A keresztesvirágúakat fertőző dohány mozaik vírus replikáz alegysége, a p122 fehérje RNS silencing szupresszor

Átírás

1 EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR A keresztesvirágúakat fertőző dohány mozaik vírus replikáz alegysége, a p122 fehérje RNS silencing szupresszor Doktori értekezés tézisei Csorba Tibor Levente Ph. D. program: Klasszikus és Molekuláris Genetika, Biologia doktori iskola Program vezetője: PROF. DR. OROSZ LÁSZLÓ Dsc, az MTA levelező tagja Biológia doktori iskola vezetője PROF. DR. ERDEI ANNA Dsc, az MTA levelező tagja Témavezető: DR. BURGYÁN JÓZSEF Dsc, az MTA doktora Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, GÖDÖLLŐ 2009

2 Bevezetés és célkitűzés: Az RNS interferencia (RNA interference, RNAi) az eukariótákban konzervált jelenségcsoport, mely során a nem transzlálódó RNS molekulák negatív regulátor szerepet töltenek be a sejt fehérjekészletének poszttranszkripciós szintű szabályozásában befolyásolva a messenger RNS-turnovert illetve a transzláció folyamatát. Az RNAi szerepet játszik egyrészt a génregulációban, stresszválaszokban másrészt a genom védelmét szolgálja önző genetikai elemek (transzpozonok, transzgének) és vírusok inváziójával szemben. A folyamat központi molekulái a nukleotidból álló, 3 végükön 2 nukleotid túlnyúló régióval rendelkező kis interferáló RNS-ek (small interfering RNS, sirns) (Hamilton & Baulcombe 1999) és mikró RNS-ek (mirns) (Bartel 2004) (lásd a modellt a 7. oldalon). Ezek prekurzorai kétszálú RNS-ek (doublestranded RNA, dsrns) (ez lehet duplaszálú RNS v. erős másodlagos szerkezettel rendelkező egyszálú RNS), melyekből RNáz III típusú endoribonuklázok, a Dicer típusú enzimek (DCL) érlelik őket (Bernstein et al., 2001). A sirnsek és mirnsek a HUA ENHANCER1 (HEN1) enzim működése révén 3 végükön metilálódnak (Li et al., 2005), majd a duplex érett szála az RNS-indukálta silencing komplexbe (RISC) épül be, míg az ellentétes orientációjú csillag szál (*) lebomlik (Schwarz et al., 2003, Khvorova et al., 2003). Az így programozott RISC komplexben a sirns a szekvenciaspecifikusságért, a RISC központi fehérjéje, az Argonauta (AGO) pedig a homológ RNSek vágásáért ( slicing ) vagy bizonyos esetekben transzlációs gátlásáért felelős (Bartel 2004, Brodensen et al., 2008). Az RNAi válaszban a sirnsek amplifikációját az RNS-dependens RNS polimerázok (RdRP) végzik (Vazquez, 2006). A sejtben megjelenő aberráns RNS-ek, vagy az RdRP komplexbe épült sirnsekkel homológ RNSek az RdRP enzimkomplex aktivitása révén dsrnsekké alakulnak. A dsrnsekből a DCL enzimek másodlagos sirnseket termelnek, melyek újabb RISC komplexeket képesek programozni. Az amplifikációs folyamat révén az RNAi válasz sokkal hatékonyabbá válik (lásd a modellt). Már a korai vizsgálatok rámutattak arra, hogy az RNAi egyik fő feladata a vírusfertőzések elleni védelem. Virális eredetű szekvenciák transzgénikus növényben való kifejeztetése, RNS lebontása által, védelmet biztosít az azokkal homológ vírusok ellen (Linbdo et al., 1992). Azt is kimutatták, hogy az RNSmediálta antivirális védekezés természetes körülmények között is lejátszódik (Ratcliff et al., 1997). A későbbiekben, olyan virális fehérjéket azonosítottak, melyek képesek az RNAi alapú növényi védelmet kikapcsolni, ezek az RNS silencing szupresszorok (Kasschau & Carrington 1998). RNS silencing szupresszorokat növényi és állati vírusok is kódolnak (Silhavy & Burgyán, 2004; Baulcombe et al., 2004; Li & Ding, 2005). A dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic virus, TMV) sokat tanulmányozott, a biológia számos területén használt modelll organizmus. Bár korábbi kísérleti eredmények utaltak rá, nem volt ismert az RNS silencing szupresszor fehérjéje és az a mechanizmus sem, mely segítségével kikapcsolja a növény 2

3 védelmi rendszerét. Munkánk során a TMV silencing szupresszor azonosítását és hatásmechanizmusának jellemzését tűztük ki célul. Kísérleteinkhez a keresztesvirágúakat fertőző TMV törzset (crucifer-infecting TMV, cr-tmv) használtuk. A vírusgenom 4 fehérjét kódol: a 122 kda (p122) és 178 kda (p178) replikáz kis és nagy alegységei, a 29 kda mozgásért felelős fehérje (movement protein, MP) és a 18 kda köpenyfehérje (coat protein, CP). Korábbi kísérletek utaltak arra, hogy a replikáz kis alegysége lehet a TMV silencing szupresszora. A TMV-OM törzsében a heterodimér replikáz komplexben a p126 (a crtmv p122 homológja) és a p183 (a p178 homológja) a fehérjék sztöchiometriai aránya 1:1, azonban a p126 fertőzés során tízszer nagyobb mennyiségben van jelen. A p126 többletnek a biológiai szerepét nem sikerült tisztázni (Watanabe et al., 1999). A TMV-L törzs esetében a p126 amber stop kodonja tirozin kodonra való cseréje után, mely esetén csak a p183 fehérje képződik, a vírus szaporodásra és szisztemizálódásra volt képes, bár tízszer gyengébben a vad típusú vírusnál (Ishikawa et al., 1986). Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy a replikáz kis alegysége a replikáz funkció mellett egy másik fontos szerepet is betölt. A paradicsom mozaik vírus (Tomato mosaic virus, ToMV) esetében bizonyították, hogy a p122 homológja, a p130 silencing szupresszor aktivitással bír, de a működés molekuláris mechanizmusa nem került leírásra (Kubota et al., 2003). Munkánkban azonosítottuk és jellemeztük a cr- TMV vírus szupresszorát. Anyag és módszer Vírusfertőzés Agrobaktérium infiltráció Northern blot analízis Western blot analízis Gél mobility shift assay Gél kromatográfia Natív gél electroforézis Drosophila heterológ in vitro RNA silencing rendszer β-elimináció 3

4 Eredmények és következtetések: 1. A cr-tmv replikáz alegysége, a p122 in vivo silencing szupresszor aktivitással bír. N. benthamiana növényben expresszált transzgén GFP mrns ellen erős RNAi válasz indul be, mely a GFP mrns és fehérje szint csökkenésében v. annak teljes eltűnésében nyilvánul meg. GFP transzgén ellen indukálódott RNAi válasz gátlódott a p122 fehérje jelenlétében. A p122 hatása DCL aktivitástól downstream, de RdRP aktivitástól upstream nyilvánul meg, mivel a p122 jelenlétében a GFP-eredetű elsődleges sirnsek képződése zavartalan, de a másodlagos sirnsek képződése gátolt. cr-tmv vírusfertőzés során a p122 nem képes gátolni a sirns érést in planta: nagy mennyiségű 21nt hosszú virális-sirns halmozódik fel. 2. A p122 a már felépült RNAi effektor komplex (RISC) aktivitását nem gátolja Drosophila embrió natív kivonatában nyomon lehet követni a RISC komplex felépülését szintetikus jelölt sirns hozzáadásával. Ha a jelölt sirnsekkel egyidőben p122 fehérjét is adunk az in vitro rendszerbe, a RISC komplex összeszerelődése megreked (direkt kompetíció), de ha a p122 fehérjét késleltetve adjuk a reakcióelegyhez (10 perccel később, indirekt kompetíció), a RISC komplex felépül. A p122 a már felépült RISC aktivitását nem volt képes gátolni, a RISC elvágta a felajánlott homológ régióval rendelkező jelölt target RNS molekulákat, melyek vágástermékét méret alapján azonosítottuk. 3. A p122 nem gátolja a RISC aktivitást in planta A GFP mrns 3 nem transzlálódó régiójában mirns ill. vírus-sirns célszekvencia (target) helyeket építettünk be. Ezeket a konstrukciókat a növényekben felépülő mirnsekkel ill. vírusfertőzött növényekben virális-sirnsekkel programozott RISC komplexek (mirisc ill. sirisc) képesek lebontani. A p122 szupresszor a már jelen lévő mirisc és sirisc aktivitást nem volt képes gátolni. 4. A p122 fehérjének erősen méretspecifikus sirns kötő képessége van in vitro Növényekben ektopikusan expresszáltattuk a p122 fehérjét, majd ezen növények natív kivonatainak RNS kötő aktivitását teszteltük in vitro gel mobility shift assay kísérletekben. A kísérletek lényege, hogy fehérje-rns interakció esetében az RNS mobilitása a gélben lelassul. A p122-t termelő levélkivonat nem mutatott affinitást az egyszálú RNS molekulákkal szemben, függetlenül azok méretétől. Nagy affinitással kötötte viszont a 2nt 3 túlnyúló 21nt hosszú duplaszálú tipikus sirnseket. Az RNS mérete és 3 túlnyúló régiói nagyon fontosak a kötés kialakulásában: a kötés erősség csökkent a 19nt illetve a 21nt hosszú, túlnyúló végekkel nem rendelkező dsrns formák iránt. A 24nt hosszú sirnseket gyengén, a 19nt (17+2), 26nt (24+2) és 49nt (47+2) 2nt 3 -túlnyúló régióval rendelkező dsrns-eket egyáltalán nem kötötte. Mivel a TMV sirns-ek 21nt hosszúak, az eredmények arra utalnak, hogy a vírus-gazda koevolució során a p122 fehérje sirns-kötő méretspecifikussága az antivirális silencing gátlásárt szolgáló adaptáció eredménye. 4

5 5. A cr-tmv nagy replikáz alegysége, a p178 fehérje nem szupresszor Mivel a cr-tmv genomban a p122 és a p178 fehérjéket átfedő ORFek kódolják (a p122 replikáz kis alegység amber stop kodonjának átolvasása során transzlálódik a p178 replikáz nagy alegység) in vitro teszteltük a p178 RNS molekulák iránti affinitását. Képtelenek voltunk a p178-at növényben termeltetni, ezért vírusfertőzött növény natív kivonatával dolgoztunk. A vírusfertőzött kivonatokban (a p122 és p178 együtt van jelen) azonos mobilitású a fehérje-sirns komplexek voltak jelen, mint a p122-t expresszáló kivonatokban. A p122 mutáns cr-tmv- p122 fertőzőtt kivonattal végzett gel mobility shift assay során nem találtunk sirns kötési aktivitást. Ezek a megfigyelések arra utaltak, hogy a vírus replikáz nagy alegysége, a p178 fehérje nem játszik szerepet a sirns kötésben. Gélkromatográfiában a cr-tmv vírusfertőzött kivonatban a sirns-fehérje komplex mérete 108,4 kda. Ez a p122 monomér-sirns komplexnek feleltethető meg (a sirns szabad formában 7 kda), hiszen a p178-sirns vagy a p178-p122-sirns fehérjekomplex mérete ennél jóval nagyobb tartományban várható. Ezek az eredmények teljes mértékben kizárják a p178 fehérje szerepét az RNAi során és alátámasztják azt a feltételezést, hogy a p122 az egyetlen cr-tmv silencing szupresszor. 6. A p122 gátolja a mirns-mediálta endogén RNAi útvonalakat A cr-tmv fertőzött növény tünetei a mirns útvonalban mutáns növények (Palatnik et al., 2003) illetve a silencing szupresszor fehérjéket termelő növények (Dunoyer et al., 2004) tüneteihez hasonlítanak. Mivel a sirns és a mirns duplexek nagyon hasonló szerkezettel rendelkeznek a p122 képes lehet a mirns duplexek kötésére, mely részben magyarázhatná a vírusfertőzés tüneteit. Teszteltük a p122 mirns duplexek (mirna/mirna*) iránti affinitását in vitro: a p122 közel azonos erősséggel kötötte a szintetikus mir171a, mir171b, mir171c duplex molekulákat, mint a valódi sirns szerkezetű (sir171 sirna) (Kr=1) formát. Vírusfertőzés során a p122 in vivo stabilizált több tesztelt mirns-t és mirns*-t, feltehetően p122-mirna/mirna* komplex formájában (nemfertőzött növényekben a mirna* gyorsan degradálódik). Bár vírusfertőzés során nagy mennyiségű mir168/mir168* volt jelen, a mir168 target mrnse (Argonaute1) nem csökkent, sőt drasztikusan megemelkedett, ami a mir168 aktivitásának hiányával magyarázható (Vaucheret et al., 2004). 7. A p122 gátolja a sirnsek és a mirnsek 3 metilációját A sirnsek és a mirnsek érésüket követően 3 végükön metilációval stabilizálódnak. A metilációt végző HEN1 enzim működésének lokalizációja nem ismert. Mivel a p122 köti a mirns és sirns duplexeket, megvizsgáltuk vírusfertőzött A. thaliana növényi kivonatokból származó sirnsek és mirnsek metilációját: a sirnsek teljes, a mirnsek részleges metilációja volt megfigyelhető a vírusfertőzött kivonatokban, míg a mock-inokulált kivonatokban a mirnsek teljesen metiláltak voltak. A részleges metiláltsági szint arra enged következtetni hogy a HEN1 metiltranszferáz a sejtmagban is a citoplazmában is aktív. Lokalizációjából adódóan a p122 kizárólag a citoplazmás 5

6 aktivitást képes gátolni. A vírus azon képessége, hogy a mirns-ek metilációját részlegesen gátolja, arra enged következtetni, hogy a mirns-ek metilált és nem-metilált formában is kiszállítódhatnak a magból a citoplazmába. Kizárható egy másik metiltranszferáz részvétele a mirns metilációs folyamatokban, mivel a hen1-1 növényekben (HEN1 metiltranszferáz null mutáns növény) sem a sirns-ek sem a mirns-ek nem metilálódnak. Ez eddig nem volt észlelhető, mivel a nem-metilált mirnsek/sirnsek gyorsan lebomlanak, jelen esetben a szupresszor stabilizálja őket, feltehetőleg p122-mirns/mirns* komplex formájában. 8. A p122 fehérje az RNAi választ a sirns és mirns duplexek silencing rendszerből való kivonásával gátolja. Ez egy nagyon hatékony és eltérő víruscsaládok szupresszorai által széles körben alkalmazott stratégia. Összegzés Munkánk során bizonyítottuk, hogy a cr-tmv vírus silencing szupresszora a p122. Ennek hatásmechanizmusa nagyon hasonlít az általunk korábban jellemzett vírusszupresszorok működésére (Lakatos et al., 2006, Csorba et al., 2007). A tombusvírusok által kódolt p19, a potyvírusok által kódolt HC-Pro, a closterovírusok p21 fehérjéje és a tobamovírusok p122 szupresszorának működési elve azonos: kivonják a sirnseket a silencing rendszerből ezáltal megakadályozva az antivirális RISC komplexek felépülését, a sirns-ek az RdRP komplexbe való beépülését és a sirns amplifikációt. A virális és endogén sirnsek ill. a mirnsek közötti fizikai hasonlóság következtében a vírus szupresszorok az endogén silencing útvonalakat is megzavarják. Ez a folyamat valószínűleg hozzájárul részben a vírustünetek kialakulásához. Sem a sirns-ekkel sem a mirns-ekkel pre-programozott RISC komplexek aktivitását nem képesek ezek a szupresszorok gátolni. Ennek eredményeképpen az antivirális silencing szupresszió azonnali, de hatása az endogén útvonalakra késleltetett (a töltött RISC komplexek életideje 2,5-3 nap, Csorba et al., beküldött kézirat). 6

7 A cr-tmv p122 szupresszor hatásmechanizmusa: A különböző forrásokból származó RNSek duplaszálú régióiból a DCL enzimek sirnseket ill. mirnseket érlelnek. Ezek, a HEN1-mediálta 3 metilációt követően, beépülnek a RISC effektor komplexekbe és a homológ RNSek degradációját okozzák. A sirnsek részt vehetnek egy amplifikációs lépésben, az RdRP komplexekbe épülve további dsrns és végső soron másodlagos sirnsek képződését idézik elő. A p122 a DCL aktivitástól downstream hat, megköti a metilált és metilálatlan mirns és sirns duplexeket, ezáltal megakadályozva az új RISC ill. az RdRP komplexek képződését. Irodalomjegyzék: Baulcombe, D RNA silencing in plants. Nature 431: Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature Jan 18;409(6818): Brodersen P, Sakvarelidze-Achard L, Bruun-Rasmussen M, Dunoyer P, Yamamoto YY, Sieburth L, Voinnet O. (2008) Widespread translational inhibition by plant mirnas and sirnas. Science May 30;320(5880): Dunoyer, P., C. H. Lecellier, E. A. Parizotto, C. Himber, and O. Voinnet Probing the microrna and small interfering 7

8 RNA pathways with virus-encoded suppressors of RNA silencing. Plant Cell 16: Hamilton AJ, Baulcombe DC. (1999) A species of small antisense RNA in poszttranscriptional gene silencing in plants. Science Oct 29;286(5441): Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD. (2003) Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell Oct 17;115(2): Ishikawa, M., T. Meshi, F. Motoyoshi, N. Takamatsu, and Y. Okada In vitro mutagenesis of the putative replicase genes of tobacco mosaic virus. Nucleic Acids Res 14: Kasschau, K.D. and Carrington, J.C. (1998) A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of poszttranscriptional gene silencing. Cell 95, Kubota, K., S. Tsuda, A. Tamai, and T. Meshi Tomato mosaic virus replication protein suppresses virus-targeted poszttranscriptional gene silencing. J Virol 77: Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. (2003) Functional sirnas and mirnas exhibit strand bias. Cell Oct 17;115(2): Lakatos, L., T. Csorba, V. Pantaleo, E. J. Chapman, J. C. Carrington, Y. P. Liu, V. V. Dolja, L. F. Calvino, J. J. Lopez-Moya, and J. Burgyan Small RNA binding is a common strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors. Embo J 25: Li HW, Ding SW (2005) Antiviral silencing in animals. FEBS Lett 579: Junjie Li,1 Zhiyong Yang, Bin Yu, Jun Liu, Xuemei Chen (2005) Methylation Protects mirnas and sirnas from a 3_-End Uridylation Activity in Arabidopsis Curr Biology, Vol. 15, , Lindbo JA, Dougherty WG. (1992)Pathogen-derived resistance to a potyvirus: immune and resistant phenotypes in transgenic tobacco expressing altered forms of a potyvirus coat protein nucleotide sequence. Mol Plant Microbe Interact Mar- Apr;5(2): Palatnik, J. F., E. Allen, X. Wu, C. Schommer, R. Schwab, J. C. Carrington, and D. Weigel Control of leaf morphogenesis by micrornas. Nature 425: Ratcliff, F. et al. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276, Silhavy, D., and J. Burgyan Effects and side-effects of viral RNA silencing suppressors on short RNAs. Trends Plant Sci 9: Vazquez F. (2006) Arabidopsis endogenous small RNAs: highways and byways Trends Plant Sci 11(9): Vaucheret H., F. Vazquez, P. Cre te and D. P. Bartel (2004) The action of ARGONAUTE1 in the mirna pathway and its regulation by the mirna pathway are crucial for plant development Watanabe, T., A. Honda, A. Iwata, S. Ueda, T. Hibi, and A. Ishihama Isolation from tobacco mosaic virusinfected tobacco of a solubilized template-specific RNA dependent RNA polymerase containing a 126K/183K protein heterodimer. J Virol 73: A PhD dolgozathoz kapcsolódó közlemények Csorba T, Bovi A, Dalmay T, Burgyan J. (2007) The p122 subunit of Tobacco mosaic virus replicase is a potent silencing suppressor and compromises both sirna and mirna mediated pathways. J Virol. 2007, 81(21): IF: 5,332 8

9 L Lakatos, T Csorba, V Pantaleo, E J Chapman, J C Carrington, YP Liu, VV Dolja, L F Calvino, J J Lopez-Moya and J Burgyan: (2006) Small RNA binding is a common strategy to suppress RNA silencing by several viral suppressors, EMBO J. 25(12): IF: 10,086 Egyéb közlemények T. Csorba, R. Lózsa, J. Burgyán (2009) Polerovirus protein P0 targets unloaded Argonaute1 for degradation (kézirat) Laporte P., Satiat-Jeunemaitre B., Velasco I., Csorba T., Campalans A., Burgyán J., Arevalo M. and Crespi M.(2008) A small nodulin is a novel RNA-binding protein required for rhizobial release in the M. truncatula-s. meliloti symbiotic interaction (beküldött kézirat) Lózsa R., Csorba T., Lakatos L., Burgyán J. (2008) Inhibition of small RNAs methylation in virus infected plants requires spatial and temporal co-expression of small RNAs and the viral silencing suppressor proteins. Nucleic Acids Res. 36(12): IF: 6,954 Molnár A., Csorba T., Lakatos L., Várallyay É., Lacomme C. & Burgyán J.: (2005) Plant Virus- Derived Small Interfering RNAs Originate Predominantly From Highly Structured Single-Stranded Viral RNAs, J Virol. 79(12): IF: 5,332 Tudományos tevékenység (előadások, poszterek) Tibor Csorba, Lózsa Rita, József Burgyán Polerovirus protein P0 targets unloaded Argonaute1 for degradation (poszter) SIROCCO meeting Dec. 2008, Hinxton, Cambridge, UK. Pantaleo V., Csorba T., Burgyán J.: Mechanism of viral targeting by virus induced gene silencing (poszter) Keystone symposia, RNAi and Related Pathways, Jan. 2006, Vancouver, British Columbia. Csorba T., Lakatos L., Pantaleo V., Burgyán J.: Characterization of the RNA Silencing Suppressor p21 Encoded by Beet Yellows Virus, (poszter) RNAi meeting, 11 Nov. 2005, Turin, Italy. The 1th Congress of the International Society for Applied Phycology and 9th International Conference on Applied Algology Aquadulce, Roquetas de Mar Almeria, Spain May 2002 (Fodorpataki L., Marton A. & Csorba T.: Metabolic recovery of algal cells in polluted water in the presence of vitamin U) The 1th Congress of the International Society for Applied Phycology and 9th International Conference on Applied Algology Aquadulce, Roquetas de Mar Almeria, Spain May 2002 (Fodorpataki L., Marton A. & Csorba T.: Photosynthetic recovery of two Scenedesmus species exposed to photoinhibition and heavy metal pollution) III. Day of Biology, Cluj-Napoca, Romania, Apr (Marton A. & Csorba T.: Zöldalga tenyészetek termelékenységének szabályozási lehetőségei vegyi tényezők által) Sesiunea stiincifica actualitati in biologia vegetala Editia a X-a, BBU Cluj-Napoca, Romania: Fodorpataki L., Marton A. & Csorba T.: 2002 (Evidentierea antistress ale sulfoniului de metil-metionina prin intermediul fluorescentei clorofiniene induse in culturi de celule algale) Eleventh Algological Meeting, Pécs, Hungary, Apr (Fodorpataki L., Marton Attila & Csorba T.: Photosynthetic recovery of two Scenedesmus species exposed to photoinhibition and heavy metal pollution) 9

10 Annual Meeting of Science and Matemathical section of Erdélyi Múzeum Egyesület, Cluj-Napoca, Romania, 27 Oct (Csorba T., Marton A & Fodorpataki L.: Környezetszennyező anyagok által kiváltott válaszreakciók zöldalga sejttenyeszetekben) ETDK, Cluj-Napoca, Romania 7-8 Dec (1st PRIZE) (Csorba T. & Marton A.: Egy kevésbé ismert bioaktív anyag, az U vitamin élettani hatásai algasejtek anyagcseréjében stresszkörülmények között) Pályázatok: Identification of Endogenous and Antiviral RISC complex component proteins in plants (Csorba Tibor), EMBO Short Term Fellowship, , University of Dundee, Dundee, UK, Gy. Hutvágner lab , EMBO organization, EU. Characterization Of Molecular Mechanisms of Viral RNA Silencing Suppressor Proteins (Csorba Tibor) National PhD Grant for Offboard Hungarians, , Ministry of Education, Hungary. Studies on the Molecular Mechanisms of UV-B Radiation on the Photosynthetic Apparatus of Cyanobacteria Synecocystis PCC 6803 (Csorba Tibor and Dr. Vass Imre, Molecular Stress and Photobiology Laboratory, Plant Biology, BRC, Szeged, Hungary co-sponsored by BRC, EU and UNESCO) Sapientia Foundation Research Grant: 2001 Studies concerning the influence of chemical water pollution on physiological parameters and on the bioproductivity of in vitro algal cell cultures (Fodorpataki L., Marton A. & Csorba T.) 10

11 11

12 12

13 13