatás ismerete fontos. Hypoxia hatására beinduló transzdukciós kaszkád eredményeként egy transzkripciós faktor ( a folyamatok végső közös pontja ), a HIF 1 (hypoxia inducible factor) aktiválódik, és a DNS számos részén elhelyezkedő HRE (hypoxia responsible element) promoter régiókhoz kötődik, indukálva ezáltal az O 2 szenzitív gének transzkripcióját. A HIF 1 egy dimer szerkezetű molekula, melynek HIF 1β része konstitutívan jelen van a sejtben, míg a HIF 1α egy oxigénhiányra indukálódó protein aszparagin, és prolin hidroxilázok hatására [30]. A hypoxiás sejtben, a HIF 1α aktív dimert képez a HIF 1βval és az így kialakuló dimer bejut a sejtmagba és indukálja az O 2 szenzitív gének átírását. Ezt a transzkripciós faktort először a hypoxia hatásra fokozódó erythropoetin termeléssel [31], valamint a daganatokban kimutatható VEGF expresszióval [32] kapcsolatban írták le. Ma már ismert, hogy target génjei közé tartoznak egyes glikolitikus enzimek (pl. LDH A), a GLUT 2 glukóz transzporter, az angiogenesisben szerepet játszó VEGF, inos génje, valamint az apoptózisban szerepet játszó p53. Látható tehát, hogy ez a jelpálya is több irányba viheti tovább a sejt sorsát [33]. A hypoxia jelpályának újabb kutatások központi szerepet tulajdonítanak az ischaemia mediálásában, illetve az ischaemiás preconditionalás során felépülő védelmi rendszernek A (paradox) reperfúziós károsodás Reperfúziós károsodásnak nevezzük, amikor a szerv keringése spontán, vagy terápiás beavatkozás hatására helyreáll, és paradox módon a szervkárosodás fokozódik. 17. oldal

18 A reperfúzió nélkülözhetetlen az ischaemiás károsodásból való felépüléshez. Helyreállítja a szövet oxigén és energiaellátását, valamint elszállítja a felhalmozódott toxikus metabolitokat. Ezzel egyrészt megmentheti az ischaemia során reversibilisen károsodott sejteket [25], másrészt paradox módon a sejtek további károsodásához vezet, ezt a jelenséget oxygen paradox ként tárgyalja az irodalom [34;35]. Ismert, hogy az ischaemiás szövetekben felszaporodó purin és az elégtelenné váló antioxidáns mechanizmusok, az újrainduló oxigenizáció során kedveznek a reaktív szabadgyökök kialakulásának, felszaporodásának. Az szabadgyök makromolekulák (pl.: DNS, membránok lipid és fehérjekomponensei) károsításával olyan láncreakciókat (pl. lipidautoperoxidáció) indít el, melyek szintén a sejtek integritásának megbontásához, sejthalálhoz vezethetnek. Mindezek mellett igen kifejezett intracelluláris Ca 2+ felszaporodás tapasztalható, mely az egyik legfontosabb meghatározója az I R károsodásnak [35]. A mitochondriumok a kalciumot aktív transzporttal veszik fel. A szükséges energiát az elektrontranszport fedezi. A kalcium molekuláris oxigén és vas jelenlétében elősegíti a mitochondrium belső membránjának károsodását, ezáltal mintegy felerősíti a mitochondrialis szabadgyök képződést. E hipotézis szerint a Ca 2+ ionok aktiválják a foszfolipáz A 2 enzimet, amely a membrán foszfolipidek hasítását követően fellazítja a lipid fehérje kölcsönhatásokat. A mitochondriális univalens elektronszivárgás következtében a folyamatosan képződő szuperoxid anion, ezáltal bejut a mátrix térbe. Így az extrém mértékű szabadgyök kínálat miatt az antioxidáns védekezőmechanizmusok kimerülnek, továbbá az O 2 és a H 2 O 2 vas jelenlétében OH gyököt termel. A képződött OH gyök a belső membrán proteinjeinek, azaz a respirációs lánc alkotóinak SH csoportjait megtámadja, azok részleges aggregációját okozza az S S keresztkötések kialakulása miatt. A vas Ca 2+ jelenlétében mobilizálódni képes kötött formájából, így a folyamat felerősödik. A mitochondrium belső membránjában úgynevezett lyukak, pórusok (MPTP) nyílnak meg, melyek hozzájárulnak az energiatermelő folyamat teljes dezorganizációjához [36], illetve a necrosis vagy apoptózis megjelenéséhez (ld fejezet) Ischaemia reperfúzió mikrocirkuláció endothel dysfunctio Míg korábban a parenchymasejtek halálos reperfúziós károsodása volt az érdeklődés középpontjában, fontosságuk a szervi dysfunctiók szempontjából ma már megkérdőjelezett a. Jelenleg a kiserek falát szegélyező endothelsejtek szerepét tartjuk 18. oldal

19 meghatározónak, mely sejtek különösen érzékenyen reagálnak hypoxiából és reoxigenizációból eredő károsító hatásokra egyaránt [37]. Az erek belső felszínét bélelő endothelsejtek élő és dinamikus struktúrát alkotnak, mely alapvető fontosságú a vascularis homeosztázis fenntartásához. Elhúzódó hypoxia hatására megváltozik a membránpotenciál, ion, illetve folyadék eloszlási zavar jön létre, megnő a sejttérfogat, csökken a membrán fluiditása és gátlódik a cytoskeleton szerveződése. Az energiaraktárak kimerülése mellett egyes bioaktív anyagok (pl.: PGI2, NO) csökkent, mások (pl.: ET, TXA 2 ) fokozott termelődése jön létre. A hypoxiás környezetben bizonyos gének (pl.: adhéziós molekulák, cytokinek) indukciója, míg mások (pl.: enos, thrombomodulin) szuppressziója alakul ki bennük [38]. Az így kialakult állapotot összefoglalóan endothel dysfunctionak nevezzük. A reperfúzió során említett elváltozások nagy része súlyosbodik a hirtelen megnövekvő oxigénkínálatból eredő nagy mennyiségű szabadgyök képződés miatt [39]. A reperfúziót követő időszakban hirtelen alakul ki súlyos endothelialis dysfunctio anélkül, hogy kezdetben a sejtek morfológiai károsodása észlelhető lenne. A morfológiai jelek kialakulásához relatíve hosszabb idő szükséges. Ide soroljuk a sejtek duzzadását, a piknocitikus vezikulák elvesztést, az endothel sejtek elemelkedését a basalis membránról és aktivált neutrophilek kitapadását a sejtek felszínéhez [25]. Annak ellenére, hogy a sejtek a mikrocirkuláció egész területén egyformán ki vannak téve az I R károsító hatásának, a dysfunctiojuk elhelyezkedésükre jellemző módon jön létre [40]. Az arteriolák, a kapillárisok és a venulák egymástól eltérően reagálnak ebben a helyzetben Arteriolák Ezen az érterületen elsősorban a vazodilatáció válik elégtelenné az endothel dysfunctio következtében. A jelenség oka, hogy a nitrogén monoxid (NO) mediálta relaxáció elégtelensége miatt a simaizomzat vasodilatatorokra adott válaszkészsége csökken [40]. A exogen adagolt, endothel független relaxáló ágensekre (pl: nitroprussid Na) adott válasz az ischaemiát követően is megtartott marad, ami arra utal, hogy a vasodilatatio csökkenése nem a simaizom elégtelen működésére vezethető vissza. Az endothelsejtek NO termelése fiziológiásan 2 3 nagyságrenddel meghaladja a szuperoxid anion (O 2 ) képződés mennyiségét, I R hatására azonban az O oldal

20 túlprodukciójával egyidejűleg az NO képzése csökken. Reaktivitásuknak köszönhetően a két molekula gyorsan reagál egymással, ami még toxikusabb peroxynitrit (ONOO ) kialakulását eredményezi. Az utóbbi számos károsító hatása mellett ez a reakció a NO t gyakorlatilag teljesen elvonja biológiai funkciójától [37]. Amennyiben a szuperoxid anionok túlsúlyát az NO val szemben szuperoxid dizmutáz (SOD), illetve antioxidánsok segítségével sikerül megszüntetni, a vasodilatatio helyreáll. A lokális gyulladás következtében kitapadó aktivált fehérvérsejtek a szuperoxid anionok további fontos forrásai lehetnek. Ezzel hozzájárulnak a NO reperfúziót követő inaktiválódásához, illetve az igen agresszív ONOO té alakulásához [40] Kapillárisok Az I R nak kitett kapillárisokban megnő az endothel barrier áteresztőképessége, ami a folyadékkiáramlás jelentős fokozódásában nyilvánul meg [2;41]. A kapilláris dysfunctio másik eleme, az átáramoltatott kapillárisok számának csökkenése, shuntkeringés kialakulása. Ez utóbbi jelenség még inkább egyenlőtlenné teszi az interstitialis oedema miatt már károsodott szöveti perfúziót. Feltételezik, hogy az NO csökkent hozzáférhetőségének szerepe van a barrier funkció elégtelenné válásában [37]. Az NO szintáz (NOS) kísérletes gátlásával normál kapillárisok filtrációja is növelhető, ami arra utal, hogy a NO deficitnek patológiás körülmények között is jelentősége lehet [38]. Mikroembolia 5. ábra: Kapillárisok szerepe a reperfúzióban Számos I R nak kitett szervben leírták az átáramoltatott kapillárisok számának a csökkenését és az ebből eredő szöveti hypoxiát. Ennek más más oka lehet az egyes 20. oldal

21 szövetekben. A májban a fenti stimulusra aktivált, nehezen deformálható fehérvérsejtek, megduzzadt, részben levált endothelsejtek és a lumenbe türemkedő Kupffer sejtek képeznek áramlási akadályt a sinusoidokban, nyomásgrádienst okozva a sinusoidalispostsinusoidalis oldalon. Ismerve azt a tényt, mely szerint a Disse tér két oldalán a sinusiodokban a fenesztrált endothelek miatt a fehérjekoncentráció, illetve az ezzel összefüggésben álló onkotikus nyomás azonos, így minimális nyomáskülönbség hatására is jelentős mennyiségű folyadékfiltráció indul meg. Ezt bizonyítják azon korábbi kísérletek is, melyek szerint az izolált perfundált anoxiás patkánymáj ascitest termel, melynek mennyisége az ischaemia hatására többszörösére fokozódik [2;41]. Ezt követően a postcapillaris venulák területén megnövekedett fehérje és folyadékkiáramlás kapilláris kompresszióhoz vezet, csökkentve ezáltal bennük a véráramlást. A filtráció ilyen mértékű növekedésében már a gyulladásos endothelkárosodásnak is szerepe van. A leukocyták kitapadása, valamint aktiválódása mindkét mechanizmus során kulcsfontosságú. A különbség inkább abban nyilvánul meg, hogy a mechanikai akadály, vagy a szuperoxid termelés és a lokális gyulladás kap e nagyobb szerepet az obstructio létrehozásában, ami a véráramlás újraindulását tovább késlelteti. A fent ismertetett kapilláris dysfunctio no reflow jelenségként vált ismertté az irodalomban. Fontosságát az adja, hogy a reperfúzió során továbbra is fenntartja az ischaemiás hypoxiás állapotot, ráadásul teljesen kiszámíthatatlan eloszlásban és rosszul megjósolható ideig (5.ábra) Venulák Az érterület válaszreakciójára jellemző a leukocyta adhézió, aktiválódás és migráció, a thrombocyta aggregáció, valamint az albumin fokozott extravazációja [40]. Az I R hoz kapcsolódó gyulladásos válaszreakció jelentős része ezen az mikrocirkulációs szakaszon zajlik. Az interstitiumban mindenkor jelen lévő macrophagok és hízósejtek, ischaemia alatt a kapillárisok környékére vándorolnak, aktiválódnak és mediátorokat szabadítanak fel. Ezek diffúzió útján jutnak el az endothelsejtekhez, ahol erősítik az beinduló gyulladásos kaszkádot. A folyamat egyik meghatározó lépése, az aktivált leukocyták migrációja az érfalon keresztül. Ebben az eseménysorban számos adhéziós molekula részvételére van szükség, mind az endothelsejtek, mind pedig, a leukocyták részéről [40;42]. Első lépésként a 21. oldal

22 marginalizálódott neutrophilek és az endothelsejtek között P selectin segítségével laza kapcsolat alakul ki, amely még nem gátolja a görgést (ún. rolling). Az érpályából való kilépést megelőzően stabil kapcsolat jön létre [43], melyben a neutrophilek β2 integrinje az endothelialis intercellularis adhéziós molekulák 1 es típusához (ICAM 1) kapcsolódik [42]. Az ICAM 1 kis mennyiségű konstitutív expressziója fennáll az endothelsejtekben, de fiziológiás körülmények között legtöbbjük felszínéről teljesen hiányzik, vagy nem hozzáférhető. Lokális gyulladásos reakció hatására azonban, rapidan megemelkedik, majd a gyulladás progressziója során up regulálódik az ICAM 1 expressziója [43], ami további fehérvérsejtek (monocyták, eosinophilek, lymphocyták) toborzásához vezet. Az ICAM 1 expressziója, kisebb mértékben ugyan, de a nem ischaemizált májlebenyekben is megemelkedik, mely arra enged következtetni, hogy az indukcióban szisztémásan ható mediátorok játszanak szerepet, melyek az aktivált Kupffer sejtek, illetve endothelsejtek termékei lehetnek [25]. Szabadgyökök a postcapillaris venulák területén, tehát több forrásból is felszabadulnak, ezért az oxidatív stresszhatás itt a legintenzívebb. Az endothelsejtekből felszabaduló szuperoxid (O 2 ) és hidrogén peroxid (H 2 O 2 ) kialakulásában szerepet játszó egyik legfontosabb enzim a xantin oxidáz (XO). (ld. később) Az I R hatására megnövekedett vascularis permeabilitás fokozódás a venulák területén, az egész kérdéskör legszerteágazóbban vizsgált eleme. Kialakulásának alapja az endotheliális barrier elégtelensége, mely a plazmafehérjékre nézve nagymértékben megnövekedett áteresztőképességet jelent. Természetesen a dysfunctio ezen eleme is szervesen kapcsolódik a gyulladásos reakció többi részéhez. Kísérletes adatok vannak arra, hogy az albumin kilépés mértéke egyértelműen korrelál az odavándorló, valamint kitapadó fehérvérsejtek számával, tehát a terület leukocyta forgalma határozta meg a kialakuló interstitialis oedema mértékét [44]. Az összefüggések szorosságának további bizonyítékai azok a kísérletek, melyekben az endothel ODFR termelését, illetve a leukocyták kitapadását gátló kémiai anyagokkal a permeabilitás fokozódása is mérsékelhető volt [38] A reperfúzió dinamikája Vizsgálatok alapján egyértelművé vált, hogy szövet típustól és szerkezettől függően más más dinamikával, de általánosságban hasonló időbeli lefolyással jön létre sejtpusztulás. Különbség van azonban a pusztán ischaemiás és az ischaemiás 22. oldal

23 reperfúziós körülmények okozta sejtpusztulások dinamikája közt. A kezdeti azonos mérvű sejtpusztulás, egy, szövetenként változó hosszúságú idő után exponenciális növekedést mutat. Ugyanezen rendszerben a reperfúziós periódus, az oxidatív és nitrózativ stressz következtében ugrásszerű sejtpusztulást eredményez, majd ezt követően, a védelmi rendszerek jótékony aktivációjának eredményeként egy platófázist Sejtpusztulás % Is ch ae m ia ér el (6. ábra). Az egyes sejttípusok ischaemiás reperfúziós érzékenységében leírt különbségek, elsősorban a létrejövő elváltozások mértékében és nem annyira az elváltozás típusában mutat koznak meg. A leginkább szélsőséges eltérések két szövettípus között a reperfúziós károsító hatások intenzitásában jelennek meg, mely alapvetően a jelenlévő sejtféleségek tulajdonságaitól és arányától függ, de folyamatot mégis ugyanazok a mechanizmusok képezik. Különösen érvényes ez a reperfúzió utáni 0,5 4 óra eseményeire, melyek az I R károsodás korai fázisának tekinthetőek. Az ilyenkor felszabaduló, ún. korai, lokális mediátorok teremtik meg a késői (az I R után 6 24 óra múlva kialakuló) károsodás alapját, amikor már a gyulladásos folyamatok dominálnak. Ebben a fázisban a vérpályából kilépő leukocyták, tehát az odavándorló sejtes elemek, játszanak meghatározó szerepet. Is ch ae m ia + Re p e r ú zió 6. ábra: A sejtpusztulás dinamikai különbségei ischaemia és I R során Mivel a gyulladás kaszkád jellegű folyamatsor, a reakció mértékét a korai mediátorok mennyisége lényegesen befolyásolja. m in 1.4. Az ischaemiás reperfúziós kár osodás effektor mechanizmusai Oxidatív és nitrózatív stressz A szabadgyökök (ODFR vagy ROS) egy vegyértékkel rendelkező molekulák vagy molekula fragmentumok külső elektronhéjukon párosítatlan spinű elektront 23. oldal

24 tartalmaznak, melyek rendkívül hajlamosak a párképződésre. A szabadgyökök instabilak, és igen reaktívak, az általuk elindított reakciók nem enzimatikus láncreakciók. A szabadgyökök féléletideje igen rövid, szinte azonnal reakcióba lépnek a szervezetben található makromolekulákkal. Reaktív oxigéntartalmú szabadgyökök a szervezetben élettani körülmények között is keletkeznek kis mennyiségben. Az igen reaktív gyököket antioxidáns enzimek és antioxidáns anyagok folyamatosan inaktiválják. 7. ábra: ODFR koncentráció változása ischaemia és reperfúzió során Oxidatív stressznek nevezzük azt az állapotot, amikor aktuális szabadgyök antioxidáns megnövekszik. kontrollmechanizmus kiszabadult arány A alól szabadgyökök megtámadhatják a tiol, és amintartalmú peptideket. Különösen érzékenyek azok a fehérjék, melyek szabad funkciós csoporttal rendelkező aminosavakat tartalmaznak. A makromolekulák ennek következtében polimerizálódhatnak, aggregálódhatnak, fragmentálódhatnak, így az enzimfunkcióval rendelkező fehérjék inaktívvá válhatnak. A szabadgyökök kifejezett DNS károsító hatással is rendelkeznek. A DNS károsodása létrejöhet a cukorrészen, ami egyértelmű láncszakadáshoz vezet, a legjellemzőbb károsodás az egyszálú lánctörés, amely különféle repair komplex, így a PARP (poly(adp ribóz) polimeráz, (ld. később) aktiválásával jár, mely eredményeként a sejtek apoptotizálnak vagy nekrotizálnak. A telítetlen kettős kötéseket tartalmazó lipidek, koleszterin és zsírsavak oxidatív bomlása, illetve a beinduló autokatalitikus lipidperoxidáció kapcsán megváltoznak a membránok permeabilitási tulajdonságai A lipidperoxidok a légzési láncot is károsítják [45;46]. I R alatt keletkező ODFR k fő forrása a xantin oxidáz, illetve a mitochondriális légzési lánc, főként az I. komplex [45]. ODFR szintjének kis emelkedése figyelhető meg ischaemia alatt, míg a keringés helyreállításának harmadik negyedik percében 24. oldal

25 óriási mennyiségű ODFR keletkezik (7. ábra). A jelenség a respiratory burst [36;45;46], mely reakciói energiaigényes folyamatok. Ezen killing mechanizmusok során a phagocyták oxigénfogyasztása a sejteket ért stimulus hatására hirtelen megnő. E fokozott légzés nem gátolható cianiddal, ami arra utal, hogy benne a mitochondrialis oxigénfogyasztáson túl más mechanizmusok is szerepet játszanak [47], a folyamatban O 2 anion szabadul fel [48;49]. A fenti mechanizmusban résztvevő enzimek: NADPHoxidáz, L és D aminosav oxidázok, mieloperoxidáz hidrogénperoxid halid rendszer. A tökéletlenül redukált oxigénszármazékok közé tartoznak a következő molekulák: (1) O 2 szuperoxid anion; enzimatikus, és nem enzimatikus úton is keletkezik; (2) OH hidroxilgyök; természetes (kozmikus sugárzás), vagy mesterséges (gamma sugárzás) hatására víz hasításával képződik; (3) NO: nitrogénmonoxid; melyből ONOO peroxynitrit képződhet. (4) A spontán és enzimatikus úton keletkező, de a fenti definíció szerint nem szabadgyök az igen reaktív H 2 O 2 (hidrogén peroxid), kémiai reaktivitása és szabadgyök prekurzor tulajdonsága miatt a szabadgyökök közé soroljuk Szabadgyökök keletkezése ODFR k keletkezhetnek mind (A) nem enzimatikus, mind (B) enzimatikus, spontán reakciók hatására. Ezen fejezet részletes megbeszélése a kísérleteim során felhasznált metodikai lépések megértése miatt elengedhetetlen. (A) ODFR k képződése nem enzimatikus úton: A folyamatban a vas atom fontos szerepet játszik. Különböző Fe 2+ komplexek, így nukleotid Fe 2+ komplexek (pl. ADP Fe 2+ ) oxigénnel reagálva hoznak létre tökéletlenül redukált oxigénszármazékokat. A belélegzett levegő O 2 je 1 3% ban O 2 ná alakul, mivel a légzési láncban a normális körülmények között is képződik szuperoxidanion. Fő képződési helye a koenzim Q (I. komplex), itt termelődik az összes szabadgyök mintegy 2/3 része. Az emlősök mája megközelítőleg 24 nmol O 2 /min/g mennyiségben képez szuperoxidaniont. A mitochondrium O 2 steady state szintje M a szuperoxid dizmutáznak köszönhetően. A normális O 2 termelés évente kb. 2 kg [50]. (B) ODFR k képződése enzimatikus úton: Enzimatikusan O 2 és H 2 O 2 termelődhet. Fagocitózisra képes sejtekben található, cianiddal nem gátolható NADPH oxidázt, oxigénfogyasztása a respiratory burst során hatszor több mint a többi oxidázé. Ischaemia reperfúzió során a NADPH oxidáz aktivitásának növekedését figyelték meg. 25. oldal

26 Hypoxiában az ATP ből ADP, majd xantin keletkezik, amely reakciót a FAD tartalmú xantin oxidáz (XO) katalizálja [51]. Ennek a reakciónak mellékterméke O 2 és H 2 O 2. Az enzim nagy mennyiségben található az endothelsejtekben, ahol hypoxia, illetve ischaemia hatására a xantin dehidrogenáz xantin oxidázzá alakul át [37]. A hypoxia során az ADP lebontása is bekövetkezik, amely reakciósor végtermékeként hypoxantin halmozódik fel. A XO szubsztrátjaként az enzim nagy mennyiségű O 2 termelését teszi lehetővé, amikor a reperfúzió során hozzáférhetővé válik a működéséhez szükséges O 2. A XO elsősorban a reperfúziót követő első percekben felelős az ODFR termeléséért, addig, amíg vissza nem nyeri dehidrogenáz funkcióját. Az ezt követő, jóval nagyobb mértékű oxidatív stressz forrása a sok kitapadó, aktivált fehérvérsejt. A XO aktivitása és az adhézióra képes fehérvérsejtek toborzása közötti kapcsolat bizonyítottnak látszik, tehát az XO nak mintegy iniciátor szerepe van a folyamatban, így ennek allopurinollal való gátlása kedvező hatású lehet [2;34;37;38]. Prooxidáns enzimnek tartják a konstitutív és indukálható izoformával rendelkező nitrogénmonoxid szintázt (NOS). A nitrogén monoxid (NO) rövid félélet idejű jelátviteli molekula, melyet ereken kifejtett biológiai hatása miatt először EDRF nek (endothel derived relaxing factor) nevezték. A NO t az endothelsejtek termelik, és a vascularis simaizomsejtek relaxációját okozza: IC cgmp szint növelését követő protein kináz G (PKG) aktiváción át IC Ca 2+ szint csökkentéssel. A NO szintézise enzimatikus úton történik L argininből a NO szintáz (NOS) által katalizált reakcióban. Az enzimnek több izoformája ismert: (1) konstitutív formája van jelen, mely a bazális NO szintézist biztosítja pl. enos = endothelialis NOS. (2) Sokkal aktívabb indukálható NOS (inos) különböző jelátviteli utak hatására expresszálódik. Az enzim szintéziséhez kb. 6 8 órára van szükség, így az I R károsodás korai szakában nem játszik szerepet [52;53]. Ezt követően viszont órán keresztül fennmarad aktív formában és nagy mennyiségű NO termelésére képes. Az I R során a NO aktuális biológiai hozzáférhetősége mind a mikrocirculációra, mind a gyulladásos válaszra hatással van [54]. Ischaemia alatt az endothelsejtekben lecsökken a NO szintézis kofaktorainak (O 2 és NADPH) a szintje. Ezzel egyidejűleg fokozódik az argináz aktivitása és lebontja a szintézishez nélkülözhetetlen L arginint. Az enos tehát, a postischaemiás szövetekben még gátolt állapotban van, amikor a reperfúzió során hirtelen megemelkedik a szuperoxid termelése a respiráció újraindulása 26. oldal

27 következtében [52]. Normál körülmények között a NO termelődése jóval meghaladja a szuperoxidanion termelődés mértékét. Ez a két reaktív molekula igen nagy affinitással, nem enzimatikus úton reagál egymással: NO + O 2 ONOO. A képződött peroxynitrit (ONOO ) kifejezett citotoxikus hatással rendelkezik [55]. Annak ellenére, hogy a peroxynitrit az egyik legagresszívebb szabadgyök, fiziológiás körülmények között az antioxidánsok semlegesítik és nem ér el toxikus koncentrációt [56]. Kísérletek bizonyítják az exogén NO donorok protektív hatására. Ugyanakkor ismeretes, hogy a későn (kb. 6 órával a reperfúzió után) adott NO donorok, a károsodást növelték. Ez azzal magyarázható, hogy ekkorra már bekövetkezik az inos termelése és ez az aktivitás a donorokkal együtt a NO koncentrációt toxikus mértékben megemeli [54;56;57]. Az ún. kettős hipotézis: eszerint az alacsony NO szint amit a sinusoidális endothelben az enos termel protektív a májsejt necrosis és apoptózis ellen, továbbá fenntartja a szöveti perfúziót. A magas NO szint amit a hepatocytákban lévő inos termel kompenzatorikus és pro apoptotikus hatású [55] Szabadgyökök eliminációjáért felelős mechanizmusok (A) ODFR eliminálás enzimatikus úton: A mitochondriumokban és microsomákban megtalálható szuperoxid dizmutáz (SOD) a szuperoxidanionok semlegesítését végzi: O 2 + O H + H 2 O 2 + O 2. [58] A keletkező H 2 O 2 ból Fe 2+ jelenlétében OH gyökök keletkezhetnek, mely gyökök ellen közvetlen enzimes védekezés nincs, a szervezet úgy védekezik a hidroxilgyökök ellen, hogy prekurzorát, a hidrogén peroxidot eliminálja. Az említett H 2 O 2 eliminálásában játszik szerepet a peroxiszómák 40% át adó, haem tartalmú enzim, a kataláz: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 A H 2 O 2 ot, és a lipidperoxidokat a peroxidáz enzim vízzé redukálja. A szelén tartalmú glutation peroxidáz esetében az elektron/hidrogén donor a glutation, mely a sejtek redox státuszában szulfhidril pufferként viselkedik. A glutation két formában van jelen a sejtekben, a redukált tiol formában (GSH) és az oxidált formában (GSSG), amely egy diszulfid kötéssel összekapcsolt két tripeptidből áll. A GSSG t a glutation reduktáz redukálja GSH vá. GSH/GSSG arány a sejtekben több mint 500. (B) ODFR eliminálás nem enzimatikus úton: Felsorolás szintjén: E vitamin: A lipidperoxidáció gátlómolekulája. 1 molekula E vitamin kb lipidmolekulát képes 27. oldal

28 megvédeni a lipidperoxidációban [5;59]. C vitamin: lánctörő antioxidáns. A C vitamin az E vitamin ko antioxidánsa. A mitokondriális ubikinon (koenzim Q, Co Q) redukált formája (az ubikinol) fontos antioxidáns [60 62]. Flavonoidok: silymarin, mely kiváló antioxidáns hatású, növeli a lymphocyták SOD aktivitását.[6;63] Glutation (GSH): A máj igen fontos a GSH szintézisben, ahol egy komplex, ciszteint, glutamátot és glicint is, mint köztiterméket, magába foglaló bioszintetikus út ér véget. Külön említést érdemel a glutamin (Gln): A glutamin protektív hatása a csökkent szabadgyök produkción keresztül valósul meg. A májban a glutamin, a GSH bioszintézisében esszenciális fontosságú. A GSH szintézisének egyik lehetősége a májban lejátszódó aminosavtranszport folyamatokkal függ össze. A gamma glutamilciklus során a redukált GSH (glutamil cisztein glicin) glutamil gamma karboxil csoportja és egy transzportálandó aminosav aminocsoportja között kötés jön létre a sejtmembránban, és így egy külső aminosav a sejt citoszoljába kerül, ahol aztán felszabadul. A ciklus további része a hidrolizált GSH reszintézisét szolgálja. Egy ciklus végbemeneteléhez 3 ATP szükséges. A folyamat egyrészt aminosav sejtszintű felvételét és másrészt az antioxidáns glutation szintézist szolgálja. Kísérletek igazolták, hogy a glutaminban gazdag enterális táplálás eredményeként a NO szintézis csökkent, ezáltal csökkent a nitrózativ stressz. A glutamin önmaga nem gátolja a NOS t, de a glutamin metabolizmus, még nem pontosan ismert úton, dózisdependens módon befolyásolja az endothelialis NO produkciót [64]. A glutamin, a fentiek mellett az apoptózisban is fontos szerepet tölt be [65] A lokális gyulladásos reakció résztvevői Leukocyták A leukocyták I R károsodásban betöltött szerepéről már részben szóltam a microvascularis dysfunctioval, illetve a szabadgyök képzéssel kapcsolatban. Az általuk kiváltott hatások és a belőlük felszabaduló mediátorok, illetve enzimek a gyulladásos reakció szerves részét képezik. A leukocytákat számos kemotaktikus anyag vonzza a károsodás területére. Közülük sejtes eredetűek a LTB 4, a PAF, az IL 1, a TNF α és az IL 8, valamint különböző sejtvonalak növekedési faktorai. A plazma eredetű a komplement kaszkád elemei: C3a, C4a és C5a. Az említett vegyületek hatására az aktivált neutrophilek szuperoxidot és hidrogén peroxidot termelnek, illetve myeloperoxidázt szekretálnak: OCl + H 2 O 2 Cl + H 2 O + 1 O oldal

29 Több lépéses folyamat teszi lehetővé a neutrophileknek a sinusoidális endothelsejtekhez való adhézióját. Az L selectin hatására a neutrophilek megtapadnak lassú, érfal melletti szoros áramlás jön létre, majd sejtadhéziós β 2 integrin receptorok up regulálódnak. A aktivált neutrophilek a lassan gördülőnek (rolling) az érfalon. A β 2 integrin ligandja az endothelialis ICAM 1 (intercelluláris adhéziós molekula 1). A molekulák kapcsolódásával a neutrophilek kitapadnak, migrálódnak [66]. Az ICAM 1 emelkedett expresszióját normál epitheliális és endotheliális cytokinek (TNF α, IL 1) indukálják [67], így nem meglepő, hogy az I R emelkedett ICAM 1 expresszióval jár [68]. A folyamat eredménye: leukostasis azaz a fehérvérsejtek lassult keringése, mely akadályozza a mikrokeringést. A kitapadó fehérvérsejtek nem tömeszelik el teljesen a sinusoidealis keringést, azonban az áramlásuk lelassulása nagyban hozzájárul a reperfúzió utáni mikrokeringés elégtelenségének (no reflow jelenség) kialakulásához Kupffer sejtek 1876 os felfedezésük (von Kupffer) óta tudjuk, hogy a májsinusoidokban elhelyezkedő Kupffer sejtek teszik ki szervezetünk szöveti macrophagjainak legnagyobb hányadát [69]. Aktiválódásukkal nagy mennyiségű gyulladásos mediátort és szabadgyököt termelnek. A reperfúzió során észlelt aktivációjuk jeleit elektronmikroszkópos vizsgálatokkal tették láthatóvá [70], amelyek összefüggést mutattak a májparenchyma károsodásával. Gadolínium kloriddal Kupffer sejt inhibitorral előkezelt patkánymájak I R károsodása csökken [70]. A Kupffer sejtek és az endothelsejtek sokkal ellenállóbbak a hypoxiára, mint a hepatocyták, míg a reperfúzió az endothelsejtek károsodást jobban fokozza, a nyugalomban lévő Kupffersejteket és a hepatocytákat kevésbé [7] Citokinek Az ischaemia reperfúzió során egy komplex gyulladásos kaszkád aktiválódik, melynek indukálásában és fenntartásában fontos szerepet játszanak a citokinek (TNF α, IL 1, IL 6). Lokális gyulladást elősegítő hatásuk fokozottan érvényesül az I R során megjelenő mikrocirkulációs zavar hatására. A csökkent véráramlás miatt a citokinek kimosódása a szövetből csökken, így nagy koncentrációt érnek el a károsodott szövetben. A tumor necrosis factor alpha (TNF α) és az interleukin 1 (IL 1) a két legfontosabb proinflammatikus citokin az I R károsodás patogenezisében. Mindkét 29. oldal

30 citokin indukálja a kemotaktikus hatású interleukin 8 (IL 8) szintézisét [11] és fokozza az adhéziós molekulák (pl. L szelektin, β integrin) expresszióját. Kísérleteim szempontjából kiemelendő a Tumor Necrosis Factor alpha (TNF α) számos immun és nem immun sejtben termelődik. A TNF α és β közös molekulacsaládba tartozik; a TNF α 25 kda molekulatömegű II. típusú sejtmembránfehérjeként szintetizálódik, amiből proteolitikusan hasad le a 17 kda méretű szekretált forma, amely stabil homotrimereket alkot. A TNF α elsősorban aktivált macrophagokból, a TNF β (más néven limphotoxin α LTα) pedig aktivált T sejtekből származik. A TNF α t először tumorsejteket ölő és általános leromlást (cachexiát) okozó hatása alapján írták le (ez utóbbi miatt kahektin nek is nevezték). Máj I R során a TNF α elsődleges forrásai a neutrophil és Kupffer sejtek. A kialakuló gyulladásos válasz indukciójában van fontos szerepe a TNF α nak, mivel koncentrációja gyorsan növekszik a károsodott szervben, és sok más citokin termelését fokozza (IL 1, IL 6, IL 8). A TNF α nagyon erős kemotaktikus hatással rendelkezik, és szabadgyökök termelését fokozza. A sinusoidealis endothel és a neutrophil sejtek közötti kapcsolatok száma növekszik TNF α jelenlétében, mivel az adhézióban jelentős ICAM 1 és E szelektin expresszióját segíti elő Nitrogén monoxid endothelin egyensúly Korábban említett vazodilatátor, prooxidáns prekurzor NO molekula keletkezésére, tulajdonságaira hivatkozok a fenti fejezetre ( ODFR k keletkezése), itt csupán a mikrocirkulációs zavarban betöltött hatásáról szóló evidenciák kerülnek ismertetésre. A NO koncentráció a reperfúzió első 4 6 órájában alacsony. Ez az ischaemiás szakasz után megfigyelhető alacsony kofaktor (O 2, NADPH) szint, valamint az argináz enzim jelentős mennyiségének felszabadulása miatt következik be. Igazolja ezt, hogy orthotopicus májtranszplantáció során a máj reperfúziója után közvetlenül nagy mennyiségű argináz szabadul fel a graftból, amely 30 perccel a reperfúzió beállta után az L arginin szintjének csökkenését vonja maga után [71]. Nem valószínű, hogy szignifikáns NO produkció a reperfúziót követő első 6 órán belül bekövetkezik, mivel ehhez az inos indukciója szükséges, amely 4 6 órát vesz igénybe [72]. Ennek következtében farmakológiai értelemben a máj hasznot húzna az exogén NO koncentráció emeléséből a reperfúzió korai szakaszában. Bizonyítják ezt azzal is, hogy 30. oldal

31 állatmodellben az inos gátlása jelentős májkárosodást okozott [73]. Az exogén úton bejuttatott NO hatása időfüggő (ld fejezet) [74]. Az endothelin 1 (ET 1) vasokonstriktor, hatását a simaizmokon található, kizárólagosan érszűkületet okozó ETA receptoron és különböző sejteken található, változatos hatású ETB receptorokon fejti ki. Az ETB receptor két izoformája ismeretes: az ETB1 receptor az endothelsejtekben az enos serkentésén keresztül relaxációt okoz, amíg az ETB2 vasokonstrikciót. Az ET 1 sinusoidon kívül is hat, azonban a sinusoidok belseje a fiziológiásnál jóval alacsonyabb koncentrációra is érzékeny [75]. Az endothelin (ET) a májreperfúzió korai fázisában a plazmában és a májparenchymában is emelkedett koncentrációt mutat, ami korrelál a csökkent májáramlással [76]. Egy I R patkánymodellben bosentannal (ET receptor antagonista) előkezelt állatok mérsékelt károsodást mutattak, hasonlóképpen mint exogén NO bevitelkor [77]. Más vizsgálatokban azt találták, hogy az endothelin 1 dózisdependens módon okozza az Itosejtek aktivációját vasokonstrikciót eredményezve, addig a nitroprussid Na ezek inaktivációját okozza [35], így feltételezhető, hogy az I R károsodás az ET és a NO egyensúlyának felborulása miatt következik be a reperfúzió alatt [77] Sejthalál: necr osis vagy apoptózis Az I R károsodás számos reakciósor egymásba kapcsolódó láncolata. A szabadgyökök megjelenése, a ph eltolódása, no reflow jelenség, illetve a gyulladásos válaszjelenség kialakulása számos mediátor részvételével határozza meg a károsodott sejtek további sorsát: túlélés vagy sejthalál. Az irodalomban az elmúlt évtizedben egyre szélesebb körben jelentek meg közlemények, melyek szerint a májban lejátszódó anoxiát követő reperfúzió után nem csupán az energiadeficitből adódó sejtelhalás, necrosis, hanem programozott sejthalál, apoptózis is előfordul. Ezen fejezet hivatott bemutatni ezen jelenségek patofiziológiáját, ezzel könnyebb érthetőséget biztosítva a kísérletes modell eredményeihez Necrosis ischemiás reperfúziós károsodások kapcsán Az ischaemiában megjelenő hypoxia eredményeként a szövetekben csökken a mitochondriumok által termelt ATP szint. Ez a sejtek és a mitochondrium duzzadásához, gömbölyűvé válásához, az endoplazmatikus retikulum dilatációjához, majd végül a plazmamembrán protrúzióból létrejött ún. bleb ek kialakulásához vezet 31. oldal

32 [78;79]. A bleb ek megjelenése egyértelműen az ATP hiány következtében kialakult megváltozott sejtvolumen és a cytoskeleton architektúrájának felborulásából fakad. Egy rövid ideig tartó anoxia/ischemia után jött reperfúzió a bleb képződés gyors megszűnéséhez vezet. A sejthalál előtti pillanatban a hepatocyták és a sinusiodalis endothel sejtek metastabil állapotba kerülnek, mely jellemzői: a mitochondrialis permeabilitás növekedése, a lysosomák disruptioja, a bleb ek növekedése és egybeolvadása, sejtduzzadás, illetve az anionos komponensek szivárgása. Ezzel egyidőben a fokozott intracelluláris Ca 2+ beáramlás tovább súlyosbítja a mitochodriumok működését [80]. Az anionok megnyílt csatornákon való kiáramlása vezet további sejtduzzadáshoz, majd a bleb ek, ezzel a sejtmembrán, majd így sejt ruptúrájához. A fenti vacuolizációval, kariolysissel, majd gyulladásos jelenségekkel járó folyamatot necrosis nak, újabb nomenklatúrák szerint oncosis nak, oncotikus necrosisnak nevezzük [81]. A sejtes elemek extracelluláris térbe való kilépése gyulladásos válaszjelenséget indít meg a reperfúzió alatt. Ezt követően a későbbiekben macrophagok bekebelezik a sejtfragmentumokat és sarj, majd kötőszövet foglalja el az érintett területet Az apoptózis Az apoptózisban résztvevő sejteket morfológiájuk alapján különböztetjük meg [82]. Az apoptózis klasszikus jelei: a sejt zsugorodása, a sejtmag kondenzálódása, a kromatin marginalizációja, a mag és a citoplazma apoptotikus testecskékben (apoptotic body) való fragmentációja, melyeket a környező sejtek fagocytálnak. Az apoptózis eredeti definíciója szerint az apoptózisban részt vevő sejtek citoplazma organellumai az egészségeshez hasonló morfológiát mutatnak, szemben a necrosissal. Ugyanakkor az utóbbi időben tanulmányok számolnak be arról, hogy az apoptózis folyamatában a mitochondriumok megduzzadnak, az endoplazmatikus retikulum struktúrájában változások állnak be [83]. Ugyanakkor fontos jelenség, hogy az apoptózist nem kíséri gyulladásos válasz. A degradálódott sejteket a környező phagocytosisra alkalmas sejtek távolítják el, következményes gyulladás nélkül. Elmondható továbbá, hogy az apoptózis jelensége inkább izolált sejteket érint, ritkábban egyes véletlenszerű sejtcsoportokat, de egyértelműen nem összefüggő területeket, mint a necrosisban. Előfordul az is, hogy az apoptózis programjába belépő sejt nem megy végig a fenti úton. Egy következményes, másodlagos necrosis lép fel, mely gyulladásos jelenségekkel kísért (ld. necrapoptozis). 32. oldal

33 A hepatocellularis apoptózis mechanizmusa Az apoptózis mechanizmusában a két legfontosabb jelátviteli út ismert: (A) külső, ún. halálligand halálreceptor út, valamint a (B) belső, ún. mitochondriális út. (A) I. típusú, extrinsic vagy halálligand halálreceptor út A halálligandok (pl.: TNF α, Fas ligand) olyan cytokinek, melyek specifikus receptoraikhoz kapcsolódva elindítják az arra érzékeny sejtek apoptózis programját. Ilyenkor instruktív apoptózisról beszélünk. A TNF két ismert receptora TNFRI és a TNFRII az apoptotikus folyamatok indukálásában van szerepe. A halálreceptorok intracitoplazmatikus részükön haláldomént tartalmaznak a jelátvitel elindításához. Az apoptózis programját a stimulust jelentő ligand és receptorának kapcsolata indítja el. Az intracelluláris haláldoménen keresztül adaptorfehérjék, rajtuk keresztül pedig, iniciátorkaszpázok kapcsolódnak hozzájuk aktivációs komplexet hozva létre. A kaszpázok proteázok, proenzim formában találhatóak a sejtek citoplazmájában. Az apoptózis folyamataiban elsősorban a kaszpáz 3, 6, 7, 8, 9 és 10 játszanak fontos szerepet. A leggyakoribb iniciátorok a kaszpáz 8 és 9, míg a végrehajtásban a kaszpáz 3 é a legfontosabb szerep [84]. (B) II. típusú, intrinsic vagy mitochodrialis út Amellett, hogy az apoptózishoz szükséges energiát a mitochondriumok szolgáltatják, részt vesznek az apoptózis megindításában is. Általánosságban elmondható, hogy a hepatocytákban a II. típusú, mitochondriumokon keresztül lejátszódó apoptózis indul meg gyakrabban. Általában olyankor kell a mitochondrialis út iniciátor szerepével számolni, amikor DNS károsodás miatt jön létre az apoptózis. Ezen az úton a receptor ligand kapcsolódás után aktiválódó kaszpáz 8 fragmentumok a Bcl 2 családba tartozó Bid fehérjéhez kötődnek, aktiválva ezzel azt (tbid), és így megteremtik a mitochondrialis transzlokáció feltételeit. Ezt követően a MPTP (mitochondrial permeability transition pore) jelenlétén keresztül egyes molekulák mitochodriális intermembrán térbe való kijutása jöhet létre [85]. Az oxidatív stressz, adenin nukleotid hiány, foszfátszint emelkedés és a mitochondrium depolarizáció érzékenyítik a MPTP t Ca 2+ iránt. A Mg 2+ és ph szint csökkenése antagonizálják a Ca 2+ kötődést, ezáltal a MPTP nyílást. Reperfúzió során viszont fokozza az MPTP nyitás feltételei, mivel ilyenkor néhány percen belül az alacsony ph gátló hatása is megszűnik [86]. Az MPTP nyitás következménye egyrészt, hogy az intermembrán térben 33. oldal

34 fenntartható protongrádiens megszűnik, szétkapcsolódik az oxidatív foszforiláció. 8. ábra: Az apoptózis szignáltraszdukciója májsejteben. Forrás: Jaeschke H, Gastroenterology. 125(4), p1248; 2003 Másrészt, az MPTP okon keresztül citokróm c n kívül prokaszpázok, IAP (inhibitor apoptózis protein) gátló és egy apoptózis indukáló faktor (AIF) is a citószolba jut (8. ábra). mitochondrium Az AIF hatására a membrán depolarizációja, a kromatin állomány kondenzációja, hosszanti duzzadása és a plazmamembrán foszfatidil szerinjeinek a külső rétegbe való áthelyeződése figyelhető meg, így a sejt környezete felismeri az apoptótikus sejtet. A citoplazmában a citokróm c az ún. apoptoszóma kialakításában vesz részt, APAF 1 (apoptosisis activating factor 1), a prokaszpáz 9 el együtt, ami ennek aktiválásához vezet, ami kaszpáz 3 aktivációt eredményez. A kaszpáz 3, mint végső iniciátor, megindítja az effektorválaszban résztvevő enzimek aktiválását, úm: DNázok, transzglutaminázok, proteázok. Érdekes megfigyelés volt, hogy a halálreceptorok által beindított szignáltranszdukciók a sejt túlélését is közvetíthetik. A TNF α receptor asszociált factor képes aktiválni az NFκB (nukleáris faktor κb) t, egy olyan transzkripciós faktort, mely számos gén promoteréhez képes kapcsolódni és antiapoptotikus lehetőségnek tekinthető [87] Az apoptózis kimutatása, szöveti reakciók Az apoptózis kimutatására használt leggyakoribb módszerek [88]: Sejtmag morfológia vizsgálat szövettani metszetek és fluorescens festéssel (DAPI, propidium jodid) kimutatható DNS töredezettség TUNEL (Terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dutp digoxigenin nick end labeling) és ehhez kapcsolódó módszerek (DNS lánctörések in situ kimutatása) Annexin V (foszfatidilszerin externalizáció kimutatása) 34. oldal

35 Kaszpázok kimutatása: (1) enzim reakciók; (2) immunhisztokémia speciális antitestekkel; (3) Western blot az aktív fragmetumok növekedésének, illetve a prokaszpáz szint csökkenésének kimutatására Magfestési eljárások szupravitális festésekkel (trypan blue, propidium iodide) Mitochondrialis depolarizáció kimutatása (rhodamine 123) Cytochrom c IC kimutatása pl. Western blottal vagy immunhisztokémiával Proapoptotikus fehérjék (Bax, Bid stb) mitochondrialis transzlokációjának kimutatása. Kiemelendő, hogy az apoptózis során lejátszódó események egymás láncolataként, egyben vizsgálva értelmezhetőek, csupán egyfajta sejtszintű változás nem jelent apoptózist [89]. Úgy tűnik, hogy a kaszpáz 3 kimutatás a leghatékonyabb apoptózis kimutatására, ugyanakkor ismerni kell azt a tényt is, hogy nem minden apoptózisban jelenik meg törvényszerűen. Necrosis során szintén létrejön random módon DNS fragmentáció, mely nem internucleosomalis és túlnyomó többségében nem 190 bázispárnyi. Gélelektroforézissel a fragmentumok nagysága kimutatható. Ugyanakkor, egyes megfigyelések [90;91] szerint a TUNEL reakció nem képes érzékenyen differenciálni az apoptózis jelenlétét, mivel internucleosomalis DNS fragmentációk és a moderált necrosis során létrejött DNS töredezettség hasonló jelenséget mutathat. Összességében elmondható, hogy az apoptózis identifikálására használt legmegbízhatóbb módszer a morfológiai vizsgálat, mely, ha felveti az apoptózis jelenlétét, továbbiakban kiegészíthető a fent említett vizsgálati elemekkel Az apoptózis májszöveti ischaemia reperfúzió során 1996 ban született az első közlemény, mely I R alatt bekövetkezett apoptózisról számol be májban [92]. A kísérletben 60 perces meleg ischaemiát és 24 órás reperfúziót követően növekedett a morfológiai jelek alapján apoptotikusnak tartott sejtek száma. Más tanulmányok TUNEL reakció segítségével bizonyították az apoptózis számának növekedését hepatocytákban humán májtranszplantációkat követően [93]. További, hasonló metodikával készült (TUNEL, elektronmikroszkópia) kísérletekkel igazolták, hogy a hideg I R károsodás után reperfúzió 6. órájában elsősorban a sinusoidealis endothelsejtekben (60 80%) jött létre apoptózis [94]. A folyamat indukciójáért elsősorban a Kupffer sejtekből felszabadult mediátorokat (TNF α) tartották felelősnek. A növekvő irodalmi adatok alapján megállapíthatjuk, hogy a májban a meleg I R 35. oldal

36 károsodásokat követően a necrosis dominál elsősorban, mely transzamináz eltérésekkel kísért. Ezen állítással szemben, egyes szerzők állítása szerint ischaemia, TNF α indukálta apoptózis a májsejtek 15 30% ban jelenik meg, szoros caspase 3 aktivációt eredményezve [95;96]. Mások, hasonló feltételezések alapján, kaszpázinhibitorokkal szerzett protektív hatásról számolnak be máj I R során [97;98]. Hideg ischaemiás károsodás (traszplantációs tárolás) kisebb hepatocyta elhalást és csökkent transzamináz felszabadulást okoz, viszont jelentősen fokozódik az endothelsejt pusztulás [91]. Fontos megjegyezni, hogy amíg a necrosis tipikusan összefüggő területeket érint, főként a pericentralis vagy II. zónában, addig az apoptózis individuálisan, sejtenként jelenik meg. Ha nagyobb sejtcsoportok mutatnak összefüggő, apoptózisra jellemző mintázatot, az in vivo létrejött TNF α, Fas aktivációval magyarázható [88] Necrapoptózis Az apoptózis és a necrosis részben egymástól jól elkülöníthető, részben egymást átfedő jelenség. A MPTP csakúgy, mint az apoptózisban, necrosisban is jelentős szerepet játszik. Ischaemia alatt az anaerob glikolízis és az ATP hidrolízis kapcsán rapidan csökkenő ph erős védőmechanizmus a necroticus sejtpusztulás ellen, szemben a csökkenő ATP szinttel. Ugyanakkor a reperfúzió során a fiziológiás ph visszatér, beindul egy ún. ph dependens sejthalál, melynek központi lépése a MPTP aktivációja, mely 7 alatti ph esetén egyébként gátolt [25;86;99]. Az MPTP aktivációja következtében a mitochondriumban az energiatermelő folyamatok szétkapcsolása jön létre, mely további ATP deplécióhoz, majd sejthalálhoz vezet [86]. Jogosan merül fel a kérdés: hogyan lesz a folyamat vége apoptózis vagy necrosis, ha a központi lépést ugyanaz a molekula (MPTP) irányítja? A válasz az ATP szintben rejlik. Úgy tűnik, hogy a magas energiatartalmú foszfátok koncentrációja határozza meg az utat az apoptózis és necrosis között. Amikor a reperfúzió egyszerre jár ATP deplécióval és MPTP aktivációval, akkor az apoptózis szignálútjai gátlódnak apoptosoma szinten és necrosis következik be (necrapoptózis). Azon esetben, ha a glikolízis szubsztrátjai elérhetőek és elegendő koncentrációban vannak jelen, nem következik be ATP depléció és következményes necrosis. Ehhez, a normoxiás májsejteknek körülbelül 10 % szabad ATP koncentrációval kell rendelkezniük. Ezért az az ATP szint (15 20 % a a 36. oldal

37 normoxiás sejt ATP tartalmának), mely elegendő a necrosis kivédésére, már több mint elég a cytochrom c dependens kaszpáz aktivációhoz. [100]. Ugyanakkor a klasszikus apoptózis folyamata necrosisba fordulhat, ha a fogyatkozó ATP szint miatt zavar keletkezik a plazmamembrán barrier funkciókban. Így az apoptózist egy secunder necrosis követi [101]. Ezen fenomén leírására született a necrapoptozis vagy aponecrosis kifejezés, mely jól tükrözi, hogy a folyamatok egymásba konvertálódhatnak. Közös pont a folyamatban az MPTP aktiváció, mely ATP dependens módon irányítja a folyamatot Az IP és az apoptózis Az ischaemiás preconditionálás és az apoptózis összefüggése nem egyértelmű. Tények alapján elmondható, hogy a NO csökkenti az apoptózist az endothelsejtekben [102]. Kísérleti modellben, parciális májischaemia előtt alkalmazott IP gátolta az apoptózis kialakulását hepatocytákban és sinusiodealis endothelsejtekben. A jelenséget a kaszpáz 3 inaktivációjával hozták összefüggésbe [103]. A kapcsolat az IP és a kaszpázok csökkent aktivitása közt csupán spekulatív. Kimutatták, hogy a NO kaszpáz gátló hatással rendelkezik in vitro. Ezen elképzelés szerint [104] a NO antiapoptotikus hatása a megnövekedett cgmp szinttel, a Bcl 2 upregulációjával, illetve fokozott HSPs termeléssel lenne kapcsolatban [105]. Fentiek alapján vélhetően a májban az IP antiapoptotikus hatása NO mediált A PARP fiziológiás és patológiás szerepe az I R kár osodásban A poli(adp ribóz) polimerázok (PARP ok) számos sejtfunkció regulálásában vesznek részt. A sejtmag enzimjeinek nagy részét a PARP molekulák teszik ki. Számos izoformáját leírták, a sejtben a legnagyobb mennyiségben PARP1 izoforma fordul elő. A PARP1 molekula három fő hatása: (1) szerepe van a DNS károsodások kijavításában; (2) működése során a sejt energiaraktárait depletálhatja; (3) proinflammatorikus gének transzkripcióját serkenti. A PARP1 116 kda os fehérje; a C terminális régión elhelyezkedő katalitikus domént követi egy auto modifikációs köztes domén, végül az N terminális végén találhatók a DNS kötődésért felelős cink ujjak. A PARP1 molekula két fő szerepe a DNS károsodás felismerése (szenzor funkció) és a repair komplexek működésének elősegítése (szignál funkció). A DNS kötő régió a DNS szabadgyökök, ionizáló 37. oldal

38 sugárzás, alkiláló szerek, hypoxia hatására létrjött egyszálú, illetve kétszálú lánctöréseit érzékeli. Az aktivációt követően a katalitikus domén működésének eredményeként az energia metabolizmusban esszenciális szerepet betöltő NAD + ot (nikotinamid adenindinukleotid) elhasítja nikotinamiddá (NA) és ADP ribózzá. Az utóbbi szolgál építőkőként egy polinukleotid polimerhez, a poli(adp ribóz) hoz (PAR), ami kovelensen képes kötődni az akceptor fehérjékhez. A PARP aktivációja, működése során tehát csökkenti szubsztrátjának, a NAD + nak a szintjét. Később említendő biokémiai lépések eredményeként végső soron a PARP működésének hatására a sejt energiaszintje csökken, ami az enzim túlaktiválódása esetén a sejt nekrózisát okozhatja. Nehezen meghatározható a PARP1 bazális aktivitása normál, élettani körülmények között. A irodalom erre vonatkozó adatai ellentmondóak. A bazális aktivitás megbecslésénél figyelembe kell venni a DNS lánctörések relatív alacsony szintjét, és az oxidatív foszforiláció és egyéb anyagcsereutak melléktermékeként normális, élettani körülmények között is keletkező szabadgyök molekulák szintjét [106] PARP szerepe a DNS károsodások kijavításában A PARP1 elengedhetetlenül fontos a genom integritásának megőrzésében, a DNS károsodások kijavításában. A DNS repair lépéseiben a kromatinállomány dekondenzációjáért, és számos repair enzim serkentéséért felelős. A sejt DNS ének védelmében betöltött szerepét de Murcia és mtsai bizonyították [107]. A DNS sérülés helyén a kromatinállomány fellazul, dekondenzálódik, így a PARP javítja a sérült terület hozzáférhetőségét a repair enzimek számára. A PARP számos repair enzim aktivitását fokozza, többek között a sérült láncdarab kitöltéséért ( gap filling ) felelős DNS polimerázt, és a láncok összekapcsolásáért ( ligáció ) felelős DNS ligáz III t. [106]. A poli(adp ribóz) lánc energiát is szolgáltat a repair enzimek számára. Ennek folytán energiatranszport molekulának is tekinthetjük a PAR t, ami a citoplazma energiaraktárainak felhasználásával (NAD + bontása) energiát szolgáltat a sejtmagban zajló DNS repair számára [108]. Patológiás körülmények között a PARP túlaktiválása a citoszól energiaraktárainak depletálásával okozza többek között a sejt halálát A PARP szerepe a szignáltranszdukcióban, és a génexpresszióban A PARP fiziológiai szerepe ami mind patofiziológiai, mind terápiás szempontból releváns a transzkripció regulálása, befolyásolva ezzel számos fehérje intracelluláris 38. oldal

39 szintjét. A transzkripció szabályozása három szinten valósulhat meg: (1) hisztonfehérjék eltávolítása a DNS láncról; (2) PARP szerepe a DNS metiláció szabályozásában; (3) PARP részvétele enhancer/promoter komplexekben. Ezen utóbbi jelentőségét az adja, hogy a PARP1 szerepet játszik az NF κb mediált transzkripciós folyamatok finomszabályozásában. Annak ellenére, hogy a PARP1 általában serkenti az NF κb dependens transzkripciós folyamatokat [109], leírtak olyan géneket is, amelyek expressziója PARP1 hatására csökken. A PARP1 nek szerepe van számos, gyulladáshoz kapcsolódó transzkripciós faktor aktiválásában, így patológiás körülmények között egy olyan önmagát erősítő folyamat indul be, melynek során a gyulladásos mediátorok túlzottan felszaporodnak, fokozva ezzel a szerv károsodását [110] A PARP szerepe a sejthalálban A PARP nak szerepe van mind az apoptózis, mind a nekrózis folyamatában. A PARP1 az egyike volt azon molekuláknak, melyről bizonyították, hogy az apoptózis 9. ábra: A DNS károsodások folyamatában kulcsfajtái súlyosság szerint Forrás: fontosságú kaszpá Virág L, Szabó C zoknak a szubsztrátja. Pharmacol.Rev Az apoptózisban a PARP nak nincs aktív szerepe, hanem bizonyos kaszpázokhoz kapcsolódik, mely a PARP inaktiválódásával jár. A sejtek ischaemia reperfúziós károsító hatásra apoptózissal vagy nekrózissal válaszolhatnak. Ez nagymértékben függ a DNS károsodás mértékétől [8;106]. Eszerint a modell szerint a károsító hatásnak kitett sejt számára háromféle út lehetséges (9. ábra): 39. oldal

40 1. lehetőség: Ha a DNS károsodás enyhe fokú, akkor a PARP enzim aktiválódik, ennek hatására a kromatin dekondenzálódik, a repair enzimek hozzáférnek a sérült szakaszhoz, ezenfelül aktivitásuk is növekszik PARP jelenlétében, végső soron a károsodott szakasz kijavításra kerül, a sejt túlél. Valójában ez a PARP fiziológiás szerepe (10. ábra). 2. lehetőség: A sejt DNS ének sérülése a p53 fehérje megjelenését váltja ki, ami felfüggeszti a sejtciklust addig, amíg a DNS ki nem javítódik. Ha azonban a DNS károsodás olyan nagy mértékű, hogy a repair rendszer a hibát nem tudja kijavítani, tehát a repair komplexek javítókapacitását a sérülés nagysága meghaladja, akkor a p53 mint transzkripciós faktor, a bcl 2 és bax génekre hatva beindítja az apoptózis programját. Tehát nagyfokú DNS károsodásra a sejt válasza apoptózis, amely endogén szabályozó faktorok (p53, AIF) hatására játszódik le. 11. ábra: PARP túlaktiválódása Forrás: Jagtap P, Szabo C: Nat.Rev.Drug Discov ábra: PARP fiziológiás szerepe Forrás: Jagtap P, Szabo C: Nat.Rev.Drug Discov lehetőség: Igen nagy mértékű, excesszív DNS károsodás esetén a PARP túlaktiválódik. Az oxidatív és nitrózatív stressz hatására ilyen nagy mértékű DNS károsodás jön létre a hepatocytákban (fokozott mértékben a májlebenykék centrolobularis régiójában) ischaemia reperfúziós károsodás során. A PARP túlzott működése során mely a DNS lánc hibáinak kijavítására irányul a szubsztrátként szolgáló NAD + ot fokozottan bontja, a sejt NAD + poolja drámaian lecsökken. Ebből következik, hogy a NAD + dependens energiatermelő celluláris folyamatok, úgymint az anaerob glikolízis, a citrátkör leállnak. A citrátkör 40. oldal

41 működésének felfüggesztésével együtt jár, hogy a citokrómokból álló mitochondriális légzési lánchoz nem érkezik elegendő elektron, ami mitochondriális diszfunkcióhoz, a mitochondriális membrán depolarizációjához vezet. Ennek eredményeképpen az ATPszintáz enzim ATP ázként kezd működni, tovább csökkentve ezzel a sejt energiaraktárait. A sejt a NAD + készleteit is igyekszik regenerálni (nikotinamid nikotinmononukleotid NAD + úton), azonban ez is fokozott ATPfelhasználással jár. ATP hiányában az energiaigényes folyamatok leállnak, mint például a membrán integritásáért felelős Na + /K + pumpa, a membrán szétesik, az intracelluláris enzimek kiömlenek a sejtből. Az ATP hasításából ADP és inorganikus foszfát keletkezik (P i ). Az egyre nagyobb mennyiségben felhalmozódó P i indukálja az MPTP megjelenését a mitochondriális membránban, ennek hatására a mitochondrium membrán depolarizálódik, működése felfüggesztődik [88]. Tehát az excesszív károsodást szenvedett, energetikai krízisbe kerülő sejt nekrózissal pusztul el, elősegítve ezzel a lokális gyulladás kialakulását. A nekrotizált sejtek bekebelezéséért felelős makrofágok további proinflammatorikus és kemotaktikus molekulák termelésével fokozzák a gyulladásos választ. Az enzim gátlásának köszönhetően a sejt energiaraktárai nem fogynak el, elegendő energiát biztosítva ezáltal az apoptózis ATP t igénylő lépéseihez, és a membrán integritásának fenntartásához (Na + /K + pumpa) Glutamin szerepe az I R kár osodásban A szervezetben megtalálható thiolok a reaktív gyökökkel szemben nagyfokú védelmet jelentenek. A glutation (GSH) a legnagyobb mennyiségben jelenlévő alacsony molekulasúlyú intracelluláris thiol, antioxidáns vegyület. Anup [111] kísérleteiben leírta, hogy önmagában a sebészi beavatkozás is fokozza az ODFR képződését. Mérései szerint a májból mobilizált GSH plazmakoncentrációja 30 perccel a laparotomia után emelkedett és csak 24 óra múlva normalizálódott. Az antioxidáns pool ok kialakításában fontos szerepe van az élettani körülmények között nem esszenciális aminosavnak, a glutaminnak. Egyes közlemények szerint a glutamin protektív hatása a csökkent szabadgyök produkción keresztül valósul meg. A májban a glutamin a GSH bioszintézisében esszenciális fontosságú. A máj igen fontos a GSH szintézisben, ahol egy komplex, ciszteint, glutamátot és glicint is, mint köztiterméket magába foglaló bioszintetikus út ér véget. A máj GSH raktárainak depléciója figyelhető meg sepsisben, 41. oldal

42 több szervet érintő traumában, drogok és gyógyszerek indukálta oxidatív stresszállapotokban, illetve hypovolaemias shockban. A máj által szintetizált GSH aktív transzport útján jut el egyéb szervekbe. A GSH szintézisének egyik lehetősége a májban lejátszódó aminosavtranszport folyamatokkal függ össze. A gamma glutamil ciklus 12. ábra: Glutamin szerepe apoptózisban Roth E, Nutrition 2002 alapján során a redukált GSH glutamil gamma karboxil csoportja és egy transzportálandó aminosav aminocsoportja között kötés jön létre a sejtmembránban, és így egy külső aminosav a sejt citoszoljába kerül, ahol aztán felszabadul. A ciklus további része a hidrolizált GSH reszintézisét szolgálja. Egy ciklus végbementéhez 3 ATP szükséges. A folyamat egyrészt aminosav sejtszintű felvételét, másrészt az antioxidáns glutation szintézist szolgálja. A glutamin, a fentiek mellett az apoptózisban is fontos szerepet tölt be (12. ábra). Feltételezések szerint a glutamin az alábbi módon az apoptózist befolyásolja: az extrinsic apoptózist gátolja, míg az intrinsic úton meginduló apoptózist serkenti. Ezen energiaigényes folyamatnak igen fontos szerepe van a posztoperatív időszakban kialakuló gyulladás csökkentésében, hiszen az apoptózis hiányában/helyett a sejtek necrosis felé indulnak. A glutamin adása megnöveli, és megőrzi a szervezet glutation poolját. A glutation fontos antioxidáns anyag, mely kulcsszerepet játszik a redox státus szabályozásában Az I R kár osodás csökkentésének lehetséges módszerei A teljesség igénye nélkül az irodalomban talált lehetséges módszereket foglaltam össze, külön hangsúlyt fektetve a kísérleteimben alkalmazott ischaemiás preconditionálás eljárás, illetve kémiai vegyületek (PARP inhibitorok, glutamin) bemutatására. 42. oldal

43 Ischaemiás preconditionálás (IP) A több ciklusban alkalmazott rövid, ischaemiás reperfúziós periódusokból álló ischaemiás preconditionálás (IP) védő hatását először myocardiumban írták le 1986 ban Murry és munkatársai. Megfigyeléseik szerint állatmodellben, a többszörösen, rövid ideig alkalmazott ischaemiás periódusok megóvták a szívizomzatot egy ezt követő hosszabb ischaemiás periódustól: Thus, we proposed that multiple brief ischemic episodes might actually protect the heart from a subsequent sustained ischemic insult [9]. Miután eme módszer hatásossága kutyaszíven, majd más állatfajokon is igazolódott, így 1993 ban megkezdődtek az első humán alkalmazások [112]. Ezt követően hamarosan az eljárás hatásos voltát, illetve kísérletes alkalmazhatóságát vázizmokban [113], agyban [114], vesében [115], bélben [116] és 1993 ban májban [117] is felismerték. Ugyanakkor, a tapasztalati tényeken kívül, az IP pontos patomechanizmusa nem volt kellően tisztázott. Az IP t úgy jellemezték, mint egy olyan adaptív mechanizmust, mely során a rövid ideig tartó I R periódusok még nem okoznak szervkárosodást, viszont kellő triggerként aktiválják a szövetek endogén védelmi rendszerét [9]. A korai vizsgálatok alapján ígéretes lehetőségnek bizonyult a preconditionálás a máj, illetve egyéb szövetek transzplantációja, illetve hosszan tartó, kirekesztéssel járó beavatkozások klinikai alkalmazása kapcsán. Ugyanakkor a pontos biokémiai, (pato)fizilógiai háttér ismerete elengedhetetlen volt az egyes lépések esetleges farmakológiai befolyásolásához. A legpontosabb és mélyrehatóbb információink a szívizmon végzett, ún. tiszta, klasszikus formájú preconditionálásról vannak, a májban lejátszódó folyamatok szereplőiről, pontos dinamikájáról csupán szórványos irodalmi adatok állnak rendelkezésünkre. További nehézséget okoz az alább felsorolt irodalmi adatok áttekintésekor, hogy a módszerek, illetve a kísérleti állatok nem minden esetben egyformák. Sőt, egyes közlemények az IP hatásosságát megkérdőjelezik, tekintve, hogy vizsgálataik során a hideg ischaemia előtt alkalmazott IP növelte a repefúziós károsodásokat [118]. A teljesség kedvéért a kifejezés magyar vonatkozásában egy az angol fordításból adódó szemantikai megjegyzéssel kell élnem. A preconditioning jelentése: előkészítés (az angol műszaki nyelvben az anyag előkészítését jelenti). Ellenben a preconditionálás szótöve, a conditio a latin nyelvben befőzést, fűszerezést (!) jelent aligha gondolunk erre a kifejezésre használatakor. Viszont a latin szótárban, a 43. oldal

44 szomszédságban található condicio feltétel, helyzet, körülmény, állapot már inkább alkalmas a megfelelő asszociációra. A gyakorta használt magyaros latinos orvosi írásmódunk során későbbiekben célszerűbb lenne inkább így írni: precondicionálás, illetve még helyesebben praecondicionálás IP sal szerzett evidenciák meleg ischaemiában Az első, 1993 ban leírt, máj ischaemiás preconditionálásról szóló közlemény óta (Lloris Carsi és mtsai [117]) közel 250 közlemény található az elektronikus keresőfelületeken, melyek a legszűkebb körben foglalkoznak a máj ischaemiás preconditionalásának patomechanizmusával. A fent említett 1993 as közlemény szerint, a patkánymáj afferens ereinek 5 perces okklúzióját követő 10 perces reperfúzióval az állatok túlélése növelhető volt, illetve a transzamináz szintek csökkentek egy 90 perces ischaemiás modellben. Ezt követően Hardy és munkatársai [119] patkányokon végeztek májresectiót 45 perces ischaemiával, melyet a fenti séma szerint egy 5 perces ischaemia, illetve 10 perces reperfúziós ciklus előzött meg. Az IP eredményeként javuló túlélésről számoltak be. Hasonlóképpen, Yoshizumi kutatócsoportja bebizonyította, hogy IP után végzett májresectiok során a szöveti ATP szint magasabb a kontroll csoporthoz képest [120]. Ezt követően számtalan, az IP feltételezett lépéseinek különbőző aspektusait is figyelembe vevő tanulmány született, melyek végeredményeként elmondható, hogy a meleg ischaemiát megelőzően alkalmazott IP csökkenti a hepatocellularis károsodás fokát [121], növeli a szöveti ATP szintet [120], csökkenti a TNF α [122;123] és IL 6 szintet [122], ezzel párhuzamosan csökkenti a leukocyta/endothelsejt interakciók gyakoriságát [124], növeli a májsejtek intracellularis oxygenizációját [125], javítja a mikrocirkulációt [126;126;127]. Igaz, ezen utóbbi paraméter vizsgálata során számos ellentmondás született a mérési metodika hiányosságaiból. Ugyanakkor nem született tanulmány, amely IP t követő különböző idejű ischaemiás idők hosszát, illetve a mikrocirkulációs változásokat vetné össze. A fentiek szerint elmondható, hogy a vizsgálatok által megalapozott evidenciák szerint az IP csökkenti az I R indukálta májkárosodás mértékét állatkísérletekben. Ezen felbuzdulva született meg az első humán alkalmazás is (Clavien és mtsai; 2000), mely bizonyította, hogy hemihepatectomian átesett betegek sinusiodealis endothel sejt apoptózisa a reperfúzió 30. percében gátolható volt ischaemiás preconditonálással. További kérdésként vetődött fel a zsírmáj előkezelések hatékonysága. Serafin és mtsai bebizonyították [128], hogy 44. oldal

45 rágcsálókban, a stetatosisban végezett IP szintén képes növelni az I R károsodásokkal szembeni ellenállóképességet. Ezen felismeréseknek további hasznos klinikai következményei lehetnek, tekintettel a növekvő traszplantációs igényre. Más, nagyállatokon végzett kísérletek egyértelművé tették, hogy az IP csupán funkcionális védelmet tud nyújtani reverzibilis ischaemiás periódusok ellen, de elveszti protektív hatását elnyújtott ischaemiás periódusok alatt IP sal szerzett evidenciák hideg ischaemiában Az IP protektív hatása nem csupán meleg ischaemiára korlátozódik, hanem ugyanolyan hatékonysággal csökkentette a reperfúzió okozta károsodást a hidegben prezervált szervek ischaemiás reperfúziós károsodása kapcsán. Az endothelsejt károsodás, illetve a Kupffer sejt aktiváció tipikus jellemzője a tárolási és reperfúziós károsodásnak, melyek graft elégtelenséghez vezethetnek. Kísérletek során kis, és nagyállatokban a máj University of Wisconsin (UW) oldatba helyezése előtt IP t alkalmaztak, mely eredményeként a 30. órában mért Kupffer, és sinusiodalis endothelsejt aktiváció szignifikánsan csökkent, illetve egy órával az UW oldat alkalmazását követően csökkent az endothelsejtek apoptózisa, illetve fokozódott a mátrix metalloproteázok aktivitása [129]. További megfigyelés volt, hogy patkányokon végzett májtranszplantációk során az IP növelte a graft életképességét, csökkentette a posztoperatív morbiditást. Egy 2001 ben publikált közlemény szerint [130] a hidegben (UW oldat) prezervált patkánymájban az IP kedvező hatása 30 óra után csökkentette a non parenchymális killing mechanizmusokat. Továbbá, ha a májszövet fele volt csupán IP sal előkezelve, akkor a kedvező hatás nem csupán az ipsilateralis lebenyt érinti, hanem a contralateralis lebenyt is, javítva ezzel a graft túlélést orthotopicus májtranszplantácio során. Észrevételük szerint az így előkezelt máj, átültetés után, a recipiensben csökkentette a TNF α koncentrációt, növelte a túlélést. Tehát az ún. heterológ, különböző eredetű, eltérő affrentációjú IP új jelentéssel ruházza fel az eljárást: Eszerint a májszövet egy jelentős része védhető az I R károsodások ellen anélkül, hogy az ischaemia hatását kifejtené a szöveten [131]. Megállapítható, hogy az IP okozta, sinusiodalis endothelsejteken kifejtett protektív hatás elsősorban a traszplantációs kísérletekben bekövetkező károsodások ellen jelent védelmet, tekintve, hogy a sinusiodalis endothelsejtek sokkal érzékenyebben reagálnak 45. oldal

46 a hideg kiváltotta károsodásokra, szemben a hepatocytákkal, melyek elsősorban a meleg ischaemia reperfúzióval szemben érzékenyek [132] IP sal szerzett evidenciák izolált hepatocyta kultúrán Az ischaemiás preconditionálás hepatoprotektív hatása izolált hepatocyta kultúrákon is kimutatható. Az in vitro vizsgálatok szerint a frissen izolált, preconditionalt májsejtek fokozott ellenállóképeséget mutattak a csökkent oxygénkoncentráción végzett inkubációk során. Továbbá az IP növelte a májsejtek életképességét, optimalizálta az energia felhasználását patkánymájsejtekből kivont kultúrákban normoterm ischaemia alatt [133] IP feltételezett patomechanizmusa Az ischaemiás preconditionálás pontos mechanizmusa nem kellően ismert. A myocardiumon végzett tanulmányok alapján a preconditionálás ligand receptorok Triggerek G proteinekhez kapcsolt receptorok aktívációja A 1/A 3 M 2 AT 1 B 2 δ α 1 (adenozin) (acetilkolin) (angiotensin) (bradykinin) (opioidok) (katekolaminok) Mediátorok PKC Tirozin kináz MAP kináz Végső effektor Foszforiláció / aktiváció Szénhidrát K + ATP/más mf 0F 1 ATP áz ecto5 nucleotidáz anyagcsere ioncsatornák Védelem 13. ábra: Az IP feltételezett inciális trigger szignáltranszdukció effektor mechanizmus láncolat elemei mechanizmusa széles körben elfogadott. Az ischaemia alatt felszabadult molekulák receptorokhoz kötődnek, melyek jelpályák útján létrehozzák a preconditionálást, mint válaszjelenséget. A gyakran vizsgált molekulák: az adenozin, a protein kináz C (PKC), nitrogén monoxid (NO), hőshock fehérjék (HSPs), tirozin kinázok, mitogén aktivált 46. oldal

47 protein kinázok (MAPK), oxidatív stressz elemei, nukleáris faktor κb (NF κb), illetve az apoptózis kaszkád elemei. A májban a legnagyobb figyelmet az adenozin, a NO, PKC, HSPs kapták. E vegyületek bonyolult, nem kellően tisztázott kapcsolatrendszerén keresztül épül fel egy iniciális trigger mediátor, szignáltranszdukció effektor mechanizmus láncolat. A triggerek a folyamat beindításában, a mediátorok a jelátviteli folyamatokban, a végső effektorok pedig a sejtek különböző adaptációs, transzkripciós, stb. mechanizmusainak beindításában játszanak szerepet (13. ábra). Alább csupán a májszöveti preconditionalásban szerepet játszó legfontosabb vegyületeket részletezem, úm.: (A) adenozin, (B) PKC, (C) HSPs, (D) NO. Mivel evidencia szintű megállapítások jelenleg nem állnak rendelkezésünkre, így a kísérletes adatokból levonható következtetésekből alkothatunk egységes képet. (A) Az adenozin: Az adenozin, mint extracelluláris molekula, mind triggerként, mind mediátorként szerepel az IP mechanizmusában. Az ischaemia alatt az ATP bomlásból jelentős mennyiségű adenozin képződik, mely az ischaemiás reperfúziós károsodásban megjelenő leukocyta adhéziót, adhéziós molekula expressziót, illetve a neutrophil és thrombocyta aktivációt gátolja, és ezen lépéseken keresztül csökkenti az ODFR termelődését [134]. Az adenozin, mint vazodilatátor, szintén fontos szerepet játszik a korai I R károsodások kivédésében, de hatása összességében multifaktoriális. Az adenozin különböző receptorokon keresztül eltérő hatásokat vált ki. Az A1 receptor stimulálásával megnöveli a toleranciát az ischaemiás periódusban. A1 és A3 receptorok blokkolásával preconditionáló hatása majdnem teljesen felfüggeszthető. Szívnél az A1 és A3 receptorok, máj esetében az A2 receptor játszik fontos szerepet [135]. Megfigyelések szerint, adenozin uptake inhibitorral (dipyridamol) kezelt állatokban, az így megnövelt endogén adenozin koncentráció azonos hatású az IP sal: csökkenti a reperfúzió során észlelt szöveti, mikrocirkulációs károsodásokat [136]. (B) Protein kináz C (PKC) Az adenozin, és más triggerek receptorukhoz kapcsolódva foszfolipáz C hez (PLC) kapcsolt G proteinek aktivációját idézik elő [137]. A PLC aktiváció hatására membránlipidekből IP3 és DAG szabadul fel. IP3 hatására nő az IC Ca 2+ szint. Ez utóbbi jelenlétében a DAG hozzákötődik a PKC regulációs alegységéhez, a molekula 47. oldal

48 aktiválódik A protein kináz C (PKC) bizonyítottan fontos szerepet játszik a preconditonálásban: blokkolása csökkenti, aktivációja növeli [138] az IP protektív hatását. PKC aktiváció csökkenése patkányszíven, 20 perc globális ischaemiát követően teljesen felfüggeszti a szív funkcionális felépülését IP után. PKC inhibitor (chelerythrine) [139] alkalmazásával bebizonyított a PKC fent leírt szerepe máj IP során. Adenozin, Bradykinin, Opioidok, stb. Preconditionáló stimulus PIP 2 Extracell. tér R G PLC Cytosol IP 2 DAG AMP Adenozin Ca 2+ PKC Ecto 5 nucleotidáz I. p38 MAPK MAPKAPK 2 HSP27 PTK II. P46/54 JNK III. ERK Cytoskeleton stabilitás nő szerepe kétséges K ATP csatorna? MAPK Mitochondrium ROS VÉDELEM 14. ábra: Az IP celluláris mechanizmusa, effektorai. Rajz: Stang Rita & Szentiványi Zoltán A PKC aktiváció eredményeként a foszforilált K ATP csatornák megnyílnak. A K ATP csatornák nyitásával nő a K + kiáramlás, így az akciós potenciál ideje lecsökken [140], ennek következtében csökken a feszültség függő Ca 2+ csatornákon beáramló Ca 2+ mennyisége (14. ábra). Az alacsonyabb intracelluláris Ca 2+ szint csökkentheti az ischaemiás károsodást [141]. A mitochondriális csatornák szerepére két hipotézis is 48. oldal

49 létezik: (1) A nyílásával csökken a mitochondriális Ca 2+ többlet, ami a mitochondriumok integritását őrzi meg. (2) A másik elmélet a mitochondriumok alakjával magyarázza a jótékony hatást [142]. Az alakjuk megváltozásával javul az energiaáramlás, és az elektron transzport. A fentiek alapján a szívizomhoz hasonlóan, a májban lévő mitochondriális K ATP csatornák kulcs, effektor szerepe kézenfekvő, érthető. (C) Hőshockfehérjék (HSPs) A hőshock fehérjék a frissen szintetizálódott polipeptidláncok harmadlagos térszerkezetének kialakítását segítik a sejtekben. Aktiválódásukra extrém hőhatással kapcsolatos válaszreakciókban figyeltek fel, de szerepük van más sejtkárosodások kivédésében is. A sérült fehérjék térszerkezetének helyreállításán kívül transzkripciós faktorokat aktiválnak, melyek hőshock szekvenciát tartalmazó promoterekhez kötődve fejtik ki hatásukat a génátírásra. A HSP szintén korai emelkedést mutat I R alatt. Az ischaemia alatt a sejt homeosztázisának felborulása után direkt és indirekt módon aktiválódhat, mely utóbbiban hibás térszerkezetű fehérjék szerepét feltételezik. A reperfúzió alatt is megjelenik HSP aktiváció, mivel az oxidatív stressz okozta fehérjekárosodás HSP aktiváló. Az általuk aktivált gének között antioxidánsok, cytokinek, adhéziós molekulák és növekedési faktorok szerepelnek. Kimutatták, hogy a HSPs elsősorban a mitochondrium membránjának integritásának fenntartásáért felelősek [143]. In vitro kísérletben bebizonyították, hogy HSP72 "overexpressziója" kapcsán csökkenthető volt az I R károsodás, csakúgy, mint IP sal [144]. Ezen HSP expozíciója a preconditionálást követően 6 72 óra múlva is kimutatható, így feltételezhetően a késői IP patomechanizmusában is fontos szerepet játszik. (D) Nitrogén monoxid (NO) A NO val kapcsolatos általános tudnivalókat ld.: fejezetben. Ismertes, hogy az enos által állandóan termelődő, illetve hepatocyták és más sejtek által transzkripciós módosulásokkal regulált inos által termelt NO kulcsszerepet játszik az IP iniciálásában, illetve mint mediátor szerepel a folyamatban. A NO, mint potens vazodilatátor, hatását mind sinusiodalis, mind presinusoidalis szinten kifejti. A NO mediálta IP jelpályán cgmp változáson át, a végső effektorok a már korábban említett K ATP csatornák, melyek a mitochondrium, és így az energiatermelés integritásáért 49. oldal

50 felelősek. Egyértelmű, hogy az NO asszociált IP mind hideg, mind meleg ischaemiában működik, jelen van. A pontos mechanizmus nem ismert. Peralta szerint a NO nak az endothelinen történő gátlása okozna preconditionáló hatást [145]. Más vizsgálatok szerint az adenozin uptake gátlása és a NO donor egyidejű adagolása IP hoz hasonló állapotot eredményez, mely arra enged következtetni, hogy az A2 receptorok aktivációja és a következményes NO szintézis vezet a májban lejátszódó IP hoz [146]. Kimutatható, hogy az IP hatására megnövekedett mikrocirkuláció és intracelluláris oxigénhasznosítás hátterében a megnövekedett NO szint áll [125]. A NO ugyanakkor képes csökkenteni az apoptózist az endothelsejtekben IP dinamikája Nem minden időkombinációban végzett preconditionálás hatásos. Körülbelül 3 5 perces ischaemiát követően minimum 5 perc reperfúzióra van szükség a kiváltásához [9]. Kimutatták továbbá mind szíven mind májban hogy már egy epizód ischaemia is elég a protektív hatás eléréséhez, illetve, hogy a klasszikus, vagy korai preconditionálás gyors adaptációs mechanizmus révén hat. Patkánymáj esetén bizonyított, hogy a preconditionálás kritériumát teljesíti az afferes ereinek 5 perces okklúzióját követő 10 perces reperfúzió [117]. A rövid ischaemia időtartamán és az alkalmazott ciklusok számán kívül az elhúzódó ischaemia előtt megengedett reperfúzió ideje is meghatározó jelentőségű. Amennyiben a tipikusan 5 perces ischaemiát legfeljebb 60 perc reperfúzió követi, a jótékony hatás még tapasztalható. Ha a köztes időintervallum meghaladja az 1 4 órát, a protektív hatás már nem alakul ki [147]. Ha az IP és az azt követő ischaemia közötti időt órára növeljük, azt tapasztaljuk, hogy az ischaemiás károsodás ismét csökken [147]. Ez az ún. késői preconditionálás, vagy second window of protection. Ekkorra az adaptáció már a génátírás modulálásán keresztül alakul ki. A korai preconditionálással szemben a preconditionálásnak ez a formája alacsonyabb szintű védelmet nyújt, de hatása elhúzódó. A késői preconditionálás elemeit is 3 részre lehet osztani. Triggerei az első ischaemia hatására aktiválódnak. Mediátorai az újonnan expresszálódó fehérjék, melyek az elkövetkező órában nyújtanak védelmet [148]. Az IP késői hatásai eredményeként javul a postischaemiás sinusoidális perfúzió, az epeelválasztás, valamint csökken a leukocyta infiltráció, illetve az aminotranszferáz felszabadulás. A késői preconditionálás szorosan összefügg a hőshockfehérjékkel [149]. A HSP27 és HSP oldal

51 fontosak, mert kötődnek citokróm c hez, APAF 1 hez, valamint AIF hez és ezáltal megelőzik a kaszpáz aktivációt [121]. Az egyik HSP, a hem oxigenáz (HSP32) upregulációja csökkenti az NF κb aktivációját, így anti inflammatoricus és antiapoptotikus hatású. Gátlásával teljesen felfüggeszthető, serkentésével pedig előidézhető az IP hatás [150] IP szerepe a klinikai gyakorlatban Ahogy az a bevezetőben tárgyalásra került, a májresectiók kapcsán alkalmazott kirekesztések permanens, vagy intermittáló volta sok esetben haemodinamikailag nehezen tolerálható, növelve ezzel a posztoperatív szövődmények számát, a halálozást, illetve a kórházban töltött napok számát. A fentebb említett állatkísérletes tanulmányok alapján az IP, azáltal, hogy a hosszabb idejű ischaemiás periódust az elviselhető, biztonságos időintervallum közé képes szorítani, lehetővé teszi a szövődmények, illetve a mortalitás csökkentését. Az első humán májműtét során alkalmazott IP t Clavien és mtsai [151] alkalmazták hemihepatectomiak során. Ezen vizsgálatban a 30 perces kirekesztést megelőzően 5 perces ischaemiát követő 10 perces reperfúzióval hoztak létre IP t, mely szignifikánsan csökkentette a szérum transzamináz szinteket. Ugyanakkor ezen vizsgálat kapcsán a nem előkezelt, kontroll csoporttal történt összehasonlítás során nem volt különbség a műtéti idő, a posztoperatív intenzív osztályos ápolási napok, illetve a mortalitás között. Májtranszplantációk során fennálló prolongált meleg vagy hideg ischaemia a graft károsodását okozza, melynek eredményeként létrejött korai és késői szövődmények retranszplantációt igényelhetnek. Ezért az IP nak a májsebészet ezen területén is létjogosultsága van. Az IP humán májtranszplantáció kapcsán észlelt kedvező hatásairól először 2006 ban jelentek meg közlemények: Wayel Jassem és mtsai [152]. Vizsgálataik eredményeként [153] a preconditionált donor allograft beültetését követően szignifikáns módon csökkent a posztoperatív hepatocyta károsodás, illetve a szérum AST, ALT, LDH szintek 24 órával a transzplantációt követően. Szignifikáns módon csökkenthető volt az intenzív terápiás osztályon eltöltött idő, illetve az akut rejekciók száma is jelentősen (28 % vs. 50%) csökkent az előkezelt csoportban. Tekintve a növekvő igényt az orthotopikus májtraszplantációkra, illetve a potenciálisan alkalmas donorok számának hiányát, a transzplantációs programoknak célcsoportként kellett választaniuk a határeseti májszövettel bíró donorokat is. Ebbe a 51. oldal

52 csoportba tartoznak a zsírmájjal rendelkező donorok, amely esetekben a kivételkor alkalmazott IP kedvező hatással bírt a posztoperatív szövődmények csökkentésére [154;155] PARP inhibitorok A PARP fiziológiás és patológiás szerepe kapcsán (1.6. PARP fiziológiás és patológiás szerepe az IR károsodásban) már említésre került, hogy a PARP inhbitorok alkalmazása képes csökkenteni az I R károsodásokból eredő oxidatív és nitrózatív stresszt, illetve a DNS károsodás mértékétől függően a sejteket apoptózis irányba tereli necrosis helyett. A kifejlesztett PARP inhibitorok száma jelentős, vélhetően a jövőben szervspecifikus inhibitorok állnak rendelkezésre Glutamin A korábbi fejezetekben (1.7. fejezet) leírtak alapján összefoglalva elmondható, hogy a glutamin adagolása megőrzi, illetve megnöveli a szervezet glutation poolját. A glutation fontos antioxidáns anyag, mely kulcsszerepet játszik a szervezet redoxstátuszának szabályozásában, így csökkenteni képes az I R károsodásokat. Kísérletek igazolják, hogy a glutaminban gazdag enterális táplálás eredményeként a NO szintézis csökkent, ezáltal csökkent a nitrózatív stressz. A glutamin önmaga nem gátolja a NOS t, de a glutamin metabolizmus még nem pontosan ismert, dózisdependens módon befolyásolja az endothelialis NO produkciót [64;106;156;157] Kémiai és fizikai módszerek Évtizedekre visszamenőleg ismeretes, hogy pl. a glukagon, az aszparaginsav vagy az ATP MgCl 2 kísérletes alkalmazása növeli a máj ischaemia toleranciáját [2;3]. Abból a tényből kiindulva, hogy a reperfúzió során a mikrocirkuláció zavara áll fent, ésszerűnek tűnik vasodilatátorok és vazokonstriktor inhibitorok adása a károsodás csökkentésére. Emellett számos lehetőség kínálkozik az I R patofiziológiai lépéseinek terápiás célzatú befolyásolására. Alább néhány lehetőség, a teljesség igénye nélkül: endothelin 1 inhibitor, PAF antagonista, Ca 2+ antagonista, N acetylcystein, TXA 2 szintáz inhibitor, NO donorok, inos gátlás, SOD, scavangerek, vas kelátorok, UW oldat, hűtés. 52. oldal

53 1.9. Szöveti áramlásmérés és a mikr ocir kuláció jellemzése Ebben a fejezetrészben rövid összefoglalásként felsorolásra kerülnek a legfontosabb áramlásmérési technikák, melyek közül tekintve kísérleteim metodikai szempontjait a flowmeterek bővebben kerülnek ismertetésre [ ] Szöveti áramlásmérés alapjai Egy adott szerv véráramlásának méréséhez alapvető az adott szövet fiziológiájának, illetve biokémiájának ismerete. Bár a végtagok, vese, szív, agy és tüdő véráramlását pontosan le lehet mérni, a máj véráramlásának mérését számos technikai és anatómiai ok komplikálja. A máj kettős vérellátása miatt két áramlásmérés szükséges a teljes májáramlás megméréséhez. Bár a vena hepaticán átfolyó véráramlás egyenlő a két beáramlás összegével, a máj véráramlásának mérése mégis bonyolult ezen keresztül, mert a vena hepatica igen rövid, ennek is jelentős része intraparenchymás elhelyezkedésű és igen közel van a rekeszhez. További probléma lehet, hogy a portális rendszer nehezebb elérhetősége miatt a legtöbb humán méréskor a splanchnikus véráramlást mérik, a máj valódi véráramlása helyett. A májáramlás mérésére használt eljárásokat direkt és indirekt csoportokba soroljuk Direkt áramlásmérési technikák A direkt technikák invazívak, magukba foglalják a máj és annak ereinek feltárását, manipulációját. Ezen eljárások kísérleti állatokon vagy humán intraoperatív körülmények közt alkalmazhatók Direkt katéteres áramlásmérések (A) Intraluminalis eljárások: A máj véráramlás mérésének eredeti módszere szerint az arteria hepatica t vagy a vena portae t kanülálni kell. Markeranyagot vagy levegőt injektálnak az ér proximális szakaszába, melynek továbbszállítódási aránya összefüggésben áll a véráramlással. Rotaméter segítségével lehet mérni az áramlást. Az eljárásnak ma már csak történeti jelentősége van. (B) A máj vénás kiáramlásának időzített gyűjtése: Ezen eljárást kizárólag állatkísérleteknél használják, a vena hepaticából kifolyó vér összegyűjtésével és a vérvolumen meghatározásával az idő függvényében. Az eljáráshoz szükség van a suprahepaticus vénás rendszer kanülálására, az infrahepaticus vénás rendszer lekötése 53. oldal

54 mellett. Az innen elfolyó vért egy kanül segítségével a v. jugularisba vezetik. A vena portae áramlása a vena lienalis splenectomiát követő kanülálása és a vena portae májkapunál történő leklippelése után mérhető. Ezek a vérgyűjtő technikák pontosak, de használatuk korlátozott, viszont referenciát szolgáltatnak az indirekt technikák kalibrációjához Plethysmographia Ezen technikához vénás okklúziót kell alkalmazni, ez a szerv duzzadását eredményezi, mely akut volumenváltozásként jelenik meg. A korai volumenváltozás direkt arányos az artériás beáramlás arányával. Ezen eljárás invazív plethysmographot ill. laparotómiát igényel Transzlumineszcenciás vizsgálatok A transzlumineszcenciás technikát a hepaticus vasculáris egységek véráramlásának relatív változásainak kimutatására a mikrocirkuláció képi és számszerű jellemzésére dolgozták ki. Altatott kísérleti állatok májszéle alatt kvarcfényt átvezetve, a lumineszkáló részek mikroszkóppal vizsgálhatók, fényképezhetők. A sinusoidok méretét a nagyított fényképen lehet lemérni. Az intrasinusoidalis áramlás fotometriás számlálóval határozható meg, s így az áramlási volumen kiszámítható (mm 3 /sec). Ezen mérés igen demonstratív, de bonyolult és hátránya, hogy csak a sinusoidalis áramlásról szolgáltat információt Flowmeterek Ezen műszerek egyrészt állatkísérletekben, mint krónikusan beültetett intraluminalis mérőeszközök alkalmazhatóak, másrészt egyszeri mérésekre ( akutan ) állatkísérletek és humán vizsgálatokban használhatóak. A tartósan beültetett mérőfejekkel pontos és folyamatos mérés végezhető Elektromágneses flowmeter A mérőfej Faraday elektromágneses indukciós törvénye alapján mér, miszerint a mágneses mezőn áthaladó vér feszültséget indukál, amely két elektróda közt mérhető. A keletkezett feszültség egyenesen arányos a véráramlással. A méréshez a két elektródának az érhez történő rögzítésére van szükség. Ezen elektródákat merőlegesen 54. oldal

55 kell az erekre felhelyezni, mivel a merőlegeshez képest akár 10 fokos eltérés már csak 98,5 % os jelet eredményez. Ezért fontos, hogy ezen elektródák a vizsgálat alatt lehetőleg ne mozduljanak el, aminek tartós biztosítása jelentős nehézséget okoz a beültetés során. A technika hátránya, hogy a nem megfelelően elhelyezett vagy túl szorosan illeszkedő mérőfej, érösszehúzódást és/vagy turbulenciát okoz, ezáltal meghamisítja az eredményeket. Az erek külső és belső átmérőjének aránya szintén befolyásolja az áramlásmérést, mivel az érfal vezetőképessége különbözik az áramló vérétől. Az olyan kis átmérőjű erek, mint az arteria hepatica esetén, a véráramlást alábecsülhetjük ezen eljárással. A falvastagságot figyelembe véve a perivascularis elektromágneses mérőfejek ± 5% pontossággal mérnek. Az elektromágneses áramlásmérők gyakori és nagyon alapos kalibrációt igényelnek Ultrahangon alapuló áramlásmérés A Doppler elven alapuló mérőfej a jel leadáson és felvételen kívül az ér átmérőjét is meg tudja határozni. Az áramlás mértéket és a volumenét az áramlás sebességének és az ér átmérőjének szorzata alapján számolhatjuk. Ezzel az eljárással a vena portae áramlása pontosan mérhető, de az arteria hepatica és a vena portae együttes áramlása a jelek interferenciája miatt nem mérhető meg. Ezt a problémát a két ér külön külön végzett áramlásmérésével kerülhetjük ki Laser Doppler flowmérés A laser Doppler technika a Doppler elven alapuló, az alacsony áramlású, microvasculatura áramlás vizsgálatára alkalmas non invazív készülék. A vizsgálat előnye, hogy: (1) könnyen kezelhető, (2) folyamatoan látható jelet produkál, (3) a vizsgálat maga nem zavarja a mikrocirkulációt, tekintve, hogy a mérés nem jár együtt a szöveti integritás megbontásával. A vizsgált régióban a szövetvastagság típusosan 1mm, ahol a kapillárisok átmérője átlagosan 7 10 μm, illetve az áramlási sebesség 0,01 10 mm/s közt mozog. A készülék folyamatos Doppler pulzációs lézer jelet állít elő. Ez 2 nw energiájú hélium/neon monokromatikus lézer fény 632,8 nm hullámhosszon. A folyamatos pulzációs szignált két száloptikai érzékelő viszi a mérőegységben elhelyezett fotodetektorokhoz. A visszavert fény részben a szövetek statikus reflexiójából adódik (ez nem hoz létre a Doppler szignálban eltolódást), részben a 55. oldal

56 mozgó vörösvértestek által okozott reflexióból. A két reflexió eredőjeként elektromos jeleltolódás észlelhető. A 20 Hz 12 khz közötti tartományban a frekvencia eltolódás lineáris feszültségváltozást eredményez, amely arányos az áramló vörösvértestek sebességével, illetve a vér szöveti koncentrációjával. Amennyiben a vörösvértest koncentrációt konstansnak tekintjük, a lézer szignál az időegység alatti véráramlással arányos, amit térfogatfluxusnak vagy vérátáramlásnak nevezünk. Nagyon magas áramlásértékek esetén megnövekszik a lézer fotonreflexió és a szöveti hatások közötti interakciók valószínűsége, ezért a lézer flowmérés alulértékelheti a valós áramlást. Az elektronikus korrekció és a mért adatok komputerizált interpretációja ezeket a hibákat kiküszöböli. A laser Doppler flowmérés in vitro modellekben történt ellenőrzése bebizonyította, hogy vörösvértestek időegység alatti térfogatfrakciója a különböző túlnyomásos, ellenőrzött áramlási rendszerekben is a igen tág határok között lineárisan arányos a lézer szignál eltolódásával, azaz a lézer Doppler flowmetria igen jól használható a vörösvértest áramlás vizsgálatára. Az eredeti kísérleti modellekre illesztett lineáris korreláció hibaértéke 0,2 % alatti. A módszer kimeríti a szöveti áramlásméréssel szemben állított kritériumokat és korábban számos tanulámány jelent meg használhatóségéról egyéb gastrointestinalis szervek, bőr, vázizmok vese szöveti perfúziójának méréséről. Ugyanakkor kevés tanulmány foglakozik a LDF májszöveten való alkalmazásával. Számos kritika érte a vizsgálati metodikát, mivel a vizsgálat nagyon érzékeny és in vivo történő mérések során a légzőmozgások okozta szervfelszíni elmozdulások nem engedik a stabil áramlási jelek rögzítését. További kifogás érte a módszert azért is, hogy a máj egy erősen perfundált szerv, mely így magas vörösvértest koncentrációval rendelkezik és így nagyobb az esélye a lézerfény többszörös szóródási valószínűségének, mely ezáltal a valódi áramlást, mérést alábecsüli. Megjegyzésként szerepel az irodalomban, hogy a LDF mérőfeje alatti terület csupán egy kis része a csak a vizsgált szövetnek, így nem használahtó egy olyan kalibrációs faktor, mely segítségéval a perfúzió abszolút értéke meghatározható lenne. Többlépcsős, bonyolult, hím Wistar patkányokon végzett, in vivo tanulmány [164] eredményeként megállapíthatjuk, hogy: 1. A patkánymáj vérellátása homogén, mely jól követhető laser Doppler flowmetriával. Ezt bizonyítja a LDF rel egyidőben végzett, azonos eredményt adó indocianin zöld clearence és 51 Cr mikroelem technika. 56. oldal

57 2. A többcsatornás (több mérőfejjel egyidőben, különböző helyeken végzett), vizsgáltok megerőstik, hogy a LDF rel regisztrált áramlási értékek adott körülmények között a máj egészére extrapolálhatók. 3. A máj felszínén mért LDF jel a konvencionális elméleteknek megfelelelően viselkedik a máj haemodinamikai változásai során. Az arteria hepatica, illetve a vena portae szelektív okklúziója során kapott áramláscsökkenés értekei százalékos arányban megfelelnek az artéria vena megoszlási aránynak (16% vs. 74%), melyet a kísérletben radioaktív mikoszférák megoszlásával mértek. 4. A LDF segítségével a májperfúzió relatív változásait lehet követni, regisztrálni. Ezt bizonyítja a hemihepatectomiák vagy a haemorrhagiás shock áramláskövetése kapcsán jelentkező, más ármalásvizsgálatokkal korreláló eredmények. Ugyanakkor a nulla áramláskor mért jellel és az áramlás abszolút értékének megítélésével még problémák vannak Hőmérsékletváltozáson alapuló technikák Ezen eljárások alapjául az a teória szolgál, miszerint egy forró test hőmérsékletváltozása arányos az őt körülvevő folyadék áramlásával. A mérőfejek a májba vagy a vena hepatica ba implantalhatóak percutan technikával vagy intraoperatívan. Ezen eljárás csak a májáramlás relatív változásait detektálja, az alapáramlás a műszer májbeli helyzetétől függ. A máj metabolikus állapota is jelentősen befolyásolja a hőmérsékletet, mindezek miatt a módszer csak szemi kvantitatív áramlásmérésre alkalmas Indirekt technikák Az indirekt eljárások lehetnek invazívak, szemi, vagy non invazívak, mely utóbbiak klinikailag szélesebb körben használhatók. Ezen eljárások közé a különböző festékek, radioaktívan jelzett anyagok vagy markerek clearencé nek vizsgálata tartozik. Ilyen vizsgáló módszerek a: Festék dilúciós technika Clearence eljárások Inert gáz wash out Microsphera frakcionált megoszlási módszere Radiographiás eljárások 57. oldal

58 2. CÉLKITŰZÉS 2.1. Célkitűzés A máj véráramlásának mérése különböző problémákat vet fel: a módszer kiválasztásán túl, nagy körültekintéssel kell megszabni a mérések körülményeit. Az irodalomban számos módszer és eredmény található a máj mikrocirkulációjának vizsgálatáról, amelyek megfelelő nemzetközi konszenzus hiányában nehezen összehasonlíthatók. Ezért célul tűzetem ki irodalmi adatok közt jelenleg nem jól definiált fogalmak tisztázását, a szükséges jelenségek számára fogalomrendszer bevezetését, mindezt úgy, hogy magyar kutatók (Kupcsulik P., Kokas P., Faller J., Jakab F. [19;20; ]) korábbi eredményeit mintegy értékeléseként veszem alapul, és fejlesztem tovább. Továbbiakban ezért célom volt: (a) a szöveti perfúzió, mikrocirkuláció vizsgálatára alkalmas, non invazív laser Doppler flowmeter (LDF) máj mikrocirkulációs vizsgálatokban való bevezetése, (b) a mérési standardok, (c) hibák kiküszöbölésének, (d) matematikai transzformációkkal végzett és ezáltal statisztikai analízisre alkalmas individuális áramlási görbék kidolgozása, illetve ezek bemutatása. Ezen objektív paraméterek segítségével kívánom bemutatni: (e) állatkísérletes modell kapcsán a máj ischaemiás toleranciájának spektrumát, illetve (f) a különböző idejű ischaemiák előtt alkalmazott IP protektív hatását (I. kísérlet). A fentiekből kapott eredményekből, (g) egy második kísérleti sor (II. kísérlet) kapcsán vizsgálom, a máj számára vulnerábilis ischaemiás periódus előtt alkalmazott IP, PARP inhibitor, illetve a glutamin protektív hatását. Az ischaemias preconditionalás és a kémiai előkezelések (I II. kísérlet) által felépített védőhatást a mikrocirkuláció változásának objektív jellemzése mellett a szöveti, illetve immunhisztokémiai reakciók, a szérum és a májszöveti antioxidáns paraméterek, rutin laborparaméterek, citokinszintek (TNF α) változásával mérem; értékelem az apoptózis necrosis kapcsolatát a fenti rendszerben. Összegezve tehát, állatkísérleteim alapján, dolgozatomban célul tűztem ki az alábbi problémák megválaszolását: 58. oldal

59 I. Kísérlet: 1. Milyen standardizálási paraméter és matematikai transzformációk szükségesek a lézer Doppler flowmeter alkalmazása kapcsán, különös tekintettel a máj mikrocikulációjára? 2. Különböző idejű ischaemiás periódusok, illetve ezt kiegészítve, megelőző preconditionálás után milyen elváltozások észlelhetőek: a) LDF regisztrált áramlásgörbéken; b) szövettani vizsgálatok során; c) TNF α szintekben; d) rutin laborparaméter változások kapcsán, illetve e) hogyan alakul az állatok túlélése? 3. A mikrocirkulációs adatok és az állatok túlélése alapján mely ischaemiás időtartamok előtt alkalmazott IP képes protektív hatást kifejteni, illetve van e hatáskülönbség az ischaemiával összefüggésben? II. Kísérlet Az I. kísérlet alapján, a kritikusnak vélt 60 perces ischaemiás időszak előtt alkalmazott előkezelések, úm. (A) Ischaemiás preconditionálás; (B) PJ 34 PARP inhibitor; (C) Glutamin alkalmazása kapcsán, az alábbi kérdésekre keresem a választ: 1. Az előkezelések hogyan befolyásolják a máj mikrocirkulációjának jellemzésére alkalmas laser Doppler áramlás értékeket? 2. Milyen szövettani változások észlehetők: necrosis/apoptózis? 3. Előzőek milyen immunhisztokémiai vizsgálatokkal bizonyíthatóak (TUNEL reakció, caspase 3 aktiváció)? 4. Milyen TNF α szint; 5. Milyen rutin laborparaméter; illetve 6. Milyen szérum és májszöveti antioxidáns változások jönnek létre? 59. oldal

60 2.2. A témaválasztás indoklása Jelen tanulmány első része elsősorban az I R károsodás kialakulásának mechanizmusát, valamint a preconditionálás patofizilogiáját, a mikrocirkuláció jellemzésére használt metodikákat kívánta bemutatni, összegezve az elmúlt 20 év irodalmi adatait. Az irodalmi adatok áttekintéseiből, illetve a fenti vizsgálatok eredményeinek összegzéséből alább kitűnik, hogy az IP, illetve a kémiai előkezelés klinikai alkalmazási lehetőségei során számos tisztázatlan kérdés van, melyek megválaszolása minden bizonnyal további távlatokat nyit. Ugyanígy nincs konszenzus a máj áramlásának, mikrocirkulációjának megítélésére laser Doppler flowmeter alkalmazása kapcsán. A dolgozat második felében, többlépcsős állatkísérletes modellen keresztül az ischaemia tolerancia növelésében alkalmazható eljárás: (1) az ischaemiás preconditionálás, illetve két, potenciálisan hasonló tulajdonságokkal bíró vegyület: úm. (2) egy, a máj mikrocirkulációra kifejtett hatásai szempontjából még, nem vizsgált a poly(adp)ribóz polymeráz inhibitor és (3) egy reményeink szerint protektív hatással bíró aminosav, a glutamin alkalmazásával nyert eredmények kerülnek bemutatásra. A értekezés témaválasztását attól érzem megalapozottnak, hogy az irodalmi ismeretek és közlemények a máj tekintetében a fenti eljárásokkal kapcsolatban korlátozottabbak, mint pl. a szív esetében. Különös figyelmet érdemel, hogy nincs korábbi tanulmány az ischaemiás prekondícionálást követő, különböző idejű ischaemiás idők hosszának, ill. a mikrocirkulációs változásoknak az összehasonlításáról. A legfontosabb és legmélyrehatóbb információink a szívizmon végzett, ún. tiszta, klasszikus formájú preconditionálásról vannak, a májban lejátszódó folyamatok szereplőiről, pontos dinamikájáról csupán szórványos irodalmi adatok állnak rendelkezésre. A fentiek mellett a témaválasztást továbbiakban indokolja, hogy az egyes szervekben lejátszódó I R károsodásra adott szöveti szintű válaszreakciók, illetve ezek kivédésére használható szerek spektruma igen eltérő. A szívvel kapcsolatban a preconditionálásról szóló ismereteink a legrégebbiek. Ebben az esetben érvényesül a preconditionálás tiszta formája, mivel a myocardiumban speciális szöveti sejtek nincsenek az izomsejteken kívül. A máj esetében sokkal több az ellentmondásos eredmény, bár a preconditionálás jótékony hatása ma már széles körben elfogadottá válik. Ugyanígy az irodalomban csupán szórványos, néhol ellentmondásos 60. oldal

61 közlemények jelentek meg a fenti vegyületekkel végzett kémiai előkezeléskről máj ischaemiás reperfúzió mikrocirkulációs változások összefüggésben. A hatásmechanizmusok tekintetében azonban még különösen sok a tisztázatlan kérdés, mivel májszövet esetén a szervspecifikus sejtek jelenléte (Kupffer, Ito) tovább színezi a képet. 3. MÓDSZEREK A módszerek leírása kapcsán egyes paraméterek meghatározása az I. és II. kísérletben eltérő lehet (ld. pl. TNF α szintek). Itt kerülnek részletezésre a LDF alkalmazása kapcsán bevezetett standardizálási körülmények és matematikai transzformációk, habár újszerűségüket tekintve ezek a dolgozatban didaktikai szempontból inkább az eredmények részbe tartoznának A máj mikr ocir kulációjának mérése laser Doppler flowmeterrel A máj mikrocirkulációját laser Doppler flowmeterrel (LDF) követtem (MOOR Instruments Ltd. DRT4; kétcsatornás eszköz; λ = 632,8 nm; monokromatikus; 2 mw Helium Neon Laser). A eszközhöz tartozó 0,5 cm átmérőjű felszíni mérőfejet a máj felett mindig azonos lokalizációba helyeztük: a patkánymáj V. lebenyén, a májszélhez képest 1 cm re, ahol az átlagos szövetvastagság 1 cm. Az eszköz on line adatrögzítéssel és számítógépes feldolgozással rögzíti a mérőfej alatti áramlást, a vörösvértest koncentrációt és a hőmérsékletet. A mérések reprodukálhatóságát néhány standardizáló tényezővel biztosítottuk, melyek a befolyásoló tényezők szerepének minimalizálására irányultak: Hőmérséklet: Az állatok hőmérsékletét folyamatosan követtük (felszíni mérőfej méri a májfelszín hőmérsékletét, párhuzamosan rectalis hőmérsékletmérés történt), illetve fűthető műtőasztallal az állatok hőmérsékletét 37,5 38,5 C között tartottuk. Légzőmozgás: Az állatok megfelelő mély anaesthesiája biztosítja a légzési mozgás ritmusosságát. A görbéken látható áramlási ingadozások a nagyobb erekben meglévő pulzushullámból adódó 1 2 % os fluxingadozások, artefactumként kezelendők. 61. oldal

62 Nyomóerő: A máj felszínére kutatócsoportunk által készített rugós rögzítőkar segítségével, állandó nyomóerő mellett, a mérőfejet lazán helyezettük el a kiválasztott májlebenyre. A mérőfej követi a máj légzőmozgás okozta elmozdulásait, így azonos nyomás mellett ugyanazon területen marad. Mérési hely: A mérések során olyan állandó vastagságú szövetet kerestünk a mérőfej felhelyezéséhez, ahol LDF által azonos vörösvértest koncentrációt mértünk. Így megvalósítható volt, hogy a mérőfej alatt mindig közel azonos Doppler jelet adó szöveti struktúrák helyezkedjenek el. Külső fényerő: Az áramlási értékeket befolyásolja a külső fényerősség. Ennek elkerülésére a mérőfejet leárnyékoltuk. Az így standardizált mérések eredményeként hőmérsékletre, vörösvértest koncentrációra és szövetvastagságra korrigált fluxot kaptunk, mely a máj mikrocirkuláció változásait az adott terület felett pontosan jelezte. Visszatérő kérdésként szerepel, mind a nemzetközi irodalomban, mind a tudományos fórumokon, hogy a mérőfej által mért szövetterület áramlása hogyan extrapolálható az egész májra. Válaszként el kell fogadnunk, hogy a máj globális áramalásváltozásait leíró módszer nem létezik. A microcrikuláció jellemzésére szolgáló eljárások a májszövet szerkezeti egységének (májacinus) keringésváltozásait veszik alapul, azaz portalis triad vena centralis közötti áramlásváltozási fenoménekre próbálnak következtetni. A pontos, állandó területen történő, korábbi kísérleteinkben két vagy több mérőfejjel végzett kísérletek, mérési sorozatok, illetve az ebből származó több száz áramlási görbe elemezése, azt igazolja, hogy (1) a lejátszodó mikrocirkulációs változások bizonyos törvényszerűséget követnek, illetve (2) a máj több pontján hasonló dinamikával játszódnak le. Az előbbi megállapítás részben matematikailag jellemezhető (ld. alább), részben megfigyelésen alapul, tapasztalati tény. Természetesen ismeretes a no reflow jelenség a máj tekintetében is, mely ugyanakkor az előbbi állítást abban a tekintetben módosítja, hogy a kapott eredményeket minden esetben fenntartással kell kezelnünk, illetve, hogy a máj mikrocirkulációjának vizsgálatakor kapott, mérési 62. oldal

63 hibának tartott gyenge ármalási jelek megfelehetnek ezen jelenség klinikai manifesztációjának. Éppen ezért a máj mikrocirkulációjának globális jellemzésére alkalmas eszköz kifejlesztésére nagy az igény. A laser Doppler flowmeter folymatos méréseiből, a vizsgált területről, egy perc alatt 15 ször, azaz 4 másodpercenként rögzítettünk adatot. A LDF által szolgáltatott áramlási adatok arbitrális skálán szerepelnek. Mivel az egyedek alap májszöveti áramlásértékei eltérőek, ezért a görbék nehezen összehasonlíthatóak. Az áramlási adatok, görbék összehasonlíthatóságára ezért munkacsoportunk által a görbék matematikai korrekciója történt [168]. Az áramlási görbe regisztrálása a beavatkozás előtt kezdődött (baseline), majd az ischaemia, illetve a reperfúzió alatt folyamatos volt. A reperfúzió előtti beavatkozás kb. 5 7 mp es zavaró jeleket idézett elő, amelyek a máj mozgásából adódtak. E periódus jeleit nem értékeltük. Az ischaemia alatti áramlást zajnak vettük (biological zero), és egy új, relatív skála nulla értékeként szerepelt. A máj felszínére, nyugalmi állapotban, az ischaemia előtt elhelyezett mérőfej által regisztrált áramlási alapértéket (baseline) vettük a relatív skála 100 as értékének: T flux flux bz = 100 baseline bz T flux : korrigált áramlási érték; flux: mért áramlási érték; bz: biological zero, az ischaemia alatt mérhető áramlás; baseline: normál, alapáramlás az ischaemia előtt. Fenti matematikai korrekciónak köszönhetően a különböző egyedeknél mért áramlási görbék összehasonlíthatók lesznek, és a jel/zaj aránya maximális lesz (15. ábra). A kapott % os skálába illesztett görbéken látható egy kiindulási (baseline) 100% os kezdeti, alapáramlás, majd nulla százalék körüli, kb. + 5% os ingadozást mutató ischaemiás periódus. Az ezt követő reperfúzió leírására újabb fogalmakat vezettünk be [168]: 63. oldal

64 Plató maximum (PM): A reperfúziós áramlási görbe karakterét vizsgálva látható, hogy egy meredek emelkedést követően az áramlás normalizálódik, csak lassan emelkedik. A vizsgált áramlási görbe lefutásából maximálisnak vált értékkel, értékekkel lehet jellemezni az áramlási maximumot. Ugyanakkor egy több száz (60 perc reperfúzió esetén: 60 x 15 = 900) mérési pontból származó görbe esetén ezen egyetlen szám kiválasztása nem helyes, túlzottan önkényes. Éppen ezért a görbéhez úgy rendelhetünk egy áramlási maximumot leíró számot, hogy a reperfúziós szakasz laposodó, stabil áramlást mutató szakaszán tetszőlegesen kiválasztott időintevallumhoz (utolsó mért 5 perc = 75 mérési pont) tartozó szakasz értékeit átlagoltuk. Ezt önkényesen Plató Maximumnak neveztük. Jogosan merül fel a kérdés, hogy hogyan lehet valami, ami átlag, egyben maximum? Az átlag általában valamely sorozat maximális és nem maximális értékeinek bizonyos középértéke szokott lenni. Ezen esetben viszont Plató Maximumnak önkényes módon a kísérletben egy egy reperfúziós görbe utolsó 5 percében látható stabil áramlási értékek számtani közepét jelenti. Mértékegysége: % baseline bz A B 15. ábra: LDF rel regisztrált áramlási görbék. (A) A különbőző kiindulási fluxok után (baseline) létrehozott ischaemia (bz) majd ezt követő reperfúzió kapcsán egymással nehezen összevethető görbéket kapunk. A fenti képlet használata után látható, hogy az eltérő kiindulású, más bz értékű görbék ugyanazt az áramlási fenomént írják le (B). Ezen utóbbi, azonos lefutású görbék a % y tengelyben ábrázolva összehasonlíthatóak, ezen esetben identifikusak. Reperfúziós terület (RT): A PM önmagában nem írja le a vizsgált reperfúziós idő alatti áramlási változások dinamikáját, az adott területen átáramló vér mennyiségét. 64. oldal

65 A reperfúziós terület, azaz a reperfúzióhoz tartozó görbe alatti terület jól jellemzi az átáramlott volument. A görbe alatti terület kiszámításánát integrálással végezhetjük el. Ennek eredményeként a 4 másodpercenként felvett áramlási értékekhez tartozó területek összegét kapjuk meg. Így Repefúziós Területnek neveztük az áramlási görbe reperfúziós szakasza alatti területet. Reperfúziós Maximális Idő (RMI): A reperfúziós görbe karakterének jellemzésére, a mikrocirkuláció ischaemia utáni helyreállásának leírására szolgál a görbe meredeksége. A görbe felszálló szárára fektetett regressziós egyenes és az önkényesen stabil áramlásúnak leírt (áramlási ingadozás kisebb mind 5%) plató szakasz melynek hossza nem feltétlenül egyezik a PM számításához használt hosszúsággal metszéspontjából kapjuk meg a Reperfúzióhoz használt Maximális Időt (RMI). A metszéspont a görbe karakterétől függően a görbe alatt vagy felett helyezkedik el (16. ábra). A no reflow jelenség, illetve a makroszkóposan látható foltos reperfúzió miatt (ld. később!) az RMI értelmezése bonyolultabb, mint az előbbi két paraméteré (PM, RT). 16. ábra: A reperfúziók jellemzése: a reperfúziós görbe leírására PM, RT, RMI használható. A különbőző reperfúziós görbék összehasonlítása egy ideális reperfúziót alapul véve a területarányokkal végezhető el. K RT : A fenti paraméterek (PM, RT) csupán egy egy görbét jellemeznek. Ezen adatok egy része (PM) már alkalmas két különböző állatból nyert mikrocirkulációs változások jellemzésére. Ugyanakkor a területintegrálból nyert RT önmagában nem informatív. Két görbe összehasonlításakor a RT ek abszolút értékük összevetése csupán a kisebb nagyobb relációra enged következetni, a gyakorlatban nehezen kezelhetőek az intgerál ereményeként megjelent, több ezres nagyságrendű számok. Éppen ezért egy újabb, könnyen számolható és használható arányszámot vezettünk be, amit K RT val 65. oldal

66 jelöltünk. Ehhez egy hipotetkus modellt, áramlási helyzetet kell felállítanunk. Az ideális egy olyan helyzet lenne, ahol az ischaemiát követő reperfúzió 0. pillanatában már a kezdeti áramlási értékekkel azonos, 100% os áramlási értéket regisztrálnánk. (16. ábra piros áramlási görbe). Ezen görbe reperfúziós területe (RT 0 ) maximális. K RT értknek az aktuális áramlási görbe reperfúziós területének (RT x ) és egy hipotetikus, ideális áramlási görbe reperfúziós területének (RT 0 ) arányát értjük: K RT RT x = 100 RT 0 Ezzel az arányszám bevezetése gyakorlati haszonnal jár: két görbe reperfúziós területének összehasonlításakor nem ezres nagyságrendű számokkal kell dolgoznunk, hanem egy könyebben áttekinthető as skálarendszerben kapunk számokat, százalékban. A kutatócsoportunk által létrehozott, a LDF szoftveréhez illeszkedő, a regisztrált mérési pontokkal dolgozó Excell program segítségével ezen számolás automatikus. Összefoglalva, továbbiakban az ischaemia reperfúzió laser Doppler flowmeterrel rögzített adatait a következő értékekkel jellemezzük: PM: Plató Maximum RT: Reperfúziós Terület RMI: Reperfúziós Maximális Idő K RT arányszám: A minta RT ének ideálishoz való viszonya. Gyakorlati szempontok: Méréseink feldolgozása során további szempontokat kellett még figyelemb vennünk: (1) Minden áramlási görbét egyedileg (is) értékeltünk, úm: grafikus megjelenítés, lefutás, karakter jellemzése, PM, RT, RMI. (2) A kísérleti elrendezés szempontjából egy csoportban tartozó egyedek, 4 másodpercenkét rögzí tett áramlási értékeit átlagoltuk (17. ábra). Így egy átlag áramlási görbét kaptunk. Tekintve a kísérletek menetét (ld. később) ez db állat vizsgálatát, 66. oldal

67 azaz db egyéni áramlásgörbe átlagolását jelentette. Ezt követően jelenítettük meg a görbét garfikus formában, majd elvégeztük a fent leírt matematikai transzformációkat (PM, RT, RMI). (3) Megállapítható volt, hogy az átlaggörbéhez tartozó szórás kellően alacsony volt, az elfogadható hibahatáron belül mozogott. Mint ahogy az a görbék egyesével való elemzésekor is általános jelenség volt, hogy a reperfúziós periódus kb. utolsó harmadában az áramlás stabilizálódott. Így a 10 görbe átlagának szórása is egyre csökkent. Mint később látható, hosszabb ischaemiás (90 min) periódusok után ezen stabilizáció a szöveti architektúra nagyfokú dezorganizációja miatt nem mindig jött létre. 0 % // (4) A kapott átlag áramlási görbét összvetettük az átlagot adó, 10 db kiindulási görbével. Azon esetekben, ahol az állatból nyert egy egy áramlási görbe nagymértékben (karakter, PM, RT) eltért a kapott átlag áramlási görbétől azokat a mintákat és állatokat a vizsgálatból kizártuk, a kísérletet megismételtük. Ilyen esetekben, nagy százalékban technikai hibát vettünk észre (nem kellő kirekesztés, az állat oxigenizációjának zavara, teljes testet érintő hypoxia stb.) (5) A dolgozat további részében: a görbék jellemzésekor a számított paraméterek (PM, RT, RMI) kapcsán csupán az adott kísérleti csoportban kapott átlagot (n=10) tüntetem fel. Nem kerülnek részletezésre az állatok egyedi áramlásgörbéi. (Célszerű lett volna ennek megfelelően minden PM; RT és RMI érték megjelenítésekor, a 10 görbe átlagát jelző átlag alsó indexszel is ellátni (pl: PM átlag ) de ettől eltekintettünk kerülve a már így is zsúfolt jelölésrendszer tovább bonyolítását). á tlag á t la g + s zó r ás 17. ábra: Áramlási görbe szórásokkal. 10 db áramlási görbéből számított átlag szórásokkal sec 67. oldal

68 az ischaemiás időtartam feltüntetésekor a lépték nem folytonos, az x tengelyen lévő törés (//) a kirekesztés idejét jelenti; csupán az ischaemiás periódus első és utolsó 5 perce van ábrázolva Szövettan Minden állatból, műtéttípustól függetlenül, azonos anatómiai helyről, 3 db mintát vettünk. A májszeleteket 10 % os formalinban fixáltuk 24 órán át, majd paraffinba ágyaztuk. A szövettani vizsgálatokat konvencionális fénymikroszkópos elemzéssel végeztünk 3 5 µm vastag metszeteken, hematoxilyn eosin (HE) festést követően. A kiértékelés szemikvantitatív módon, táblázatos regisztráció alapján történt, 5, egymást át nem fedő látótérben. Az alábbi eltéréseket vettük figyelembe: (1) sejtduzzadás, (2) sinusoidális pangás, (3) vénatágulat, (4) szöveti bevérzés, (5) gyulladásos sejtek 18. ábra: Apoptózis szöveti jelei: (1) sejtzsugorodás; (2) kromatin marginalizáció; (3) kondenzáció és fragmentáció (4) apoptotic body k megjelenése. Forrás: Jaeschke H, Gastroenetrology, 2003 jelenléte, (6) necrosis jelei: vacuolizáció, karyolysis, karyorrhexis, eosinophilia, (7) apoptózis jelei: sejtzsugorodás, a kromatin marginizációja, kondenzációja, fragmentációja, apoptotic body megjelenése (18. ábra). A vizsgáló patológus a minták jelzését nem ismerte, a csoportbeosztás, illetve a beavatkozás módja és ideje tekintetében nem volt tájékozott. A fenti elváltozások az alábbiak szerint kerültek pontozásra: 0: nincs változás, +: a látótér vagy szöveti struktúra (pl. portális triad, epeút) sejtjeinek kevesebb mint 10% a érintett, ++: %, +++: több mint 50% érintett. A maximálisan adható pontok összege a fenti szempontok (1 7) alapján 7 x 3 (azaz: +++ ) = 21 volt. 7 pont alatt a károsodás mértékét enyhének, 7 14 között középsúlyosnak, 14 pont felett súlyosnak véleményeztük. 68. oldal

69 3.3. Immunhisztokémia TUNEL Az apoptózist jellemző DNS fragmentáció vizsgálatához TUNEL (terminal deoxyribonucleotidyl transferase mediated dutp digoxigenin nick end labeling) assayt végeztünk. A módszer lényege, hogy a DNS lánc törések miatt kialakuló szabad 3 hidroxil végeket deoxynucleotidil transzferáz enzim segítségével és jelölt dutp val detektáljuk. A TUNEL assay hez kereskedelmi forgalomban levő kitet használtunk (ApopTag in situ apoptózis detection kit, Chemicon), és a gyártó által javasolt protokollt követtük. Röviden, a szöveteket neutrál pufferolt formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk és 4 μm vastag metszeteket készítettünk. A deparaffinálást követően 20 μg/ml DNase mentes Proteináz K s (Sigma) emésztéssel végeztünk antigénfeltárást. Az endogén peroxidáz aktivitást 3% H 2 O 2 dal blokkoltuk. A DNS szabad 3` OH végeinek jelölésére a metszeteket 1 órán át inkubáltuk terminális deoxynucleotidyl transferáz (TdT) enzimmel és digoxigenin dutp t tartalmazó nukleotid keverékkel. A digoxigeninnel konjugált nukleotidok detektálásához tormaperoxidázzal konjugált anti digoxigenin antitestet és a reakció láthatóvá tételéhez, 3` diaminobenzidin t (DAB) alkalmaztunk. A metszeteken metilzölddel (Vector) végeztünk háttérfestést. A TUNEL reakció értékelését fénymikroszkóp (200x nagyításon, Olympus BX mikroszkóp) segítségével végeztük. Tíz egymást nem átfedő területen 1000 sejtet számoltunk meg és a TUNEL pozitív sejtek számát az összes sejt ezrelékében fejeztük ki Aktív kaszpáz 3 immunhisztokémia A májszövetet neutrál pufferolt formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk és 4 μm vastag metszetet készítettünk. A deparaffinált szövetet rehidráltuk, az endogén peroxidáz aktivitást 0,6% os hidrogén peroxidban blokkoltuk, majd 10 mm os citrát pufferben (ph 6,0) végeztünk antigén feltárást mikrohullámú sütővel (20 perc). Mosást követően az aspecifikus kötődés megakadályozására a szövetet 1,5% os kecske szérummal blokkoltuk (1 óra, szobahőmérsékleten). Az aktív kaszpáz 3 detekciójára a szöveteket poliklonális antitestettel (1:100, Chemicon) egy éjszakán át inkubáltuk 4 o C on. A detekcióhoz biotinált szekunder antitestet, és az ABC módszert használtuk. Kromogénként diaminobenzidint (DAB) alkalmaztunk, majd háttérfestést Gill féle 69. oldal

70 hematoxylinnal végeztünk. A reakció értékelését fénymikroszkóp (200x nagyításon, Olympus BX mikroszkóp) segítségével végeztük. Tíz egymást nem átfedő területen 1000 sejtet számoltuk meg és a pozitív sejtek számát az összes sejt ezrelékében fejeztük ki Poli (ADP ribóz) immunhisztokémia Anti PAR vizsgálatokat csupán az áloperált, I R és PJ 34 előkezelt csoportokon végeztünk, igazolandó a PARP inhibitor működésének hatásosságát. A formalinban fixált szöveteket paraffinba ágyaztuk és 4 μm vastag metszeteket készítettünk. A deparaffinált metszeteket 0,6% hidrogén peroxiddal kezeltük, hogy az endogén peroxidáz aktivitást gátoljuk, majd 0,2 M citrát pufferben (ph 3,0) végeztünk antigén feltárást mikrohullámú sütővel. A metszeteket 2% normál kecske szérummal szobahőn blokkoltuk 1 órán keresztül, majd 4 o C on inkubáltuk egy éjszakán át 1:2000 titerben poliklonális nyúl PAR ellenes antitesttel (Calbiochem). Ezt követően biotinilált szekunder antitesttel (1:200), és ABC reagenssel (Vector) inkubáltuk a metszeteket. A peroxidáz aktivitást DAB kromogénnel detektáltuk, majd hematoxylinnal végeztünk háttérfestést. Tíz egymást át nem fedő területen 1000 sejtet számoltunk meg és a pozitív sejtek számát az összes sejt ezrelékében fejeztük ki TNF α szint TNF α szint vitalitás próbával A TNF α szintet életképesség teszt szerint határozzuk meg az I. kísérletben a reperfúzió 30. percében. Sejttenyészet: A biológiailag aktív TNF α tartalmat WEHI 163 TNF szenzitív sejtvonal segítségével határoztuk meg. A sejttenyészetet 10% FCS tartalmú DMEM (Dulbecco által módosított MEM,Sigma) tápfolyadékban tartottuk fenn. 24 órás inkubálás után határoztuk meg MTT redukciós teszt segítségével. Redukciós kapacitás mérése: Mossman Hansen szerint [169;170]: a MTT ( 3 (4,5 dimetiltiazolil) 2,5, difeniltetrazolium) kék színű formazanná redukálódik a sejtek NADH, NADPH tartalmával arányos mennyiségben. A redukált koenzim tartalom jó közelítéssel vethető össze bioszintetikus aktivitásuk mértékével, ezért a módszer alkalmas életképességük mérésére. Optikai denzitás mérése: A sejteket 96 lyukú növesztő tálcán a sejtfolyadékban oldott 0,25 mg/ml MTT vel inkubáltuk 3 órán át 70. oldal

71 37 o C os CO 2 termosztátban. A sejtanyagot háromszoros térfogatú savas (0,08M HCl) izopropil alkohollal oldottuk, majd a formazantartalmat 630 nm referencia és 570 nm mérési hullámhosszokon fotometriás úton mértük. Az egyes adatpontokat 8 párhuzamos mérés átlagaként adtuk meg. A kapott optikai denzitás értékekből az aktív TNF α tartalmat ismert koncentrációjú TNF α val készített kalibrációs sor alapján határoztuk meg, pg/ml ben adtuk meg TNF α ELISA A szérum TNF α szintet szendvics ELISA módszerrel mértük a II. kísérletben, a reperfúzió 6. órájában, a kereskedelmi forgalomban elérhető kit segítségével (TNF α immunoassay kit, R&D Systems, Minneapolis, USA). A mérésnél a gyártó által javasolt eljárást alkalmaztuk, kalibrálási görbét rekombináns egér TNF α hígítási sorával készítettünk. Minden mérést duplikátumban végeztünk. A TNF α ellenes antitesttel bevont ELISA plate et 100 μl szérum mintával szobahőmérsékleten 2 órát inkubáltuk. Ismételt mosást követően a plate et polyclonalis anti TNF α tormaperoxidáz konjugátummal 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mosási lépés után hydrogen peroxid és tetrametil benzidin segítségével színreakciót idéztünk elő. A színváltozást 20 perc múlva leállítottuk kénsav hozzáadásával. Az abszorbanciát 450 nm en mértünk. Az abszorbancia értékekből a rekombináns TNF α standard segítségével készített kalibrációs görbe alapján számítottuk ki a szérum TNF α koncentrációkat, pg/ml ben adtuk meg Laboratóriumi paraméterek Az állatokból vett vérminták alvadásgátlását EDTA val hoztuk létre, 10 percig, szobahőmérsékleten centrifugáltuk (3000 r.p.m.), majd a hemolízismentes, sejtmentes felülúszót, szérumot elválasztottuk a sejtes elemektől. Kémiai analízisek elvégzéséig a mintákat 80 o C on folyékony nitrogénben tároltuk. 24 órán belül, 2,5 szeresre történt hígitás után spektrofotometrián alapuló, laboratóriumi automatán (Hitachi 747) rutin tesztek felhasználásával elvégeztük a méréseket. A kapott értékeket a hígítási arányból visszaszámoltuk. Szérum alanin aminotranszferázt (ALT), aszpartát aminotranszferázt (AST), laktát dehidrogenáz (LDH), szérum bilirubin (sebi) szintet mértünk. 71. oldal

72 3.6. Oxidatív stressz vizsgálata Az antioxidáns státusz vizsgálatát csak a II. kísérletben végeztük májhomogenizátumból és szérumból. Májhomogenizátum: A rezekált májszeletek egy részét apró darabokra vágtuk, majd 10% os KCl oldatban többszöri mosással annak vértartalmát csökkentettük. Ezután a májszövet homogenizálását Potter Elvehjem készülékkel jeges hűtés mellett (0 4 o C) végeztük. A májhomogenizátumok fehérjetartalmát 10 mg/ml re állítottuk be, 0,15 M KCl oldattal, Lowry szerint. Szérum vizsgálatok: Az állatokból vett artériás vérminták alvadásgátlását EDTAval hoztuk létre, 10 percig, szobahőmérsékleten centrifugáltuk (3000 r.p.m.) majd a hemolízismentes szérumot elválasztottuk a sejtes elemektől. Kémiai analízisek elvégzéséig a mintákat 80 o C on folyékony nitrogénben tároltuk Luminometriás össz scavanger kapacitás mérés Heide Bögl módszere Blázovics féle módosítással [171]. Az össz scavangerkapacitás mérése a májhomogenizátum mintákból történt. A reakcióelegy hidrogénperoxidot, luminolt és mikroperoxidázt (SIGMA, St. Louis) tartalmazott. A mérés elve: a luminol szabadgyökök hatására gerjesztett állapotba kerül, és fényt bocsát ki, amelyet luminométerrel (Lumat LB9051; Lumat Bertold, Windbad, Germany) detektálni lehet. A fényintenzitást a gyökfogó vegyületek csökkentik. Az eredményeket Relative Light Unit (RLU) egységben adtuk meg. A fényintenzitás (RLU) arányos a mintában található szabadgyökök koncentrációjával. Az alkalmazott eljárások közül ez a legérzékenyebb a redox státusz meghatározásában, az antioxidánsok kimutatása nmol nagyságrendben történik Redukálóképesség meghatározása Oyaizu [172] módszere szerint a redukálóképesség a szérum és a szövet teljes antioxidáns képességéről informál (antioxidánsok+fehérjék). Korábbi felfogás szerint az oxidáció az oxigénnel való egyesülés vagy a hidrogénelvonás (dehidrogénezés), a redukció az oxigén elvonás, illetve a hidrogénnel való egyesülés volt. Mai felfogásunk szerint az oxidáció elektron leadást, a redukció elektron felvételt jelent. 72. oldal

73 A vizsgálati minták (májhomogenizátum, szérum) redukálóképességének meghatározása a Fe 3+ Fe 2+ redukciós átalakulás alapján történt. A mért színintenzitás egyenesen arányos a vizsgált minta redukálóképességével. Referencia vegyületként aszkorbinsavat használtunk. A minta redukálóképessége aszkorbinsav ekvivalensben (ASE) szerepel. A vizsgálati minta redukálóképessége akkor 1 ASE, ha hatása 1 μmol aszkorbinsav redukálóképességével egyenértékű. A kapott érték fordítottan arányos a minta antioxidáns tulajdonságával Hidrogén donor aktivitás meghatározása A mintákban (májhomogenizátum, szérum) található fehérjéket metanol (MERCK, Darmstadt) hozzáadásával kicsaptuk, így antioxidáns tulajdonságukat megszüntettük. Éppen ezért ez a módszer a fehérjéhez nem kötött antioxidáns kapacitás mértékéről informál. Blois és Hatano [173] módszere szerint 1,1 difenil 2 pikrilhidrazil stabil gyök jelenlétében mértük 517 nm en spektrofotométerrel. Az aktivitás mérésének alapját az 1,1 difenil 2 pikrilhidrazil (DPPH) gyök 517 nm en történő detektálása képezi. A DPPH viszonylagos stabilitása révén megbízhatóan fotometrálható molekulagyök, melynek abszorbancia maximuma 517 nm nél mérhető. Az analitikai reakcióban a molekula H atomok jelenlétében (melyet a vizsgálandó H donor aktivitással rendelkező vegyületek szolgáltatnak) könnyen regenerálódik, mely folyamat eredményeként az abszorbancia csökken. Az eredményt gátlás % ban adtuk meg Szabad szulfhidril (SH) csoportok meghatározása A szabad szulfhidril (SH) csoporttal rendelkező anyagok kifejezett antioxidáns tulajdonsággal bírnak. Példaként említhető a fehérje láncok SH csoport tartalma (cisztein aminosav) és a glutation (GSH) antioxidáns hatása. A szabad SH csoportok mennyiségének meghatározása Sedlak [174] módszere alapján történt, a fehérjékhez kötött antioxidáns paraméterekről informál. Méréseinket spektrofotométerrel végeztük májhomogenizátumból és szérumból, Ellman reagenssel (5,5 ditiobisz nitrobenzoesav, SERVA) ph 7,4 Na foszfát pufferben 512 nm en. 73. oldal

74 Biológiai minták fehérjetartalmának meghatározása Lowry [175] szerint a fehérjetartalmat fotometriásan 650 nm en standardként tiszta kristályos bovin szérumalbumint alkalmazva határoztuk meg. A kapott értékek mmol/g protein mértékegységgel szerepelnek. A külön meg nem jelölt felhasznált vegyszerek, oldószerek analitikai tisztaságú Reanal készítmények voltak. Az oldatok készítéséhez minden esetben bidesztillált vizet használtunk. A pufferek ph ját Reanal gyártmányú standard ph oldatok segítségével, Radelkis OP 264/1 laboratóriumi ph mérővel állítottuk be Kísérleti elrendezés, műtéttechnika Törvényi háttér Kísérleteink során szigorúan betartottuk az évi XXVIII. sz. állatvédelmi törvényt, valamint a 243/1998 (XII. 31) Kormányrendelet szerint elvárt követelményeket. Kísérleteimet a 1858/000/2004 számú engedély alapján, a Semmelweis Egyetem EÁB által kiállított, állatkísérletek végzésre feljogosító 27/2000 sz. bizonyítvány megszerzése után végeztem el. A Semmelweis Egyetem I. sz. Sebészeti Klinikáján 1997 szeptemberétől a T/ sz. OTKA kutatási program keretében folynak a máj mikrocirkulációs vizsgálatok. Az I. kísérletet felölelő anyagot az OTKA bírálóbizottsága kiváló nak minősítette. A II. kísérlet a Magyar Mesterséges Táplálásért Alapítvány és az Inotek Pharmaceuticals Corporation (Massachusetts, Beverly, USA) segítségével jött létre Csoportbeosztás I. Kísérlet: Ischaemiás preconditionálás ischaemia reperfúzió Ebben a kísérletben a 30, 45, 60 és 90 percig tartó ischaemiás periódusokat követő 30 perces reperfúzió utáni mikrocirkulációs, szövettani, rutin labor és TNF α szint (korai oxidatív stressz) változásokat vizsgáltuk, 1 hetes túlélést követve, csoportonként állaton. 74. oldal

75 30 perc ischaemia 45 perc ischaemia 60 perc ischaemia 90 perc ischaemia I R IP + IR táblázat: Az I. kísérlet elrendezése a kísérletbe bevont állatok számával II. Kísérlet: Kémiai előkezelések ischaemia reperfúzió Az első kísérletből levont következtetések alapján (ld. Eredmények), a kritikusnak tartott 60 perces ischaemiát követő 60 perces reperfúziót vettük alapmodellnek. A kísérletet kiegészítettük ischaemiás preconditionálással, PJ 34 PARP inhibitor, illetve glutamin előkezeléssel. A posztoperatív 6. órában, az állatok leölése után, vizsgáltuk a késői oxidatív stressz jellemzőit, a necrosis, apoptózis jelenlétét. Csoportonként állatot használtunk fel, túlélő állat nem volt. Ischaemiás PJ 34 Glutamin Ischaemia Áloperált preconditionalás előkezelés előkezelés reperfúzió + I R + I R + I R Állatok táblázat: A II. kísérlet elrendezése a kísérletbe bevont állatok számával Az operáció Az I és II. kísérlet operáció közös részei Tekintettel az I. és a II. kísérlet különbségeire (nem túlélő/túlélő állatok, ischaemia, reperfúzió ideje stb.), itt csupán a közös jellemzők kerülnek feltüntetésre. Állatok: Kísérleteinkhez (I II) gramm súlyú, spf, hím Wistar patkányokat használtunk /Charles River Magyarország Kft/. Preoperatív időszak: Az állatok száraz tápot és vizet kaptak ad libitum, a műtét előtti 12 órában csak vizet biztosítottunk számukra. Tartásuk a napszaki változásokat követő mesterséges világítás mellett, C os hőmérsékleten történt. 75. oldal

76 Műtét ideje: A műtéteket mindig azonos időben végeztük, hogy elkerüljük a cirkadián ritmus zavaró hatásait. Anaesthesia: Az állatokat intraperitonealisan adott 90mg/ttkg ketaminnal (Calypsol ) + 10 mg xylasinnal (Xylasin ) altattuk el, majd az altatás fenntartására 50 mg/ttkg/h ketamint adtunk infúziós pumpa segítségével a jobb oldali vena jugularis internán keresztül. Testhőmérséklet: Az állatok hőmérsékletét rectalisan és a májfelszíni mérőfejen át folyamatosan regisztráltuk. Fűthető műtőasztal segítségével az állatok hőmérséklete a kísérletek alatt mindvégig 37,5 38,5 C között volt tartható. Kirekesztések anatómiai alapja: A máj ischaemiás károsodásának vizsgálatára számos módszert dolgoztak ki, melyek közül az alapvető céloknak megfelelő patkány modellt a Semmelweis Egyetem I. sz. Sebészeti Klinikáján 1974 és 1979 között végzett kísérletek során fejlesztették ki (Kupcsulik és mtsai, 1977) [2;3;27 29;41;176]. nemzetközi A irodalomban ismert további modellek lényegében ezen alaptípus változatai (Clemens 1985, Sepherd 1987, Wheatley 1993, stb.). A modellek 19. ábra: A patkánymáj szerkezete. III IV V lebeny: jobb és bal lebeny ; I II: lobus quadratus ; VI VII: lobus caudatus Rajz: Mihály Zoltán lényege az, hogy a patkánymáj lebenyezett szerkezete révén (19. ábra) a kiválasztott lebenyek keringése megszüntethető, a máj és splanchnicus keringés a reziduális lebenyeken át zavartalan. Így nem alakul ki splanchnicus pangás, illetve nincs anhepaticus fázis. Ezzel elkerülhetőek az előbbiek multiviscerális károsító hatásai. Az ischaemia és reperfúzió alatt mindvégig az explorált hasüreget nedves lappal fedtük le. 76. oldal

77 I. kísérlet részletes leírása LDF X Kontroll szövettan Ischaemia IP + I R : min VAGY: I R: min Reperfúzió X Ischaemiás szövettan X Reperfúziós szövettan 1. posztoperatív nap 7. posztoperatív nap 7. posztop. X I R szövettan 20. ábra: Az első kísérlet vázlatos menete. Rajz: Mihály Zoltán & Szijártó Attila 12 órával a beavatkozás előtt 0,5 ml vérmintát vettünk farokvénából (kontroll minta: sebi, ALT, LDH, bazális TNF α szint meghatározás), melyet fiziológiás sóoldattal pótoltunk. A műtét napján az anaesthaesia bevezetését, majd median laparotomiat 77. oldal

78 követően a májat rögzítő peritoneális szalagokat átvágtuk, az I. és II. lebenyeket a retroperitoneumból felszabadítottuk. A VI. lebenyt kontroll hisztológiai mintavétel céljából eltávolítottuk. Az I, II, V. lebeny ischaemiáját az odavezető pediculumra szegmentális bilio vascularis nyélre helyezett atraumatikus mikroklippel hoztuk létre. Az ischaemia ideje csoportonként 30, 45, 60, 90 perc volt. A leszorítás alatt a splanchnicus keringés zavartalan volt, minthogy a portális áramlás a máj ép lebenyein (III., IV. és VII. lebenyen, összvolumen mintegy 40% án [177]) át megtartott maradt. Az áramlást LDF rel vizsgáltuk folyamatosan az V. lebenyen. Az ischaemiás preconditionálást minden csoportban, 1 ciklusban [5 perc ischaemia 10 perc reperfúzió] hoztuk létre a tervezett ischaemiát megelőzően. A prolongált ischaemiát követően a I. lebenyt hisztológiai vizsgálat céljából rezekáltuk. A csoportonként eltérő ischaemiás idők letelte után a microklippeket eltávolítottuk. A reperfúzió 30. percében a II. lebenyt rezekáltuk szövettani feldolgozásra. A 30 perces vizsgált reperfúzió végén vénás vérmintát vettünk TNF α szint meghatározásra. Az állatok így az ép III IV VII., valamint az I R károsított V. lebennyel éltek tovább (jelen maradék májlebenysúlyarányok alapján /ld.: fejezet/ 50 % ép, 50 % I R károsodott). Az állatok a preoperatív időszaknak megfelelő körülmények között éltek tovább. A v. jugularis kanült eltávolítottuk, az állatokat izolálva gondoztuk. További vérmintát vettünk: az első posztoperatív napon minta: sebi, ALT, LDH meghatározás céljából. Az állatokat a hetedik posztoperatív napon kivéreztettük, majd a vérmintákat (sebi, ALT, LDH), illetve az V. (I R károsodott) lebenyből szövettani mintát vettünk. Az időközben elhullott állatokat felboncoltuk, a kóros patológiai jegyeket rögzítettük (20 ábra) II. kísérlet részletes leírása Az első kísérlettől eltérően, itt nem terveztünk túlélő állatokat, így a metodika különbözött a fentiektől, illetve a vizsgált reperfúziós idők és a mintavételi időpontok sem egyeztek. Légútbiztosítás, érkanülálás: Az ip. anaesthesia indukció után lege artis tracheakanült helyeztünk be a légutak nyitva tartására. Ezután a jobb alsó végtag arteria és vena femoralis kipreparálása után az erekbe lege artis polietilén kanülöket vezettünk be. Ugyanilyen kanült helyeztünk a jobb vena jugularisba is. Az arteria femoralison át 78. oldal

79 bevezetett nyomásmérővel (Biopac MP100 system, SDR, Sydney) regisztráltuk az állatok artériás vérnyomását, ill. a vénás kanülök vérminta vételére és egyéb oldatok beadására (jugularis vénás kanül: PJ 34, fiziológiás sóoldat) használtuk. A femoralis vénán keresztül 3 ml/ttkg/óra adagban fiziológiás sóinfusiót, infúziós pumpával anaesthetikumot és intravénás bólusban 60 IU/ttkg Na heparint adtunk. PJ 34 PARP inhibitor (21. ábra): A kisérletben a vízben oldható PJ 34 szelektív PARP 1 inhibitort alkalmaztuk [Inotek Pharmaceuticals Corporation (Massachusetts, Beverly, USA)]. A PJ 34 gátlószer szerkezete: (N (6 oxo 5,6 dihydrophenanthridin 2 yl) N,N dimethyacetamide HCl). A PARP inhibitort egy órával a beavatkozás előtt adtuk be az állatoknak 10mg/ttkg dózisban, intravénásan 1 mg/ml törzsoldatból, melyet frissen készítettünk a por alakú gyógyszer fiziológiás sóoldattal történt oldása után. 21. ábra: PJ 34 PARP inhibitor szerkezete 22. ábra: Glutamin szerkezete Glutamin (Gln, 22. ábra): Kísérleteinkhez Dipeptiven (Fresenius Kabi) B05XB02 ATC számú törzskönyvezett (OGYI: /41/2003) glutamin tartalmú oldatot használtunk, melynek hatóanyaga: l ml oldatban 82 mg/ml L alaninum (Ala) és 134, 6 mg/ml L glutaminum (61,8 % Gln). Extrapolálva a humán dózist állatokra, a rágcsálók metabolizmusát is figyelembe véve 1,25 szörös térfogathígításával 160 mg/ml es Ala+Gln törzsoldatot nyertünk, mellyel 0,5 ml/óra sebesség mellett testtömegtől függően kb. 3 óra alatt 245 mg/ttkg aminosav oldatot infundáltunk, így elérhettük a maximális napi dózis kétszeresét (240 mg aminosav), amely kevesebb a subletális dózisoknál. Műtét: A megfelelő oldatok (fiziológiás sóoldat, PJ 34, glutamin) beadása után 1 órával az artériás kanülből 0,5 ml vérmintát vettünk, melyet 0,5 ml fiziológiás sóoldattal pótoltunk vénás oldalon. Median laparotomia után mobilizáltuk a májat. Az V. májlebenyen 5 percig laser Doppler flowmeterrel alapáramlást mértünk. Az egyik csoportban (IP) 1 ciklusban [5 perc ischaemia 10 perc reperfúzió] ischaemiás 79. oldal

80 x x x x x x x I R szövettan és homogenizátum Splanchnikus keringést fenntartó shunt ök 23. ábra: Az második kísérlet vázlatos menete. Rajz: Mihály Zoltán & Szijártó Attila preconditionálást végeztünk. A többi csoportban ilyen beavatkozás nem volt. Ezután a III., IV., V. lebenyek bilio vascularis nyelére atraumatikus mikroklippeket helyeztünk 60 percre. A májban így a szerv közel 2/3 t érintő [177] szegmentális ischaemiát hoztunk létre. A I., II., VI., VII. lebenyeken át a splanchnikus keringés zavartalan volt splanchnikus pangás nem jött létre. A 60 perc ischaemia letelte után a I., II., VI., VII. lebenyeket rezekáltuk. Ezután a mikroklippeket eltávolítottuk, így a reziduális lebenyek vérellátása helyreállt. 60 percig kísértük LDF rel az V. lebeny mikrocirkulációját. Ezt követően zártuk a hasüreget, majd a postischaemiás 6. órában mindhárom I R károsodást szenvedett lebenyből (III., IV., V.) 1 1 db 3 4mm es szeletet eltávolítottunk szövettani, immunhisztokémiai feldolgozásra. A máj maradék, további részét apró darabokra vágtuk, majd többszöri mosással annak vértartalmát csökkentettük. Ezután a 80. oldal

81 májszövet homogenizálását Potter Elvehjem készülékkel jeges hűtés mellett (0 4 o C) végeztük. Végül az állatokat az arteria femoralison át exsanguináltuk, a vérmintából szérum antioxidáns paramétereket, TNF α szintet, AST t, ALT t szinteket mértünk (23. ábra). Az áloperált csoportban a kanülök behelyezését és a laparotómiat követően percig nyitva tartottuk a hasüreget, majd a fenti metodika szerint 6. órában mintavétel, illetve az állatok leölése történt Májvolumenek Az áloperált állatok (II. kísérlet) máját a kísérlet végén, artériás kivéreztetés után lebenyenként lemértük, hogy pontos adatokat kapjuk az ischaemisált lebenyek/egész máj arányról Statisztikai feldolgozás Az adatok grafikus és statisztikai megjelenítését Microsoft Office 2003 Excel, illetve Statisoft Inc. STATISTICA 6.0 for Windows szoftver segítségével végeztük el. Az átlagértékek közötti különbségeket p<0,05 konfidencia intervallum esetén értékeltük szignifikáns különbségként. A táblázatban a mérések eredményét a mért értékek átlagával és a standard deviáció (± S. D.) megadásával fejeztük ki. A táblázatokban és az ábrákon * karakterrel jelöltük a szignifikánsan eltérő értékeket p<0,05, illetve ** karakterrel p<0,01 valószínűségi szinten. Student féle egy és kétmintás t próbát, variancia analízishez kétutas és egyutas ANOVA t használtunk. 81. oldal

82 4. EREDMÉNYEK 4.1. I. kísérlet eredményei Haemodinamikai paraméterek Nem volt mérhető szignifikáns különbség az állatok pulzusszáma (382 ± 22/perc), illetve az artériás középnyomás (MAP: 103±15 Hgmm) tekintetében. Ezen paraméterek a 30, 45 perces ischaemiás csoportban nem szignifikáns módon változtak meg a kísérlet alatt, sem az ischaemiás reperfúziós (I R) sem az ischaemiás preconditonálásban részesült állatok csoportjai (IP + I R) között. Általános jelenség volt az ischaemia alatti hypotónia, mely mintegy 10% kal tovább csökkent a reperfúzió kezdeti szakasza alatt, mely így a 60 és 90 perces ischaemiás csoportban a MAP szignifikáns csökkenését (p<0,05) okozta mind az ischaemia mind a reperfúzió alatt Mikrocirkuláció Az állatok individuális áramlási adatain végzett matematikai transzformáció után az egy csoporton belüli (n=10) átlagot tüntettük fel (24. ábra, 3. táblázat). A sematikus ábrán (3.1. fejezet: ábra) is feltüntetett PM és a RT elemzésekor látható, hogy valamennyi ischaemiás csoport között szignifikáns különbség mutatható ki (p<0,05); a Plató Maximum (PM: a reperfúziós görbe utolsó 5 percének átlaga) és Reperfúziós Terület (RT: görbe alatti terület integrálja) értéke fordítottan arányos az ischaemiás idővel. Plató Maximum (% ) Reperfúziós Terület arány K RT = (RT x /RT 0 ) x 100 I R IP + I R I R IP + I R ISCHAEMIA 30 min 90 (± 5) 93 (± 4) 79 (± 6) 82 (± 8) 45 min 66 (± 12) 80 (± 15) * 51 (± 15) 75 (± 12) * 60 min 38 (± 21) 61 (± 18) * 31 (± 12) 60 (± 17) * 90 min 19 (± 13) 28 (± 21) 15 (± 8) 20 (± 14) 3. táblázat: PM és RT értékek * = Szignifikáns (p<0,05) különbség preconditionált és nem előkezelt csoportok áramlási paraméterei (PM, RT) között. 82. oldal

83 Az IP sal előkezelt 45 és 60 perces ischaemiás csoportokban szignifikánsan magasabb (p<0,05) áramlásértékeket mutatott mind a RT, mind a PM a tisztán ischaemizált reperfundált csoportokhoz képest. A két görbe alakja (IR, IP + IR) közt jelentős eltérés nem látható, az IP csoportok görbéinek meredeksége kifejezettebb. 90 perces ischaemiát megelőző IP áramlásban mutatott eredménye a tisztán ischaemiás csoportokhoz képest nem mutatott szignifikáns (p<0,05) különbséget (3. táblázat). A görbék karakterének vizsgálatakor látható, hogy a rövid (30 perces) idejű károsodást követő meredek emelkedés az ischaemiás idő megnyúlásával laposodik. Azt követően a reperfúzió végéig a platószakasz kissé emelkedik, majd egy szinten beáll. A görbe meredekségére és platófázisra illesztett egyenesek metszéspontjának, azaz a Reperfúziós Maximális Időnek (RMI; 3. táblázat) számítása során az ischaemiás (I R) csoportban az alábbi meglepő értékeket kapjuk: RMI 30 = 8 25 ; RMI 45 = 9 23 ; RMI 60 = 9 45 ; RMI 90 = Az ischaemiás preconditionált csoportokban, az előző adatokhoz képest, csupán a 45 és 60 perces ischaemiás csoportban vannak érdemi eltérések: RMI 45 = 6 03 ; RMI 60 = A reperfúzió kezdetén, a 4 ischaemiás, nem előkezelt (I R) csoportok RMI átlagát (RMI átlag = 8 23 ± 1 53 ) nézve megállapítható, hogy egységesen kb. 7 9 perces időintervallum alatt a mikrocirkuláció kezdeti meredeken emelkedő fázisa befejeződik, innentől a platófázis lassan emelkedik csupán (4. táblázat). Ezeken az értékeken az IP sem RMI átlag (min, sec) javít lényegesen, habár a megjelenő ISCHAEMIA 30 min I R 8 25 IP + I R 8 39 változás a 45 és 60 perces csoportban megjelenő változás szembetűnő. Az 45 min adatok azt sugallják, hogy a 60 min 90 min reperfúzió kezdeti szakaszában, egy rövid intervallumban az átjárható 4. táblázat: RMI átlagidők kapillárisok szintje feltöltődik, innen egy lassú oldódási szak indul meg. A 90 perces ischaemiás csoportban észlelhető rövid RMI pedig az átjárható, nyitva maradt kapillárisok, nagyerek csökkent számát igazolja. Az előző észrevételeket összevetve a szövettani mintákon (ld.: ) látható morfológiai eltérésekkel, illetve figyelembe véve ezek súlyossági fokát is (+/+++), a jelenség hátterében az alábbi patofiziólógia folyamatok állhatnak: (1) a reperfúzió kezdetén lévő meredek 83. oldal

84 emelkedést, a portális és arteriális vér beáramlása okozza. Az ischaemiás idő növekedésével létrejövő fokozott sinusoidalis pangás, leukostasis ezt lassítja. Így pl. 90 perc ischaemia után ezen jelenség nem jelenik meg, a görbe mindvégig lapos; (2) a reperfúzió végéig megjelenő kisfokú áramlás javulás, javuló tendenciát mutató flux ingadozás a vizsgálat során makroszkóposan is látható, foltos reperfúzió (no reflow jelenség) oldódásával, az érspazmus megszűnésével magyarázható. Ilyen makroszkópos, foltos reperfúziós jelenség 30 perc ischaemiánál szinte alig, 90 perc ischaemiánal pedig már nem figyelhető meg, tekintve a reperfúziós elégtelenséget. A legszembetűnőbb változások 45, illetve 60 perc ischaemiát követő reperfúzió során jönnek létre. 24. ábra: Különböző idejű ischaemiakat (30 90 perc) követő 30 perces reperfúzió LDF rel rögzített áramlásgörbéi; 10 görbe átlagai 84. oldal

85 Szövettani feldolgozás Az eltávolított mintákon HE festés történt, az értékelés táblázatos, szemikvantitatív módon végeztük. (ld: 3.2. fejezet) A nem preconditionalt I R csoport Az ischaemiás szövettani mintákban (I. lebeny) az elváltozások a kirekesztés után nem jellemzően lineárisan változnak az idővel. 30 perces kirekesztést követően csupán sinusoidalis pangás látható (25. ábra), nomenklatúránk szerint (ld.: 3.2. fejezet) a 25. ábra: Sinusoidalis pangás A reperfúzió után vett mintákban (II. lebeny) 30 perces csoportoknál a fenti kép változatlan. 45 perc ischaemia után vénatágulatok alakulnak ki, kereksejtes periportális infiltráció jelenik meg, középsúlyos károsodás látható (13 pont). 60 perc után a fenti jelenségek nagyobb számban észlelhetőek (++ / +++; 20 pont), pericentralis foltos necrosisok jelennek meg. A 90 perces csoportban a legkifejezettebbek a vénatágulatok, károsodás foka enyhe (6 pont). 45 perc után a vacuolisatio elvétve látható; középsúlyos károsodás (10 pont). 60 perc ischaemia után vénatágulatok, jelentősebb vacuolisatio látható (16 pont), súlyos károsodás. 90 perc ischaemia után a fentiek mellett kifejezett sejtduzzadás, vacuolisatio, karyolysis, karyorrhexis és nagy kiterjedésű necrosis jelenik meg (19 pont). 26. ábra: Összefüggő pericentrális necrosis 90 perc ischaemia után és intenzív vacuolisatio, illetve helyenként bevérzett, összefüggő II III zónát érintő 85. oldal

86 necrosis (26. ábra) látható (21, maximális pont). Apoptózis jeleit érthető módon a megfigyelés rövid volta miatt elvétve, vagy nem láttunk. A túlélő állatokból a 7. napon vett mintákban (V. lebeny) 30 perces ischaemia után restitutio ad integrum, 45 perces csoportban periportalis kereksejtes beszűrődés látható (27. ábra). A 60 perces csoportokban vacuolisatio és egy egy látótérben, igen kis terjedésű foltos necrosis jelen van (II. zóna) kifejezett periportális kereksejtes beszűrődéssel (15 pont); fibrózis, bridging vagy epeúti proliferáció nem fordult elő. 90 perc ischaemiát túlélő állat nem volt a 7. napon. 27. ábra: Portalis triad körüli kereksejtes beszűrődés egy héttel a műtét után Az IP csoportok hisztológiai elváltozásai. A 30, 45 és 90 perces mintákat vizsgálva azok sem az ischaemiát, sem a reperfúziót követően vett mintákban nem mutatnak jelentős különbséget a kontroll ischaemiás csoportokhoz képest, a necrosisra gyanús sejtek száma 10 15% kal kisebb. Súlyossági besorolásuk nem tér el a kontrollcsoportjukétól. A 60 perces csoportban mind az ischaemiás mintában, mind a reperfúziós mintákban a destrukció kisebb fokú: 14 és 17 pont, szemben a kontroll, I R csoportban fent leírtakkal (16 illetve 20 pont). Ezen csoportban összefüggő necrosis nem látható, pericentralisan fokozott sejtelhalási jelek mutatkoztak. A 7. napon vett mintákban azonban a 30, 45, 60 perces IP + I R csoportokban a kereksejtes beszűrődés és a szövetdestrukció foka kisebb a nem előkezelt csoportokhoz képest, enyhe középsúlyosnak mondható. Apoptózis elvétve fordult elő. A 60 perces csoportban kiterjedt necrosis nincs. 90 perces IP + I R csoportból az egyetlen túlélő állat májában kifejezett necrosisok és lymphocyta infiltráció volt látható. 86. oldal

87 TNF α szintek A kontroll, beavatkozás előtt 12 órával vett bazális szintekhez képest ( 28.ábrán nem jelölt) a reperfúzió 30. percében vett TNF szintek, mind az I R, mind az IP+I R csoportban szignifikánsan emelkedettek voltak. Az I R és IP+I R csoportban mért TNF szintek (28. ábra) arányosak az ischaemiás idővel. Jelen tanulmányunkban IP hatására a 30 és 45 perces ischaemiát követően a reperfúzió 30. percében vett TNF α szintek szignifikáns (p<0,05), 60 percnél erőteljes szignifikáns (p<0,01) csökkenést mutattak. A 90 perces ischaemiát követően a preconditionálás nem okoz szignifikáns TNF α csökkenést. 28. ábra: TNF α szintek a reperfúzió 30. percében; * p < 0,05; ** p < 0, Laboratóriumi vizsgálatok: sebi, ALT, LDH A 30 perces ischaemiát követően sem a direkt bilirubin szint, sem a többi vizsgált laborérték (ALT, LDH) nem mutat szignifikáns (p<0,05) emelkedést a kontroll mintához képest, sem az első, sem a 7. posztoperatív napon. Ehhez hasonlóan az IP sem eredményezett szignifikáns csökkenést a csoporton belül. A 45 és 60 perces ischaemiát követően, az összes mért paraméter (direkt bilirubin, ALT, LDH) a kontroll mintához képest szignifikáns (p<0,05) emelkedést 29. ábra: Szérum bilirubin szintek * p < 0,05; ** p < 0,01 mutat az első napon. A preconditionált csoportokban mért laborértékek a tisztán 87. oldal

88 ischaemiás csoporthoz képest szignifikánsan (p<0,05) alacsonyabbak az első napon. A 7. posztoperatív napon ezek szintje egyik csoportban sem különbözik szignifikánsan a kiindulási kontroll csoportok értékeitől ( ábrák). 30. ábra: ALT szintek * p< 0,05, ** p < 0, ábra: LDH szintek * p< 0,05, ** p < 0,01 A 90 perces ischaemiát követően a kontroll értékekhez képest minden laborparaméter szignifikáns (p<0,05) emelkedést mutat az első napon, viszont nincs különbség a preconditionált és a nem előkezelt csoportok között. A 7. posztoperatív napon az enzimszintek továbbra is emelkedettek a preconditionáláson átesett egyetlen túlélő állatban Túlélés a 7. posztoperatív napon A kísérleti állatok túlélésének eredményei, illetve a két csoport összehasonlítása I R IP + I R 30 min 100 % 100 % 45 min 90 % 100 % 60 min 60 % 70 % 90 min 0 % 10 % 5. táblázat: Túlélő állatok 1 hét után során talált különbségek az 5. táblázatban láthatók. 100% os túlélést jelentett, ha a csoportban lévő 10 állatból az összes túlélt. Megjegyzést érdemel, hogy az állatok 90 % a, a 3 4. posztoperatív napon hullott el. Egyes állatok 88. oldal

89 láthatóan vérzéses szövőd ményt mutattak. Az elhullott állatok tetemeit felboncolva a 90 perces ischaemiás csoportban, szinte kivétel nélkül az érintett májlebeny nagyfokú felpuhulását, necrosisát észleltük. Az állatok felében észleltünk zavaros, vörhenyes ascitesszerű hasűri folyadékot. Az állatok halála vélhetően a dekompenzált májműködésből, illetve az ezt követő szeptikus állapotból származhatott II. kísérlet eredményei A második kísérlet elvi háttere, problémafelvetése az I. kísérlet eredményein alapszik. Megfigyeléseink szerint a 60 perces ischaemiás idő jelentős mikrocirkulációs, szöveti, illetve transzamináz és TNF α szint változást okoz. Továbbá, az I. kísérletből levonható következtetés, hogy a 90 és 30 perces ischaemia kapcsán alkalmazott IP érdemileg nem befolyásolja az említett paramétereket. 45 perces ischaemiát követően a reperfúzió során látott változások inkább a 30 perces ischaemiához állnak közelebb. A 60 perces kirekesztést követő drámai változások, az IP hatására szignifikáns módon javulnak mind a mikrocirkuláció (PM, RT, RMI), mind a szöveti struktúra változásának tekintetében. Fentiekből arra a következtetésre jutottunk, hogy a patkánymáj számára ezen modellben a vulnerabilis periódust a 60 perces kirekesztés jelenti. További vizsgálatainkat ezért ezen hipotézis és modell alapján folytattuk Haemodinamikai paraméterek A laparotómia előtt nem volt mérhető szignifikáns különbség az állatok pulzusszáma (361 ± 32/perc), illetve az artériás középnyomás (109 ± 17 Hgmm) tekintetében. Ezen paraméterek szignifikáns módon változtak az ischaemia második felében és a reperfúzió első 20 percében, mind a 4 csoportban (I R, IP, PJ 34, Gln) a MAP elérte a 59 ± 19 Hgmm t, míg a szívfrekvencia közel állandó (380 ± 62/min) volt. 89. oldal

90 Mikrocirkuláció Az egyéni áramlási adatokon végzett matematikai átalakítás után az egy csoporton belüli (n=10) átlagot tüntettük fel (32. ábra). A PM és a RT elemzésekor látható, hogy az áloperált, kezelésben nem részesült állatok mikrocirkulációja mindvégig stabil volt. Az áloperált és az I R csoport átlagait tekintve a különbség erősen szignifikáns (p<0,01). Plató Maximumot és Reperfúziós Területet alapul véve (6. táblázat) valamennyi előkezelt (IP, PJ 34, Gln) csoport és tisztán ischaemiás (I R) csoport között szignifikáns különbség mutatható ki (p<0,05). Az előkezelt csoportok között számszerűen szignifikáns eltérés nem volt, ugyanakkor a görbék karaktere eltérő. A két 120 % // I m in áloper ált I R Glu PJ 34 IP + I R 32. ábra: A II. kísérlet során (60 perc ischaemia + 60 perc reperfúzió), laser Doppler flowmeterrel regisztrált áramlási görbék átlagának eredménye. görbe alakja az IP és PJ 34 csoportok közt jelentős eltérés nem mutat, míg a Gln előkezelt csoportban a később szignifikáns javulást mutató görbe a reperfúzió második felében javul, meredekebben emelkedik. Ha csak 30 perces reperfúziót figyelembe véve számoljuk ki az áramlási jellemzőket, megállapítható hogy a Gln csoport PM és RT értéke nem különbözik szignifikáns módon az I R csoport értékeitől. 90. oldal

91 A görbék karakterét és az RMI értékeket figyelembe véve látható, hogy az I R és IP+I R csoportokban a kapott eredmények közel azonosak az I. kísérletben mértekhez: egy relatív gyors emelkedés után egy hosszabb platófázis következik, lassan javuló Plató Maximum (% ) Reperfúziós Terület arány (% ) K RT = ( RT x /RT 0 ) x 100 Reperfúzió Maximális Idő (min, sec) E L Ő K E Z E L É S Nincs, Áloperált 99,5 (± 2) 101,1 (± 4) I R 35 (± 9) ** 30,3 (± 11) ** IP + I R 58 (± 14) * 56 (± 10) * 7 18 PJ 34 + I R 58 (± 13) * 48 (± 12) * Gln + I R 50 (± 15) * 53 (± 14) * táblázat: Mikrocirkulációs jellemzők a II. kísérletben mikrocirkulációval. A PJ 34 gyel és glutaminnal előkezelt csoportokban viszont az áramlási görbék kezdetben az előzőekhez képest lassabb, de a végeredmény tekintetében eredményesebb reperfúziót írnak le. A korábbi, az I. kísérlet eredményeiben leírt okfejtést folytatva, illetve a szövettani minták áttekintése után, a jelenség hátterében a csökkent oxidatív stressz eredményezte kisebb fokú leukostasis, no reflow jelenség állhat Szövettani feldolgozás Hematoxilyn eosin festés A kísérlet során csak egy alkalommal, a kísérlet végén történt szövettani mintavétel. Szemikvantitatív táblázatos módszer alapján a következő mondható el: Az áloperált állatok májában kórjelző eltérés nem volt látható. Az I R csoportban az I. kísérlethez hasonló jelenségek voltak megfigyelhetők (34. ábra), viszont a reperfúziós idők 91. oldal

92 különbsége miatt ezen modellben a szövettani kép színesebb volt. A mintákon jelentős (+++) sinusoidális pangás, II III zóna határon vacuolisatio, centrolobularis foltos és 33. ábra: Apoptózis jelei (kromatin kondenzáció és fragmentáció) a posztoperatív 6. órában az IP, a PJ 34 és Gln előkezelt csoportokban. összefüggő necrosis, periportalis neutrophil infiltráció volt látható, nomenklatúránk szerint (ld.: 3.2. fejezet) a károsodás foka súlyos (19 pont). Az IP csoportban az I. kísérlethez hasonlóan, I R csoportban észlelt jelenségek intenzitása csökkent: egyértelmű, összefüggő necrotikus terület nem volt látható, pericentralis vacuolisatio volt látható a III. zónában, de a II. ban nem. Egy metszeten láttunk focalis necrosist. Periportalis kereksejtes infiltráció volt megfigyelhető kisebb fokú sinusoidalis pangás (++) mellett; apoptózisra gyanús sejtek (33. ábra) száma látóterenként 1 2 volt; összesen 14 pont: középsúlyos súlyos károsodás. A PJ 34 előkezelés után foltos necrosist nem észleltünk, ugyanakkor nagyobb számban volt látható apoptózisra gyanús sejtjelenség: sejtzsugorodás, a kromatin marginalizációja, kondenzációja, fragmentációja, apoptotic body megjelenése. A sejtek egymástól függetlenül, zónafüggetlenül voltak megfigyelhetőek (35 ábra). Összességében a károsodás foka középsúlyos súlyos: 15 pont. A glutamin előkezelés hatására a PARP inhibitorhoz hasonló jelenségek voltak láthatók, azzal a különbséggel, hogy a sinusoidalis pangás foka jelentősen csökkent. Apoptózisra gyanús morfológiai jelek inkább a II. III. zóna határán voltak megfigyelhetőek. A károsodás középsúlyosnak tekinthető; 14 pont. 92. oldal

93 34. ábra I R csoport: sejtkárosodás jelei döntően a II III. zónában 35. ábra: PJ 34 és Glu előkezelés utáni I R sejtkárosodás a III. zónában 93. oldal

94 TUNEL reakció A DNS töredezettségének kimutatására elvégzett TUNEL reakció során kapott eredményeket a HE metszeteken apoptózisra látott, gyanús sejtekkel vetettük össze. Az áloperált csoportban, az apoptózisra gyanús, illetve TUNEL pozitivitást mutató sejtek száma (1,6 ) megfelelt a nemzetközi irodalomban [88] található adatoknak mely szerint ez nem több mint egy két ábra: TUNEL pozitív sejtek száma 10 látótér átlagából, ezrelékben kifejezve. ezrelék ( ábra). Az I R csoportban centrolobularis foltos, helyenként összefüggő necrosisok mellett, 10 látótér átlagát figyelembe véve, a TUNEL pozitív sejtek száma 26,5 volt, mely az áloperált csoporthoz képest szignifikáns emelkedést jelent. Jobban áttekintve a metszeteket, gyakorta a II. III. zónának megfelelően volt látható pozitív festődés, mely inkább az I R alatt bekövetkezett DNS töredezettséget reprezentálja. Megerősíti ezt az is, hogy sok helyen elvétve is előfordultak TUNEL pozitív sejtek, sejtcsoportok is, de ugyanakkor jelentős számban volt látható összefüggő területeket érintő pozitivitás is, mely inkább az I R károsodásról, sem mint apoptózisról tanúskodik. Az IP csoportban összefüggő necroticus terület nem volt látható, pericentralis vacuolisatio mellett 23,8 volt TUNEL pozitív sejt. A PJ 34 és glutamin előkezelés után foltos necrosist nem észleltünk, ugyanakkor TUNEL pozitív sejtjelenség: PJ 34: 32,8 vs. Gln: 31,9, mely nem jelent szignifikáns emelkedést. Ezen csoportban jelentősebb számban voltak láthatóak rendezettséget nem mutató, önálló, pozitív festődésű sejtek, egy pár sejtből álló csoportok minden zónában. A további tisztázására aktív kaszpáz 3 kimutatást végeztünk (ld. ott). 5 0 áloperált I R IP + I R PJ 34 Glutam in 94. oldal

95 37. ábra: TUNEL festés, 20 x nagyítás (A E). Csoportok A: áloperált; B: I R ; C: IP+I R ; D: PJ 34 ; E: Glu. F ábra 1000x nagyítás TUNEL pozitív sejtekről, a reakció eredményeként látható barnás festődés a DNS töredezettséget jelzi Aktív kaszpáz 3 immunhisztokémia Az aktív kaszpáz 3 festés során, a TUNEL reakcióhoz képest kisebb számban voltak találhatóak pozitív festődésű sejtek, melyek a TUNEL től eltérően nem csoportban, B A 38. ábra: Áloperált állatból vett minta vett minta, pozitivitás: 1,8. 400x nagyítás 39. ábra: Aktivált kaszpáz 3 pozitivitás: barna festődés a citoplazmában (A) és a magban (B) 95. oldal

96 zónákra elosztva jelentek meg. Aktív kaszpáz 3 aktivitás (barna festődés, 39. ábra) volt látható mind a magban, mind a citoplazmában, ezen utóbbi volt túlsúlyban. Az áloperált állatok között az kaszpáz 3 pozitív sejtek aránya 1,8 volt, mely nem meglepő, közel azonos a TUNEL reakciókkal kapottakhoz (38. ábra). Az I R csoportban a pozitív festődés aránya 15,4, míg az IP csoportban ez eléri a 22,2 et, ugyanakkor a PJ 34 gyel előkezelt állatok csoportjában: 30,5. A Gln csoportban a pozitív festődést mutató sejtek aránya 28, Poli(ADP ribóz) (PAR) immunhisztokémia Anti PAR vizsgálatokat csupán az áloperált, I R és PJ 34 előkezelt csoportokon végeztünk, igazolandó a PARP inhibitor működésének hatásosságát. A festési eljárás során látható volt, hogy az I R csoportban szignifikáns módon nőtt az anti PAR pozitív sejtek száma, mely hátterében a PARP túlaktivációja okozta fokozott PAR szintézis áll. 40. ábra: Anti PAR festés A: áloperált, B: I R ; C: PJ 34 előkezelt csoportban A PJ 34 előkezelt csoportban a pozitív sejtek száma mintegy 42 45% kal csökkent, jelezve a beadott inhibitor hatásosságát (40. ábra) TNF α szintek Az ischaemiás preconditionált csoportban a TNF α szint változás tendenciája hasonló az I. kísérletben, WEHI sejtkultúrán mért értékekkel. Ezen csoportban az IP hatására a kontroll, nem előkezelt, ischaemiás reperfúziós (I R) csoporthoz képest a TNF α pg/ml á lo p e r ál t I R IP + I R P J 3 4 G lu t a m in 41. ábra: TNF α szintek ELISA módszerrel a postischaemias 6. órában. * p < 0,05 szint szignifikánsan csökkent. Ugyanakkor sem a PJ 34, sem a glutamin előkezelés nem * 96. oldal