NEM SZTEROID GYULLADÁSCSÖKKENTŐ GYÓGYSZEREK (NSAIDS) MEGHATÁROZÁSA BIOLÓGIAI MINTÁKBAN

Átírás

1 Egészségtudományi Közlemények, 2.kötet, 1. szám (2012), pp NEM SZTEROID GYULLADÁSCSÖKKENTŐ GYÓGYSZEREK (NSAIDS) MEGHATÁROZÁSA BIOLÓGIAI MINTÁKBAN DR. EMMER JÁNOS 1, DR. LOVRITY ZITA 1, DOJCSÁKNÉ KISS-TÓTH ÉVA 1, JUHÁSZNÉ SZALAI ADRIENN 1, KOSKA PÉTER 1, DR. FODOR BERTALAN 1 Összefoglalás: Munkánkban rövid áttekintést adunk a nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek (NSAID) meghatározására alkalmas analitikai módszerekről, detektálási módokról. A biológiai mintáknál a minta előkészítése az analitikai folyamat legfontosabb része. Az előkészítési módszerek bemutatása után néhány gyakorlati alkalmazást ismertetünk. Kulcsszavak: NSAIDs, minta-előkészítés, kromatográfia, tömegspektrometria Bevezetés A reumaellenes szerek (antireumatikumok) legnagyobb és leggyakrabban terápiás célra használt csoportját a nem szteroid gyulladáscsökkentők (NSAIDs) alkotják. Fájdalomcsillapító és gyulladáscsökkentő hatásuk miatt széles körben alkalmazzák ezeket a készítményeket. Gyulladáscsökkentő hatásuk mellett általában lázcsökkentő (antipyreticus) hatással is rendelkeznek. E gyulladáscsökkentők kenőcsök, gélek formájában helyileg alkalmazva nagyon jól csökkentik a fájdalmat, izomgörcsöt. A nem szteroid gyulladáscsökkentő hatóanyagok és metabolitjaik minőségi és mennyiségi meghatározására elsősorban biológiai mátrixokban van igény, mint például plazma, szérum, vér, vizelet, különböző testnedvek és szövetek. A szermaradékok kimutatása és mennyiségi meghatározása az élelmiszerbiztonság igénye és környezeti minták vizsgálatánál is szükséges. Az egyik bonyolult összetételű mátrix például a szennyvíziszap. Tanulmányunkban először rövid áttekintést adunk a fő vizsgálati technikákról, amelyeket ezen a területen használnak, majd néhány kiválasztott példán bemutatjuk e módszerek alkalmazását NSAID meghatározására különböző biológiai mátrixokban. Vizsgálati módszerek nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek (NSAIDs) meghatározása A nemzetközi irodalom tanulmányozása után megállapítható, hogy a NSAIDhatóanyagok, gyógyszermaradványok és metabolitjaik kromatográfiás módszerekkel azonosíthatók és mennyiségileg meghatározhatók dúsítás és tisztítás után [1 5]. Egyes esetekben használják a tömegspektrometriát és az ultraibolya spektroszkópiát is kromatográfiás elválasztás nélkül [6, 7]. A NSAI-gyógyszerek és rokonvegyületeik elemzése igazi kihívás az analitikusok számára. Nincs általánosan elfogadott módszer. Különböző lehetőségek közül választhatunk. Ilyen a gázkromatográfia-tandem tömegspektrometria (GC-MS-MS), gázkromatográfia- 1 Miskolci Egyetem, Egészségügyi Kar, Nanobiotechnológiai és Regeneratív Medicina Tanszék

2 20 Emmer Lovrity Dojcsákné Kiss-Tóth Juhászné Szalai Koska Fodor nagyfelbontású tömegspektrometria (GC-HRMS), nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia-ultraibolya detektor (HPLC-UVD) és a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria (HPLC-MS-MS). Az utóbbi években egyre jobban terjed az ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC, UHPLC), fotodiódasoros és tömegspektrometriás detektálással (UPLC-PDA-MS), amellyel a kimutatási határ és a vizsgálati idő tovább csökkenthető. A döntés, hogy GC-t vagy LC-t választunk, a vizsgálandó vegyület fizikai-kémiai jellegétől függ. Az elválasztást követően a detektálás módja a döntő. Az MS alkalmazása megkönnyíti az azonosítást komplex, sokkomponensű rendszerekben és az érzékenysége is megfelelő. Az eluensek kiválasztásánál figyelembe kell venni, hogy izokratikus vagy gradiens elúcióval valósítják meg az elválasztást. A többkomponensű minta alkotóinak elválasztása főként gradiens elúcióval történik. Mivel a NSAI-gyógyszerek savas jellegűek, pk a = 3,0-4,5 közötti értékkel, az eluensrendszer egyik komponensének puffernek kell lennie, amivel a ph változtatható. A ph-t úgy kell beállítani, hogy a vizsgálandó szerves savak disszociációját visszaszorítsák. A vizsgálatok során különböző ph-jú foszfát-, acetát- és formiát puffer alkalmazható. Minta-előkészítés A minta előkészítése az analitikai folyamat egyik legfontosabb lépése a gyógyszerek és metabolitjaik kinyerésénél. Miért van szükség minta-előkészítésre? A minta nagyon híg koncentrálás, dúsítás, nagyon bonyolult a mátrix mintatisztítás, a minta közvetlenül nem kromatografálható extrakció, származékképzés. Az irodalomban számos leírást találunk gyógyszerek kinyerésére és a minták előkészítésére vizsgálathoz [8 14]. A kinyerés legtöbb esetben extrakcióval történik. A ma korszerű, gyors, környezetkímélő extrakciós eljárások: SPE szilárd fázisú extrakció DSPE diszperzív szilárd fázisú extrakció DPX szilárd fázisú extrakció pipettahegyben MISPE molekuláris lenyomatú polimer szilárd fázisú extrakció SPME szilárd fázisú mikroextrakció LPME folyadékfázisú mikroextrakció Az SPE lényege, hogy a szilárd állófázison a célkomponens megkötődjön, a szennyezők pedig átmosódjanak. A minta tisztul. Az állófázisról a megkötődött komponensek szelektíven leoldhatók a megfelelő oldószerrel. Dúsítás. Az SPE hatásosságát vizsgálni kell a különböző NSAID-hatóanyagoknál és metabolitoknál, ami függ az állófázis fajtájától és az elúcióra alkalmazott oldószertől. Fontos jellemző paraméter a visszanyerés és a kimutatási határ. Az SPME lelke egy vékony kvarcszálra felvitt polimer-, illetve adszorbensréteg. Leggyakrabban alkalmazott bevonó anyagok: poliakrilát, poli(dimetil-sziloxán-divinil-benzol), (PDMS-PDV), C18 és Carbowax-DVB. Az eljárás megoszlási egyensúly kialakulásán alapul: megfelelően megválasztott SPME-szál esetén a kialakuló egyensúly olyan, hogy a vizsgálandó komponens a szálra felvitt rétegben jelentősen dúsul. A célkomponens visszanyerése hődeszorpció vagy kioldás deszorpció eluenssel. A QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) eljárás gyors, egyszerű, olcsó, hatékony, robusztus és biztonságos módszer, melyet eredetileg peszticid szermaradékok meghatározására fejlesztettek ki zöldségekből és gyümölcsökből [10]. A módszer két

3 Nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek (NSAIDS) meghatározása részből áll: egy folyadék-folyadék extrakcióból (LLE), majd azt követő diszperzív SPE-ből (DSPE). DSPE használatánál a szorbens szerepe nem a vizsgálni kívánt, hanem a mátrix komponenseinek megkötése. A DSPE lényege, hogy a mintát kis mennyiségű szorbenssel összerázzák, majd a szorbenst centrifugálással vagy szűréssel elválasztják. DSPEszorbensnek bármely kromatográfiás állófázis alkalmazható. A DPX (disposable pipette extraction) egy változata a hagyományos SPE- és DSPEtechnikának. Az 1 vagy 5ml-es pipettahegyben a szorbens lazán van betöltve két frit közé, és a folyadékminta a felszívás során intenzíven keveredik a szorbenssel, amely hatékonyan extrahálja a megfelelő komponenseket. MISPE (molecularly imprinted polymer SPE): A rendkívül szelektív extrakció révén igen tiszta extraktumok nyerhetők. A gázkromatográfiás vizsgálatokhoz az erősen poláros, savas jellegű NSAIgyógyszereknél származékképzésre van szükség, hogy a vegyületeket illékonnyá és hőstabillá alakítsuk. A leggyakrabban alkalmazott reagensek: savanhidridek, benzilhalogenidek, alkil-kloroformátok, diazometán, szililező reagensek. A vizsgálati módszerek alkalmazásának bemutatása A NSAID-készítmények legfőbb felhasználási területe a humán gyógyászat, ezért a legtöbb analitikai vizsgálatra is ezen a területen van szükség. Suenami és munkatársai [1] NSAID-hatóanyagokat határoztak meg humán plazmában folyadékkromatográf és tömegspektrométer kapcsolt technikával. A minta tisztítása és dúsítása szilárd fázisú extrakcióval történt. Emami és munkatársai [4] ugyancsak humán plazmában mérték a diclofenac koncentrációját farmakokinetikai vizsgálat során. de Kanel [6] munkatársaival 14 nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszert határozott meg negatív elektroporlasztásos ionizációval, tandem tömegspektrometriával (ESI-MS/MS), kromatográfiás elválasztás nélkül. A módszerrel óránként 30 minta mérhető. Az ibuprofen mennyiségét Mitić [7] és munkatársai spektrofotometriás módszerrel határozták meg gyógyszerkészítményekben és humán plazmában. Demircan [15] és munkatársai szemészeti kezeléseknél mérték a diclofenac koncentrációját fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával, elektrokémiai detektálással (RP-HPLC-ECD). Dorado [3] és munkatársai vizeletben HPLC-s módszerrel mérték a diclofenac és metabolitjainak koncentrációját. Folyadékfolyadék extrakció (LLE) után a komponenseket fordított fázisú oszlopon választották el, a detektálás UV-tartományban 282 nm-en történt. Suárez [16] és munkatársai karboxilezett nanocsöveket (c-swnt) használtak NSAID-vegyületek koncentrálására vizeletből. A szorpciós kapacitást úgy növelték, hogy a nanocsöveket üvegpor felületén megkötötték, majd ezt egy 1,2 mm belső átmérőjű PTFE-csőbe töltötték. Ezt a mini oszlopot használták a komponensek töményítésére. A minták tisztítása után a vegyületeket kapilláris elektroforézissel határozták meg, tömegspektrometriás detektálással (CE-MS). Payán [17] munkatársaival szalicilsavat, ibuprofent és diclofenacot extrahált vizeletből. A kinyerés háromfázisú, üreges szál alapú, folyadékfázisú mikroextrakcióval (HF-LPME) történt, amelyhez dihexil-éterrel kezelt polipropilén membránt használtak. Ezt követően a HPLCmeghatározáshoz monolitikus szilika oszlopot használtak diódasoros (DAD) és fluoreszcens (FLD) detektorokkal. Napjainkban egyre inkább előtérbe kerül az élelmiszerbiztonság. Az élelmiszerekben előfordulhatnak peszticid maradékok, állatgyógyászatban alkalmazott gyógyszerek és

4 22 Emmer Lovrity Dojcsákné Kiss-Tóth Juhászné Szalai Koska Fodor metabolitjaik, természetes toxinok, környezeti szennyezők, az előállítás és tárolás során bekerült szennyezők. Malik és munkatársai [5] részletes áttekintést adnak a folyadékkromarográfia-tömegspektrometria (LC-MS) szerepéről az élelmiszervizsgálatokban. Az állatgyógyászatban is széles körben használják a nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszereket, ezért maradékaik és metabolitjaik vizsgálata az állati eredetű élelmiszerekben elengedhetetlen. A NSAID-tartalmat vizsgálták szarvasmarhák izomzatában és veseszövetében UPLC-MS/MS technikával, valamint tejében UPLC-TOF-MS-készüléken. Az extrakció minden esetben SPE-módszerrel történt. Dowling [18] munkatársaival gyors LC- MS/MS-módszert dolgozott ki NSAID meghatározására tejben. Jedziniak [19] és munkatársai NSAID-maradványokat határoztak meg állati izmokban ugyancsak LC-MS/MStechnikával. A gyógyszerek természetes úton és a hulladékokkal is kijuthatnak a környezetbe,és ott hatással lehetnek az ökoszisztémára tól kezdődően Indiában, Pakisztánban és Nepálban a keselyűk tömeges pusztulására figyeltek fel. A pusztulást a diclofenac állatgyógyászati alkalmazásával hozták kapcsolatba. Taggart és munkatásai [20] a kezelt és elhullott állatok májából 1488 mintát vizsgáltak meg, hét indiai államban. A mintákban kilenc féle NSAID-hatóanyag volt jelen. Az extrahálást acetonitrillel végezték. Homogenizálás, centrifugálás és szűrés után a gyógyszermaradványokat LC-ESI/MS-módszerrel mérték. A szennyvízbe kerülő NSAIDs a szennyvíziszapban feldúsulhat, ezért ennek vizsgálata is nagyon fontos a további felhasználás miatt. Radjenović és munkatársai [21] nyomás alatti folyadék extrakciót (PLE) kapcsoltak egy LC-MS/MS-rendszerhez, és így határozták meg a gyógyszereket, köztük NSAID-hatóanyagokat a szennyvíziszapból. Dobor és munkatársai [22] egy új minta-előkészítési módszert fejlesztettek ki savas jellegű gyógyszerek meghatározására szennyvíziszapban. Mikrohullámmal segített folyadék extrakciót és diszperzív mátrix extrakciót (DME) követően hagyományos SPE és származékképzés után GC-MSvizsgálatot végeztek. Mérték a szennyvíziszap ibuprofen-, naproxen-, ketoprofen- és diclofenac tartalmát. Az üreges szál alapú, folyadékfázisú mikroextrakció (HF-LPME) szennyvíziszapnál is alkalmazható NSAID kinyerésére. Sagristrà és munkatársai [23] közvetlenül alkalmazták, és ezt követően LC-MS-mérést végeztek. Saleh és munkatársai [24] pedig a nyomás alatti forró vizes extrakciót követően használták dúsításra és tisztításra. Következtetések Rövid áttekintésünkből kitűnik, hogy sokféle vizsgálati módszer használható NSAIDtartalmú biológiai minták elemzésére. Az alkalmas módszer kiválasztásánál figyelembe kell venni a meghatározni kívánt gyógyszer vagy metabolit fizikai-kémiai jellemzőit, valamint a mátrix összetételét. A minta előkészítése lehetőleg legyen gyors, egyszerű, olcsó, hatékony, robusztus és biztonságos. A bemutatott példák alapján látszik, hogy ezt nem könnyű megvalósítani. A kívánt cél eléréséhez a legtöbb esetben a különböző módszereket kombinálni kell. Köszönetnyilvánítás Jelen munka a TÁMOP B-10/2/KONV jelű projekt részeként az Új Magyarország Fejlesztési Terv keretében az Európai Unió résztámogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

5 Nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek (NSAIDS) meghatározása Irodalomjegyzék [1] Suenami, K., Lim, L. W., Takeuchi, T. et al.: Rapid and simultaneous determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in human plasma by LC MS with solidphase extraction. Anal Bioanal Chem, 2006, 384, p. [2] Martín, M. J., Pablos, F., González, A. G.: Simultaneous determination of caffeine and non-steroidal anti-inflammatory drugs in pharmaceutical formulations and blood plasma by reversed-phase HPLC from linear gradient elution. Talanta, 1999, 49, p. [3] Dorado P., Berecz, R., Cáceres, M. C. et al.: Analysis of diclofenac and its metabolites by high-performance liquid chromatography: relevance of CYP2C9 genotypes in diclofenac urinary metabolic ratios. Journal of Chromatography B, 2003, 789, p. [4] Emami, J., Ghassami, N., Talari, R.: A rapid and sensitive modified HPLC method for determination of diclofenac in human plasma and its application in pharmacokinetic studies. DARU, 2007, 15(3), p. [5] Malik, A. K., Blasco, C., Picó Y.: Liquid chromatography mass spectrometry in food safety. Journal of Chromatography A, 2010, 1217, p. [6] de Kanel, J., Vickery, W. E., Diamond F. X.: Simultaneous Analysis of 14 Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs in Human Serum by Electrospray Ionization- Tandem Mass Spectrometry without Chromatography. J. Am. Soc. Mass. Spectrom, 1998, 9, p. [7] MITIĆ S. S., MILETI, G. Ž., PAVLOVIĆ A. N. et al.: Quantitative analysis of ibuprofen in pharmaceuticals and human control serum using kinetic spectrophotometry. J. Serb. Chem. Soc., 2008, 73, 8 9, p. [8] Kole, P. L., Venkatesh, G., Kotecha, J. et al.: Recent advances in sample preparation techniques for effective bioanalytical methods. Biomed. Chromatogr., 2011, 25, p. [9] Kinsella, B., O Mahony, J., Malone, E. et al.: Current trends in sample preparation for growth promoter and veterinary drug residue analysis. Journal of Chromatography A, 2009, 1216, p. [10] Anastassiades, M., Lehotay S.J., Stajnbaher, D., et al.: Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC Internation, 2003, 86, 2, p. [11] Wille, S. M. R., Lambert, W. E. E.: Recent developments in extraction procedures relevant to analytical toxicology. Anal. Bioanal Chem., 2007, 388, p. [12] Kataoka, H.: New trends in sample preparation for clinical and pharmaceutical analysis. Trends in Analytical Chemistry, 2003, 22, 4, p. [13] Sarafraz-Yazdi, A., Amiri A.: Liquid-phase microextraction. Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29, 1, p. [14] Fontanals, N. R., Marcé, M., Borrull, F.: New materials in sorptive extraction techniques for polar compounds. Journal of Chromatography A, 2007, 1152, p. [15] Demircan, S., Sayin, F., Basci, N. E. et al.: Determination of Diclofenac in Subretinal and Aqueous Humor Fluids by HPLC with Electrochemical Detector. FABAD J. Pharm. Sci., 2005, 30, p.

6 24 Emmer Lovrity Dojcsákné Kiss-Tóth Juhászné Szalai Koska Fodor [16] Suárez, B., Simonet, B. M., Cárdenas S. et al..: Determination of non-steroidal antiinflammatory drugs in urine by combining an immobilized carboxylated carbon nanotubes minicolumn for solid-phase extraction with capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2007, 1159, p. [17] Payán, M. R., López, M. Á. B., Fernández-Torres, R. et al.: HPLC determination of ibuprofen, diclofenac and salicylic acid using hollow fiber-based liquid phase microextraction (HF-LPME). Analytica Chimica Acta, 2009, 653, p. [18] Dowling, G., Gallob, P., Malone, E. et al.: Rapid confirmatory analysis of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in bovine milk by rapid resolution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2009, 1216, p. [19] Jedziniak, P., Szprengier-Juszkiewicz, T., Olejnik, M. et al.: Determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs residues in animal muscles by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 2010, 672, p. [20] Taggart, M., Senach, K., Green, R. et al.: Analysis of Nine NSAIDs in Ungulate Tissues Available to Critically Endangered Vultures in India. Environ. Sci. Technol., 2009, 43, p. [21] Radjenović, J., Jelić, A., Petrović, M et al.: Determination of pharmaceuticals in sewage sludge by pressurized liquid extraction (PLE) coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Anal. Bioanal. Chem., 2009, 393, p. [22] Dobor, J., Varga, M., Yao, J. et al.: A new sample preparation method for determination of acidic drugs in sewage sludge applying microwave assisted solvent extraction followed by gas chromatography mass spectrometry. Microchemical Journal, 2010, 94, p. [23] Sagristrà, E., Larssonb, E., Ezoddin, M. et al.: Determination of non-steroidal antiinflammatory drugs in sewage sludge by direct hollow fiber supported liquid membrane extraction and liquid chromatography mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2010, 1217, p. [24] Saleh, A., Larsson, E., Yamini, Y. et al.: Hollow fiber liquid phase microextraction as a preconcentration and clean-up step after pressurized hot water extraction for the determination of non-steroidal anti-inflammatory drugs in sewage sludge. Journal of Chromatography A, 2011, 1218, p.