CITOKRÓM P450 ENZIMEK IN VITRO ÉS IN VIVO INDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA REGENERÁLÓDÓ MÁJSEJTEKBEN. Tamási Viola

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA CITOKRÓM P450 ENZIMEK IN VITRO ÉS IN VIVO INDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA REGENERÁLÓDÓ MÁJSEJTEKBEN Doktori (Ph.D.) értekezés Tamási Viola Témavezetők: Monostory Katalin Dobozy Ottó Készítés helye: MTA Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézet Farmakobiokémiai Osztály és Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Budapest, 2004

2 Szigorlati bizottság: Elnök: Dr. Mandl József, egyetemi tanár, Orvos Vegyytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet Tagok: Dr. Szél Ágoston, egyetemi tanár, Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet Dr. Tihanyi Károly, osztályvezető, Richter Gedeon RT Az értekezés opponensei: Dr. Kardon Tamás, egyetemi tanársegéd, Orvos Vegyytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet Dr. Tihanyi Károly, osztályvezető, Richter Gedeon RT 2

3 Tartalomjegyzék: Tartalomjegyzék 3 Rövidítések 6 1. Bevezetés 8 2. Tudományos előzmények P450 enzimek szerepe A gyógyszermetabolizmusban fontos szerepet játszó P450 enzimek CYP1A CYP1A CYP1A CYP2B CYP2E CYP3A CYP3A CYP3A CYP3A A májregeneráció folyamata Májregeneráció a partiális hepatectomia után A regenerációban szerepet játszó faktorok Glükokortikoidok hatása a regenerációra Glükokortikoidok hatása a P450 enzimekre P450 enzimek szintjének változása a regeneráció során Célkitűzések Mòdszerek Használt vegyszerek és kísérleti állatok Az állatok kezelése 32 3

4 4.3. Partiális hepatectomia Májsejtpreparálás Mikroszóma preparálás Mikroszómapreparálás májszövetből Mikroszómapreparálás sejtekből P450 enzimaktivitások meghatározása Etoxiresorufin O-dealkiláz aktivitás Pentoxiresorufin O-dealkiláz aktivitás p-nitrofenol hidroxiláz aktivitás Klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás Etoxikumarin O-dealkiláz aktivitás meghatározása Aminopirin N-demetiláz Etilmorfin N-demetiláz P450 enzimek kimutatása immunoblot (Western blot) technikával Eredmények és értékelésük A P450 enzimek aktivitására regenerálódó patkány májban Dexametazon hatása a P450 enzimekre regenerálódó májban CYP2E1 enzim indukciójának vizsgálata sejtkultúrában Mòdszer a klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás sejtkultúrában valò meghatározására CYP2E1 indukciója patkány májsejtekben P450 enzimek in vitro indukciójának vizsgálata regenerálódó májból izolált sejtekben CYP1A enzim indukciója regenerálódó májból izolált sejtekben CYP2E1 enzim indukciója regenerálódó májból izolált sejtekben CYP3A enzim indukciója regenerálódó májból izolált sejtekben Összegzés 61 4

5 7. Köszönetnyilvánítás Irodalomjegyzék Összefoglaló Summary Mellékletek Az értekezés témájában megjelent közlemények Az értekezés témájához kapcsolódó poszterek Az értekezés témájához kapcsolódó előadások Különlenyomatok 79 5

6 Rövidítések: AhR AhRR Arnt BTE BTEB CAR C/EBP COUP-TF DDT DMSO DR DXM DexRE EDTA EGTA EGF ER GR GRE HGF HNF Hsp90 IGF IL INFγ INF IM aromás szénhidrogén receptor AhR represszor AhR nukleáris transzlokátor basic transcription element basic transcription element binding protein konstitutív androgén receptor CCAAT-enchancer binding protein chicken ovalbumin upstream promoter factor diklòr-difenil-triklòretán dimetil-szulfoxid egyirányú ismétlődő szekvencia (direkt repeat) dexametazon dexametazon érzékeny szakasz etilén-diammino-tetraecetsav etilén-glikol-bis (2-aminoetileter)-N, N, N, N -tetraecetsav epidermális növekedési faktor kifelé fordított ismétlődő szekvencia (everted repeat) glükokortikoid receptor glükokortikoid receptor kötőhely hepatocyta növekedési faktor hepatocyta nukleáris factor hősokk fehérje inzulin növekedési faktor interleukin interferon-γ interferon imidazol 6

7 IR befelé fordított ismétlődő szekvencia (inverted repeat) IRE insulin érzékeny szakasz iprop izopropanol NF-kappaB nukleáris factor kappab NFY nukleáris factor-y NF1 nukleáris factor 1 NRE negatív szabályzò elem NR1 és NR2 nukleáris receptor kötő helyek Oct-1 szerves kation transzporter-1 PB fenobarbitál PBRU phenobarbital responsive unit PPAR peroxiszóma proliferátor aktivált receptor PXR pregnán X receptor RIF rifampicin RXR retinoid X receptor SRC-1 szteroid ko-aktivátor Sp1 transzkripciós faktor SDS nátrium-dodecil-szulfát STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 TCDD 2,3,7,8-tetrechlorodibenzo-p-dioxin TGFα transzformáló növekedési faktor TGF-β transzformáló növekedési faktor-β TNF tumor nekrózis faktor upa3 urokináz típusú plazminogén aktivátor XAP2 hepatitis B vírus asszociált fehérje XREM, XRE xenobiutikum érzékeny szakasz 7

8 1. Bevezetés A citokróm P450 enzimek (P450) számos endogén (szteroid hormonok, zsírsavak, leukotriének) és a szervezetbe kerülő exogén anyag (xenobiotikumok) metabolizmusáért felelősek. Szervezeten belül a májban helyezkednek el legnagyobb mennyiségben. A P450 aktív centrumába került szubsztrát molekula az enzim segítségével vízoldékonyabbá válik és így könnyebben kiürül a szervezetből. A P450 enzimek aktivitása a szervezeten belül nem állandó; a szervezetbe kerülő xenobiotikumok, vagy egyes endogén szabályzó molekulák képesek növelni (induktorok) vagy csökkenteni (inhibítorok) a P450 enzimek aktivitását. Különböző patofiziológiás elváltozásoknak (pl. chirrosis, diabetes mellitus) szintén kísérő jelensége az, hogy megváltozik az egyén metabolikus kapacitása. Kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy osztódó májsejtekben hogyan változik egyes P450 enzimek aktivitása. Partiális hepatectomiát követően a megmaradt hepatocyták dedifferenciálódnak (ezzel a specifikus, homeosztatikus funkciók, mint amilyen pl. a metabolizmus, csökkenek) és osztódni kezdenek. Vizsgálataink során arra kerestünk választ, hogy a májregeneráció során, hogyan változik a P450 enzimek közé tartozó CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek alapszintje és indukálhatósága. Nemcsak a P450 enzimek in vitro indukálhatóságát vizsgáltuk, hanem ezen enzimek változását a májban partiális hepatectomiát követően. Irodalomból jól ismert a glükokortikoidok (pl. dexametazon) regenerációra és P450 enzimekre gyakorolt hatása. A későbbiekben arra kerestünk választ, hogy in vivo dexametazon kezelés hogyan befolyásolja a P450 enzimeket a regeneráció során. 8

9 2. Tudományos előzmények 2.1 P450 enzimek szerepe A P450 enzimek olyan hem tartalmú enzimek, amelyek számos anyag metabolizmusáért, szintéziséért és átalakításáért felelősek. A P450 enzimeknek egyik jelentős csoportja a sima felszínű endoplazmás retikulum membránjában helyezkedik el. Ezen enzimek fő feladatai közé tartozik a szervezetbe kerülő testidegen anyagok (xenobiotikumok) vízoldékonyabbá tétele (fázis I). Az így képződött metabolitok konjugálódhatnak glukuronsavval, glicinnel, szulfáttal stb. (fázis II) és kiürülnek a szervezetből. Ezek a fázis I. metabolizmust katalizáló enzimek a CYP1-4, csoportba sorolhatók. A P450 enzimek nem specifikus enzimek, számos vegyület átalakítására képesek (29, 37). Egyes endogén anyagok metabolizmusáért is felelősek, mint például a tesztoszteron, telítetlen zsírsavak, alkoholok, prosztaglandinok hidroxilezése (29). Az endoplazmás retikulum membránjában lévő P450 enzimek működéséhez szükséges elektront a NADPH, vagy a NADH szolgáltatja. A citokróm P450 enzim az elektrontranszportot létrehozó redukáló enzimekkel (NADPH-citokróm P450 reduktáz, NADH-citokrómb 5 -reduktáz) együtt multienzim komplexet alkot és a következő reakciót katalizálja: 9

10 P450 RH + O 2 + NADPH + H + ROH + H 2 O + NADP + ROH NADPH-P450 reduktáz RH e- Fe 3+ (RH) Fe 3+ (RH) Fe 2+ O 2 (ROH) Fe 3+ (RH) Fe 2+ (O 2 ) (RH) Fe (O ) 3+ (RH) Fe 3+ (O 2 ) 2- (RH) Fe 3+ (O 2 ) - H 2 O 2H + e- NADPH-P450 reduktáz 1. ábra: P450 enzimek működése (Fe: az enzim aktív centrumában lévő hem, RH: szubsztrát, ROH: oxidált termék. A szubsztrát megkötése után az enzim aktív helyén lévő Fe(III) könnyen redukálódik (1. ábra). A redukció során a NADPH-ról az elektronok a NADPH-citokróm P450- reduktázon keresztül jutnak el a citokróm P450-hez. A redukáló enzim két koenzimet tartalmaz (FAD és FMN). A redukált, Fe(II)-őt tartalmazó P450 enzim képes megkötni a molekuláris oxigént és egy újabb elektron felvételével stabilizálódik. Az elektron két enzimtől is származhat: NADPH-citokróm P450-reduktáztól és NADHcitokróm-b 5 -reduktáztól. A keletkezett komplex O-O kötése felhasad, egy molekula víz kilépésével aktív intermedier jön létre, amely elvégzi a szubsztrát oxidációját. Végül is az oxidált metabolit disszociál az enzimről. A P450 enzimek számos kémiai 10

11 reakciót katalizálnak: hidroxilezést, N-, O-, S-dealkilezést, azocsoportok, epoxidok és N-oxidok redukcióját. 2.2 A gyógyszermetabolizmusban fontos szerepet játszó P450 enzimek A P450 géncsalád felosztása kisebb családokra és alcsaládokra a DNS szekvencia homológia alapján történik. Általában 40%-os hasonlóság szükséges ahhoz, hogy egy családba és 55%-os hasonlóság szükséges, hogy egy alcsaládba soroljuk a megfelelő géneket. A CYP betűjelek után arab számmal jelölik az enzimcsaládot, betűvel az alcsaládot, majd az adott gén jelölése ismét arab számmal történik. A patkányban lévő P450 enzimek közül a gyógyszerek metabolizmusában főleg a CYP1-CYP4 család enzimei vesznek részt. Munkám során négy P450 enzimcsoporttal foglalkoztam részletesen, - CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A. Ezen enzimek nagy mennyiségben fordulnak elő a májsejtek endoplazmás retikulumában, ahol is számos vegyület átalakításáért, felelősek. A CYP1-CYP4 családba tartozó enzimek szabályzásában számos endogén és exogén anyag vesz részt. A szabályzás eredménye fokozott transzkripció vagy a már meglévő mrns vagy enzimfehérje (pl. CYP2E1) stabilizálása. A transzkripciò fokozòdása nukleáris receptorokon keresztül történik (3. ábra). A xenobiotikummal közvetlenül, vagy foszforilációs kaszkádon keresztül aktivált nukleáris receptor a sejtmagban dimerizációs partnerével homo- illetve heterodimert képez és a DNS megfelelő szakaszához (kötőhely) kapcsolódik. Ez a szakasz általában AGGTCA szekvenciát tartalmaz (sok esetben egy-két bázis eltérhet ettől, de a nukleáris receptor akkor is felismeri a kötőhelyet). A dimer megkötéséhez két ilyen szakasz kell, amelyeket általában 1-7 bázis köt össze a DNS-en és többféle orientációban helyezkednek el. Az elhelyezkedés alapján az angol terminológiával élve a következő féle ismétlődő szakaszokat különböztetjük meg: DR: direct repeat (egyirányú ismétlődő szekvencia), ER: everted repeat (kifelé fordított ismétlődő szekvencia), 11

12 IR: inverted repeat (befelé fordított ismétlődő szekvencia) (2. ábra) (79, 28). RECEPTOR DIMERIZÁCIÓS PARTNER P450 CYP1A CYP2B CYP3A RECEPTOR AhR CAR, PXR GR, PXR, CAR XENOBIOTIKUM P450 mrns 5 3 (AGGTCA-Nx) 2 DRx ERx IRx 2. ábra: A nukleáris receptorok kapcsolódasa a P450 enzimek reszponzív eleméhez (87) CYP1A A patkány CYP1A enzimcsaládba két izoenzim tartozik: CYP1A1 és CYP1A2. A két enzim aminosav sorrendje 68%-os azonosságot mutat. A patkány májában lévő CYP1A1 gén 6.1 kb hosszú, hét exont és hat intront tartalmaz. A szabályzò szakaszok főképp a gén 5 végén helyezkednek el, valamint egyes intron szakaszokban is (22). 12

13 CYP1A1 A CYP1A1 gén főleg a tüdőben expresszálódik, de indukció [pl. 3-metilkolantrén, 2,3,7,8-tetrechlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), cigarettafüst komponensei] hatására a májban is kifejeződik (29). Szubsztrátjai közül legismertebbek a planáris, policiklusos aromás szénhidrogének pl. a benzantracén. Gyógyszervegyületeket eddigi ismereteink szerint nem metabolizál. A CYP1A1 gén kifejeződését szabályzó szakaszok három nagy csoportra oszthatók (18): BTE, (basic transcription element), amely a gén alapszinten történő átíródásáért felelős, XRE (xenobiutikum érzékeny szakasz), amely az indukciós hatásért felelős, NRE (negatív szabályzò elem ), amely a gén átíródását csökkenti, GRE, (glükokortikoid receptor kötőhely), amely az indukciós hatás módosításaért felelős. A BTE szekvencia egy GC-gazdag szakasz, ezért GC-boxnak is nevezik. Ide kapcsolódnak olyan transzkripciós faktorok, mint az Sp1 (92). Az XRE szakaszokhoz kapcsolódnak az induktor molekulák, mint pl. a 3- metilkolantrén, TCDD (3. ábra). A kapcsolódás nem közvetlen, hanem egy receptor (AhR), egy nukleáris transzlokátor (Arnt) és az induktor molekula által alkotott komplex szükséges hozzá. A sejtbe került induktormolekula asszociálódik az AhR-al, aminek hatására az leválik a Hsp90 (hősokk fehérje), (transzkripciòs faktor), a BTEB (basic transription element binding protein) az XAP2 (hepatitis B vírus asszociált fehérje) és a p23 fehérjékből álló komplexről (3). Az induktor-ahr komplex átjut a magmembránon, majd a nukleáris transzlokátor proteinnel aszociálódva az XRE-hez kapcsolódik és megnöveli, illetve beindítja a CYP1A1 gén transzkripcióját (89, 67). 13

14 5 3 NRE XRE GC TATA EX.I GRE GRE GRE EX.II Oct-1 CYP1A1 mrns SEJTMAG Arnt p23 XAP2 Hsp90 AhRR CYP1A1 induktor CITOSZOL AhR 3. ábra: A CYP1A1 gén indukciójának szabályzása. (AhR-aromás szénhidrogén receptor, Hsp90-hősokk fehérje, Arnt nukleáris transzlokátor, AhRR aromás szénhidrogén receptor represszor, XAP2-hepatitis B vírus asszociált protein). Ennek eredményeként a CYP1A1 fehérje szint is megnő a sejtben. E folyamatnak szab hatart egy fehérje, az AhRR, ami az endoplazmás retikulumban megjelenő CYP1A1 fehérje hatására aktiválódik és az Arnt-hez kapcsolódva megakadalyozza a további transzkripciót (95). 14

15 A génen belül helyezkedik el egy negatív szabályzò szakasz is (NRE), ami képes megkötni az Oct-1 nevű transzkripciós faktort és lassítani a gén átíródását (77). A CYP1A1 gén I. intron régiójában három GRE (glükokortikoid érzékeny szakasz) található (43), aminek nagy szerepe van az indukciós hatás módosításában, ugyanis képesek módosítani az XRE-hez kötődő induktor hatását. Patkányban a glükokortikoidok a glükokortikoid receptorhoz (GR) kötődve aktiválják a GRE szakaszokat és növelik az indukciós hatást. XRE nélkül a GRE nem képes önállóan indukciós hatást kiváltani (38) CYP1A2 A CYP1A2 szubsztrátjai közé tartozik pl. a fenacetin, koffein, etoxirezorufin, aromás aminok, a dohányfüst egyes komponensei (29). A 3-metilkolantrén és a TCDD, a dohányfüstben és a káposztafélékben található egyes vegyületek képesek indukálni a CYP1A2-t. A gén promoterében számtalan szabályzó szakasz van az XRE-n kívül. Szabályzása szintén az AhR-on keresztül történik hasonlóan a CYP1A1-hez, de a mechanizmus teljes egészében még nem tisztázott CYP2B A patkány genom két aktív CYP2B gént tartalmaz: CYP2B1 és CYP2B2. Szubsztrátjai közül ismertek: etilmorfin, kokain, metilén-dioximetamfetamin (Ecstasy) etoxikumarin, 6-aminokrizén, ciklofoszfamid, tesztoszteron (16α/β hidroxilezés). Számos vegyület képes indukálni (pl. fenobarbitál, fenitoin, DDT (diklòr-difenil-triklòretán), diallil-szulfid) (29, 73). A CYP2B szabályzása nem teljesen ismert, azonban miként, emberben, egérben és csirkében, patkányban is megfigyeltek a promoter előtti génszakaszon egy aktivitást fokozó (enhancer) régiót (PBRU; phenobarbital responsive unit), ami tartalmaz egy NF1 (nukleáris 15

16 factor 1) kötőhelyet és két nukleáris receptor kötő helyet (NR1 és NR2). A nukleáris receptor kötő helyeket egy 4 bázispárból álló szakasz, a DR4 választja el (4. ábra) és csupán egy bázisban különböznek a humán CYP2B6 gén megfelelő régiójától (78). Ezen kívül még valószínűleg számos transzkripciós faktor kötőhely van jelen. NF1 NR2 DR4 NR1 DR4 PBRU 4. ábra: A CYP2B gének szabályzó régiója patkányban. (NR1 és NR2 nukleáris receptor kötő helyek, NF1 nukleáris factor 1, PBRU fenobarbitál érzekeny szakasz). Patkányban a CYP2B indukciója nagyon hasonlóan megy végbe, mint emberben. Fenobarbitál okozta indukció esetén, az induktor egy foszforilációs kaszkádot indít el, amely a CAR sejtmagba kerülését idézi elő. A sejtmagba jutott CAR az RXR-el heterodimert képez és képes a PBRU régióhoz kapcsolódik (NR1 és NR2) és fokozza a CYP2B gének transzkripcióját (5. ábra) (97). A CAR/RXR heterodimer hatását fokozhatják olyan ko-aktivátor molekulák, mint amilyenek az SRC-1 (szteroid ko-aktivátor) és Sp1 (transzkripciós factor) (53). Ezek nemcsak az indukciós hatást, hanem a konstitutív kifejeződést is képesek befolyásolni. A CYP2B gének transzkripcióját a PXR (pregnán X receptor) is képes szabályozni 16

17 (ld. még t). A PBRU génszakaszhoz kötődik a PXR/RXR heterodimer (és ez által a PXR-hez kapcsolódó induktor) és fokozza a CYP2B gén átíródását, de a fő szabályzás a CAR/RXR segítségével történik (78, 25). Hsp90 Foszforiláció P CAR Sp1 SRC-1 P PBRU TATA INDUKTOR Defoszforiláció RXR CYP2B mrns PXR 5. Ábra: A CYP2B enzimek indukciójának mechanizmusa. (CAR konstitutív androgén receptor, RXR retinoid X receptor, HSP90 hősokk fehérje, PBRU fenobarbitál érzekeny szakasz, SRC-1 szteroid ko-aktivátor, Sp1 transzkripciós faktor, PXR pregnán X receptor) CYP2E1 A CYP2E1 enzim szubsztrátjai főképp kis molekula súlyú vegyületek, mint pl. alkoholok, aldehidek, kloroform, de számos gyógyszermolekulát is képes metabolizálni (paracetamol, klórzoxazon). Egyes prekarcinogén vegyületeket képes karcinogénné alakítani (nitrozaminok). A CYP2E1 enzimet számos molekula (etanol, aceton, dimetil-szulfoxid, izopropanol, pirazol és imidazol) indukálja (29). A CYP2E1 promoter régiójában lévő TATA box mellett még számos transzkripciós faktor kötőhely van [HNF1 kötőhely (hepatocyta nukleáris factor), az NFY-t 17

18 (nuklearis factor Y) kötő CCAAT-szakasz, IRE (inzulin érzékeny szakasz)] (83, 64). Számos endogén hormon (androgének, ösztrogének, növekedési hormon, inzulin) képes befolyásolni a gén átíródását, de a mechanizmus még nem teljesen tisztázott. A CYP2E1 gén embrionális korban inaktív, csupán születés után aktiválódik (84). A CYP2E1 génben a TATA box mellett, valamint az első exonban és intron szakaszban számos ponton metilálódhat. Embrionális korban, vagy a CYP2E1 transzkripció drasztikus csökkenésekor ezen régiók hipermetiláltak. A különböző endogen szabályzó molekulák, vagy egyes patofiziológiás állapotok (kóros éhezés, diabetes) során fellépő hormonális változások nemcsak DNS szinten, hanem (6. ábra) poszttranszkripciós szinten is hatnak azzal, hogy képesek növelni, vagy csökkenteni a CYP2E1 mrns féléletidejét. A transzkripciós szintű zabályzás csak az endogén hormonokra jellemző, xenobiotikumok jelenlétében a CYP2E1 enzim mennyisége és aktivitása főleg transzlációs és poszttranszlációs szinten szabályzott PO 4 P450 kináz CYP2E1 hem - ER PO 4 induktor hsp PO 4 Proteoszomális degradáció Lizoszomális degradáció 6. ábra: A CYP2E1 enzimek degradációjának mechanizmusa. (29, 32). A posztranszlációs szintű szabályzás a CYP2E1 fehérje stabilizálását jelenti (6. ábra). Ha nem kapcsolódik induktor molekula az aktív centrumhoz, akkor az enzimet egy P450 kináz foszforilálja; a foszforiláció következtében konformációváltozást szenved, aminek során elveszti hem csoportját. A megmaradt 18

19 apoprotein egy hősokk fehérjével (hsp) asszociálódva proteoszomális úton gyorsan degradálódik (11, 98). Amennyiben induktor molekula kapcsolódik az enzimhez, a fenti út gátlódik és az induktor stabilizálja az enzimet, ami miatt az több szubsztrátot képes átalakítani. Az enzim ugyan degradálódik, de ez a degradáció lassú, lizoszomális degradáció (29) CYP3A Patkány májban öt féle CYP3A enzimet lehet megkülönböztetni: CYP3A1, CYP3A2, CYP3A9, CYP3A18 és CYP3A23 (35). Kifejeződésük nem, szövet, faj és kor függő (88): például a CYP3A2 gén hím patkányokban az egész élet során aktív, míg nőstényekben csupán az embrionális korban van jelen (19). A CYP3A1 és a CYP3A18 expressziója hím patkányban figyelhető meg, viszont a CYP3A9 enzim mennyisége nőstény állatban tízszer nagyobb, mint a hímekben (2). A CYP3A enzimek nagyon sokféle eltérő szerkezetű vegyületet képessek metabolizálni (eritromycin, cyclosporin A, lidokain, nifedipin, etilmorfin, tammoxifen, verapamil, omeprazol). Legfontosabb endogén szubsztrátja a tesztoszteron (29). A CYP3A enzimet számos xenobiotikum: glukokortikoidok (dexametazon), rifampicin, fenobarbitál, eritromycin, troleandomycin indukálja CYP3A1 A CYP3A1 gén 30 kb hosszú és 13 exonból áll (54). CYP3A1 enzim nagyon kis mennyiségben van jelen a patkány májában, azonban nagymértékben indukálható különböző vegyületekkel (dexametazon, pregnenolon 16α-karbonitril). Nemcsak a májban, hanem más szövetekben is expresszálódik (8). A CYP3A1 indukciós mechanizmusában fontos szerepet játszik a PXR/RXR komplex, azonban maximális indukcióhoz egyéb transzkripciós faktoroknak is 19

20 aktiválódniuk kell COUP-TF (chicken ovalbumin upstream promoter factor) és a HNF-4 (hepatocyta nukleáris factor) (ld ) CYP3A2 A CYP3A2 gén is 13 exonból áll, azonban ellentétben a CYP3A1-el csupán hím patkány májában fejeződik ki és a pillanatnyi mennyisége az élet előrehaladtával változik CYP3A23 A patkánymájban jelen lévő CYP3A23 mind szubsztrát spektrumában, mind szabályzásában az emberi májban jelen lévő CYP3A4-nek felel meg. A CYP3A23 gén proximális szakaszában több féle szabályzó szakasz van (7. ábra). Ezek közül három képes glükokortikoid tipusú indukciót létrehozni: DexRE-1, DexRE-2 és az XREM; a site A nevű reszponzív elem egyéb faktorokat köt. DexRE-1 -TTAACTCAAAGGAGGTCA- DexRE-2 -TGAACTTCATGAACT- XREM -AGTTCATGAAGTTCA- 7. ábra: A CYP3A23 enzim génjében lévő reguláló szakaszok. 20

21 A dexametazon indukciót közvetítő PXR/RXRα komplex csupán a DexRE-2-höz képes kötődni. A DexRE-1 és a sitea kötőhelyek a COUP-TF és HNF-4 faktorokat kötik, amelyek főképp az alapaktivitás közvetítésére képesek (28). Alacsony glükokortikoid koncentráció esetén a sejtbe kerülő induktor csupán a glükokortikoid receptorokat (GR) képes aktiválni (8. ábra). Az aktivált GR serkenti a PXR és RXR átiródását, ami komplexet képezve képes a DexRE-2 génszakaszon keresztül aktiválni a CYP3A23 gén transzkripciót (26). A PXR/RXR komplex megkötésével DXM (< 10-7 M) PXR/RXR transzkripció DXM (> 10-7 M) GRE CAR/RXRα PXR/RXRα B komplex PXR/RXRα HNF-4 Dex-RE-1 DexRE-2 Site A XREM COUP-TF CYP3A23 mrna +1 TATA CAAT 8. ábra: A CYP3A enzim regulációja. (GR glucocortikoid receptor, COUP-TF chicken ovalbumin upstream promoter factor, RXR Retinoid X receptor, PXR pregnán X receptor, HNF-6, hepatocyta nukleáris factor 6, CAR konstitutív androsztán receptor, DXM dexametazon, PB fenobarbitál, RIF rifampicin). 21

22 a gátlást közvetítő COUP-TF disszociál a DexRE-2 szakaszról. A COUP-TF a Dex- RE-1-hez is képes kapcsolódni és kompetitíven gátolja a komplex B kötődését ehhez a reszponzív elemhez. A komplex B-t még eddig nem meghatározott transzkripciòs faktorok alkotják, amelyek a CYP3A23 gén aktiválásában vesznek részt. Magas dexametazon koncentráció esetén (10 µm) az induktor képes a PXR/RXR komplexet közvetlenül aktiválni és ezáltal kifejteni indukciós hatását, ami magasabb CYP3A23 expressziót eredményez, mint a GR receptoron keresztüli mechanizmus (27). Más reszponzív elemek is képesek módosítani a PXR/RXR komplex által létrehozott indukciót. Ilyen például az XREM, ami valójában egy PXR/RXR kötőhely (DR3) (94). Fenobarbitállal aktiválható CAR/RXR komplex a XREM-hez kötődve nem csak a CYP2B, hanem a CYP3A gének átíródását is képes növelni. Patkányban a reszponzív elemekben lévő ATGAACT szakaszhoz számos nukleáris receptor képes kapcsolódni, pl. D vitamin receptor (VDR), tiroxin receptor (TR), peroxiszóma aktivált receptor (PPAR), azonban ezek funkcionális jelentősége nem bizonyított (63) A májregeneráció folyamata Májregeneráció a partiális hepatectomia után A regeneráció egy szövet vagy egy szerv azon képessége, amelynek segítségével pótolni tudja a hiányzó (pl. partiális hepatectomiával eltávolított vagy más úton roncsolt) szöveti, szervi részeket (24). A legtöbb szervben nem figyelhető meg olyan regeneráció, amely sejtszám növekedéssel (hyperplasia) jár; ezekben csupán sejtnagyobbodás (hypertrophia) történik. A máj tulajdonságai eltérnek ettől: itt mindkét jelenség megfigyelhető. A májregeneráció folyamata nagymértékben függ a májeltávolítás módjától. Ha a sérülés nem túl nagy, a megmaradt hepatocyták és májban lévő őssejtek fognak 22

23 regenerálódni. A májban lévő őssejtek a Hering-csatorna környékén és az epevezeték mellett helyezkednek el (58, 20). Kétféle sejttípust képesek létrehozni: hepatocytákat és epevezeték sejtjeit (12). Amennyiben drasztikus sérülés áll fenn a szervezet képes a csontvelőben lévő őssejtek mozgósítására, amelyek tovább differenciálódnak májsejtekké (60). Patkányon végzett partiális hepatectomiát követően, amikor is a máj 2/3-a kerül eltávolításra, főleg a már meglévő hepatocyták fognak osztódni. Fiatal állatokban a hepatocyták 95%-a vesz részt a regenerációban, idősebb állatban ez az arány valamivel kisebb: nem annyira teljes, kevesebb hepatocyta vesz részt benne. A májsejtek a szervezet legdifferenciáltabb sejtjei közé tartoznak. Életük során nem sokszor osztódnak (kb.nyolcszor) és mitózisra 2x10 4 sejt közül csak egy képes (71). Hepatectomia után megváltozik a sejtek tulajdonsága és megindul a DNS-szintézis (13). Jelölt sejtek mennyisge (%) Hepatocyta Epevezetèk sejtjei Kupffer sejtek Szinuszoidális endothel sejtek A regeneráció ideje 9. ábra. A különböző sejttípusok DNS szintézisének kinetikája a regeneráció során (58). 23

24 A májrészek eltávolítása után először is megváltozik a sejtmembrán polaritása (Na + ionok áramlanak be a sejtbe) és megnövekszik a véráram. Egyes sejtek dedifferenciálódnak és bekerülnek G 0 fázisból az S fázisba és a DNS szintézis fokozódik. A sejtosztódás nem egy időben történik a különböző sejtekben (9. ábra). Először is a periportális régióban lévő hepatocyták osztódnak. A májparenchima főképp a megmaradt érhálòzat és epekapilláris köré szerveződik. Két nap elteltével már a pericentrális részekben is beindulnak az osztódási folyamatok. A májban többrétegű lemezek jönnek létre. Három nap múlva a periportális régióban nyalábszerű képletek keletkeznek. Ezek hepatocytából állnak. A májnyalábokbòl szerveződnek későbbiekben a máj lebenyei. A későbbiekben osztòdnak a Kupffer sejtek, majd organizálódnak az epe canalikusai az epevezeték sejtjeinek osztódásával. A máj új érhálòzata a májba áramlò endothel sejtekből szerveződik (50). A normális szöveti szerkezet helyreállításához egy hét szükséges. A májsejtek addig osztódnak, amíg a szerv el nem éri az eredeti nagyságot, térfogatot. A teljes mikromorfológiai szintű regeneráció kb. három hét alatt zajlik le (76) A regenerációban szerepet játszó faktorok A májsejtek osztòdását és a máj organizáciòjat szabályzò molekulák még nem teljesen ismertek. Nem ismert az a központi mediátor, aminek hatására a májsejtek dedifferenciálódnak és osztódni kezdenek, viszont számos faktorról bizonyosodott be, hogy képes befolyásolni a regenerációt. A májra ható endogén szabályzò molekulákat Michalopoulos nyomán három csoportra osztjuk (48, 49): 1. komplett mitogének: olyan faktorok, amelyek sejttenyészetben és szérum hiányában is képesek DNS-szintézist és mitózist előidézni (HGF (46), TGFα, EGF (47), TNF (1)). 2. növekedési inhibítorok: gátolják a proliferációt, DNS-szintézist, mitózist (TGF-β (13), IL-6 (4), INF-γ (77)). 24

25 3. növekedési triggerek (komitogének): nincs közvetlen proliferációs hatásuk, szerepük a komplett mitogének felerősítésében és az inhibitorok gátló hatásának csökkentésében van (szteroid hormonok (9, 16), IGF (64), inzulin (17)). A fenti felosztáson kívül jelentős szerepet játszanak még egyes immunszupresszív molekulák is pl. prosztaglandinok, valamint egyes protoonkogének, mint például a c- fos, c-jun és a c-myc (72, 74). Partiális hepatectomia után a megmaradt májsejteket számos hormonális hatás éri (pl. HGF, TNF-α, IL-6; lásd 10. ábra). A májregenerációt iniciáló lépések egyike az úgynevezett korai gének aktiválódása. Olyan általános transzkripciòs fehérjék szintetizálódnak, mint pl. az IGF-I, IGF-II, NF-κ B és STAT3, valamint a c-fos és c- jun faktorokból álló AP-1 komplex (50). Hepatocyta Kupffer sejt Mellèkvese Szinpatikus neuron U Brunner mirigy HGF U HGF receptor Pajzsmirigy Vèrá ram Extracellulá ris mátrix Inzulin Pankreász Noradrenalin 10. ábra: A regeneráció iniciálásáért felelős faktorok (50). 25

26 Ezek aktiválják pl a HGF átíròdását, ami a regenerációs folyamat egyik kulcs lépése (10. ábra). A HGF nagymértékben felelős a DNS-szintézis megindításáért a hepatocytákban. Ha a májba HGF-et juttatunk, a májsejtek osztòdni kezdenek. Ha a HGF-t tartalmazò infúziòhoz kis mennyiségű kollagenázt adunk, a májsejtek DNS szintézis sebessége még nagyobb lesz, ami annak a következménye, hogy a sejteket körülvevő mátrix felbomlásakor még több HGF szabadul fel (39). A májsejteket körülvevő extracelluláris mátrix nemcsak a kollagenáz hatására, hanem a partiális hepatectomia után is felbomlik. Először is aktiválódik az urokináz (upa) nevű proteolitikus enzim (44), ami egy foszforilációs kaszkádon keresztül aktiválja a plazminogén átalakulását plazminná, valamint bontja a biomátrixban jelen lévő laminin, entactin és fibronektin fehérjéket (33). A mátrix bontása során a benne lévő HGF felszabadul, és serkenti a májsejtek proliferációját. Az urokináz kapcsolódva a sejtfelületen lévő urokináz receptorhoz aktiválja a prehgf átalakulását HGF-é (50). A másik fontos regenerációt stimuláló faktor a Kupffer sejtekben termelődő TNFα, ami fokozza a DNS-szintézist és az IL-6 termelődését. A TNFα hatása főleg a kesőbbi regenerációs szakaszokban jelentős. A korai szakaszban fontos szerepet játszik még az EGF (epidermális növekedési faktor), noradrenalin, inzulin és a tiroid hormonok (50) Glükokortikoidok hatása a regenerációra A glükokortikoidok hatása a máj proliferációs folyamataira gyakorolt hatása már régen ismert. A glükokortikoid hatás jól modellezhető egy szintetikus glükokortikoiddal a dexametazonnal. A glükokortikoidok a hepatocytákban képesek a TNF-α stimulált DNS-szintézist és proliferációt serkentő hatását gátolni. Egyéb glükokortikoidok, mint a kortizon és hidrokortizon hasonló hatást mutattak. Más szteroidok, mint a progeszteron és β- estradiol nem befolyásolták a TNF-et. Az említett hatás dexametazon adás nélkül is jelen van, ugyanis a regenerációs folyamat kezdetén meginduló TNF-szekréció 26

27 következtében a központi adrenerg rendszeren keresztül megemelkedik a keringésben a glükokortikoidok szintje. Az ezúton nagyobb mennyiségben megjelenő glükokortikoidok képesek lesznek TNF szintézisét megakadályozni. Mivel a dexametazon előkezelés gátolja a TNF-stimulált in vitro hepatocyta proliferációt, ezért a glükokortikoidok lassítják a májregenerációt. Mivel a TNF segítségével szabályzott kémiai mediátorok (citokinek) szekréciója, a differenciálódás és sejtnövekedés szabályzásában is részt vesznek (pl. a máj regenerálódása, embriogenesis) az egész regenerálódási folyamatra hatással lesznek (70, 55, 56). A dexametazonnak ismertek a regenerációra gyakorolt egyéb hatásai is. A hepatocyták a májban gap junctionokkal és dezmoszómákkal kapcsolódnak egymáshoz. A regeneráció során a sejtek közti gap junction kapcsolódások nagymértékben lecsökkennek, a dezmoszomális kapcsolódás viszont megmarad. Különböző sejtproliferációt gátló ágensek hatására (dexametazon) a gap junctionok down-regulációja is lassul. Mivel a gap junctionok fő feladata differenciált sejtek esetében a sejtek közti kommunikáció, így dexametazon hatására a sejtek közti kapcsolat tovább megmarad (15) Glükokortikoidok hatása a P450 enzimekre A glükokortikoidok citokróm P450 enzimre gyakorolt reguláló hatása már régen ismert. Nemcsak endogén glükokortikoidok, hanem a dexametazon, vagy egyéb szteriodok is képesek befolyásolni a P450 enzimek aktivitását. Röviden összegezve a 2.2 fejezetben leírtakat: CYP1A enzim esetében a gén I. intronjában több GRE is megfigyelhető. A dexametazon önmagában nem képes indukálni a CYP1A enzimet, de amennyiben valamely CYP1A induktor mellett dexametazon is jelen van, fokozódik a gén átíródása (38). 27

28 A CYP3A enzim esetében a dexametazon már önmagában is képes indukálni. Kis koncentrációban a glükokortikoid receptoron keresztül hat; nagyobb koncentrációban pedig a PXR-hoz kötődve növeli a CYP3A enzim átíródását (63). Mivel a dexametazon számos nukleáris receptor mennyiségét fokozza a sejten belül (pl GR, PXR), így azon P450 enzimek indukciója fokozódik, amelyek indukciós mechanizmusa ezekhez a receptorokhoz kötött P450 enzimek szintjének változása a regeneráció során A P450 enzimek aktivitását számos patológiás állapotban (pl. cirrhosis, diabetes mellitus, hepatocarcinoma, hepatitis) befolyásolja. Ez valójában azzal magyarázható, hogy ilyen állapotokban a homeosztatikus egyensúly megbomlása számos hormon/transzmitter szint változásával, vagy a szövetet alkotó sejtek dedifferenciálódásával jár együtt. Májregeneráció során mindkét hatás érvényesül; mind hormonális, mind a megmaradt sejtek dedifferenciációja és folyamatos osztódása csökkenti a P450 enzimek mennyiségét. Irodalomból ismert, hogy a regeneráció során a P450 enzimeket bontó hem-oxigenáz mennyisége megnő, vagy a májban lévő nitrogén-monoxid-szintáz mennyiségének növekedése miatt a felszaporodó nitrogén-monoxid (NO) kapcsolódhat a P450 enzimek aktív centrumához, és ezáltal gátolhatja azok működését. A NO nemcsak a hem-hez tud kapcsolódni, hanem az apoprotein tiol-csoportjaihoz is és ez által növeli a degradáció sebességét. A májsejtek dedifferenciálódása miatt szintén csökkenhet a P450 enzimek mennyisége (75, 93, 31). A regeneráció során nemcsak a P450 enzimek alapaktivitása, hanem indukálhatósága is megváltozhat, mivel megváltozhat az indukciós mechanizmusban részt vevő faktorok mennyisége. Például a sejtosztódás során az RXR degradációja lassul. Hepatocarcinoma sejtekben kimutatták, hogy a nukleáris receptor foszforilációval stabilizálódik, ami növeli a transzaktivációs képességét, valamint elősegíti a sejtosztodást. A RXR számos, más nukleáris receptorral képes dimerizálódni pl. 28

29 (PXR, PPAR, CAR). Ezen heterodimerek pedig jelentős szerepet játszanak a P450 enzimek szabályzásában (lásd előző fejezetek) (45). Másrészt a CYP1A enzimek indukciós mechanizmusában (TCDD indukció) szerepet játszó AhR mennyisége is változást mutat a sejtciklus során (G 2 /M szakaszban csökken, Go és G 1 szakaszban pedig nő) (68). Az AhR-hoz számos aktiváló fehérje kapcsolódhat. Egyik ilyen koaktivátor a prb, ami defoszforilált formában képes kötődni a receptorhoz. Mivel a defoszforilált forma csupán a G és G 0 szakaszban van jelen, a CYP1A indukciója ebben a fázisban kifejezettebb, mint a G 2 /M fázisban (10). 29

30 3. Célkitűzések Munkám során négy P450 enzim csoportot (CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A) vizsgáltam. 1. A kísérletsorozat első részében a májregeneráció, valamint a májregeneráció és in vivo dexamethazon kezelés hatását figyeltük meg a patkány CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimeire. A következő kérdésekre kerestük a választ: Hogyan változik a CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek mennyisége és aktivitása a regeneráció korai periódusában (0-72h)? Hogyan hat egy szintetikus glükokortikoid, a dexametazon a fenti enzimek kifejeződésére a regeneráció során? 2. A kísérletsorozat második részében a CYP1A, CYP2E1 és CYP3A indukálhatóságát határoztuk meg. A májregeneráció során azt vizsgáltuk, hogy: Miként változik a fenti enzimek mennyisége és aktivitása specifikus induktoraik (CYP1A; 3-metilkolantrén, CYP2E1; imidazol, CYP3A; dexametazon) hatására regenerálódó májból izolált sejtekben? A kísérletekhez beállítottunk egy in vitro módszert a CYP2E1 indukciójának vizsgálatára májsejt kultúrában. Azt vizsgáltuk, hogy: a CYP2E1 enzim klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitása hogyan változik primer patkány és humán hepatocyta kultúrában az idő függvényében? a CYP2E1 indukciója hogyan változik különböző irodalomból ismert induktorok hatására (pirazol, aceton, etanol, i-propanol, dimetil-szulfoxid, imidazol)? 30

31 4. Módszerek 4.1. Használt vegyszerek és kísérleti állatok A dexametazont, 3-metilkolantrént, imidazolt, klórzoxazont, fenacetint, etoxiresorufint, marha szérum albumint, etoxikumarint, aminopirint, Williams` medium E-t, nutrient mixture F-12 (Ham)-t, inzulint, etilmorfint, glükagont, amfotericin B-t, glükózt, piruvátot, kollagenázt (Type IV), tripán kéket, EGTA-t a Sigma Chemie GmbH-tól (Deisenhofen, Germany) rendeltük. A vizsgálatainkban használt pentoxirezorufin a Boehringer Mannheim, GmbH (Germany) terméke. A következő vegyszerek: diklórmetán, acetonitril, dietiléter, glükóz-6-foszfát, glükóz- 6-foszfát-dehidrogenáz a Merck-től (Darmstadt, Germany) származtak. A fehérje kimutatásához használatos oldatot és filmet (ECL Western blot reagens, Hyperfilm TM ECL TM ) az Amersham Pharmacia Biotech-től (Buckinghamshire, England) rendeltük. A patkány CYP1A1 elleni antitest és a patkány CYP2B1/2 elleni antitest a Gentest Co. (Woburn, MA, USA) terméke. Az IgG elleni antitestek a Bio- Rad-tól (Hercules, CA, USA) származtak. CYP2E1 és CYP3A1 elleni antitesteket Magnus Ingelman-Sundberg professzortól (Karolinska Intézet, Stokholm, Svédország) kaptuk. Noretilmorfint Riedl Zsuzsanna (MTA KKKI) szintetizálta. Minden egyéb vegyszert a Reanaltól (Budapest) vásároltunk. Kísérleteinket g súlyú hím Wistar patkányokon (Toxicoop Safety Toxicological Study Center (Budapest)) végeztük, amelyet standard körülmények között tartottunk (25 O C, fényviszonyok 12h világosság, 12h sötétség). 31

32 4.2. Az állatok kezelése Az in vivo vizsgálatok során patkányokat kezeltünk p.o. 100 mg/kg dexametazonnal a partiális hepatectomiát megelőzően három napon keresztül. A dexametazont napraforgó olajos szuszpenzióban (100 mg/ml) gyomor szondán keresztül juttatuk az állatokba Partiális hepatectomia A partiális hepatectomiát Higgins és Anderson módszerével végeztük el (21). Az állatokat éterrel elaltattuk, majd a hasfal felnyitása után a máj 2/3-át eltávolítottuk. A műtéti stressz hatásának vizsgálatára áloperációt is végeztünk, ami kísérleteink során az állat hasfalának felnyitását, a máj felületének végigsimítását és a has visszazárását jelentette Májsejtpreparálás A műtétek során éteres altatást használtunk. A hasfal felmetszése után két érbe, a véna cava inferiorba és a véna portaeba kanült helyeztünk: a v. portae-ban lévő kanülön keresztül juttatuk a perfúziós folyadékot a májba, ami a máj átmosása után a véna cava inferioron keresztül távozott (6). A perfúzió célja a hepatocyták közötti sejtkapcsoló struktúrák megszüntetése, hogy végül májsejt szuszpenzióhoz jussunk. Első lépésként a májat kelátképzőt (EGTA) tartalmazó pufferrel átmostuk. Az EGTA komplexet képez a kálcium ionokkal, így a kálcium-függő sejtkapcsoló struktúrák megszünnek. Második lépésben a kelátképzőt kimostuk a májból. Végül kollagenázt és fiziológiás koncentrációjú kálciumot tartalmazó folyadékkal feloldottuk a sejtek közötti mátrixot és sejtkapcsoló strukturákat, így a sejtek elváltak egymástól (5, 52). A preparált sejteket Ferrini és mtsai (14) által leírt tápfolyadékban szuszpendáltuk és tripánkék festéssel meghatároztuk az élő sejtek számát. A kísérleteinket kizárólag 90%-nál magasabb életképességű sejtpreparátummal végeztük. A sejteket kollagénnel borított petricsészékbe helyeztük (4x10 6 sejt/petri 32

33 csésze) és 37 o C-on 5% CO 2 -n inkubátorban tartottuk. A sejteket különböző induktorokkal kezeltük 48 órán keresztül: dexametazon (10 µm) 3-metilkolantrén (3.7 µm) aceton (5mM, 50mM) etanol (10mM, 100mM) izopropanol (5mM, 50mM) dimetil-szulfoxid (5mM, 50 mm) pirazol (50µM, 500µM) imidazol (50µM, 500µM). 4.5 Mikroszóma preparálás Mikroszóma preparálás májszövetből A mikroszóma preparálás van der Hoeven és Coon módszere alapján történt differenciál centrifugálással (86). A májat izotóniás NaCl oldattal mostuk, majd ollóval összevágtuk. Ezután 1 mm EDTA-t és 0,15 M KCl-ot tartalmazó Tris-HCl pufferben (0.1M, ph 7.4) homogenizáltuk. A homogenizátumból centrifugálással eltávolítottuk a sejtmagot és a mitokondriumot (10 4 x g), majd a felülúszóból ultracentrifugálással (10 5 x g) kiülepítettük a mikroszóma frakciót. Ez után egy újabb tisztítási centrifugálás következett. Az üledéket a fenti pufferben szuszpendáltunk és ismét centrifugáltuk (10 5 x g). A fehérje koncentrációt Lowry és munkatársai módszere alapján mértük (40), standardként marha szérum albumint alkalmazva. A vizsgálatoknál használt mikroszóma mennyiséget a fehérje tartalom alapján adtuk meg. 33

34 Mikroszómapreparálás sejtekből Nemcsak májból, hanem kultúrában tartott sejtekből is történt mikroszóma preparálás. A petricsészében a kollagénmátrixhoz tapadt sejteket speciális kaparó segítségével lekapartuk és PBS oldattal (foszfàt puffert tartalmazó sóoldat) szuszpendáltuk. A sejteket jéghűtés mellett ultrahang segítségével tártuk fel, majd a fent már leírt módon mikroszómát preparáltunk belőle. A mikroszómák fehérjetartalmának meghatározását Lowry módszere szerint végeztük (40) P450 enzimaktivitások meghatározása P450 enzimek aktivitásának meghatározása specifikus szubsztráttal történt. Mind májsejtkultúrából, mind mikroszómából az alábbi módszerek segítségével mértünk aktivitást Etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás A CYP1A enzimek etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitását Burke és Thomson módszere alapján (7) határoztuk meg (11. ábra). A májszövetből nyert mikroszómához (0,4 mg fehérje/ml) 10 µm etoxirezorufint NADPH regeneráló rendszert (0.5 mm NADPH, 5 mm glükóz 6-foszfát, 3 mm MgCl 2, 1.2 unit/ml glükóz 6-foszfát dehidrogenáz) adtunk. A reakciót jéghideg metanollal állítottuk le, a kicsapódott fehérjéket centrifugáltuk, majd a felülúszóból fluorimetriássan meghatároztuk a keletkező metabolit (rezorufin) mennyiségét. N N CYP1A O etoxirezorufin O O HO Etoxirezorufin Etoxiresorufin-O-dealkiláz O rezorufin O 11. ábra: Az etoxirezorufin CYP1A enzimen keresztül történő metabolizmusa. 34

35 A sejtekből történő aktivitás meghatározás során 5µM rezorufinnal történt az inkubálás 10 µm dikumarol jelenlétében (47). A dikumarol gátolja a citoszólban lévő diaforáz enzimet, amely a rezorufint tovább alakítaná. Áz inkubációs idő elteltével az extracelluláris folyadékból meghatároztuk a termelődött rezorufin mennyiségét Pentoxirezorufin O-dealkiláz aktivitás A mikroszómális fehérjét (0,6 mg fehérje/ml) 10 µm pentoxirezorufinnal inkubáltuk a fejezetben leírt módszerhez hasonlóan (7) (12. ábra). N CYP2B N O pentoxirezorufin O O HO Pentoxiresorufin-O-dealkiláz Pentoxirezorufin O-dealkiláz O rezorufin O 12. ábra: Az pentoxirezorufin CYP2B enzimen keresztül történő metabolizmusa p-nitrofenol hidroxiláz aktivitás A CYP2E1 mikroszomális p-nitrofenol hidroxiláz aktivitását (13. ábra) Reinke és Moyer módszere alapján mértük (66). 20µM p-nitrofenol és 1.5 mg/ml fehérje és NADPH regeneráló rendszert (0.5 mm NADPH, 5 mm glükóz 6-foszfát, 3 mm MgCl 2, 1.2 unit/ml glükóz 6-foszfát dehidrogenáz) tartalmazó elegyben. A felülúszó lugosítása után (ph 12, 10N NaOH-al) a metabolit (4-nitro-katekol) mennyiségét fotometriássan határoztuk meg. 35

36 NO2 NO2 CYP 2E1 OH p-nitrofenol-hidroxiláz OH OH p-nitrofenol 4-nitro-katekol 13. ábra: A p-nitrofenol CYP2E1 enzimen keresztül történő metabolizmusa Klórzoxazon 6-hidroxiláz aktivitás A CYP2E1 enzim egyik szelektív szubsztrátja a klórzoxazon. A reakció során 6- hidroxi-klórzoxazon termelődik Az irodalomban leírt mikroszomális meghatározást (59) módosítva alkalmaztuk májsejt kultúrában. Sejtkultúrából történő aktivitás meghatározás során 4x10 6 sejtet 2.5 ml 400 µm klórzoxazont tartalmazó HBSS oldattal (Hank s balanced salt solution) inkubáltunk (14. ábra). Az inkubálás végén az extracelluláris folyadékhoz 17,2 µm fenacetint adtunk belső standardként, 0,34 M foszforsavval savanyítottuk, 3x5 Cl NH O O klórzoxazon KLÓRZOXAZON CYP2E1 Cl NH O O OH 6-hidroxi-klórzoxazon 14. ábra: A klórzoxazon CYP2E1 enzimen keresztüli metabolizmusa. ml diklórmetánnal extraháltuk, bepároltuk és 300 µl 40%-os acetonitrilben oldottuk. A termelődött 6-hidroxi-klórzoxazon mennyiségét HPLC-vel határoztuk meg (oszlop: 125x4mm, LiChrospher RP18 5µm, mozgó fázis: acetonitril: 0.2% foszforsav = 25:75 v/v, áramlási sebesség: 1 ml/perc, hullámhossz: 290 nm) Etoxikumarin O-dealkiláz aktivitás meghatározása Az etoxikumarin O-dealkilezésében több enzim vesz részt: CYP1A, CYP2B és CYP2E1. 4x10 6 sejtet 2.5 ml 150 µm etoxikumarint tartalmazó KHB (Krebs-Henseleit 36

37 puffer) oldattal inkubáltunk. Mivel a keletkezett metabolit (hidroxi-kumarin) a sejtekben gyorsan glükuronálódik, ezért a reakcióidő eltelte után az extracelluláris folyadék 1ml-ét β-glükuronidázal (1ml 0.1 M Na-acetát ph 4,4) emésztettük. Az emésztés célja a hidroxi-kumarin glükuronid konjugátumából való felszabadítása. A hidroxi-kumarin mennyiségét ph állítás után (ph 11) fluoriméterrel határoztuk meg (15. ábra). H 5 C 2 O CYP1A, CYP2B CYP2E1 O O O CYP2E1 O OH Etoxikumarin Etoxikumarin O-deetiláz Hidroxikumarin 15. ábra: Az etoxikumarin CYP1A, CYP2B és CYP2E1 enzimen keresztül történő metabolizmusa Aminopirin N-demetiláz A CYP3A egyik jelentős szubsztrátja az aminopirin, amelyből az enzim egy metil csoportot hasít le formaldehid képződése közben. A mikroszómális fehérje megfelelő mennyiségét (1mg/ml) 10 mm aminopirinnel inkubáltuk, a reakcóidő eltelte után a fehérjét centrifugálással eltávolítottuk, majd a képződött formaldehidet Nash-reagenssel (0.6% acetilaceton, 3.9 M ammònium-acetát) mutattuk ki (57). (16. ábra). A Nashreagens hozzáadása után a keletkezett komplex fotometriássan mérhető. C H 3 N C H 3 N O C H 3 C H 3 CYP3A C H 3 N C H 3 N O H C H 3 + HCHO - Aminopirin N-demetilaz Aminopirin Noraminopirin 16. ábra: Az aminopirin CYP3A enzimen keresztül történő metablizmusa. 37

38 Etilmorfin N-demetiláz A CYP3A egyik specifikus szubsztrátja az etilmorfin, amelyből az enzim egy metil csoportot hasít le (17. ábra). 4x10 6 sejtet 2,5 ml 1,77 mm etilmorfinnal (HBSS-ben oldva) inkubáltunk. Az inkubálás után az extracelluláris folyadékot a sejtekkel együtt lúgosítottuk (26µl 4N NaOH-dal), majd diklórmetán:izopropanol (85:15 v/v) elegyel extraháltuk. A szerves fázist bepároltuk és HPLC eluensben oldottuk. A noretilmorfin mennyiségét Hino és mtsai (23) módszere alapján, HPLC-vel határoztuk meg. HO HO O N CH3 CYP3A CYP3A O H N CH3 etilmorfin N-demetiláz O C 2 H 5 Etilmorfin O CH 2 H 5 Noretilmorfin 17. ábra: Az etilmorfin CYP3A enzimen keresztüli metabolizmusa P450 enzimek kimutatása immunoblot (Western blot) technikával A Western blot technika egy olyan elválasztás és kimutatási módszer, melynek során a mikroszomális fehérjéket gélelektroforézissel elválasztjuk, majd a fehérjék nitrocellulóz membránra való juttatása után az egyes fehérjék kimutatása az adott enzimre specifikus antitestek segítségével történik. Patkány máj mikroszómából, illetve hepatocyta kultúrából preparált mikroszómákból meghatároztuk az illető enzim fehérjemennyiségét (87). 38

39 A gélelektroforézis SDS-poliakrilamid gélben (7,5%-os), Laemmli módszere alapján történt (36). A mikroszomális fehérjéket denaturáltuk, így az elválasztás csupán a fehérjék méretétől függött. A gélben elválasztott fehérjéket elektromos térben nitrocellulóz membránra vittük át. A nitrocellulóz lapra került fehérjék elhelyezkedése és koncentrációja ugyanolyan, mint a gélben volt. Az elektromos cellában a membrán mindig az anód felöli részhez kerül, ugyanis az SDS-el denaturált fehérjék negatív tölktésűek (80). Antigén-antitest reakción alapuló detektálással néhány aminosavban különböző izoenzimek (pl P450 enzimek) is szelektíven kimutathatók. Az immundetektálás során két antitestet (primer és szekunder) használunk, melyekből az utóbbihoz tormaperoxidáz van kapcsolva. A következő patkány P450 enzimek ellen termeltetett ellenanyagokat használtuk: CYP1A1: kecskében előálított anti-patkány-cyp1a1 CYP2B1/2: kecskében előálított anti-patkány-cyp2b1/2 CYP2E1: nyúlban előálított anti-patkány-cyp2e1 CYP3A1/2: nyúlban előálított anti-patkány-cyp3a1/2. Szekunder ellenanyagként a következő tormaperoxidázzal konjugált ellenanyagokat alkalmaztuk: Anti-CYP1A1 és anti-cyp2b1/2-hez: nyúlban előállított anti-kecske IgG Anti-CYP2E1 és anti-cyp3a1/2: kecskében előállított anti-nyúl IgG. A kialakult antigén-primer antitest-szekunder antitest komplexhez hozzáadtuk a tormaperoxidáz szubsztrátját, a luminolt. Az enzimreakció során felvillanó fényt fényérzékeny filmmel rögzítettük (ECL Hyperfilm, Amersham). A filmen megjelenő foltok mind kvalitatív, mind kvantitatív kimutatásra is jók (61). 39

40 5. Eredmények és értékelésük 5.1. P450 enzimek aktivitása regenerálódó patkány májban A regeneráció P450 enzimekre gyakorolt hatását először von der Decken és Hutlin vizsgálta 1960-ban (85). A későbbiekben számos közlemény jelent meg ezzel kapcsolatban (23, 62, 34), amelyek azt tükrözik, hogy a P450 enzimek aktivitása és fehérjemennyisége nagymértékben lecsökken a regeneráció során. Nemcsak a P450 enzimek feherjemennyisége, hanem az mrns szintek is jelentősen csökkennek (42, 81). Kísérleteink során vizsgáltuk, hogy a máj P450 enzimaktivitásai és az egyes P450 izoenzimek mennyisége hogyan alakul a májregeneráció kezdeti szakaszában. Partális hepatectomiát követően 72 órás regenerációs periódus alatt (0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 72 óra) meghatároztuk a CYP1A, CYP2B, CYP2E1 és CYP3A enzimek aktivitását és enzimfehérje mennyiségét. Minden időpontban négy állat eredményeiből átlagoltunk. A vizsgálatok önkontrollosak voltak, ami azt jelenti, hogy a kapott enzimaktivitásokat minden állat esetében a műtétileg eltávolított májszövetből mért alap aktivitásra (100%) vonatkoztattuk. Minden regenerációs időpontban meghatároztuk az áloperált állatok enzimaktivitásait is. Az áloperált állatok enzimaktivitásai nem különböztek a normál májlebenyekből mért értéktől, ami arra utal, hogy az éterrel történő altatás és a műtéti stressz nem befolyásolta az enzimaktivitásokat. A CYP1A enzimek etoxirezorufin O-dealkiláz aktivitása enyhe csökkenést mutatott az első 6 órában, 12 órával a partiális hepatectomia után azonban az enzimaktivitás visszatért az eredeti szintre (18. ábra). A CYP1A1 fehérje szintén csökkenést mutatott a regeneráció 3. és 6. órájában és mennyisége csak a 12 órában emelkedett a kiindulási szintjére (22/A ábra). A CYP2B enzimek pentoxirezorufin O-dealkiláz aktivitása szignifikánsan csökkent az első 6 óra során, majd 12. órában visszatért a kiindulási értékre. A 24. és 36. órában azonban az aktivitások lecsökkentek és az enzim 72 órás regenerációs idő alatt nem érte el a kiindulási állapotot (19. ábra). A CYP2B1/2 enzim fehérje mennyisége az első 12 órában nem változott, azonos volt a kontroll (0h) értékkel. A 24 és 36. órában azonban jelentős csökkenést mutatott (22/A ábra). 40