A bilirubin UDP-glukuronoziltranszferáz szabályozása patológiás állapotokban. dr. Kardon Tamás

Átírás

1 Molekuláris Orvostudományok CELLULÁRIS ÉS MOLEKULÁRIS ÉLETTAN DOKTORI PROGRAM Ph.D. ÉRTEKEZÉS A bilirubin UDP-glukuronoziltranszferáz szabályozása patológiás állapotokban dr. Kardon Tamás Budapest

2 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: 1. Kardon T., Coffey M.J., Bánhegyi G., Conley A.A., Burchell B., Mandl J., Braun L.: Transcriptional induction of bilirubin UDPglucuronosyltransferase by ethanol in rat liver. Alcohol. 21, , Kardon T., Mile V., Bánhegyi G., Csala M., Burchell B., Mandl J., Braun L.: Ethanol-dependent induction of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase in rat liver is mediated by Kupffer cells. Life Sci. 70, , Braun L., Coffey M.J., Puskás F., Kardon T., Nagy G., Conley A.A., Burchell B., Mandl J.: Molecular basis of bilirubin UDPglucuronosyltransferase induction in spontaneously diabetic rats, acetonetreated rats and starved rats. Biochem. J. 336, ,

3 TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY Bevezetés Célkitűzések Irodalmi háttér A glukuronidáció, az UDP-glukuronoziltranszferázok Az enzimindukció, illetve hormonhatások szerepe a glukuronidáció szabályozásában A bilirubin képződése és átalakítása A bilirubin glukuronidációjának zavara miatt kialakuló hiperbilirubinémiák A bilirubin-ugt aktivitás változása patofiziológiás körülmények között A Kupffer sejtek szerepe az etanol által okozott májkárosításban Anyagok és módszerek Állatkísérletek A spontán diabétesz modellezése Az éhezés és acetonémia modellezése kísérleti állatokon Krónikus etanolbevitel, GdCl 3 -os Kupffer sejt inaktiválás Patkány máj mikroszóma preparálása Ellenanyagok Western blot Northern-blot A glukuronidáció és a különböző reakciótermékek mérése Statisztikai analízis Eredmények A bilirubin-ugt indukciója diabétesz mellituszban A bilirubin-ugt enzim aktivitásának emelkedése diabétesz mellituszban Az UGT1A1 enzim mennyiségének változása diabétesz mellituszban Diabétesz mellituszban az UGT1A1 mrns mennyisége nő Bilirubin-UGT indukciója éhezésben és acetonémiában UGT1A1 enzim aktivitásának változása éhezésben, illetve acetonémiában Az éhezés és acetonkezelés hatása patkány máj UGT1A1 tartalmára Éhezés és acetonkezelés hatása a máj UGT1A1 mrns-re A bilirubin-ugt indukciója etanol hatására Krónikus etanol kezelés hatása a bilirubin-ugt aktivitására Táblázat Etanol és gadolínium-klorid hatása a pnp-ugt és bilirubin-ugt enzim aktivitására, patkány máj mikroszómákon Etanol hatása a máj mikroszómák citokrom P450-2E1 és UGT1A1 fehérjéire A krónikus etanol kezelés hatása a máj UGT1A1 mrns-re Az etanol által kiváltott hatás felfüggesztése GdCl 3 hatására Krónikus egyidejű etanol és GdCl 3 kezelés hatása a bilirubin-ugt aktivitására GdCl 3 hatása az etanol által kiváltott fehérjeindukcióra A GdCl 3 hatása az etanol transzkripciós szintű UGT1A1 indukáló hatására37 8. Az eredmények tézisszerű összefoglalása Megbeszélés Köszönetnyilvánítás IRODALOMJEGYZÉK

4 1. ÖSSZEFOGLALÓ A glukoronidáció a biotranszformáció második fázisának mennyiségileg legjelentősebb reakciója. A glukuronidációt UDP-glukuronoziltranszferázok (UGT, EC ) katalizálják. Az UGT izoenzimek az endoplazmás retikulum (ER) integráns membránfehérjéi, melyek aktív centruma az ER lumenében helyezkedik el. A glukuronidáció kapacitása számos patofiziológiás állapotban I-es típusú cukorbetegség, éhezés, alkoholizmus változik. Ezekben az állapotokban emelkedik a hem katabolizmus toxikus termékének, a bilirubinnak a koncentrációja a szérumban. Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy a fentebb említett állapotokban miként változik a bilirubin glukuronidációja. Kísérleti rendszerként spontán diabetikus BB/Wor, éhező, acetonnal illetve etanollal kezelt patkányokat használtunk. Legfontosabb eredményeink az alábbiak: 1. Megállapítottuk, hogy cukorbeteg, éhező, valamint aceton- illetve etanol kezelésben részesült patkányokból preparált máj mikroszómák a) bilirubin glukuronoziltranszferáz aktivitása fokozódik, valamint b) a bilirubin glukuronsavas konjugációjában legfontosabb szerepet játszó izoenzim, az UGT1A1 mennyisége is emelkedik. 2. Diabetesben, éhezésben és krónikus etanolbevitel során az indukció transzkripciós szintű volt, mivel a fokozott fehérjemennyiség emelkedett UGT1A1 mrns-szinttel járt együtt. Az acetonkezelésben részesült patkányok esetében azonban a máj UGT1A1 mrns szintje változatlan maradt, amiből arra következtettünk, hogy diabetes mellitusban és éhezésben nem az aceton felelős az UGT1A1 indukciójáért. 3. A krónikus etanolbevitellel kiváltott UGT1A1 indukciót gátolni lehetett a Kupffer sejteket depletáló gadolínium-kloridos kezeléssel. Ebből arra következtethetünk, hogy extrahepatocelluláris mechanizmusok is szerepet játszhatnak az UGT1A1 indukciójában. 4

5 2. SUMMARY Glucuronidation is quantitatively the most important reaction in the 2 nd phase of biotransformation. Glucuronide formation is catalyzed by uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs; EC ). The various UGT isoenzymes are membrane-integrated proteins of the endoplasmic reticulum (ER) with their active site located in the lumen of the ER. The capacity of glucuronidation is altered in some pathophysiological states, such as diabetes type 1, starvation, alcoholism. In these conditions the serum concentration of bilirubin, the toxic product of heme catabolism, is elevated. The aim of our work was to investigate the changes in bilirubin-glucuronidation in the above-mentioned pathophysiological states. Spontaneously diabetic BB/Wor rats, starving rats as well as rats treated with acetone or ethanol were used as experimental system. Our more important findings are as follows: 1. In diabetes mellitus type 1, in starvation and after acetone and chronic ethanol treatment the rat liver microsomes showed a) an elevated bilirubin glucuronosyl transferase activity, and b) an elevated level of UGT1A1 protein, the most significant UGT isoenzyme for bilirubin glucuronidation. 2. In diabetes, starvation, and after chronic ethanol treatment the induction was detected on the level of transcription, as mrna levels were elevated as well. This change in the mrna level, however, was not detectable after acetone treatment, from which we inferred that acetone does not play a role in UGT1A1 induction in diabetes mellitus or in starvation. 3. Induction of UGT1A1 by chronic ethanol treatment was not observed in rats co-treated with gadolinium-chlorid. This compound leads to a depletion of Kupffer cells, so we concluded that extrahepatocellular processes may also play a role in UGT1A1 induction. 5

6 3. Bevezetés Az értekezés a bilirubin-udp-glukuroniltranszferáz szabályozásával foglalkozik. A hem bomlásterméke, a bilirubin a glukuronidáció talán legfontosabb szubsztrátja, glukuronsavas konjugációja vitális jelentőségű folyamat. A glukuronidáció a biotranszformáció részfolyamata. A biotranszformáció három fő fázisra osztható. A xenobiotikum sejtbe való bekerülése után az első fázis általában oxidoredukció. Ezt a folyamatot zömmel citokróm-p450 izoenzimek katalizálják. A második a konjugációs fázis, ebben az első fázisban már előkészített vegyületek többek között glukuronsavval konjugálódnak. A harmadik, transzporterek által bonyolított folyamat felelős a konjugálódott szubsztrát sejtből történő kiürítéséért. 4. Célkitűzések Az értekezés a bilirubin glukuronidációjának változásával és szabályozásával foglalkozik alkoholizmusban, diabétesz mellituszban, éhezésben. Ezekre az állapotokra jellemző a kialakuló acetonémia, illetve a biotranszformációs változások közül az acetont is oxidáló és az acetonémiában indukálódó, a citokróm P450 szuper géncsaládhoz tartozó CYP2E1 izoenzim fokozott aktivitása. A CYP2E1 izoenzimeknek többek között hem oxigenáz aktivitása is van. Felmerül a kérdés: a bilirubinnak, mint a hem degradáció termékének glukuronidációja hogyan változik, illetve mi ezen változások molekuláris mechanizmusa? Hasonlóak-e ezek a mechanizmusok a vizsgált állapotokban, vagy van köztük különbség? Van-e párhuzamosság a CYP2E1 indukció és a bilirubin glukuronidáció legnagyobb részét katalizáló UDPglukuronoziltranszferáz, az UGT1A1 izoenzim indukciója között? Ezeket a vizsgálatokat állatkísérletes modelleken terveztük. Diabétesz modellként BB veleszületett diabéteszes patkányokat használtunk. Az aceton, mint feltételezett induktor hatásának tanulmányozására acetonnal kezelt patkányokon is vizsgáltuk az UGT1A1 indukciót. A bilirubin glukuronidáció a hepatocitákban zajlik, de számos megfigyelés utal arra, hogy az alkoholizmusban kialakuló elváltozásokban a Kupffer sejtek szerepe a meghatározó. Ezért célul tűztük ki az alkohol hatására bekövetkező bilirubin 6

7 glukuronidáció változások vizsgálatát olyan kísérleti rendszerben, ahol a Kupffer sejtek működését bénítjuk. Ezt in vivo adott gadolínium kloriddal lehet előidézni. 5. Irodalmi háttér 5.1. A glukuronidáció, az UDP-glukuronoziltranszferázok A glukuronidáció a biotranszformáció második, konjugációs fázisának legjelentősebb reakcióútja [33]. A glukuronidáció során a hidrofób endo- vagy xenobiotikumok biológiai hatása csökken, vízoldhatósága fokozódik, a glukuronidok a máj- és vesetubulussejtek specifikus transzportereinek szubsztrátjaivá válnak és így könnyebben kiválasztódnak az epe vagy a vizelet útján. A kis molekulatömegű glukuronidok (m.m. 350) az esetek túlnyomó többségében a vizelettel, a nagyobbak a széklettel ürülnek. Glukuronsavval történő kapcsolódásra a legkülönbözőbb, alkoholos vagy fenolos hidroxilcsoportot, karboxilcsoportot tartalmazó vegyületek (aglikonok) alkalmasak. Glukuronsavval konjugálódik a szervezetbe kerülő idegen anyagok - gyógyszerek jelentős része. A glukuronsavval való kapcsolódás része az u.n. szignál molekulák átalakulásának, metabolizmusának is. Szerepet játszik a szervezet számos biológiailag aktív vegyületének (pl. pajzsmirigyhormonok, retinoidok, katekolamin származékok, epesavak, szteroid hormonok) hatástalanításában, illetve anyagcsere végtermékének (pl. bilirubin) eltávolításában. Az érzékszervek működésében egészen speciális feladata a glukuronidációnak a szaglási és ízlelési ingert kiváltó ligandok inaktiválása. Újabb eredmények szerint a glukuronidok az aglikonok szervezeten belüli szállításában is szerepet játszhatnak. A glukuronidokat a célszerv felveheti és a sejten belüli glukuronidáz segítségével aktív aglikont állíthat elő. A glukuronidációt UDP-glukuronoziltranszferázok (UGT, EC ) katalizálják. Ezeknek az enzimeknek széles a szubsztrátspecifitása és legnagyobb mennyiségben, a májban, a biotranszformáció fő szervében, de emellett vesében, vékonybélben, bőrben és szaglóhámban is megtalálhatók [19]. Az UGT izoenzimek által katalizált reakciókban az általában lipofil molekulák glukuronsavval konjugálódnak, hogy vízoldékonyabb, így könnyebben kiüríthető vegyületekké váljanak. A konjugáció azonban nem mindig jelent kizárólag méregtelenítést. A morfin, illetve egyes karcinogén vegyületek ilyen módon aktiválódhatnak. 7

8

9 Endoplazmás retikulum X-glukuronid + UDP-áz UMP UGT UDPG X + UGT + UDP-N- -ac-gluk. P i Lumen P i X Citoszol X-glukuronid UDPG UDP-N-ac-gluk. 1. Ábra Az UDP-glukuronozil transzferáz elhelyezkedése az endoplazmás retikulumban, és a működéséhez szükséges transzporterek UDPGA UDP-glukuronsav; UGT UDP-glukuronozil transzferáz; UDP-N-ac-gluk. UDP-N-acetil-glukózamin; UDP uridin-difoszfát; P i anorganikus foszfát; X aglikon; 9

10 Az UGT-k az endoplazmás retikulum integráns fehérjéi, melyeknek csak egy rövid szakasza érintkezik a citoplazmával, és aktív centrumuk a lumen felőli oldalon van (1. Ábra). Szubsztrátként UDP-glukuronsavat (UDPGA) igényelnek. Munkacsoportunk korábbi kísérleteiben kimutatta, hogy a glukuronidációhoz szükséges UDPGA forrása a glikogenolízis és nem a felvett glukóz, vagy a glukoneogenezis [9]. A mikroszómális enzimek működéséről két hipotézis alakult ki. Mindkét hipotézis az alábbi tények alapján próbálja értelmezni a glukuronidáció folyamatát: 1.) az UGT aktivitásához nélkülözhetetlen az enzim foszfolipid membránban való elhelyezkedése 2.) membránpermeabilizáló anyagok hozzáadásával az UGT-k enzimaktivitása fokozódik. Az egyik hipotézis szerint, amely a konformációs hipotézis nevet viseli, az UGT többféle konformációs állapotban található, függően az őt körülvevő foszfolipid membrántól [96]. A második, kompartimentációs hipotézis azt feltételezi, hogy az UGT-k aktív centruma intraluminárisan helyezkedik el. A membrán permeabilizálásával a szubsztrátok mennyisége az endoplazmás retikulumban megnő és ezért fokozódik az enzim aktivitása [10]. Ez az utóbbi modell feltételezi a citoplazmatikusan szintetizálódó UDPGA transzportját az endoplazmás retikulumba. Munkacsoportunk eddigi saját eredményei alapján a kompartimentációs hipotézist fogadja el. Ezt támasztják alá a jelen irodalmi álláspont mellett saját korábbi munkáink is, valamint az a körülmény, hogy egyes, nem membrán kötött intraluminális enzimek aktivitása is fokozódik permeabilizálás hatására. [8,38,29]. Az UGT-kre, mint azokra az enzimekre, melyeknek aktív centruma intraluminárisan helyezkedik el, jellemző a latencia jelensége. Ez azt jelenti, hogy az intakt membrán esetén észlelt alacsony aktivitást a membrán permeabilizálása sokszorosára fokozza. A jelenség azzal magyarázható, hogy a vízoldékony UDPGA membránon keresztüli transzportja a sebesség-meghatározó lépés [10]. Munkacsoportunk korábbi munkái alapján ez a transzport a befelé áramló UDPGA és a kifelé jövő termék kicserélődével, vagyis antiport mechanizmussal történik [7]. Egy enzim latenciája meghatározható, ha a mikroszómákat detergenssel kezeljük és ilyen viszonyok között is megmérjük az enzim aktivitását. A latencia az intakt membránnál észlelt aktivitáshoz viszonyított százalékos érték. Kiszámolható a következő képlettel: A d - A n A d 10

11 ahol A d a detergens jelenlétében mért aktivitás, A n pedig a natív, azaz az intakt viszonyok között mért aktivitás re 24 humán UGT gént azonosítottak, melyekből 16 kódol ismert fehérjéket [59]. A szekvenciák homológiája alapján az UGT-k két nagycsaládra oszthatók: UGT1 és UGT2 ( 2.ábra). 1 2 B A UGT1A5 UGT1A3 UGT1A4 UGT1A1 UGT1A6 UGT1A7 UGT1A8 UGT1A10 UGT1A9 UGT2B10 UGT2B11 UGT2B7 UGT2B4 UGT2B15 UGT2B17 UGT2A1 2. Ábra: Humán UDP-glukuronozil transzferázok Az ábrán a jelenleg ismert humán UDP-glukuronozil transzferázok családfája látható. Az összekötő vonalak az egyes izoenzimek közötti rokonságra utalnak. Az UGT2-es család további, két alcsaládra osztható: UGT2A és UGT2B. [21,60]. Az első család tagjai többek között bilirubint és különböző kisméretű planáris fenolokat - többek között a para-nitro-fenolt (pnp), a második család tagjai pedig elsősorban szteroidokat, epesavakat és retinoidokat konjugálnak [40]. Az UGT-k szubsztrátspecificitása más biotranszformációs enzimekéhez hasonlóan széles, egymást átfedő, ezért azonos aglikont több izoenzim is átalakíthat. Az UGT1 gén öt exont 11

12 tartalmaz. Különböző promóter régiokkal/első exonokkal rendelkezik, amelyek izoforma specifikus szekvenciákat kódolnak. Ezeket a másodiktól az ötödikig közös exonok követik, amelyek a minden UGT1 izoformában azonos C-terminális szekvenciáért felelősek [35,72,] Az enzimindukció, illetve hormonhatások szerepe a glukuronidáció szabályozásában A biotranszformáció enzimeinek, különösen a citokróm P450 izoenzimeknek a szabályozásában az indukció kitüntetett jelentőségű. Az UGT-k is indukálhatók a legtöbb ismert citokróm P450 enziminduktorral (metilkolantrén, fenobarbitál, klofibrát stb) [36]. Indukciójuk, szemben a citokróm P450 izoenzimek akár 100 szoros indukciójával általában kisebb mértékű, 2-4 szeres. Ezt azzal magyarázzák, hogy fiziológiás körülmények között is már indukált állapotban vannak. Részletesen tanulmányozott a fenol-ugt indukciója: az aromás szénhidrogének induktív hatását az Ah (aromatic hydrocarbon) receptor közvetíti [13,14]. Az Ah receptor heterodimert képez az ARNT-val (aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocator). Mindkét fehérje a bhlh (basic helix loop helix) DNS kötő domént tartalmazó transzkripciós faktorok közé tartozik. A heterodimer az XRE (xenobiotic response element) szekvencián keresztül kötődik a DNS-hez és így fokozódik többek között az ún. Ah battery -hez tartozó fenol UGT gén transzkripciója is [70]. Az Ah receptorokon kívül azonban más transzkripciós faktorok is szerepelnek az UGT-k köztük a bilirubin UGT expressziójának szabályozásában. Közülük a tiroid receptorok szerepét többen vizsgálták. Kimutatták patkányokban, hogy pajzsmirigyhormonok trijódtironin, L-, D-tiroxin ellenkező hatást váltanak ki a különböző UGT izoenzimeken. A bilirubin-ugt expresszióját csökkentik, a fenol-ugt expresszióját fokozzák [61]. Pajzsmirigyirtott patkányokon ezzel ellentétes hatás jött létre [62,75]. A glukagonról is leírták, hogy fokozza a bilirubin-glukuronidációt [71]. Az inzulin szabályozó szerepéről szintén számos tanulmány jelent meg, ám ezek főként az inzulin hiányában fellépő változásokat írják le, és ebből vonnak le következtetést az inzulin szerepére. Egyéb faktorok (fibroblaszt eredetű növekedési faktor), hormonok, főleg szteroidok: tesztoszteron, etinil-ösztradiol - hatását is vizsgálták a különböző UGT-k enzimaktivitására. Ezek a 12

13 vizsgálatok az androszteron-, és ösztradiol-glukuronidációjának igen intenzív (70-80%) csökkenését állapították meg. Humán máj mikroszómában kimutatható a tesztoszteron, ösztron és etinilösztradiol AZT (3'-azido-3'-deoxitimidin) glukuronidációját csökkentő hatása [43]. Hormonális szabályozásra utalhat az is, hogy a kor előrehaladtával pl. az UGT1A6 enzim aktivitása csökken, bár ennek mechanizmusáról még keveset tudunk [30]. Egyéb, nem hormon jellegű endogén vegyületekről is kimutatható, hogy befolyásolják a glukuronidációt. Epesavak gátolják a bilirubinglukuronidációt, zsíracil-koenzima-k - mirisztoil-koa, palmitoil-koa, sztearoil-koa, oleoil-koa - gátolják a tesztoszteron/4- nitrofenol glukuronidációt, nukleotidok - UDP, UTP, CDP - pedig képesek az 1-naftol glukuronidációját gátolni [39] A bilirubin képződése és átalakítása A bilirubin a hem lebontása során keletkezik, a protoporfirin váznak az oxidatív végterméke. Emberben naponta átlagosan mg bilirubin képződik, ami körülbelül µm-os plazmakoncentrációt eredményez [24]. A hem lebontása a csontvelőben, lépben és a májban történik. A hem csoport katabolizmusa során az első lépés a hem -metin (A és B gyűrű közötti) kötésének a hasítása. Ezt a lépést a hem oxigenáz I-es izoformája katalizálja, a létrejött termék a biliverdin IX [76,95]. A hasítás egy többlépéses folyamat, amelyhez szükség van molekuláris O 2 -re és NADPHra. A reakcióhoz a redukáló ekvivalensek a mikroszómális NADPH-citokróm-P450 reduktáz enzimtől származnak, amely prosztetikus csoportként FAD-ot és FMN-t tartalmaz [47]. A biliverdint a citoplazmában található biliverdin reduktáz alakítja bilirubinná. A bilirubin egy asszimetrikus, szubsztituált tetrapirrol dikarbonsav. A metin csoport metiléncsoportra való redukálása a bilirubin C10-es szénatomján konformációs változást hoz létre. A dipirrinon gyűrű a középső CH 2 csoport körül rotál, így lehetőséget ad belső hidrogénhíd(ak) kialakítására. A propionát csoportok karboxilcsoportjai és a pirrolgyűrűk laktámkonfigurációban található oxigénjei között létrejövő hidrogénhíd kötések a felelősek a bilirubin szokatlan jellemzőiért, mint például a vízben való oldhatatlansága, illetve szekrécióra való képtelensége [67]. A bilirubinnak ez a hidrofób konformációja viszont nagy affinitást mutat a központi idegrendszer sejtjei iránt. A bilirubin toxikus hatásai vese és idegrendszeri károsodásokban mutatkoznak meg [25]. 13

14 Amennyiben a bilirubin szintézis meghaladja a konjugáció sebességét, illetve a konjugálódott bilirubin kiürülése akadályozott, úgy hiperbilirubinémiáról beszélünk, ami ikteruszhoz vezet. Ennek különböző okai lehetnek, a fokozott hemolízistől kezdve egészen az epeútelzáródásig. Ezen folyamatok egy része a bilirubin anyagcsere változásoknak a következménye. A bilirubin glukuronsavas konjugációjának legfontosabb enzime az UGT1A1, amely számos szövetben megtalálható. Az enzimnek nemcsak a bilirubin az endogén szubsztrátja, hanem egyes C18 szteroid származékok is. A bilirubin anyagcseréje elsősorban a májban történik. Az UGT1A1 a májon, vesén, beleken kívül megtalálható a gonádokban, prosztatában is [87]. A szisztémás keringésben a bilirubin albuminhoz kötődve szállítódik. A májsejt a bilirubint a szinuszoidális membránon keresztül veszi fel, miután az a Disse térben disszociált az albuminról [82]. A májsejtben egy ligandin nevű fehérjéhez és egy Z fehérjéhez kötődve jut el az endoplazmás retikulumig [57] A bilirubin glukuronidációjának zavara miatt kialakuló hiperbilirubinémiák A klinikailag legfontosabb, két, konjugációs zavar miatt bekövetkező hiperbilirubinémiával járó kórkép a jóindulatú Gilbert-kór és a sokkal súlyosabb Crigler Najjar kór ban Gunn olyan mutáns Wistar patkánytörzset írt le, amelyben öröklötten hiperbilirubinémia fordult elő [42]. Ez a kísérleti törzs később jó modellnek bizonyult a Crigler és Najjar által leírt súlyos, krónikus, nem hemolitikus, emberekben is előforduló konjugálatlan hiperbilirubinémia egyik típusának [28]. A Crigler-Najjar kórnak klinikailag két formája van, az I-es és a II-es típus. Mind a kettő emelkedett konjugálatlan bilirubin szinttel jár. Az I-es típusban a bilirubin szérum koncentrációja 340µM feletti érték, a II-es típusban 60 és 340 µm között. A veleszületett konjugálatlan hiperbilirubinémiák enyhe formája a Gilbert kór, amelyben a bilirubin szérum szintje 60 µm alatt marad [48]. A két kór kialakulásának a molekuláris mechanizmusát az elmúlt években részben sikerült tisztázni. Mind humán, mind patkány UGT1A1 vizsgálata során számos mutációt mutattak ki, amelyek az említett hiperbiliruminémiák egyikéhez vezethetnek. A Crigler-Najjar I-es típusú betegeinek UGT1-es génkomplexének a vizsgálata során a 2,3,4 és 5-ös exonjában talált mutációk mindegyike az UGT1-es családba tartozó UGT-k konjugációs folyamatát érintette [51]. Azokban a betegekben azonban, ahol az első exonban (1A1) találtak mutációt, csak a bilirubin konjugációja 14

15 csökkent, s ennek következtében alakult ki a hiperbilirubinémia [79]. Klinikailag a kétféle típus között fenobarbitál kezeléssel lehet a legegyszerűbben differenciálni. Az I- es típusban fenobarbitál kezelés után nem csökkent a szérum bilirubin szintje és a konjugálatlan bilirubin is magas értéket mutatott. A II-es típusban fenobarbitál kezelésre mérséklődött a szérum bilirubin szintje, ezen belül is a konjugálatlan bilirubin aránya csökkent. Wistar patkányokban nem találtak szignifikáns eltérést a kontrollhoz képest az UGT izoformákban fenobarbitál kezelés hatására [35,45]. A humán UGT1A4 indukálható fenobarbitállal, de nem mutat jelentős bilirubin glukuronidáló aktivitást [16,73]. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy emberben az UGT1A1 a legfőbb bilirubin konjugáló enzim [16]. A bilirubin konjugálódásáért felelős másik fehérje az UGT1A4 patkányban nem expresszálódik, pszeudogén [35]. A Gilbert kór örökletes, krónikus, enyhe konjugálatlan hiperbilirubinémiával járó állapotnak írható le, amely a bilirubin csökkent glukuronidáló kapacitásán kívül nem jár egyéb májfunkció kieséssel [4]. Éhezésben emelkedik a Gilbert kóros emberek vérében a konjugálatlan bilirubin koncentrációja [81]. A bilirubin-ugt aktivitása a kontroll csoporthoz képest kb 70%-kal csökkent [11]. A Gilbert kóros betegek UGT1A1 génjének vizsgálata során két különböző típusú mutációt találtak. Az egyik típusban egy homozigota TA inzerció található a TATA boxban, az 1A1 exon promóter régiójában [63]. A másik típus egy heterozigota misszensz mutáció a kódoló régióban [3]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Gilbert kornak kétféle öröklődése lehetséges, egy autoszomális domináns, és egy autoszomális recesszív A bilirubin-ugt aktivitás változása patofiziológiás körülmények között A bilirubin anyagcseréjének változásait régóta vizsgálják. Éhezések különböző formái emelkedett bilirubin-ugt aktivitással járnak [88]. Éhezésben, újszülöttkorban, megnő a szérum bilirubin koncentrációja [5]. Kísérletes diabétesz mellituszban függően az alkalmazott diabétesz modelltől és a speciestől különböző eredményeket közöltek. Streptozotocin indukált diabéteszben egyes szerzők nem találtak változást a szérum bilirubin szintekben [92], míg más szerzők emelkedett bilirubin glukuronidációt figyeltek meg diabéteszes egerek májában [74]. Vannak olyan humán vizsgálatok, amelyek szerint a diabéteszes betegek szérumában megnőtt a konjugált (direkt) bilirubin szint [23]. 15

16 Waltman és munkatársai szerint [91] alkoholista anyák újszülöttjeiben a szérum bilirubin szint csökken. Számos munka utal arra, hogy az etanol fokozza a bilirubin clearance-t és a hem turnover-ét, ezért jótékony hatást gyakorol Gilbert kórban és neonatalis hiperbilirubinémiában [20]. Állatkísérletekben is kimutatták, hogy az etanol fokozza a bilirubin UGT aktivitását [44] A Kupffer sejtek szerepe az etanol által okozott májkárosításban A májfunkciók döntő többsége a máj parenchyma sejtjeiben, a hepatocitákban expresszálódó enzimekhez, transzporterekhez kötött. Ezért a különböző májkárosodásokban a hepatocitákban bekövetkező változásokat a hepatocitákban zajló kóros folyamatokkal magyarázták. Az etanol kiváltotta májkárosodásban is sokáig az etanol direkt szerepét próbálták bizonyítani. Az utóbbi időben azonban egyre több adat utal a Kupffer sejtek, mint az etanol toxikus hatásaiért közvetve felelős sejtek szerepére [17]. Ez összefügg a Kupffer sejtek májkárosodásokban betöltött szerepének általános átértékelésével. Az új értelmezés lényege az, hogy a Kupffer sejtek szerepe döntő a májkárosodások egy jelentős részének kialakulásában. A károsító ágens a Kupffer sejteket befolyásolja úgy, hogy azok különböző mediátorok termelésével és szekréciójával befolyásolják, károsítják a hepatociták működését. Ennek következtében jön létre a májkárosodás. Így etanol kezelés hatására több kóros állapotot közvetítő mediátor fokozott szekrécióját figyelték meg a máj Kupffer sejtjeiben. A Kupffer sejt a szervezet monocita-makrofág rendszerének az egyik legjelentősebb képviselője [31], A Kupffer sejtek a máj szinuszokban elhelyezkedő szöveti makrofágok kifejezett endocitotikus és fagocitotikus kapacitással. Ezek a sejtek felelősek a gyulladásos mediátorok - tumor nekrózis faktor-α (TNF- α), oxigén tartalmú szabad gyökök, eikozanoidok, nitrogénoxid, szénmonoxid, citokinek - szekréciójáért a májban [50]. Enterális etanolkezelés hatására bakteriális endotoxinok szabadulnak fel a bélrendszerben [2,15], melyek a véráramba kerülve a Kupffer sejteket stimulálják, így azok prosztaglandinokat, eikozanoidokat, szabad gyököket, citokineket termelnek [46,52,84]. A szérum TNF- α szintje fokozódik krónikus alkoholkezelés hatására [93]. Ennek bizonyítottan igen jelentős a funkciója számos májkárosodásban, így az alkohol okozta májléziókban is. Perfundált májon, és in vivo is megfigyelték, hogy akut etanolkezelés hatására aktiválódik a máj fagocitotikus aktivitása, amely a Kupffer sejtek fokozott részvételét mutatja a reakcióban [32,34]. A Kupffer sejtek vizsgálatának egyik 16

17 ismert eszköze a gadolínium-klorid (GdCl 3 ). A gadolínium-kloridról tudjuk, hogy a szöveti makrofágokra toxikus hatással van, így a Kupffer sejtek számát mintegy 80%- kal csökkenti [52]. Amennyiben a kísérleti állatokat az etanol mellett Kupffer sejt depletáló gadolínium-kloriddal kezelik, úgy az etanol hatására létrejövő változások - szérum enzimek emelkedő aktivitása, zsírakkumuláció, gyulladásos reakciók, nekrózis - lecsökkennek [1]. GdCl 3 kezelés hatására az etanol CYP2E1 izoenzimet indukáló hatása sem érvényesül [49]. Ezért jogosnak tűnt az a feltételezés, hogy az alkohol bilirubin glukuronidációt befolyásoló hatását a Kupffer sejtek közvetíthetik. 6. Anyagok és módszerek 6.1. Állatkísérletek Az állatokat a napszaki ingadozásanak megfelelő fényviszonyok között tartottuk állandó hőmérséklet, páratartalom mellett, biztosított és ellenőrzött "specified pathogen free" (SPF) környezetben. Az állatok a szokásos laboratóriumi takarmányt kapták A spontán diabétesz modellezése. Hím BB/Wor patkányokat (Charles River Hungary) használtunk. Ez a törzs azzal a tulajdonsággal rendelkezik, hogy egyedeinek 90%-ban spontán I-es típusú diabétesz alakul ki [65]. A forgalmazó cég a diabéteszes állatoknak inzulint adagoló implantátumot helyezett a bőre alá, hogy a szállítási időt kibírják. Ennek kimerülése után naponta mértük a vércukorszintet, majd amikor a vércukorszint meghaladta a 20 mm-os koncentrációt, az állatokat még három napig tartottuk hagyományos, a fent említett körülmények között, majd ennek leteltével dekapitáltuk őket. Kontrollként ugyancsak BB/Wor, de nem diabéteszes állatokat használtunk Az éhezés és acetonémia modellezése kísérleti állatokon. Éheztetett állatcsoport: hím Wistar patkányoktól (Charles River Hungary) négy napon (96 óra) át megvontuk a táplálékot. Acetonnal kezelt állatcsoport: az ivóvizhez adtunk 17

18 acetont 1 tf%-ban öt napon át, ezek a kísérleti állatok emellett ugyanazt a laboratóriumi tápot kapták, mint a kontroll állatcsoport.í 6.4. Krónikus etanolbevitel, GdCl 3 -os Kupffer sejt inaktiválás. A krónikus etanolbevitelt hím Wistar patkányokkal (Charles River Hungary) modelleztük a következő módon. Patkányok gyomorszondán kaptak naponta egyszer 3g/ttkg-nak megfelelő fiziológiás sóoldattal hígított 18,8%-os etanolt két héten keresztül [44]. A kontroll csoport - ugyancsak gyomorszondán át - izokalorikus glukózoldatot kapott, ugyancsak fiziológiás sóoldatban feloldva. A Kupffer sejtek inaktíválása céljából az egyik csoport intravénás gadolínium-klorid (GdCl 3 ) kezelésben részesült háromnaponta. A GdCl 3 -ot enyhén savas ph-jú fiziológiás sóoldatban oldottuk fel és a kísérleti állatok 10 mg/ttkg-os koncentrációban kapták [52]. A kontroll csoport a gadolínium-klorid oldószerét kapta háromnaponta - szintén inravénásan Patkány máj mikroszóma preparálása Mikroszómát a patkány máj homogenizátumából differenciál-centrifugálás módszerével izoláltuk. A mikroszóma frakciókat (kb. 80 mg fehérje/ml) a következő oldatban szuszpendáltuk: 100 mm KCl, 20 mm NaCl, 3,5 mm MgCl 2, 20 mm MOPS, ph 7,2 és folyékony nitrogénben tároltuk felhasználásig. A p-nitrofenol UGT aktivitásokat ugyanebben a médiumban mértük. A mikroszóma épségét mannóz-6-foszfatáz aktivitás mérésével ellenőriztük és kb. 95% volt minden esetben. A mikroszómákat bizonyos mérések esetében alameticinnel permeabilizáltuk (0,05 mg alameticin/mg fehérje) [6] Ellenanyagok Az anti CYP2E1-et, amely a humán és az egér P450-2E1-et ismeri fel, Prof. Arthur Cedrerbaum-tól, az anti UGT1A1 antitesteket (RAL, R 10 ), amelyek patkány UGT1A1-et ismerik fel Prof. Brian Burchell-től kaptuk. Az R 10 specifikus, kizárólag a bilirubint konjugáló UGT1A1-et ismeri fel. A RAL a bilirubin-ugt-n kívül a tesztoszteron-, androszteron- és fenol-ugt-vel is reagál [27]. 18

19 6.7. Western blot A mikroszómális fehérjéket szolubilizáltuk. A fehérje koncentrációkat Lowry módszerével mértük meg. Standard oldatként szarvasmarha szérum albumint használtunk A mikroszómális fehérjékből 20 µg-ot vittünk fel 0,1%-os SDS/7,5 v%-os poliakrilamid gélre. Az elektroforézist a korábbiakban már leírt módszer szerint végeztük [55] A fehérjéket elektroforetikusan vittük fel nitrocellulóz membránra [85]. Az elektroforetikus átvitel után a nem specifikus kötőhelyek lefedése céljából a membránt 7,5% lactalbumint tartalmazó PBS-Tween oldatban inkubáltuk egy órán keresztül, majd többszöri mosást végeztünk.. Ezután a megfelelő antitestekkel inkubáltuk szobahőn az antitesttől függően 1-2 órán keresztül. Másodlagos antitestekkel történt inkubálás és a membránok mosása után kemilumineszcens detektálást végeztünk. A membránokon a másodlagos antitestek, melyek tormaperoxidázt konjugátumként tartalmazó IgG-k voltak a kemilumineszcens vegyülettel reakcióba léptek, ezt fényjelenség követi, melyet röntgenfilmmel detektáltuk. Egy rövid expozíciós idő elteltével a filmet automata előhívóban hívtuk elő. A fehérjékhez specifikusan kötődött antitestek a filmen keskeny csíkként jelentek meg, ezeket denzitométerrel segítségével értékeltük Northern-blot Az állatok májából RNS-t izoláltunk a hagyományos guanidinium tiocianátos módszerrel [22]. Az UGT1A1 cdns szakaszt, amely tartalmazta a humán UGT1A1 cdns-ének a bázisig tartó szekvenvciáját Prof. Brian Burchelltől kaptuk. Ezt a szakaszt jelöltük meg [α- 32 P]dCTP-vel és használtuk hibridként a Northern-blothoz. A Northern-blotot a már leírt és bevált módszer szerint végeztük [77] A glukuronidáció és a különböző reakciótermékek mérése A paranitrofenol-udp-glukuronoziltranszferáz (pnp-ugt) aktivitást natív és permeabilizált mikroszóma frakciókon mértük meg. A mikroszómákat 5 mm-os UDPglukuronsav és 100µM-os pnp jelenlétében inkubáltuk, majd fél óra elteltével triklórecetsavval állítottuk le a reakciót. A nem konjugálódott aglikonok (pnp-ugt aktivitás) csökkenő mennyiségét spektrofotométer segítségével mértük 405 nm-es hullámhosszon [12]. A bilirubinra vonatkozó méréseket sötétben végeztük, mivel a 19

20 bilirubin fényérzékeny vegyület. Az intakt és permeabilizált mikroszómákat 10 mm UDP-glukuronsav és 122µM bilirubin jelenlététben inkubáltuk fél órán át, majd a reakciót ph:2,7 -es 0 C-os 2M -os glicin/hcl oldattal állítottuk le. A bilirubinglukuronidot Walters módszere szerint mértük [90]. A szérum glukóz koncentráció méréseket a hexokináz alapú glukózmérő kittel végeztük. A szérum aceton koncentrációját az Urbach reakció alapján mértük Statisztikai analízis Az eredményeket átlag szórás vagy átlag hiba formában közöltük. A szignifikancia meghatározására Student's t-próbát alkalmaztunk. 20

21 7. Eredmények 7.1. A bilirubin-ugt indukciója diabétesz mellituszban A bilirubin-ugt enzim aktivitásának emelkedése diabétesz mellituszban Bilirubin UDP-glukuronozil transzferáz aktivitást vizsgáltunk BB/Wor patkányokban. Ezekben az állatokban spontán I-es típusú diabétesz mellitusz alakul ki az egyedek kb 90 %-ában [65]. Kontrollként nem diabéteszes BB/Wor patkányokat használtunk. A diabéteszes állatokban megfigyelhetőek voltak a diabétesz klasszikus tünetei: polidipszia, poliúria, fogyás. A szérum glukóz és aceton szintek is egyértelműen a diabéteszre utaltak. (1.táblázat). Megmértük a szérum össz. és direkt bilirubin koncentrációját. Méréseink alapján a konjugált bilirubin koncentrációja emelkedett volt, míg az össz bilirubin koncentrációja nem emelkedett (1.táblázat). A máj mikroszómális frakcióban két UGT enzim aktivitását mértük meg: a fenol-ugt és a bilirubin-ugt-t. A fenol-ugt aktivitást p-nitrofenol modellszubsztrát konjugációjának mérésével vizsgáltuk. Az enzimaktivitásokat intakt és alameticinnel permeabilizált mikroszómákon is megmértük, ellenőrizve a membránok funkcionális épségét, intaktságát. A latencia azokra az enzimekre jellemző, amelyek membránnal határolt kompartmentben találhatók. Ezeknek az enzimeknek a működése "korlátolt", aktivitásuk a szubsztrátellátottságtól függ. A membránok épsége elsődleges jelentőségű az endoplazmás retikulum enzimeinek megfelelő működéséhez. A pnpglukuronidációját (fenol-ugt) és a bilirubin-glukuronidációját összehasonlítva a diabéteszes és kontroll állatok máj mikroszómáiban a következőket állapíthatjuk meg. A két csoport között nem volt szignifikáns pnp-ugt aktivitásbeli különbség mérhető sem intakt, sem permeabilizált mikroszómában. A bilirubin-ugt aktivitás a diabéteszes állatok máj mikroszómáiban a kontrollhoz képest körülbelül a hatszorosára fokozódott - intaktban és permeábilizáltban egyaránt (1. táblázat). 21

22

23 1. Táblázat. A máj pnp-ugt és bilirubin-ugt aktivitásának változásai diabétesz mellituszban A szérum glukóz koncentrációja A szérum aceton koncentrációja A szérum direkt bilirubin koncentrációja p-nitrophenol fogyás (nmol/perc/mg fehérje) A pnp-fenol-ugt latenciája Bilirubin-glukuronid képződés (nmol/perc/mg fehérje) A bilirubin UGT latenciája (mm) (mm) ( M) natív permeábilizált (%) natív permeábilizált (%) Kontroll BB/Wor 8,73 0,68 0,37 0,09 2,3 0,3 1,10 0,12 15,95 0,46 93,12 0,65 0,005 0,001 0,231 0,054 97,43 0,82 Diabéteszes BB/Wor 28,24 2,35* 1,34 0,10* 3,6 0,01* 0,89 0,06 16,03 0,31 94,44 0,27 0,018 0,002* 1,816 0,130* 99,02 0,07 A kontroll és diabéteszes BB/Wor patkányokat három nappal a diabéteszes patkányokban manifesztálódott diabétesz után vágtuk le. Minden állatnak meghatároztuk a szérum glukóz, aceton és direkt (konjugált) bilirubin koncentrációját. A pnp-glukuronid és bilirubin-glukuronid méréseknél a permeábilizálást alameticinnel végeztük 0,05mg alameticin/1 mg fehérje arányban Az UGT-k latenciáját a natív és permeábilizált mikroszómákon kapott eredmények különbsége adja. A százalékos érték a teljesen permeábilizált mikroszómákhoz képesti arány adja meg. Az adatok az átlag ± szórás értéket adják meg, melyek három különböző állatból származó mintán kaptunk. A szignifikancia mértéke a BB/Wor kontrollhoz képest: *P<

24 Az UGT1A1 enzim mennyiségének változása diabétesz mellituszban Ismert, hogy diabétesz mellituszban a máj citokróm P450-2E1 mennyisége is emelkedik [53]. Western blottal ezt kísérleteinkben is megerősítettük (3/A ábra). RAL antitesttel ugyanakkor kimutattuk, hogy az UGT1-es család fehérjemennyisége emelkedett a kontrollhoz képest (3/B.ábra). A RAL olyan fehérje elleni antitest, amely kétféle UGT családba tartozó UGT-t mutat ki, az 54/53 kda-os bilirubin/fenol-ugt-t (UGT1-es család), és az 52/50 kda-os androszteron/tesztoszteron-ugt-t (UGT2-es család). Az R 10 -es antitest azonban, amely specifikus az UGT1A1-re egyértelműsíti, hogy a bilirubin-ugt mennyisége emelkedett a kontrollhoz képest a diabéteszes állatok májában (3/C. ábra). A B 54/53 kda 52/50 kda C 1.5 * Denzitás (AU x mm) ábra Diabétesz hatása a máj mikroszómák P450-2E1 ésugt fehérje tartalmára Mikroszómális fehérjéket izoláltunk diabéteszes és kontroll BB/WOR patkányok májából, melyeket SDS/PAGE gélre vittünk fel mintánként 20µg menyiségben. A futtatás végeztével blottoltuk nitrocellulóz membránra. A membránokat CYP2E1 (A), RAL (B) és R 10 (C) antitestek jelelétében inkubáltuk. 1-3-ig a kontroll, 4-6-ig a diabéteszes állatok májából származó fehérjék láthatók. A denzitométeres ábrázoláson az UGT1A1 fehérjère vonatkoztatott értékeket ábrázoltam a felvitt fehérjemennyiséghez viszonyítva. Az ábrázolt értékek az ábra C 24

25 részének 1-3, illetve a 4-6 oszlopban található fehérjemennyiségeinek átlagolt értékeit mutatják*: p< 0,01 a kontrollhoz viszonyítva Diabétesz mellituszban az UGT1A1 mrns mennyisége nő Teljes RNS-t izoláltunk a diabéteszes BB/Wor és kontroll patkányokból és Northernblottal vizsgáltuk, hogy az előbbiekben megfigyelt UGT1A1 indukció vajon transzkripciós szintű-e. Az UGT1A1 cdns-ét próbaként használva hibridizáltuk a kísérleti állatok májából származó RNS-eket. Megállapítottuk, hogy a diabéteszes állatok májában szignifikánsan több UGT1A1 mrns található, mint a kontroll csoportban (4.ábra). A B 4. ábra Diabétesz hatása a máj UGT1A1 mrns-re Teljes RNS-t izoláltunk a diabéteszes és kontroll BB/Wor patkányok májából. Northern-blotot végeztünk úgy, hogy sávonként minden mintából 20 µg RNS-t vittünk fel. Az UGT1A1 cdnsének az [ - 32 P]dCTP-vel jelölt bázisáig tartó szakaszával hibridizáltunk, majd a jelölődést audioradiográfiás módszerrel tettük láthatóvá (A). A felvitt egyenlő RNS mennyiségeket az etídium-bromidot tartalmazó agaróz gélről készült UV felvétel mutatja (B). 1-3-ig a kontroll, 4-6-ig a diabéteszes állatok májából származó RNS-ek láthatók Bilirubin-UGT indukciója éhezésben és acetonémiában UGT1A1 enzim aktivitásának változása éhezésben, illetve acetonémiában. Mivel éhezésben a diabéteszhez hasonló klinikai, illetve metabolikus elváltozások fordulnak elő, ezért kísérleteinket olyan állatok májából izolált mikroszómákon, illetve szérumaikon is elvégeztük, amelyek három napig éheztek. Annak ismeretében, hogy mind a diabétesz mellitusz I-es típusában, mind éhezésben a szérum aceton szint emelkedik, kísérleteket végeztünk patkányokon, amelyek öt napig aceton kezelésben részesültek. A kontroll csoport szabadon hozzáfért a táplálékhoz és acetont sem kaptak. 25

26 A szérum direkt (konjugált) bilirubin mennyisége enyhén emelkedett volt az acetonkezelésben részesült állatokban, viszont csökkent az éhező egyedekben (2.táblázat). A szérum teljes bilirubin koncentrációja nem változott. A bilirubin-ugt és a pnp-ugt aktivitását is megvizsgáltuk mind intakt, mind alameticinnel permeábilizált máj mikroszómákon. Ebben az esetben is csak a bilirubin glukuronidáció fokozódott, az acetonkezelésben részesült egyedek máj mikroszómáiban kb. 3-4-szeresére, az éhezőkében 6-7 szeresére. A pnp-glukuronidáció nem változott (2. táblázat). 26

27 2.Táblázat. A pnp-ugt és a bilirubin-ugt aktivitásának, illetve egyes szérumparaméterek változása éhezésben, illetve acetonémiában A szérum glukóz koncentrációja A szérum aceton koncentrációja A szérum direkt bilirubin koncentrációja p-nitrophenol fogyás (nmol/perc/mg fehérje) A pnp-ugt latenciája (%) Bilirubin-glukuronid képződés (nmol/perc/mg fehérje) (mm) (mm) ( M) natív permeábilizált natív permeábilizált A bilirubin- UGT latenciája (%) Kontroll 8,56 0,43 0,33 0,06 2,1 0,2 0,41 0,16 16,08 0,28 97,45 1,00 0,006 0,001 0,217 0,031 97,21 0,47 Aceton kezelt 9,38 0,70 1,69 0,03 3,9 0,3 0,39 0,07 16,43 0,23 97,60 0,45 0,020 0,002 0,762 0,018 96,76 0,87 Éhező 6,49 0,22* 0,93 0,10 1,2 0,05 0,40 0,08 16,20 0,02 97,53 0,52 0,028 0,005 1,439 0,042 97,94 0,36 Öt napig acetonnal kezelt, 96 órán át éhezett és kezeletlen kontroll patkányokat (n=3/csoport) vizsgáltunk. Minden állatnak meghatároztuk a szérum glukóz, aceton és direkt (konjugált) bilirubin koncentrációját. A pnp-glukuronid és bilirubin-glukuronid méréseknél a permeábilizálást alameticinnel végeztük 0,05mg alameticin/1 mg fehérje arányban. Az UGT-k latenciáját a natív és permeábilizált mikroszómákon kapott eredmények különbsége adja. A százalékos értéket a teljesen permeábilizált mikroszómákhoz viszonyított arány adja meg. Az adatok az átlag ± szórás értéket adják meg, melyek három különböző állatból származó mintán kaptunk. A szignifikancia mértéke a kntrollhoz képest: *P<0.05, P<0.02, P<

28 7.2.2 Az éhezés és acetonkezelés hatása patkány máj UGT1A1 tartalmára Éhezésben, illetve magas acetonszint esetén a CYP2E1 expressziója fokozódik [53]. Saját méréseink is ezt igazolták (5/A. és 6/A. ábra). Éhezésben megemelkedik a szérum acetonszintje. Az éhező és acetonkezelt állatok máját így hasonló metabolikus hatások is érik. Miután a CYP2E1 hasonlóan fokozódott, mint diabétesz esetében, és a metabolikus változások is sok tekintetben hasonlóak (1 és 2. táblázat), megvizsgáltuk Western blottal a máj bilirubin-ugt expresszióját. A RAL antitest itt is mind a négy UGT fokozódását mutatta ki (5/B. és 6/B ábra). Az R 10 antitest segítségével elkülöníthettük, hogy a RAL esetében látott indukció nagyrészt a bilirubin-ugt-nek tulajdonítható. (5/C. és 6/C. ábra). A B 54/53 kda 52/50 kda C 2.25 * Denzitás (AU x mm) ábra Éhezés hatása a máj mikroszómák P450-2E1 ésugt fehérje tartalmára 28

29 Mikroszómális fehérjéket izoláltunk 96 órán át éhező és normál laboratóriumi tápon tartott patkányok májából, melyeket SDS/PAGE gélre vittünk fel mintánként 20µg menyiségben. A futtatás végeztével blottoltuk nitrocellulóz membránra. A membránokat CYP2E1 (A), RAL (B) és R 10 (C) antitestek jelelétében inkubáltuk. 1-3-ig a kontroll, 4-6-ig az éhező állatok májából származó fehérjék láthatók.. A denzitométeres ábrázoláson az UGT1A1 fehérjère vonatkoztatott értékeket ábrázoltam a felvitt fehérjemennyiséghez viszonyítva. Az ábrázolt értékek az ábra C részének 1-3, illetve a 4-6 oszlopban található fehérjemennyiségeinek átlagolt értékeit mutatják*: p< 0,01 a kontrollhoz képest. A B C 54/53 kda 52/50 kda 1.5 * Denzitás (AU x mm) ábra Acetonkezelés hatása a máj mikroszómák P450-2E1 ésugt fehérje tartalmára Mikroszómális fehérjéket izoláltunk acetonos vízzel itatott és normális laboratóriumi tápon tartott patkányok májából, melyeket SDS/PAGE gélre vittünk fel mintánként 20µg menyiségben. A futtatás végeztével blottoltuk nitrocellulóz membránra. A membránokat CYP2E1 (A), RAL (B) és R 10 (C) antitestek jelelétében inkubáltuk. 1-3-ig a kontroll, 4-6-ig az acetonkezelt állatok májából származó fehérjék láthatók. A denzitométeres ábrázoláson az UGT1A1 fehérjère vonatkoztatott értékeket ábrázoltam a felvitt fehérjemennyiséghez viszonyítva. Az ábrázolt értékek az ábra C részének 1-3, illetve a 4-6 oszlopban található fehérjemennyiségeinek átlagolt értékeit mutatják*: p< 0,01 a kontrollhoz képest. 29

30 7.2.3 Éhezés és acetonkezelés hatása a máj UGT1A1 mrns-re Éhező és acetonnal kezelt állatok májában megvizsgáltuk az UGT1A1 mrns változását a kontrollhoz képest. Próbának az UGT1A1 cdns-ét használtuk. Az eredményeink azt mutatták, hogy éhezésben az UGT1A1 mrns mennyisége több volt a kontrollhoz képest (7. ábra). Az acetonkezelésben részesült állatok UGT1A1 mrns-e viszont nem változott a kontrollhoz képest (8. ábra). Ez azt mutatja, hogy míg éhezésben az indukció transzkripciós szintű, addig az acetonémiában megfigyelt fokozott UGT1A1 expresszió inkább más okra, például a fehérje stabilizációjára, vezethető vissza. A B ábra Éhezés hatása a máj UGT1A1 mrns-re Teljes RNS-t izoláltunk az éhező és kontroll patkányok májából. Northern-blotot végeztünk úgy, hogy sávonként minden mintából 20 µg RNS-t vittünk fel. Az UGT1A1 cdns-ének az [ - 32 P]dCTP-vel jelölt bázisáig tartó szakaszával hibridizáltunk, majd a jelölődést audioradiográfiás módszerrel tettük láthatóvá (A). A felvitt egyenlő RNS mennyiségeket az etídium-bromidot tartalmazó agaróz gélről készült UV felvétel mutatja (B). 1-3-ig a kontroll, 4-6-ig az éhező állatok májából származó RNS-ek láthatók. A B 8.ábra Acetonkezelés hatása a máj UGT1A1 mrns-re 30

31 Teljes RNS-t izoláltunk az öt napig acetonnal kezelt és a kontroll patkányok májából. Northernblotot végeztünk úgy, hogy sávonként minden mintából 20 µg RNS-t vittünk fel. Az UGT1A1 cdns-ének az [ - 32 P]dCTP-vel jelölt bázisáig tartó szakaszával hibridizáltunk, majd a jelölődést audioradiográfiás módszerrel tettük láthatóvá (A). A felvitt egyenlő RNS mennyiségeket az etídium-bromidot tartalmazó agaróz gélről készült UV felvétel mutatja (B). 1-3-ig a kontroll, 4-6-ig az acetonkezelt állatok májából származó RNS-ek láthatók A bilirubin-ugt indukciója etanol hatására Krónikus etanol kezelés hatása a bilirubin-ugt aktivitására Etanol kezelésben részesült patkányok májából mikroszómákat izoláltunk, illetve ugyanezen állatok szérumából meghatároztuk a bilirubin koncentrációját. Egyidejű GdCl 3 -dal (lásd később) végzett kezelés hatására az etanol adására fokozódó bilirubin konjugáció nem különbözött a kontroll értékektől. Mikroszómákon megmértük a bilirubin illetve a p-nitrofenol-ugt aktivitást. Hasonló méréseket végeztünk a GdCl 3 - dal történő kezelések során. A mikroszómális méréseket itt is natív, valamint alameticinnel permeábilizált mikroszmákon végeztük. Eredményeink azt mutatták, hogy a máj mikroszómák bilirubin-ugt aktivitása jelentősen magasabb volt az etanolt kapott egyedekben, mint a kontrollban (3. táblázat). A szérum direkt bilirubin koncentrációja szintén szignifikánsan magasabb volt az etanolt kapott állatokban, mint a kontrollban (3. táblázat). A pnp-glukuronidokat összehasonlítva a bilirubin-glukuronid képződéssel, megállapítottuk, hogy csak a bilirubin-glukuronidáció fokozódott, mind a natív, mind a permeabilizált mikroszómákon végzett mérések szerint (3. táblázat). 31

32

33 3. Táblázat Etanol és gadolínium-klorid hatása a pnp-ugt és bilirubin-ugt enzim aktivitására, patkány máj mikroszómákon Kezelés A szérum direkt bilirubin koncentrációja (µm) p-nitrophenol fogyás (nmol/perc/mg fehérje) A pnp-ugt latenciája (%) Bilirubin -glukuronid képződés (nmol/perc/mg fehérje) A bilirubin- UGT latenciája (%) Per os Intravénásan natív permeabilizált natív permeabilizált Fiziológiás só savanyított só 1,19±0,45 2,66±0,65 36,27±6,35 92,88±0,67 0,013±0,001 0,250±0,007 94,80±0,61 Fiziológiás só GdCl 3 2,00±0,80 2,60±0,72 40,05±7,56 93,46±1,33 0,011±0,002 0,208±0,008 94,71±0,68 Etanol savanyított só 6,88±1,25 ** 2,63±0,35 38,61±2,08 93,16±1,00 0,029±0,003 * 0,812±0,061 * 96,43±0,79 Etanol GdCl 3 1,99±0,68 2,59±0,42 39,16±2,84 94,55±0,98 0,015±0,002 0,234±0,009 93,58±0,76 Az etanol és a GdCl 3 kezelésben részesült, valamint a kontroll (amelyek per os fiziológiás sóoldatot kaptak, intravénásan pedig enyhén savas ph-jú fiziológiás sóoldatot) patkányokat a kezelés 15. napján leöltük. Az állatoknak meghatároztuk a szérum bilirubin koncentrációját. A máj mikroszómák UGT enzimaktivitását is megvizsgáltuk alameticinnel történt permeábilizálás előtt és utána is. Az adatok az átlag ± szórás értéket adják meg, melyek 3-6 klönböző állatból származó mintán kaptunk. Az izokalorikus glukózoldatot kapott állatok szérumparamterei és a mért enimaktivitások nem különböztek a fenti táblázatban "kontroll"-ként megnevezett állatok értékeitől, ezért külön sorban nem lettek feltüntetve. A szignifikancia mértéke a kontrollhoz képest: * P<0.01; ** P<0,02, illetve a GdCl3 kezelésben részt vettekhez képest: P<0.05, P<

34 Etanol hatása a máj mikroszómák citokrom P450-2E1 és UGT1A1 fehérjéire Krónikus etanolkezelés hatására a CYP2E1 expressziója fokozódik [53]. Ezt a saját méréseink is igazolták (9/A ábra) Miután a CYP2E1 hasonlóan fokozódott, mint diabétesz, éhezés és acetonkezelés hatására, megvizsgáltuk Western blottal a máj bilirubin-ugt expresszióját. A RAL antitest az 54/53 kda-os fehérjében mutatott ki emelkedést (9/B ábra). Az R 10 antitest segítségével elkülöníthettük, hogy a RAL esetében látott indukció nagyrészt a bilirubin- UGT-nek tulajdonítható. (9/C ábra).az indukció mértékének kvantitálása céljából denzitometriás kiértékelést is végeztünk. A denzitometriás értékekből az indukció mértékét kiszámolva kb. 3-szoros indukciót kaptunk etanol esetében. A B 54/53 kda 52 kda 50 kda C 1.5 E G K * Denzitás (AU x mm) ábra Etanolkezelés hatása a máj mikroszómák P450-2E1 ésugt fehérje tartalmára Mikroszómális fehérjéket izoláltunk per os etanolkezelésben (3g/ttkg) részesült, izokalorikus glukózbevitelt kapott és normális laboratóriumi tápon tartott patkányok májából, melyeket 34

35 SDS/PAGE gélre vittünk fel mintánként 20µg menyiségben. A futtatás végeztével a fehérjéket átblottoltuk nitrocellulóz membránra. A membránokat CYP2E1 (A), RAL (B) és R 10 (C) antitestek jelelétében inkubáltuk. "E"-vel az etanollal kezelt; "G"-vel a glukózzal kezelt, "K"-val pedig a kontroll állatok májmikroszómáinak fehérjéit láthatjuk. A denzitométeres ábrázoláson az UGT1A1 fehérjère vonatkoztatott értékeket ábrázoltam a felvitt fehérjemennyiséghez viszonyítva. *: p< 0,05 a kontrollhoz (K) képest A krónikus etanol kezelés hatása a máj UGT1A1 mrns-re Diabéteszben és éhezésben a máj UGT1A1 bilirubin-glukuronozil transzferáz aktivitása és a fehérjetartalom növekedése együtt járt az enzim mrns-ének emelkedésével, indokoltnak tűnt az etanolkezelés hatását transzkripciós szinten vizsgálni. Ahhoz, hogy az indukció szintjét megállapíthassuk, Northern-blotot végeztünk a kísérletben részt vett állatok májából származó teljes RNS-sel. Próbának az UGT1A1 cdns-ét használtuk. Az eredményeink azt mutatták, hogy tartós etanolkezelés hatására az UGT1A1 mrns mennyisége több volt a kontrollhoz képest (10. ábra). Így etanol kezelés hatására a diabétesz mellituszban és éhezésben észleltekhez hasonló transzkripciós szintű indukciót figyeltünk meg. A UGT1A1 B 28S 18S E G K 10. ábra Etanolkezelés hatása a máj UGT1A1 mrns-re Teljes RNS-t izoláltunk a két hétig etanolkezelésben és a kontroll patkányok májából. Northernblotot végeztünk úgy, hogy sávonként minden mintából 20 µg RNS-t vittünk fel. Az UGT1A1 cdns-ének az [ - 32 P]dCTP-vel jelölt bázisáig tartó szakaszával hibridizáltunk, majd a jelölődést audioradiográfiás módszerrel tettük láthatóvá (A). A felvitt egyenlő RNS mennyiségeket az etídium-bromidot tartalmazó agaróz gélről készült UV felvétel mutatja (B). 35

36 Az "E" az etanolkezelt, a "G" az izokalorikus glukózooldattal itatott a "K" a kontroll állatok májából származó RNS-t jelzi Az etanol által kiváltott hatás felfüggesztése GdCl 3 hatására Krónikus egyidejű etanol és GdCl 3 kezelés hatása a bilirubin-ugt aktivitására Etanol és egyidejű GdCl 3 kezelésben részesült patkányok májából izolált mikroszómákon megmértük a bilirubin-konjugációt, illetve ugyanezen állatok szérumából meghatároztuk a bilirubin koncentrációját. Az egyidejű GdCl 3 -dal végzett kezelés hatására az etanol adására fokozódó bilirubin konjugáció nem különbözött a kontroll értékektől. A mikroszómákon ebben az esetben is megmértük a bilirubin illetve a p-nitrofenol-ugt aktivitást. A mikroszómális méréseket natív, valamint alameticinnel permeábilizált mikroszmákon végeztük. Eredményeink azt mutatták, hogy a máj mikroszómák bilirubin-ugt aktivitása jelentősen magasabb volt az etanolt kapott egyedekben, mint a GdCl 3 -t és etanolt is kapott állatokban (3. táblázat). A szérum direkt bilirubin koncentrációja szintén szignifikánsan magasabb volt az etanolt kapott állatokban, mint az egyidejűleg GdCl 3 -kezelésben részesültekben (3. táblázat). A pnpglukuronidokat összehasonlítva a bilirubin-glukuronid képződéssel, megállapítottuk, hogy csak a bilirubin-glukuronidáció fokozódott, mind a natív, mind a permeabilizált mikroszómákon végzett mérések szerint (3. táblázat) GdCl 3 hatása az etanol által kiváltott fehérjeindukcióra Ismert, hogy az etanol által kiváltott májat érintő elváltozásokban a Kupffer sejtek jelentős szerepet játszanak [52]. Annak kiderítésére, hogy vajon a Kupffer sejtek az etanol által kiváltott UGT1A1 indukcióban is szerepet játszanak-e, az etanol kezelésben részesült patkányok egy részének intravénásan gadolínium-kloridot (GdCl 3 ) adtunk. A GdCl 3 inaktíválja a Kupffer sejteket [69]. A GdCl 3 és etanol kezelésben egyszerre részesült állatok máj mikroszómáiban a bilirubin-glukuronidáció a kontroll értékre esett vissza (3. táblázat). Megvizsgálva a GdCl 3 hatását a fehérje expresszióra western blottal, * megállapíthattuk, hogy a GdCl 3 -dal kezelt és egyidejűleg etanolt is kapott állatokban az indukció nem volt megfigyelhető. A GdCl 3 önmagában nem okozott változást az UGT1A1 mennyiségében (11. ábra). 36

37 Denzitás (AU*mm) 1,0 0,75 0,5 0,25 0,0 K GdCl 3 GdCl 3 +E E * UGT1A1 54 kda 11. ábra Etanol és GdCl 3 kezelés hatása a máj mikroszómák UGT1A1 fehérje tartalmára Mikroszómális fehérjéket izoláltunk az etanollal kezelt (E), GdCl 3 -mat kapott(gdcl 3 ), GdCl 3 és etanol kezelésben egyszerre részesült (GdCl 3 + E) és a kontroll (K) patkányok májából, melyeket SDS/PAGE gélre vittünk fel mintánként 20µg menyiségben. A futtatás végeztével nitrocellulóz membránra blottoltuk a fehérjéket. A membránokat R 10 antitest jelelétében inkubáltuk. A kapott eredményeket denzitometrálás segítségével hasonlítottuk össze. *: p<0,01 a kontrollhoz és a GdCl 3 -mal kezelthez képest is A GdCl 3 hatása az etanol transzkripciós szintű UGT1A1 indukáló hatására Annak eldöntésére, hogy a Kupffer sejtek inaktivációja csak fehérje szinten érvényesülő hatást okoz, vagy befolyásolja az UGT1A1 mrns etanol hatására bekövetkező emelkedését Northern-blotot végeztünk. Megállapítottuk, hogy a GdCl 3 kivédte az etanol transzkripciós szintű UGT1A1 indukcióját (12. ábra). A GdCl 3 önmagában az UGT1A1 transzkripciót nem befolyásolta. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a Kupffer sejtek szerepet játszhatnak az etanollal kiváltott UGT1A1 indukcióban. 37

38 UGT1A1 -actin 1.5 K GdCl 3 GdCl 3 +E E Denzitás (AU x mm) * ábra Etanol és GdCl 3 hatása a máj UGT1A1 mrns-re eljes RNS-t izoláltunk a kontroll (K), a GdCl 3 -mat kapott(gdcl 3 ), GdCl 3 és etanol kezelésben egyszerre részesült (GdCl 3 + E) és az etanollal kezelt (E) patkányok májából. Northern-blotot végeztünk úgy, hogy sávonként minden mintából 20 µg RNS-t vittünk fel. Az UGT1A1 cdnsének az [- 32 P]dCTP-vel jelölt bázisáig tartó szakaszával hibridizáltunk, majd a jelölődést audioradiográfiás módszerrel tettük láthatóvá. A felvitt egyenlő RNS mennyiségekre a membránnak β-aktinnal való hibridizálása utal. A kapott eredményeket denzitometrálás segítségével hasonlítottuk össze.*: p<0,01 a kontrollhoz, ill. a GdCl 3 -mal kezeltekhez képest. 38