A C1q, a mannózkötő fehérje és a C-reaktív fehérje hatásának vizsgálata endotélsejteken, szerepük az endotél diszfunkcióban

Átírás

1 A C1q, a mannózkötő fehérje és a C-reaktív fehérje hatásának vizsgálata endotélsejteken, szerepük az endotél diszfunkcióban Doktori értekezés Oroszlán Melinda Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományi Doktori Iskola Témavezető: Prof. Dr. Romics László egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Molnár Miklós egyetemi docens Dr. Bajtay Zsuzsa tudományos munkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Falus András egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Erdei Anna egyetemi tanár, Dr. Réz Gábor egyetemi docens Budapest 2006.

2 A C1q, a mannózkötő fehérje és a C-reaktív fehérje hatásának vizsgálata endotélsejteken, szerepük az endotél diszfunkcióban Doktori értekezés Oroszlán Melinda Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományi Doktori Iskola Témavezető: Prof. Dr. Romics László egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Molnár Miklós egyetemi docens Dr. Bajtay Zsuzsa tudományos munkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Falus András egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Erdei Anna egyetemi tanár, Dr. Réz Gábor egyetemi docens Budapest

3 TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 4 1. ÖSSZEFOGLALÁS 5 2. SUMMARY 7 3. BEVEZETÉS ENDOTÉLSEJTEK ÉS SZEREPÜK AZ ÉR HOMEOSZTÁZISÁNAK SZABÁLYOZÁSÁBAN AZ ATEROSZKLERÓZIS PATOFIZIOLÓGIÁJA A KOMPLEMENTRENDSZER C1q, a C1-komplex felismerésért felelős alegysége C1q receptorok A C1q patológiás jelentősége az ateroszklerózisban A proteoglikánok szerepe a C1q funkcionális aktivitásának szabályozásában A mannózkötő fehérje (MBL) A MBL patofiziológiás jelentősége A C-reaktív fehérje (CRP) A C-reaktív fehérje szerepe az aterogenezisben A CRP, mint proinflammatorikus molekula? CÉLKITŰZÉSEK A C-reaktív fehérje és az endotélsejtek közti interakció vizsgálata Az endotélsejtek és C1q, illetve MBL közti interakció vizsgálata ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Vizsgálatainkhoz használt sejtkultúrák Humán köldökzsinór vénából izolált endotélsejtek (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) tenyésztése U937 sejtek tenyésztése Alkalmazott módszerek Reagensek A CRP preparátumok analízise szendvics ELISA módszerrel Immunfluoreszcens mikroszkópia A CRP preparátumok citotoxicitási vizsgálata Alamar Blue proliferációs vizsgálat Adhéziós molekulák detektálása sejtes ELISA (celisa) módszerrel MCP-1, IL-8 és IL-6 meghatározása HUVEC sejtek felülúszójából Áramlási citometriás vizsgálat 36 2

4 5.2.9 Kompetíciós vizsgálat Statisztikai analízis EREDMÉNYEK Natív és módosított C-reaktív fehérjék kölcsönhatása endotélsejtekkel A C-reaktív fehérje konformációs variánsainak analítikai vizsgálata ncrp és r m CRP citotoxicitási vizsgálata endotélsejteken r m CRP, u m CRP és ncrp extracelluláris kötődése endotélsejteken Natív és módosított CRP biológiai hatása HUVEC sejteken A MBL és a C1q interakciójának és biológia hatásának összehasonlítása endotélsejteken A MBL és a C1q extracelluláris kötődésének összehasonlítása endotélsejteken A MBL és a C1q kötődése LPS és TNF-α aktivált endotélsejtekhez Kompetíció a C1q és a MBL között az extracelluláris kötőhelyekért C1q és MBL receptorok extracelluláris expressziója az endotélsejteken Endotélsejtek aktivációja MBL és C1q kezelést követően A C1q kötődése endotél és U937 sejtekhez dekorin és biglikán extracelluláris mátrixfehérjék jelenlétében C1q-indukálta endotél aktiváció biglikán és dekorin jelenlétében MEGBESZÉLÉS Natív és módosított C-reaktív fehérjék kölcsönhatása endotélsejtekkel A MBL és a C1q interakciója és biológiai hatása endotélsejteken EREDMÉNYEINK ÖSSZEFOGLÁLASA ÉS KÖVETKEZTETÉSEINK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 85 3

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE a-ncrp: Ang II: celisa: CRP: CRT: CR1: C1-inh: EDTA: ELISA: ET-1: FACS: FCS gc1qr: HUVEC: ICAM-1: Ig: IL: LPS: MAC: MCP-1: MBL: ncrp: NE: NO: Ox-LDL: PAI-1: r m CRP: SAP: TF: TNF-α: u m CRP: VCAM-1: Nátrium-azid tartalmú C-reaktív fehérje Angiotenzin II Sejtes alapú enzimkapcsolt immunoszorbens assay C-reaktív fehérje Kalretikulin Komplement receptor-1 C1-inhibitor Etilén-diamin-tetraacetát Enzimkapcsolt immunoszorbens assay Endotelin-1 Áramlási citomteriás vizsgálat Fötális borjú szérum Globuláris C1q receptor Humán köldökzsinór véna endotélsejt Intercelluláris adhéziós molekula-1 Immunglobulin Interleukin Lipopoliszacharid Membránkárosító komplex Monocita kemotaktikus fehérje-1 Mannózkötő fehérje Natív C-reaktív fehérje Nemzetközi egység Nitrogén-monoxid Oxidált alacsony denzitású lipoprotein Plazminogén aktivátor inhibitor-1 Rekombináns módosított C-reaktív fehérje Szérum amiloid protein Szöveti faktor Tumor nekrózis faktor- α Urea-módosított C-reaktív fehérje Vaszkuláris sejt adhéziós molekula-1 4

6 1. ÖSSZEFOGLALÁS Az endotélsejtek fizikai határfelületet képeznek a vér és a szövetek között. A pro- és antiinflammatorikus fázis közti egyensúly megbomlása endotél diszfunkcióhoz vezet, mely az ateroszklerózis kezdeti lépése. Az endotélsejtek anatómiai elhelyezkedésüknek köszönhetően folyamatosan érintkeznek a vér humorális elemeivel, így komplement- és akut fázis fehérjékkel is. Célunk volt a klasszikus komplement kaszkád felismerésért felelős molekulájának, a C1q-nak, a lektin-út felismerő molekulájának, a mannózkötő fehérjének (MBL) és a klasszikus komplement kaszkádot is aktiváló akut fázis fehérjének, a C- reaktív fehérjének (CRP) az endotélsejtes interakcióját és az endotél diszfunkcióban betöltött szerepét vizsgálni. A szakirodalom mindhárom molekulának jelentőséget tulajdonít az ateroszklerózis kialakulásában, illetve progressziójában. Az adatok azonban hiányosak, ellentmondásosak és sokszor vitatottak. A CRP ateroszklerózisban betöltött proinflammatorikus szerepe kérdéses és aktív diszkusszió alatt áll. Kísérleteinkben pontosan karakterizált és LPS-mentes natív-, valamint konformációs variánsának a monomer-, vagy módosított CRP-nek az endotélsejtek aktivációjában betöltött szerepét vizsgáltuk. Elfogadott proinflammatorikus markereket (ICAM-1, VCAM-1, E-szelektin, IL-8 és MCP-1) mértünk CRP kezelést követően, azonban expressziójukban nem detektáltunk változást. Az endotélsejtek C1q-indukálta proinflammatorikus aktivációja bizonyított. Kimutattuk, hogy a klasszikus komplement kaszkád szabályozásában szerepet játszó két proteoglikán, a biglikán és a dekorin melyek az extracelluláris mátrix alkotóelemeigátolják a C1q kötődését az endotélsejtekhez. Továbbá, a biglikán gátolta a C1qindukálta megemelkedett IL-8 és MCP-1 expressziót. A MBL struktúráját tekintve nagymértékű hasonlóságot mutat a C1q-val, az endotélsejtek aktiválásában betöltött szerepe azonban nem ismert. Igazoltuk, hogy a MBL kálciummentes pufferben is képes kötődni az endotélsejtekhez, mely indirekt módon utal arra, hogy az interakció valószínűleg nem a Ca-függő globuláris doménen keresztül jött létre. A kialakult interakció C1q-val és vica versa gátolható volt, mely közös sejtfelszíni receptor(ok) szerepét feltételezi. LPS aktiválta sejteken megemelkedett C1q és MBL 5

7 kötődést detektáltunk, míg a TNF-α kezelés a C1q fokozott kötődést eredményezte. A C1q-val ellentétben a MBL nem aktiválta az endotélsejteket, az IL-8, az IL-6, a MCP-1 és az ICAM-1 expressziója nem változott. A komplementrendszer a veleszületett immunitás kulcsfontosságú komponense. Elsődleges feladata, hogy védelmet nyújt a szervezetünkbe behatoló patogénekkel szemben. Szabályozatlan működésük azonban autoimmun- és kardiovaszkuláris betegségek kialakulásához vezethet. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a CRP közvetlen módon nem gyakorol proinflammatorikus hatást se pentamer, se monomer formában vénás endotélsejtekre. Azt feltételezzük, hogy a C1q proinflammatorikus hatását extracelluláris mátrixfehérjék, úgymint a dekorin és a biglikán lokális expresszióján keresztül szabályozzák. A kialakult interakció gátolhatja a gyulladás kialakulását, illetve enyhítheti a gyulladást követő szöveti károsodást. Hipotézisünk továbbá, hogy a MBL és az endotélsejtek közt kialakult interakciónak szerepe lehet az aterogén antigének gyulladással nem kísért MBL-mediált eliminálásában, ily módon az MBL protektív szerepet tölthet be az ateroszklerózis kialakulásában. 6

8 2. SUMMARY INTERACTION OF C1q, MANNOSE BINDING LECTIN AND C- REACTIVE PROTEIN ON ENDOTHELIAL CELLS, THEIR ROLE IN ENDOTHELIAL DYSFUNCTION The endothelium is a physical barrier between the tissues and the blood. Disturbed balance between the anti- and proinflammatory phases alters the biological activities of endothelial cells and induces endothelial dysfunction, which is the initial step of atherosclerosis. Endothelial cells are exposed to humoral proteins in blood such as complement proteins and acute phase proteins. The goal of the study was to investigate the interaction of C1q, the recognition molecule of classical complement cascade, mannose binding lectin (MBL), the recognition molecule of lectin pathway, and one of the acute phase proteins, the complement activating C-reactive protein (CRP) to endothelial cells (ECs) and evaluate their role in endothelial dysfunction. All three molecules supposed to contribute in the pathogenesis of atherosclerosis. However, either their role is controversially discussed or there is a paucity of data concerning to their exact role. The proinflammatory role of C-reactive protein has been controversially discussed. We determined the role of carefully characterized and LPS-free native and modified CRP in the activation of ECs. None of the CRP variants induced increased expression of accepted proinflammatory markers such as ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, IL-8 and MCP-1. C1q is known as a potent proinflammatory stimulus of ECs. Our in vitro experiments proofed that abundant extracellular matrix proteins decorin and biglycan - which have been shown to regulate the classical complement pathway - strongly inhibited the binding of C1q to ECs. Furthermore, biglycan suppressed C1q-induced MCP-1 and IL-8 production by ECs. However, much less is known about the cellular interactions of the structurally similar molecule, MBL. We showed that MBL exhibited a dose-dependent binding to 7

9 ECs under calcium-free conditions, which indicates an indirect way of involvement of its calcium-independent collagenous domains. We showed in cross-competition experiments that the binding can be inhibited by C1q and vice versa, suggesting that MBL and C1q recognize shared receptor(s) on the endothelial cell surface. ECs activated with LPS showed increased C1q and MBL binding and TNF-α activation led to elevated C1q binding. In contrast to C1q, stimulation of ECs with MBL did not result in a detectable increase in the expression of ICAM-1 and production of IL-6, IL-8 and MCP-1. The complement system is a key component of the innate immune system involved in protection against invading pathogens. However, their uncontroled activity might contribute to the pathogenesis of several inflammatory diseases such as cardiovascular and autoimmune diseases. In summary, our findings do not support the notion that different isoforms of CRP alone have significant effects on inflammation of the vessel wall via an interaction with endothelial cells. We hypothesize that local expression of decorin and biglycan might regulate the proinflammatory role of C1q and thereby attenuate the inflammation and limit tissue damage. Furthermore, we speculate that binding of MBL to endothelial cells might be involved in the non-inflammatory clearance of atherogen antigens via endothelial cells, which might indicate a protective role of MBL in the pathogenesis of atherosclerosis. 8

10 3. BEVEZETÉS A fejlett ipari országokban a halálesetek kb. 45%-a, tehát messze a legnagyobb hányada keringési eredetű. Az érelmeszesedés (ateroszklerózis) korunk népbetegsége, általános érbetegség, mely vezető haláloknak számít hazánkban is. Okát és létrejöttének mechanizmusát minden részletében még ma sem ismerjük. Közel 200 évre nyúlik vissza az a megfigyelés, hogy az ateroszklerózis kialakulásában a gyulladásos folyamatoknak van kulcsszerepe, azonban a 20. századot döntően a lipid-teória dominálta. A 70-es években Sir Russell Ross kezdte ismét a gyulladás fontosságát hangsúlyozni a betegség kialakulásában és az endotél diszfunkciót nevezte meg az első lépésnek. Az endotélsejtekről alkotott felfogás teljesen átalakult az elmúlt évtizedek során. Kezdetben csak egy egyszerű sejtrétegnek tekintették, mely fizikai határfelületet képez vérünk és szöveteink között. Ma azonban már egy olyan endokrin, autokrin és parakrin szervet értünk az endotéliumon, mely aktívan vesz részt az ér homeosztázisának kialakításában, megváltozott működése pedig számos betegség, így az ateroszklerózis kialakulását is eredményezheti. 3.1 ENDOTÉLSEJTEK ÉS SZEREPÜK AZ ÉR HOMEOSZTÁZISÁNAK SZABÁLYOZÁSÁBAN Az endotélsejtek alkotta folytonos sejtréteg, az endotélium az erek intimális felszínét borítja. Területét több négyzetméterre és tömegét a teljes testtömeg 1%-ra becsülik [1, 2]. Aktívan vesz részt a vérkeringés szabályozásában, az érfalak integritásának fenntartásában, az erek homeosztázisának kialakításában és patofiziológiás folyamatokban. Fiziológiás körülmények közt a sejtek felszíne antitrombotikus, így megakadályozza a véralvadási kaszkád aktivációját, a leukociták adhézióját és a vérlemezkék trombózisát [3]. Az endotélsejtek rendkívül heterogének. A citoszkeleton struktúráltsága, az extracelluláris mátrixszal kialakított kapcsolat, az adhéziós molekulák expressziója, anatómiai elhelyezkedésük és funkciójuk határozza meg fenotípusukat [2], [4]. Sokszínűségükért örökletes és nem-örökletes, például környezeti tényezők is 9

11 felelősek. Mindez a gyakorlatban azt jelenti, hogy a genetikai anyagban tárolt tulajdonságok megmaradnak számos passzázson keresztül is, de a környezet által kialakított jellemzők eltűnnek, illetve átalakulnak. A sejtek különbözhetnek méretben, funkcionális és metabolikus aktivitásukban [4-6]. A kis erek falát főként lapos, longitudinális sejtek határolják, míg a nagy erekre a poligonális forma a jellemző [2]. Különbséget találunk a Weibel-Palade testek relatív mennyiségében is. A legkevesebb Weibel-Palade testet a mikroerek endotélsejtei, míg a legtöbbet a szívhez közeli erek sejtei tartalmazzák [2, 7]. Bizonyos fenotípusos és funkcionális paraméterekben hasonlóságot mutatnak a monocita/makrofág sejtekkel, például MHCII-t, komplement- és Fc-receptorokat is expresszálnak [2]. Patológiás leírásoknál gyakran találkozunk az aktivált endotélium, illetve az endotél diszfunkció fogalmával. Korábban az endotél aktiváció alatt azt értettük, amikor egy stimulus hatására aktivációs antigének jelentek meg a sejtek felszínén. Ma már azonban ez egy komplex fenotípusos jelenséget ír le, amit gyulladásos mediátorok hoznak létre. Különböző gyulladásos stimulusok különböző fenotípust eredményezhetnek és a különböző anatómiai helyről származó endotélsejtek különbözőképpen reagálhatnak ugyanarra a szignálra. Az endotélium aktivált állapotát az adhéziós molekulák fokozott expressziója, a megváltozott permeabilitás és a prokoagulációs állapot jellemzik. Az aktiváció első fázisa az I-típusú aktiváció, melyben nem vesznek részt géntranszkripciós folyamatok és újonnan szintetizálódott fehérjék. Jellemzői, hogy megjelenik a sejtek felszínén az intracellulárisan Weibel-Palade granulumokban tárolt P-szelektin, a sejtek von Willebrand-faktort és kemokineket szekretálnak. Továbbá megszűnik a sejtfelszín antitrombotikus jellege, lehasítódnak a heparán-szulfát, trombomodulin molekulák, valamint átrendeződik a citoszkeleton és ennek következtében megnövekszik az erek permeabilitása [3, 8-10]. Az aktiváció második fázisát, a II-típusú aktivációt aktív géntranszkripció és fehérjeszintézis jellemez. Aktiválódnak a proinflammatorikus gének, megemelekedik az intercelluláris sejt adhéziós molekula-1 (ICAM-1), vaszkuláris sejt adhéziós molekula-1 (VCAM-1), E- szelektin, IL-1α/β, IL-6, IL-8, monocita kemotaktikus protein-1 (MCP-1), plazminogén aktivátor inhibitor-1 (PAI-1) és szöveti faktor (TF) expressziója [11-14]. Az endotél diszfunkció definiálása már nehezebb feladat. Eredetileg az endotélsejtek vérlemezkék iránti megnövekedett adhéziós kapacitását jelentette. Az elmúlt évtizedekben leginkább 10

12 az erek megváltozott vazomotoros működésének jellemzésére használták. Az endotélsejtek az értónus szabályozását vazodilatátorok és vazokonstriktorok termelésén keresztül fejtik ki. Az endotélium által termelt vazodilatátorok közül a nitrogénmonoxidnak (NO) döntő jelentősége van. Normál endotél funkció esetén humorális és mechanikai ingerek hatására fokozódik a NO termelés. Ilyen ingerek az acetilkolin, ADP, bradykinin, hisztamin, trombin, substance P és a fokozott áramlás miatt keletkező nyírófeszültség. A NO az értónus közvetlen szabályozása mellett szabályozza a növekedési faktorok, adhéziós molekulák expresszióját, a trombocita adhéziót és aggregációt és a hemosztázist. Az endotélsejtek által termelt bradykinin és prosztaciklin szintén vazodilatátor hatásúak. A vazokonstriktorok közül az endotelin, a tromboxán és a prosztaglandin a legismertebbek. Az endotélium által termelt vazoaktív faktorok rendkívül bonyolult rendszert képeznek. Egy faktor szintjének megváltozása átmenetileg kibillenti az egyensúlyt, ami a rendszerben ellenreakciókat vált ki, és ez szerencsés esetben egy új egyensúlyi állapotot eredményez. Normális endotél funkció esetén az egyensúly gyorsan helyreáll, ellenkező esetben olyan láncreakciók indulhatnak be, melyek többek közt az ateroszklerózis kialakulásához vezetnek. Az endotél diszfunkciót a megváltozott vazomotoros működésre leszűkíteni azonban erősen redundáns. Az endotél diszfunkciót úgy lehet talán a legpontosabban definiálni, hogy az endotélsejtek olyan megváltozott működése, mely tehertételt jelent a szervezet számára. Endotél diszfunkció játszik szerepet autoimmun betegségekben, iszkémia/reperfúziós károsodásban, graft versus host reakcióban és ateroszklerózisban is. 3.2 AZ ATEROSZKLERÓZIS PATOFIZIOLÓGIÁJA Az ateroszklerózis kialakulásában egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak az endotél diszfunkciónak. Az endotélsejtek diszfunkciója az aterogenezis egyik, ha nem legkorábbi lépése. Az ateroszklerózis klasszikus rizikófaktorai a magas vérnyomás, a dohányzás, az elhízás, a cukorbetegség, a magas homocisztein szint, a zsíranyagcsere zavara és a különböző fertőzések (pl: Chlamydia pneumoniae, Helicobacter pylori). Mivel minden sejt egy miniatűr adó-vevőként szolgál, érzékelik környezetük biokémiai és 11

13 biomechanikai tulajdonságait és változásait, így például a magas vérnyomás következtében megnövekedett nyírófeszültséget, a dohányzás során szervezetünkbe kerülő toxinokat és a felszabaduló reaktív oxigén gyököket, a diabéteszes betegek magas vérglükóz szintjét és a káros oxidált alacsony denzitású lipoproteint (ox-ldl). A szklerotikus plakkot borító endotélsejtek megváltozott gén- és fehérje expresszióval és diszfunkcióval jellemezhetőek. Az endotél diszfunkció csökkent NO, trombomodulin és prosztaciklin működésben, megemelkedett angiotenzin II (Ang II), endotelin-1 (ET-1), PAI-1, TF, adhéziós molekula és citokin expresszióban, valamint megnövekedett permeabilitásban manifesztálódik. A diszfunkcionális endotélium abnormális vazomotoros működést okoz, kedvez a lipoproteinek oxidációjának, a lipidek felhalmozódásának, a gyulladásnak és a simaizom sejtek proliferációjának. Ha a gyulladás nem elég hatékony és nem sikerül eltávolítani vagy neutralizálni a patogéneket, akkor tovább folytatódik az ateroszklerózis progressziója. Monociták és T-sejtek jelennek meg a szubendoteliális térben. A mononukleáris sejtek ún. görgésében (rolling) és adhéziójában szelektinek (E- és P-szelektin), sejt adhéziós molekulák (ICAM-1, VCAM- 1) és integrinek vesznek részt. A monociták kemotaxisáért és transzmigrációjáért az IL-8 és a MCP-1 a felelős. A monocita kolóniastimuláló faktor (MCSF) hatására a monocitákból makrofágok keletkeznek, intracellulárisan ox-ldl-t halmoznak fel, habos sejtekké alakulnak és kialakul a jellegzetes zsír -réteg. Az extracelluláris mátrix felszaporodása, a simaizom sejtek proliferációja és intimába vándorlása eredményezi a fibrózus sapkát, kialakul az ateroma. Az artéria lumene a lézió progressziójával folyamatosan szűkül, a vérkeringés elégtelenné válik. A makrofágok által termelt metalloproteináz enzimek elemésztik a fibrózus sapkát, egy erősen trombogén felszín jön létre, ami végül az artériák elzáródásához vezet (1. ábra) [15, 16]. Az endotélsejtek anatómiai elhelyezkedésüknek köszönhetően kapcsolatba kerülnek vérünk humorális elemeivel, így akut fázis- és komplementfehérjékkel is. A szklerotikus plakkban immunhisztokémiai jelöléssel kimutatták a klasszikus komplement kaszkád felismerő egységének, a C1q-nak és a C-reaktív fehérje (CRP) akut fázis fehérjének a lerakódását. Mindkét molekulának aktív szerepet feltételeznek a betegség kialakulásában és progressziójában. A mannózkötő fehérje (MBL), mely a lektinfüggő komplement kaszkád felismerő molekulája szoros szerkezeti rokonságot mutat a C1q-val. 12

14 Azonban a humán vizsgálatok arra utalnak, hogy a MBL -a C1q-val ellentétbenprotektív szerepet tölt be az ateroszklerózis kialakulásában. A további fejezetekben a C1q és MBL komplementfehérjék, valamint a CRP akut fázis fehérje kerül bemutatásra, valamint az endotél diszfunkcióban, illetve ateroszklerózisban betöltött szerepük ismertetésre. 1. ábra. Az ateroszklerózis kialakulásának fázisai A. Az adhéziós molekulák és citokinek/kemokinek fokozott expressziója jellemzi az ateroszklerózis kezdeti fázisát. Ez elősegíti a monociták, T-sejtek vándorlását és felhalmozódását a szubendoteliális térben. B. A monociták makrofágokká, majd ox-ldl és zsírok felvételével habos sejtekké alakulnak. Az endotélsejtek felszíne protrombotikussá válik, vérlemezkék tapadnak az endotéliumhoz. Megkezdődik a simaizomsejtek migrációja az intimába. C. Folytatódik a makrofágok akkumulációja a szubendoteliális térben, melyek a felhalmozódott nekrotikus törmelékkel együtt kialakítják a plakk fibrózus sapkával borított nekrotikus magját. D. A makrofágok metalloproteinázokat termelnek, melyek elemésztik a fibrózus burkot. Trombogén felszín jön létre. Trombus keletkezik, ami az artériák elzáródásához vezet. Ross, R., Atherosclerosis--an inflammatory disease. N Engl J Med, (2): p alapján. 13

15 3.3 A KOMPLEMENTRENDSZER Az evolúció során az immunhomeosztázis fenntartására először a filogenetikailag ősibb veleszületett vagy természetes immunitás alakult ki, erre épült rá a szerzett vagy adaptív immunitás. A szervezetbe bejutó patogének először a természetes immunrendszer elemeivel találkoznak, az adaptív immunrendszer csak napokkal később aktiválódik. A természetes immunitásnak szerepe van az antigénspecifikus folyamatok elindításában, annak eldöntésében, hogy a fajlagos immunrendszer mely antigénekre és milyen effektorfunkcióval válaszol, valamint a szöveti integritás megőrzésében és a javító (repair) mechanizmusokban is. A természetes immunitás legfontosabb celluláris elemei a fagociták (monociták, makrofágok, granulociták), dendritikus sejtek, NK-sejtek, CD5 + B- sejtek és γ/δ T-sejek, humorális elemei pedig a komplementrendszer és a citokinek (IFNα, IFN-β, TNF, IL-1, IL-6). A nem-fajlagos védekezőrendszer humorális és sejtes komponensei egyaránt képesek arra, hogy szinte válogatás nélkül pusztítsanak el minden struktúrát, amely az egyed integritását veszélyezteti elsősorban a patogének cukor, lipid, nukleinsav és sziálsavmintázatát (Pathogen Associated Molecular Pattern-PAMP) ismerik fel a csíravonalban kódolt receptoraikkal (Pattern Recognition Receptors-PRR). Megkülönböztetünk sejtfelszíni és szolúbilis PRR-eket. Mindkét csoport heterogén, struktúrálisan és funkcionálisan különböző molekulák halmazai. Sejtfelszíni molekulák a Toll-like receptorok, scavanger receptorok, lektin receptorok és G-fehérjéhez kapcsolt receptorok. A MBL és a CRP a szolúbilis PRR molekulák közé tartoznak. Mivel a természetes immunitásnak nincs memóriája és az immunválasz nem antigénre specifikusan alakul ki, gyakran saját sejtek esnek a védekezés áldozataivá. A komplementrendszer a vérben és különböző testnedvekben inaktív állapotban jelen lévő, egymást láncreakcióban aktiváló faktorok, valamint a kaszkádot szabályozó molekulák összesége. A komplementrendszer megjelenése megelőzte az adaptív immunitás kialakulását, ami magyarázatot ad arra, miért játszik oly fontos szerepet annak szabályozásában. A komplement aktiváció a klasszikus, a lektinindukált és az alternatív úton indulhat el (2. ábra). A klasszikus utat elsősorban IgG, IgM, vagy CRP tartalmú immunkomplexek aktiválják. A folyamat első lépése, hogy a C1-molekulakomplex felismerésért felelős molekulája, a C1q hozzákötődik az immunkomplexhez, melynek 14

16 hatására aktiválódnak a komplex szerin-proteázai. A lektinfüggő aktiválást a különböző szénhidrát molekulákkal reagáló MBL és fikolinok, valamint a hozzájuk kötődő szerinproteázok indítják el. Az alternatív út aktiválódását mikroorganizmusok és immunkomplexek is indukálhatják. A kaszkádok számos ponton pozitív visszacsatolás révén képesek amplifikálódni és aktív molekuláiknak számát jelentősen megnövelni. Ezért van kiemelkedő jelentősége a több ponton történő regulációnak. A szerinproteázok, a konvertáz enzimek és a membránkárosító komplexek kialakulása és működése is szabályozódik. A komplement szabályozatlan aktivációja számos betegség, például: szívinfarktus, reumatoid artritisz és herediter angioneuroticus oedema (HANO) patomechanizmusában is szerepet játszik. klasszikus út immunkomplex (IgG, IgM), CRP, SAP, PTX3 lektinfüggő út mikrobiális cukrok, IgA alternatív út mikrobiális felszín, IgA C1q, 2C1r, 2C1s C1-inh MBL/ fikolinok MASP`s, Map-19 B-faktor D-faktor C3(H 2O) Ba C3(H 2O)Bb C4 C2 C4a C4b C4b2a C2b C2a C3a C3 C3a B-faktor D-faktor C3 C3a C3b H-faktor C3b C3bBb I-faktor C4b2a3b CR1 DAF C3bBb3b properdin C4BP MCP H-faktor C5 C5a C5b vitronektin C6 C7 CD59 kluszterin C8 C9 C8bp C5b-9 15

17 2. ábra. A komplementrendszer aktiválásának útjai A klasszikus útvonalat főként IgG és IgM tartalmú immunkomplexek aktiválják. A C1q kötődik az ellenanyag molekula Fc-részéhez, mely kiváltja a C1r és C1s szerin-proteázok aktiválódását. Az aktív C1s hasítja a C2-t és C4-t. Kialakul a C4b2b komplex, azaz a C3-konvertáz, mely a C3 hasítását végzi. A kialakult C4b2b3b heterotrimer komplex, a C5 konvertáz a C5-t hasítja. A lektinindukálta útvonal felismerő molekulái, a MBL, a H- és a L-fikolin, melyek a MASP-1, a MASP-2, a MASP-3 és a Map-19 szerin-proteázokkal alkotnak komplexet Ligandjaik főként mikrobiális poliszacharidok. A lektinindukálta komplement kaszkád soron következő lépései innentől kezdve azonosak a klasszikus útvonal lépéseivel. A klasszikus út aktiválódása során keletkező C3b és a C3 hidrolizációs terméke, a C3H 2 O az alternatív út aktivációját is elindítja. Magnézium jelenlétében a C3b mellé kötődik a B-faktor, ami lehetőve teszi a D- faktorral való reakciót. Ez az enzim a B-faktort hasítja és létrejön az alternatív út C3 konvertáza, a C3bBb. A komplexet a properdin stabilizálja. A C3bBb mellé kötődő újabb C3b molekula létrehozza a C5- konvertázt, a C3bBbC3b komplexet. A terminális fázisában alakul ki a membránkárosító komplex. Elemei a C5b, a C6, a C7, a C8 és a C C1q, a C1-komplex felismerésért felelős alegysége A C1q elsősorban immunkomplexeket ismer fel, bár retrovírusok burokfehérjéit, β- amiloid szálakat, LPS-t, Gram-negatív baktériumok porin fehérjéit, foszfolipideket, apoptotikus testeket és akut fázis fehérjéket, úgymint CRP-t is leírták, mint C1q ligandumokat [17-19]. Sajátságuk, hogy negatív töltésűek, így a C1q elsősorban töltéssel rendelkező csoportok felismeréséért felelős [20]. A molekulát 18 (6A, 6B, 6C) polipeptidlánc építi fel, melyek hármasával összefonódva egy hat szál tulipánból álló csokorra emlékeztető struktúrába rendeződnek (3. ábra) [21]. A polipeptidláncokra jellemző a ciszteinben gazdag, rövid N-terminális, globuláris vagy feji domén. A C- terminális, farki domén kollagénszerű struktúráltságot mutat. A kollagénszerű szárakhoz kapcsolódnak a C1s és C1r szerin-proteázok [22]. A C1-komplex szabályozását a C1- inhibitor (C1-inh) végzi, kovalens komplexet alkot a szerin-proteázokkal, ami a komplex disszociációjához vezet [23-25]. A felszabaduló kollagénszerű domén számos sejthez kötődik és a sejtek működését receptormediált úton közvetlenül szabályozza (1. táblázat) [26-59]. A molekula részt vesz a szervezet védekezőmechanizmusaiban, gyulladásban, baktériumok fagocitózisában, vírusok neutralizációjában, az apoptotikus testek eliminálásában és az immunológiai tolerancia kialakításában [18, 60-62]. C1q deficiencia 16

18 esetén autoantigénekben gazdag apoptotikus testek halmozódnak fel a szövetekben, ami autoimmunválaszt válthat ki [63-65]. A SLE kialakulásában központi szerepet tulajdonítanak az örökletes C1q-deficienciának [65]. A C1q in vivo jelentőségét demonstrálja, hogy C1q-deficiens személyekben a SLE kialakulásának valószínűsége rendkívül nagy, homozigóta C1q-deficiens személyek 90%-ban kialakul [65]. A C1q valószínűleg a késői apoptotikus testek clearance mechanizmusában fontos, mivel a korai apoptotikus testeket a C1q csak kis affinitással köti [17]. A C1q-opszonizált apoptotikus testek fagocitozisát elsősorban makrofágok és éretlen dendritikus sejtek végzik [17]. Sejt Neutrofil Fibroblaszt Endotélsejt Neuron B-sejt Hatás Fokozza a reaktív oxigén gyökök termelését [43, 44, 52, 53]. Kemotaktikus hatású [59]. Apoptózist indukál és gátolja a sejtek migrációját [29, 30]. Kemotaktikus hatású [56]. Fokozza a sejtek ICAM-1, VCAM-1, E-szelektin, IL-8, MCP-1 és IL-6 expresszióját [27, 28, 47, 58]. Fokozza a reaktív oxigén gyökök termelését. Fokozza az IgG, IgA és IgM termelését [37, 55]. Gátolja az IL-1 expresszióját [57]. T-sejt Befolyásolja a sejtek citokin termelését [48] és antiproliferatív hatású [26, 66]. Dendritikus sejt Kemotaktikum [49] és gátolja az LPS-indukálta IL-12p40 produkciót [51]. Eozinofil Indukálja a sejtek migrációját [34]. Fokozza a sejtek ADCC aktivitását [38]. Vérlemezke Fokozza a P-szelektin, GPIIb-IIIa fibrinogén receptorok expresszióját és a prokoagulációs aktivitást [32, 33, 35]. Simaizom sejt Fokozza a sejtek oxidatív metabolizmusát [50]. Monocita/makrofág Glomeruláris mezangiális sejt Fokozza a sejtek fagocitózisát [39, 41, 42] és a proinflammatorikus citokinek expresszióját [45]. Indukálja az antitestfüggő apoptózist [54]. Szinoviális sejt Fokozza az IL-8 termelését [46]. 1. táblázat. A C1q szerepe a sejtaktivációban 17

19 3. ábra. A C1q struktúrája A molekulát 18 (6A, 6B, 6C) polipeptidlánc építi fel, melyek hármasával összefonódva egy hat szál tulipánból álló csokorra emlékeztető struktúrába rendeződnek. Megkülönböztetjük az N-terminális, globuláris vagy feji domént és a kollagénszerű, C- terminális farki domént. Expert reviews in Molecular Medicine, Cambridge University Press alapján C1q receptorok A C1q fej és szár specifikus receptorai is ismertek. A C1-komplex disszociációja teszi lehetővé a komplexben rejtett C1q epitópok és a receptorok közti interakciót. Kalretikulin (CRT): A kalretikulint és komplement receptor-1-t (CR1) azonosították, mint a C1q molekula kollagénszerű doménját felismerő receptorokat. A CRT 60 kda tömegű multifunkcionális fehérje. Magvas sejtek endoplazmatikus retikulumában, mint chaperon és a Ca 2+ homeosztázist szabályozó fehérje működik [67]. Transzmembrán és GPI-horgonyzó doménnal nem rendelkezik, ezért extracelluláris expressziója koreceptort igényel [68-70]. Makrofágokon és dendritikus sejteken a CD91-t, B16 egér melanoma sejteken az α6β1-t, aktivált T-sejteken a natív MHCI-t, antigén prezentáló sejteken a scavanger receptor-a-t, míg neutrofileken a CD59-t azonosították, mint koreceptorokat [62, 69, 71-73]. A CRT, mint MBL receptor is ismert [74]. Komplement receptor-1 (CR1, CD35): Hasonlóan a kalretikulinhoz, szintén a C1q kollagénszerű doménját ismeri fel. Az interakciónak az immunkomplexek eliminációjában tulajdonítanak elsősorban szerepet. A receptor a MBL felismerésére is képes [75]. Leukociták és eritrociták felszínén a C3b és a C4b receptoraként funkcionál. Szerepe az opszonizált immunkomplexek felismerése és eliminálása keringésünkből a májon és a bélrendszeren keresztül. A CR1 extracelluláris expressziójára vonatkozó irodalmi adatok ellentmondásosak [76, 77]. Hypoxiát, TNF-α, IFN-γ és LPS stimulációt 18

20 követően kimutatták fixált endotélsejteken. Ebből azonban a fehérje intracelluláris expressziójára következtethetünk [76]. Ezzel szemben Langeggen és munkacsoportja HUVEC sejtek extracelluláris CR1 expresszióját írta le [77]. : C1qR O2- A receptor funkciója igen, identitása azonban nem ismert [53]. A C1q ezen a recptoron keresztül váltja ki a neutrofilek oxigén-szabadgyök aktivitását. α 2 β 1 : Edelson és szerzőtársainak 2006-ban megjelent publikációja az első, mely leírja, hogy az integrinek családjába tartozó α 2 β 1 is képes a C1q és a kollektinek, MBL és SP-A kötésére. A kialakult interakció EDTA érzékenysége arra utal, hogy a receptor a MBL globuláris doménját köti. Arra azonban a cikk nem ad választ, hogy vajon a C1q kollagénszerű vagy globuláris doménját felismerő receptorról van-e szó [78]. gc1qr: A C1q molekula globuláris doménját kötő, 33 kda tömegű multifunkcionális, multiligand specificitású protein, mely azonos a mitokondriális p32 fehérjével [68, 79]. Ligandjai közt említik a vitronektint, a nagy molekulasúlyú kininogént és a trombint. A kalretikulinhoz hasonlóan szintén nem rendelkezik transzmembrán doménnal, ami megkérdőjelezi a receptor extracelluláris expresszióját. Ghebrehiwet és munkatársai a gc1qr sejtfelszíni, TNF-α- és LPS-indukálta expresszióját figyelték meg [80]. Ennek ellentmond az a megfigyelés, hogy a gc1qr csak permeabilizált sejteken mutatható ki, ami a receptor intracelluláris lokalizációjára utal [66] A C1q patológiás jelentősége ateroszklerózisban Bizonyított, hogy a gyulladásos miliő kialakításában komplement molekulák is részt vesznek. A membránkárosító komplex (MAC) depozíciója utal a szklerotikus lézióban történt komplement aktivációra. A C1q-t a szklerotikus plakk nekrotikus magjában és a fibrózus sapkában is kimutatták [81, 82]. A C1q legalább kétféle módon vehet részt az ateroszklerózis progressziójában. Egyrészt a ligandkötött C1q aktiválja a klasszikus komplement kaszkádot és a felszabaduló komplement aktivációs termékek közvetett módon aktiválják az endotélsejteket. A C3a fokozza a sejtek IL-8, IL-1β és RANTES produkcióját. A C5a fokozza a P-szelektin, a késői adhéziós molekulák (ICAM-1, VCAM-1 és E-szelektin), számos citokin (IL-6, IL-8, IL-1β és RANTES) és receptoruk expresszióját (IL-6R és IL-8R) [83, 84], valamint a sejtek elveszítik az extracelluláris proteoglikán és heparán-szulfát védőréteget, felszínük ezáltal protrombotikussá válik 19

21 [85]. Kimutatták, hogy a MAC szubletális koncentrációban kötődik az endotélsejtekhez, fokozza a P-szelektin és az IL-1α expresszióját, valamint szinergisztikus módon erősíti a TNF-α hatását [86]. A MAC, mint koagulációs promóter is ismert. Fokozza a sejtek von Willebrand-faktor szekrécióját, mely kedvez a vérlemezkék adhéziójának és fokozza a sejtek TF termelését [87]. A vaszkuláris tónus egyensúlyát a sejtek vazokonstriktor (ET, PAF) és vazodilatátor (NO, PGI 2 ) mediátorokkal szabályozzák [1]. In vivo és in vitro kísérletek a C5a és a MAC vazokonstriktor hatását indikálják [88, 89]. A C1q azonban nem csak közvetett, hanem közvetlen módon is szerepet játszhat az endotélsejtek aktivációjában. C1q stimulálta endotélsejtek megnövekedett adhéziós kapacitást és citokin/kemokin expressziót mutatnak. Biológiailag aktív C1q termelésére képesek a makrofágok, a szklerotikus lézió neovaszkuláris endotélsejtjei és az éretlen, CD34 + dendritikus sejtek is [90-94] A proteoglikánok szerepe a C1q funkcionális aktivitásának szabályozásában A normál artéria extracelluláris mátrixát fibrózus fehérjék, hidratált glükozaminoglikán és proteoglikán rétegbe ágyazódott glikoproteinek alkotják. Az intima gazdag proteoglikánokban és hialuronban, a média nagy mennyiségű elasztikus rostot, kollagént és proteoglikánt tartalmaz, az adventitiában a fibrilláris kollagén a meghatározó. A szklerotikus plakkban neointima képződés figyelhető meg, amit megváltozott extracelluláris mátrix mintázat és a mátrixfehérjék akkumulációja jellemez. A proteoglikánok közé tartozó dekorin és biglikán a normál média alkotóelemei, de jelen vannak a szklerotikus plakkban, ott simaizom sejtek és makrofágok termelik [95]. Szerepet játszanak a struktúrális integritás kialakításában, a sejtek szignalizációs folyamataiban és a szöveti szerveződésben. Szolúbilis formában a veleszületett immunitást is szabályozhatják, például a C1q molekula funkcionális aktivitásának regulációján keresztül [96-101]. A dekorin és biglikán struktúrálisan rokon proteoglikánok, aminosav szekvenciájuk 55%-ban azonos [98]. A dekorin tartalmaz egy 44 kda tömegű központi fehérjét, melynek leucinban gazdag ismétlődő elemei a kollagén I, II, III, V és VI típusához, a fibronektinhez és egyéb endocitózisban szerepet játszó membrán receptorokhoz is kötődhetnek [96, 102]. Továbbá módosíthatják a TGF-β hatását is [98, 99]. 20

22 Hasonlóan a dekorinhoz, a biglikán is heterogén proteoglikán, összetétele függ a szövettípustól és a fejlődési állapottól. Csontsejtek, vázizom sejtek, endotélsejtek, keratinociták és a vese tubuláris epitélsejtjei termelhetik. Többnyire a sejtek felszínén, vagy a sejtek körüli pericelluláris mátrixban található. Szintén köti a TGF-β-t. A rekombináns és szarvasmarha dekorinról, valamint a rekombináns biglikánról is ismert, hogy kötik a C1q-t [ ]. A humán dekorin jóval nagyobb affinitással köti a C1q-t, mint a kollagént, ami a kialakult kölcsönhatás fontos fiziológiás jelentőségére utal [101]. Az irodalmi adatok alapján ezért azt feltételezzük, hogy az extracelluláris mátrix két építőelemének, a dekorinnak és a biglikánnak szerepe lehet a C1q sejtes interakcióiban és a molekula proinflammatorikus hatásának módosításában is A mannózkötő fehérje (MBL) A lektinfüggő aktiválást a szénhidrát molekulákkal reagáló MBL vagy fikolinok és a molekulákhoz kötődő MBL-asszociált szerin-proteázok, MASP-1, MASP-2, MASP-3 és a MASP-2 hasítási terméke, a Map-19 indítják el. A MBL a kollektin családba tartozó, májban termelődő kálciumfüggő szénhidrát felismerő glikoprotein [103, 104]. Ligandjait a C-terminális, globuláris doménen keresztül ismeri fel és köti [104]. Struktúrális felépítése sok hasonlóságot mutat a C1q-val [105]. A molekula kollagénszerű elrendeződést mutató N-terminális farki doménból, C-terminális feji (carbohydrate recognition domain, CRD) és egy α-helikális nyaki szakaszból áll. A polipeptid láncok trimerizációja a nyaki doménen keresztül jön létre, a molekula stabilitásáért hidrofób kötések és diszulfid hidak felelősek. A trimer alegységek tovább rendeződhetnek di-, tri-, tetra-, penta- vagy hexamer struktúrába (4. ábra) [106]. Humán szérumban leggyakoribb a 18 polipeptid láncból álló hexamer MBL elrendeződés. Az oligomer konfiguráció teszi lehetővé a szénhidrát molekulák hatékony felismerését. Egy CRD domén kis affinitással, kb M kötődik ligandjához [103], míg a CRD domének csoportos elrendeződése és az oligomer struktúra kialakulása nagy aviditású, mintegy 10-9 M interakciót eredményez [106]. Nagy affinitással kötődik a mikrobiális, emlős sejtekre nem jellemző N-acetil-Dglükózamin, mannóz, N-acetil-mannózamin, L-fukóz és glükóz szénhidrátokhoz [103], foszfolipidekhez [107], immunkomplexekhez [108] és apoptotikus testekhez [17, 62]. A legújabb vizsgálatok alapján tudjuk, hogy peptidek is lehetnek a MBL ligandjai [109, 21

23 110]. Anoxiás endotélsejtek felszínén megjelenik a citokeratin citoszkeletális fehérje, amit a MBL felismer [109]. Az interakció a lektinfüggő komplement kaszkád aktiválódását és ezáltal a sejtek károsodását eredményezi [111]. A jelenségnek az oxidatív stresszt követő sejt- és szövetkárosodásban tulajdonítanak egyre nagyobb jelentőséget [112]. A MBL egészségesekben mért szérumszintje változatos, 0 és 5 µg/ml között változik [106, 113]. A MBL-deficiencia gyakori jelenség, a humán populáció mintegy 5%-t érinti [103]. A struktúrális gének mutációja okozza a molekula hibás polimerizációját, míg a promóter régió polimorfizmusa felelős a heterogén MBL szérumszint kialakításáért. A struktúrális gének mutációja az 1 exon 52., 54. és 57. pozícióját érintheti. Az 52. pozicióban lévő arginin ciszteinre (D variáns), az 54. pozícióban lévő glicin aszparaginsavra (B variáns), míg az 57. pozícióban lévő glicin glutaminsavra (C variáns) cserélődik. A vad típust A variánsnak nevezzük [ ]. A MBL szérumszintje gyulladásban megemelkedik, azonban ez mindössze maximális háromszoros emelkedést jelent. 4. ábra. A MBL szerkezete és polimerizációja A MBL alegysége egy 25 kda tömegű polipeptid, mely egy kollagénszerű elrendeződést mutató N- terminális farki doménból, egy C-terminális feji (carbohydrate recognition domain, CRD) és egy α- helikális nyaki szakaszból áll. A polipeptid láncok trimerizációja a nyaki doménen keresztül jön létre. Az alegységek di-, tri-, tetra-, penta- vagy hexamer struktúrákba rendeződhetnek. Biochemical Society Transactions (2003) Volume 31, part 4 alapján. 22

24 A MBL a humorális PRR-molekulák közé tartozik, elsődleges feladata a patogén saját és nem saját antigének felismerése és azok közvetlen vagy közvetett úton történő eliminálása [17, 62]. A MBL-opszonizált patogéneket makrofágok és dendritikus sejtek kollektin receptoraikon keresztül kötik és fagocitálják [17, 62]. A MBL lehetséges receptoraként tartják számon a CRT-t, a CR1-t és a CD14-t. A CD14, mint LPS receptor is ismert. Így elképzelhető, hogy szerepe van a LPS kiváltotta gyulladásos immunválasz szabályozásában is. A MBL sejtaktivációban betöltött szerepe alig ismert. Az eddig megjelent tanulmányok azonban arra utalnak, hogy a MBL pro- és antiinflammatorikus molekulaként is szabályozhatja a gyulladásos választ. A MBL kálciumfüggő, C1q-val nem gátolható kötődését mutatták ki makrofágokon és U937 sejteken [45]. Soell és munkatársai monociták csökkent TNF-α produkcióját mérték MBL jelenlétében streptococcus ramnóz polimerek hatására [117]. Chaka és munkatársai hasonló jelenséget figyeltek meg cryptococcus membrán glikoproteinekkel végzett kísérleteikben [118]. A MBL-opszonizált Leismania chagasi és Candida albicans ellenben fokozták a monociták TNF-α produkcióját [119] és oxigén-szabadgyök aktivitását [120, 121]. A MBL koncentrációfüggő anti- illetve proinflammatorikus hatását írta le Jack és munkacsoportja. A Neisseria meningitis alacsony MBL koncentráció (<6 µg/ml) esetén fokozta, míg magas MBL koncentráció esetén (>6 µg/ml) csökkentette a monociták citokin produkcióját [122]. Fraser és szerzőtársainak munkája a MBL hatását LPSstimulálta monocitákon vizsgálta. Azt találták, hogy a MBL hatására az LPS-indukálta proinflammatorikus IL-1α és IL-1β mrns és fehérje expressziója csökkent, míg az IL- 10, a MCP-1, az IL-1Ra és az IL-6 expressziója pedig megemelkedett [123] A MBL patofiziológiás jelentősége Számos tanulmány bizonyította, hogy a MBL-deficiencia vagy a MBL alacsony szérumszintje kapcsolatba hozható autoimmun betegségek (pl. SLE) kialakulásával [124, 125]. Két lehetséges magyarázattal szolgál a szakirodalom a jelenség megértéséhez. Az egyik, hogy a MBL, mint opszonin elősegíti az apoptotikus és nekrotikus testek eliminációját és így megakadályozza a sejttörmelékek, mint autoantigén forrás felhalmozódását [17, 62, 126]. A második elmélet szerint, a MBL-deficiens személyek 23

25 nagyobb valószínűséggel fertőződnek meg különböző patogénekkel, melynek jelentősége lehet a betegség kialakulásában. Igaz, mindkét elméletnek ellentmond az a megfigyelés, hogy MBL-t mutattak ki SLE-s betegek veséjében és Sjögren-szindrómások mirigyeiben [127, 128], a szöveti destrukcióban pedig aktív szerepet feltételeznek a lektinfüggő komplement kaszkádnak. A MBL patológiás szerepe nemcsak autoimmun, hanem érrendszeri megbetegedésekben is bizonyított. In vivo patkány-modellben a MBL káros szerepét figyelték meg. Leírták, hogy a MBL fokozza a reperfúziót követő szövetkárosodást, míg anti-mbl antitestekkel jelentős csökkenés volt tapasztalható a miokardiális iszkémia/reperfúziót követő szövetkárosodásban [129]. Humán vizsgálatokból ismert a MBL-deficiencia és az ateroszklerózis közti összefüggés [ ]. Ezek a vizsgálatok azonban a MBL protektív szerepét sejtetik, de a pontos mechanizmus nem ismert. Saevarsdottir és szerzőtársainak 2005-ben megjelent vizsgálata szerint a szérum magas MBL szintje csökkenti a miokardiális infarktus kialakulásának kockázatát cukorbetegekben és magas koleszterinszint esetén [132]. A MBL szerepét az aterogén ox- LDL opszonizációjában és annak gyulladással nem kísért fagocitózisában feltételezik [132]. Bizonyították az ateroszklerózis és bizonyos fertőzések, pl. Chlamydia pneumoniae közti korrelációt. A MBL gén SNP mutációja és a Chlamydia pneumoniae fertőzés együttes előfordulása valószínűsíti a koronária érbetegség kialakulását [133]. Egy korábbi tanulmány pedig bizonyította a MBL genotípusa és a karotiszban kialakult plakk mérete közti kapcsolatot [135]. Nem ismert azonban a MBL kölcsönhatása natív endotélsejtekkel. Nem tudjuk, hogy a MBL és az endotélsejtek közti interakciónak lehet-e protektív szerepe, köszönhetően például a gyulladással nem kísért patogén-eliminációnak? Vagy épp ellenkezőleg, a C1q-val mutatott nagymértékű szerkezeti rokonság párosul-e a C1q-ra már bizonyított proinflammatorikus hatással és így az MBL aktív szerepet játszik-e az endotél diszfunkció kialakulásában A C-reaktív fehérje Az ateroszklerózis kialakulása és progressziója egyértelműen összekapcsolódik krónikus gyulladásos folyamatokkal, melynek kialakulása jól követhető a gyulladásos markerek 24

26 szérum koncentrációján keresztül. Ilyen markerek az akut fázis fehérjék, például a CRP, a szérum amiloid-protein (SAP) és egyes citokinek (pl. IL-6). Mindhárom molekulának prediktív szerepet tulajdonítanak az ateroszklerózis kialakulásának előrejelzésében. A CRP és SAP plazma fehérjék koncentrációja mutatja a legnagyobb és leggyorsabb emelkedést. A CRP szérumszintje már a gyulladást követő 6-8 órában megemelkedik, maximumát 48 óra elteltével éri el. A kérdés azonban máig nem megválaszolt, vajon a CRP csupán jelzi a gyulladást és a szöveti károsodást a szklerotikus lézióban, vagy aktívan részt is vesz annak kialakításában? A CRP a pentraxinok családjába tartozik. A C-terminálison található a pentraxinokra jellemző 200 aminosavból álló domén, melynek jellegzetes építőköve a 8 aminosavból álló konzervatív pentraxin szakasz (HxCxS/TWxS, x bármilyen aminosav lehet) [136]. A pentraxinok akut fázis fehérjék, gyulladást, traumát vagy fertőzést követően szérumszintjük többszörösére emelkedik. Két nagy családot különböztetünk meg: a hosszú és a rövid pentraxinokat. Az elöbbiek jellegzetessége az aminoterminális doménen található 174 aminosav hosszúságú szakasz [136]. Utóbbiak 5 vagy 10 azonos 5. ábra. A C-reaktív fehérje pentamer szerkezet alegységből felépülő sugaras, pentamer fehérjék. Prototípusai a humán CRP és a SAP. A CRP 5 azonos 23 kda tömegű alegységből épül fel. Az alegységek nemkovalens kötésekkel egy központi pórus körül szimmetrikusan kapcsolódnak össze (5. ábra) [136, 137]. Az alegységek két kálciumion jelenlétében ligand megkötésére képesek. Ligandjai a kromatin, a hisztonok, kis ribonukleoproteinek, glikánok és foszfolipidek [ ]. A C1q globuláris doménján keresztül képes a ligandasszociált vagy aggregálódott CRP-t megkötni és ezáltal a klasszikus komplement kaszkádot aktiválni [142]. A CRP szintéziséért döntően a májsejtek felelősek, bár lokálisan, kisebb mértékben limfociták, monociták, simaizomsejtek, endotélsejtek és makrofágok is termelhetik [ ]. 25

27 A pentamer struktúra EDTA jelenlétében végzett hőkezelés és redukálószerek (pl. urea) hatására szétesik [151], az alegységek másodlagosan aggregálódhatnak. Ezt a megváltozott struktúrájú CRP-t nevezik módosított vagy monomer CRP-nek (mcrp). Kimutatták gyulladt máj- és izomszövetben [152], normál humán érfalban és diabéteszes, krónikus vesebetegségben szenvedő betegek veséjében [153, 154]. Antigenitásában, ligand-specificitásában és biológiai aktivitásában is különbözik a natív fehérjétől [155, 156]. In vitro kísérletekben azt találták, hogy fokozza a megakariociták növekedését, a polimorfonukleáris leukociták és a perifériális vér monocitáinak oxigén-szabadgyök aktivitását [157]. Protrombotikus hatását neutrofileken és vérlemezkéken írták le [157, 158], valamint fokozta a neutrofilek túlélését és IL-8 expresszióját [159, 160]. Kutatómunkánk szempontjából azonban a legfontosabb észrevétel, hogy nem a natív, hanem a módosított CRP fejt ki proinflammatorikus hatást humán aorta endotélsejteken, az adhéziós molekulák fokozott expresszióját és a neutrofilek megemelkedett adhézióját detektálták mcrp hatására [161, 162] A C-reaktív fehérje szerepe az aterogenezisben Immunhisztokémia vizsgálatokkal kimutatták a CRP-t szklerotikus lézióban, ahol monocitákkal, monocita-eredetű makrofágokkal és lipoproteinekkel mutat kolokalizációt. Ez erősíti azt az elméletet, hogy a CRP közvetlen és/vagy közvetett módon szerepet játszik az aterogenezisben, de bizonyítékként még nem szolgál. In vivo és in vitro kísérletek utalnak arra, hogy a CRP a komplement kaszkád aktivációja révén közvetett módon hozzájárul a gyulladásos miliő kialakításához és az ateroszklerózis progressziójához [16, ]. Korai és késői szklerotikus lézióban is igazolták a CRP és az aktivált komplement együttes lerakódását [145, ]. A komplement aktivációban betöltött szerepe azonban kettős. A ligandkötött CRP aktiválhatja a klasszikus komplement kaszkádot, eredményeként biológiailag aktív komplement molekulák szabadulnak fel [171]. A H-faktor kötése révén azonban gátolhatja is a kaszkád aktiválódását, a komplement aktiváció nem jut el a terminális komplement komplex kialakulásáig [172], helyette az apoptotikus testek gyulladással nem kísért eliminációja valósul meg [141]. 26

28 A CRP, mint proinflammatorikus molekula? Endotélsejtek, neutrofilek, monociták és simaizom sejtek közvetlen, CRP-indukálta aktivációját is leírták [143, ]. Egyre több kritika éri azonban a CRP-nek közvetlen proinflammatorikus szerepet tulajdonító tanulmányokat és bizonyítja, hogy az eredményeket kritikusan kell értékelni. Számtalan publikáció jelent meg, melyek az endotélsejtek proinflammatorikus aktiválódását mérték többnyire rekombináns CRP kezelést követően. Az endotélsejtek megnövekedett adhéziós kapacitását, fokozott kemokin és citokin expresszióját figyelték meg CRP hatására. Szerepét leírták a véralvadási kaszkád szabályozásában, apoptózisban, lipidek módosításában és az erek aberráns vazomotoros működésében is. Így a CRP gyakorlatilag az ateroszklerózis minden fázisában képes lenne részt venni az endotélsejtek proinflammatorikus aktivációján keresztül. Az első megfigyeléseket Pasceri és munkatársai publikálták ben [176]. HUVEC és humán koronária artéria endotélsejteken (HCAEC) megemelkedett VCAM-1, ICAM-1, E-szelektin és MCP-1 expressziót és fokozott monocita adhéziót mértek CRP kezelést követően. Publikációjukat követően jelentősen megnőtt a CRP iránti érdeklődés és egyre több tanulmány jelent meg és számolt be a CRP endotélsejteken mért proinflammatorikus hatásáról. Csökkent enos expressziót és aktivitást, ezzel párhuzamosan pedig megemelkedett apoptózist mértek artériás és vénás endotélsejteken [178, 182]. A CRP indukálta apoptózis és a megnövekedett endoteliális metalloproteináz aktivitás a plakk instabilitásához, majd annak felhasadásához vezet [183]. Az endotélsejtek prosztaciklint is termelnek, mely vazodilatátor hatása mellett csökkenti a vérlemezkék aggregációját és gátolja a simaizom sejtek proliferációját [180]. CRP kezelést követően csökkent a sejtekben a prosztaciklin szintéziséért felelős enzim aktivitása. A prosztaciklinnel szemben az ET-1 érösszehúzó hatású, melynek expresszióját fokozta a CRP [184]. Fibrinolízisre gyakorolt hatását a PAI-1 és a szöveti plazminogén aktivátor (tpa) aktivitásának szabályozásán keresztül fejti ki. A PAI-1 egy szerin-proteáz inhibitor, endotélsejtek, simaizom sejtek és makrofágok is termelhetik. Expressziója diszfunkcionális fibrinolízist okoz. CRP-vel kezelt artériás endotélsejteken megemelkedett PAI-1 mrns expressziót és aktivitást, valamint csökkent tpa funkcionális aktivitást mértek [179, 185]. Az endotél diszfunkció kialakulásában az ox- LDL is szerepet játszik. Li és munkacsoportja CRP kezelt artériás endotélsejteken az ox- 27

29 LDL lektinszerű receptorának megemelkedett expresszióját és ezzel együtt a monociták megnövekedett adhézióját és az ox-ldl akkumulációját mérte [186]. A CRP proinflammatorikus szerepét in vivo állatkísérletekben is vizsgálták. CRP-tg/ApoE - / - egerekben felgyorsult szklerotikus lézió képződést figyeltek meg [187, 188]. Mivel egerekben a CRP nem akut fázis fehérje, sokkal inkább egy idegen fehérje, ezért az in vivo kísérletekből származó eredményeket nem lehet humán szituációra extrapolálni. Humán vizsgálatokkal is megkísérelték alátámasztani a CRP endotél diszfunkcióban és ateroszklerózisban betöltött szerepét [189]. Férfi önkénteseknek rekombináns humán CRP infúziót adtak. Ezt követően megemelkedett von Willebrand faktor (vwf), E- szelektin, IL-6 és IL-8 expressziót mértek. A vizsgálatot azonban több kutatócsoport is kritizálta, elsősorban a rekombináns fehérje endotoxin szennyeződés lehetősége miatt [190, 191]. A rekombináns technika növeli a LPS és más mikrobiális szennyeződések lehetőségét, és ezzel együtt egy helytelen konklúzió valószínűségét is. Nagyon sok tanulmányban vagy nem végezték el, vagy nem tüntették fel a LPS-teszt (Limulus Amebocyte Lysate-assay) eredményét. A CRP preparátumok biológiailag aktív szennyezőanyagokat, bakteriális maradványokat, például LPS-t és/vagy nátrium-azidot tartalmazhatnak, ami a kísérletek eredményeit jelentősen vagy teljes egészében módosíthatja. Kimutatták, hogy e két reagens a korábban CRP-nek tulajdonított hatásmechanizmussal bír endotélsejteken. Több független kutatócsoport tiszta preparátumot használva nem tudta bizonyítani endotélsejteken a CRP proinflammatorikus hatását, az adhéziós molekulák, citokinek, illetve kemoattraktánsok megemelkedett expresszióját, valamint a CRP proapoptotikus, antiproliferációs és vazoaktív hatását [ ]. Fontos megemlíteni, hogy a legtöbb kísérletben a fiziológiásnál jóval magasabb, sokszor még a patológiás eseteket is meghaladó koncentrációban használták a CRP-t. A legújabb kutatások azonban nem csak a molekula proinflammatorikus, hanem prediktív szerepét is megkérdőjelezik. Danesh és munkatársai a CRP kardiovaszkuláris eseményekben betöltött prediktív értékének meghatározásához korszerűsített metaanalízist használtak [195]. Ebben az esetben a magas-normál CRP szint csak csekély rizikófaktort jelentett kardiovaszkuláris betegségekben [195]. 28

30 2004-ben jelent meg az első közlemény, Khreiss és munkatársainak kutatása, mely cáfolta a ncrp proinflammatorikus tulajdonságait. Azt bizonyították, hogy a pentamer struktúra konformációs átalakulása a felelős az endotélsejtek megnövekedett adhéziós kapacitásáért, protrombotikus hatásáért és kemoattraktáns produkciójáért [162]. In vivo ApoE - / - egérmodellben azonban ennek ellenkezőjét találták, vagyis a ncrp fokozta a plakkban az ICAM-1 és a VCAM-1 expresszióját [196]. Ji és munkatársainak 2006-ban megjelent munkája a módosított CRP komplement aktivációban betöltött szerepével foglalkozik [197]. Eszerint a mcrp folyadék fázisban gátolta, míg ligandkötött vagy immobilizált formában aktiválta a klasszikus komplementkaszkád aktivációját, amivel a mcrp gyulladásban betöltött kettős szerepére utaltak a szerzők. Továbbra se megválaszolt tehát az a kérdés, hogy a CRP kizárólag a gyulladás szenzitív markere vagy a molekula - és annak mely konformációs variánsa - aktív, közvetlen szerepével hozzá is járul az ateroszklerózis kialakulásához, illetve progressziójához. 29

31 4. CÉLKITŰZÉSEK 4.1 A C-reaktív fehérje és az endotélsejtek közti interakció vizsgálata A C-reaktív fehérje ateroszklerózisban betöltött proinflammatorikus szerepét egyre több kritikai tanulmány megkérdőjelezi. Bizonyították, hogy a CRP preparátumok biológiailag aktív szennyezőanyagokat tartalmazhatnak, melyek a korábban CRP-nek tulajdonított hatással bírnak endotélsejteken. Továbbá egyre több figyelmet kap a pentamer CRP - egyelőre csak in vitro előállított- konformációs variánsának, a módosított CRP-nek lehetséges szerepe az endotélsejtek proinflammatorikus aktiválódásában. Célunk volt, hogy a CRP konformációs variánsainak eltérő antigenitását és ligand-specificitását felhasználva a preparátumokat pontosan karakterizáljuk és az endotélsejtek aktivációjában betöltött szerepét meghatározzuk. Ehhez olyan ismert és elfogadott proinflammatorikus markerek expresszióját mértük, mint az ICAM-1, a VCAM-1, az E-szelektin, az IL-8 és a MCP Az endotélsejtek és C1q, illetve MBL közti interakció vizsgálata A klasszikus komplement kaszkád felismerésért felelős egysége, a C1q kollagénszerű doménján keresztül kötődik az endotélsejtekhez és azok receptormediálta proinflammatorikus aktiválódását eredményezi. A MBL struktúráját és funkcióját tekintve nagymértékű hasonlóságot mutat a C1q-val, az endotélsejtek aktiválásában betöltött szerepe azonban nem ismert. Kérdésünk volt, hogy a MBL, a C1q-hoz hasonlóan képes-e a kollagénszerű doménján keresztül is kötődni az endotélsejtekhez és azokat aktiválni, valamint a gyulladásos körülmények hogyan befolyásolják az interakciót. Kíváncsiak voltunk arra, hogy a két struktúrálisan nagyon hasonló molekula képes-e egymás kötődését gátolni, azaz annak meghatározása, hogy azonos, vagy részben azonos receptorokon/sejtfelszíni molekulákon keresztül valósul-e meg az interakció. Ismert, hogy a C1q képes receptor-közvetített sejtaktivációt kiváltani. Az extracelluláris mátrix komponenseinek, a dekorinnak és biglikánnak szerepet tulajdonítanak a klasszikus komplement kaszkád szabályozásában. Célunk volt, hogy meghatározzuk a dekorin/biglikán és C1q közti interakció jelentőségét a 30

32 C1q és endotélsejtek közti kölcsönhatásban, valamint a C1q-indukálta sejtaktivációban. Célunk volt kutatni és tisztázni a CRP és konformációs variánsának, a mcrp-nek és C1q-nak a szerepét az endotélsejtek aktivációjában. Továbbá, eredményeinkkel szeretnénk hozzájárulni egy ezidáig kevésbé kutatott terület, a MBL sejtes kölcsönhatásainak megismeréséhez. Kutatásaink segíthetnek megérteni a komplement felismerésért felelős molekuláinak, a C1q-nak és MBL-nek, valamint a CRP akut fázis fehérjének az endotél diszfunkcióban és ezáltal kardiovaszkuláris betegségekben betöltött szerepét. 31

33 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1 VIZSGÁLATAINKHOZ HASZNÁLT SEJTKULTÚRÁK Humán köldökzsinór vénából izolált endotélsejtek (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) tenyésztése Az endotélsejteket humán köldökzsinór vénából kollagénázos (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) emésztéssel izoláltuk. A sejteket 0.5% zselatinnal (Sigma) fedett sejttenyésztő flaskában tenyésztettük M199 (Gibco/Life Technologies Inc., Breda, Hollandia) médiumban, melyet 10% fötális borjú szérummal (FCS) (Gibco), 100 NE/ml penicillinnel (Sigma), 100 µg/ml streptomycinnel (Sigma), 7,5 NE/ml heparinnal (Sigma), 2 ng/ml epidermális növekedési faktorral (EGF) (R&D, Abington, UK) és 250 pg/ml β-endotélsejt növekedési faktorral (β-ecgf) (BioSource, Camarillo, USA) egészítettünk ki. Kísérleteinkben a 2 és 4 közötti passzázs -ban lévő sejteket használtunk. Az endotélsejtek karakterizálása mikroszkópos fenotípusos megjelenésük (macskakőmintázat, 6.a ábra) és vwf pozitivitásuk alapján történt (6.b ábra). 6. ábra. HUVEC sejtek morfológiája 32

34 5.1.2 U937 sejtek tenyésztése U937 sejteket (American Type Culture Collection, Manassas, VA) RPMI 1640 (Gibco) médiumban tenyésztettük, melyet az optimális tenyésztési feltételek érdekében 10% hőinaktivált szérummal (Gibco), 100 NE/ml penicillinnel (Sigma) és 100 µg/ml streptomycinnel (Sigma) egészítettünk ki. 5.2 ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Reagensek Humán szérumból tisztított natív CRP-t (Sigma) használtunk, mely 0.1% NaN 3 -t (a-ncrp) tartalmazott. Azidmentes CRP-t (ncrp) dializálással állítottunk elő. A CRP-t 24 órán át, 4 C-on 2 mm kálcium tartalmú Tris-pufferelt fiziológiás sóoldatban dializáltuk. Potempa és munkatársai által leírt módszert használtuk az urea-módosított CRP (u m CRP, azidmentes) előállítására [156]. Röviden, a natív CRP-t 37 C-on 1 órán keresztül inkubáltuk 8 M urea és 10 mm EDTA jelenlétében, majd ezt követően a preparátumot egy éjszakán át, 4 C-on dializáltuk 25 mm Tris-HCl pufferelt, ph 8.3 oldatban. A rekombináns módosított CRP (r m CRP) [159] L. A. Potempa (Immtech International, Inc, Vernon Hills, Ill.) ajándéka volt. A CRP minták tisztaságát 12%-os SDS-poliakrilamid gélen redukáló körülmények mellett ellenőriztük. Öt mikrogramm fehérjét töltöttünk a poliakrilamid gélbe, a jelölést Coomassie Blue-R festékkel végeztük, melynek érzékenysége <500 ng/ml fehérje. A fehérjék endotoxin tartalmát Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay-vel határoztuk meg, mely minden esetben a detektálási limit (<6 pg LPS/mg fehérje) alatt volt. A 8D8 és 1D6, natív CRP és a 9C9, módosított CRP specifikus egér monoklonális antitestek L. A. Potempa ajándékai voltak [198]. A C1q alegység tisztítása rekalcifikált humán plazmából Nauta és munkatársai által leírt módszer szerint történt [18]. A MBL-t szintén rekalcifikált humán plazmából tisztítottuk. A precipitációhoz polietilén glikol 3350-t (7% w/v) (Sigma) használtunk. A precipitátumot TBS-T/Ca 2+ (50 mm Tris, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20, 20 mm CaCl 2, ph 7.8) pufferben oldottuk fel, amit egy éjszakán át, 4 C-on mannán-konjugált Sepharose gyöngyökön inkubáltunk. A gyöngyöket 1 M NaCl tartalmú TBS-T/Ca 2+ pufferben mostuk, majd a kötődött fehérjéket 33

35 10 mm EDTA-t tartalmazó TBS/T pufferben eluáltuk. A szennyező immunglobulinok eltávolítását Sepharose-gyöngyökhöz kötött mab 4E8 anti-iga (Department of Nephrology, Leiden, Hollandia), mab HB57 anti-igm (előállítása hibridóma sejtekkel (American Type Culture Collection) történt), és protein G (Pharmacia, Uppsala, Svédország) antitestekkel végeztük. MASP-mentes MBL-t gélfiltrációs eljárással állítottunk elő, melyhez Sepharose 6B (Pharmacia) oszlopot használtunk. A vivő puffer 0.2 M NaCl-t és 5 mm EDTA-t tartalmazó (ph 5.0) ecetsavas oldat volt. A frakciók MBL tartalmát ELISA módszerrel határoztuk meg, míg a frakciók MASP-2 tartalmát C4- konszumpciós hemolítikus teszttel mértük. A sejtek kezeléséhez LPS-mentes MBL-t (Statens Serum Institute, Koppenhága, Dánia) használtunk. Kompetíciós kísérleteinkben digoxygeninnel (dig) konjugált C1q-t (C1q-dig) és MBL-t (MBL-dig) használtunk, melyet az alábbi protokoll szerint állítottunk elő. A PBSben hígított C1q-t és MBL-t 3 órán keresztül szobahőn 50 µg/ml digoxygenninel koinkubáltuk, majd PBS-ben történő dialízis után a preparátumokat -20 C-on tároltuk A CRP preparátumok analízise szendvics ELISA módszerrel Polisztirén (Greiner, Frickenhausen, Németország) lemezeket bikarbonát pufferben hígított poliklonális CRP-vel (Sigma) fedtük 4 C-on 24 órán át. A lemezek blokkolását PBS-ben oldott zselatinnal (0.5%) végeztük. A lemezre felvitt, hígított CRP detektálását 1D6, natív és 9C9, módosított CRP specifikus monoklonális antitestekkel végeztük. Az antitestek kötődését torma-peroxidázzal jelzett kecske anti-egér antitesttel (Dako, Glostrup, Dánia); o-fenilén diaminnal (OPD) (Sigma) és szubsztrátként hidrogénperoxiddal mutattuk ki. Az optikai denzitást 490 nm-en mértük 600 nm referencia mellett és a párhuzamos minták átlagát számoltuk. Az antitesteket minden esetben 0.05%-os Tween-20-t (Sigma) és 0.5% zselatint tartalmazó PBS-ben hígítottuk. A lemezeket az inkubációs lépéseket követően PBS-Tween (0.05%) mostuk Immunfluoreszcens mikroszkópia Az endotélsejteket 0.5% zselatinnal fedett mikroszkópos tárgylemezen tenyésztettük. A CRP intracelluláris specificitásának vizsgálatához a sejteket aceton-metanol 50% / 50% (- 34

36 20 C) elegyével fixáltuk, majd 1% FCS-val és 2 mm CaCl 2 -val kiegészített és Tris-HCl pufferelt fiziológiás sóoldatban (ph 7.4) 10 µg/ml-re hígított ncrp-, r m CRP- és u m CRPvel inkubáltuk 20 percet, szobahőmérsékleten. A CRP extracelluláris kötődésének vizsgálatához a tárgylemezen tenyésztett sejteket 4 C-on, 20 percet inkubáltuk 10 és 100 µg/ml ncrp-, r m CRP- és u m CRP-vel. A mosási lépést követően a sejteket aceton-metanol elegyével fixáltuk. A CRP detektálásához 8D8 és 9C9 monoklonális antitesteket használtunk, melyeket Alexa 568 fluoreszcens festékkel konjugált kecske anti-egér (GAM) antitesttel (Molecular Probes, Leiden, Hollandia) tettük láthatóvá. A sejtmagot Hoechst (Molecular Probes) DNS festékkel jelöltük. A sejtek mosásához 2 mm CaCl 2 -val kiegészített és Tris-HCl pufferelt fiziológiás sóoldatot (ph 7.4) használtunk. A konfokális lézer scanning mikroszkópos vizsgálat Olympus IX 81 (FV500 scanning-unit) mikroszkóppal történt A CRP preparátumok citotoxicitási vizsgálata A CRP citotoxicitási vizsgálata az adherens sejtek DNS festésén alapult. Tízezer sejtet raktunk ki 96 lyukú 0.5% zselatinnal fedett ELISA sejttenyésztő lemezre, majd a sejteket 24, illetve 48 órát tenyésztettük a-ncrp, ncrp, r m CRP és u m CRP jelenlétében. A kezeléshez használt M199 médium 2% FCS-t tartalmazott. Ezt követően a sejteket aceton-metanol fixálással permeabilizáltuk és 20 mm Tris-HCl pufferelt (ph 7.4), 2 mm CaCl 2 -t és 1% FCS-t tartalmazó fiziológiás sóoldatban hígított (1/10000) SYBR-Green fluoreszcens DNS festékkel 30 percet inkubáltuk. A detektáláshoz Fluoroscan Ascent FL (Thermo Electron Co., Waltham, MA) fluoreszcens readert használtunk. A mérést 485 nm excitációs és 538 emissziós hullámhosszon 500 ms integrációs idővel végeztük. A citotoxicitási vizsgálatot fluoreszcens mikroszkóppal (Olympus IX81) is elvégeztük egy automatizált sejtszám meghatározó program (AnalySIS, Soft Imaging System GmbH, Münster, Németország) segítségével. Hasonlóan az elöbbiekben ismertetett módszerrel, ez a metodika is a sejtmag jelölésén alapult. A két ismertetett módszer eredményei szoros korrelációt mutattak (Pearson r=0.993, p<0.0001) Alamar Blue proliferációs vizsgálat 35

37 Kétezer sejtet raktunk ki 0.5% zselatinnal fedett 96 lyukú sejttenyésztő ELISA lemezre. A sejteket egy éjszakán át tenyésztettük 2% FCS-t tartalmazó M199 médiumban. Ezt követően a sejteket 24 órát ncrp-vel, illetve mcrp-vel kiegészített médiumban tenyésztettük. Ezután a sejtek felülúszójához 10 % v/v Alamar Blue-t (BioSource Europe, S.A., Nivelles, Belgium) adtunk. Az optikai denzitást 550 nm-en 600 nm referencia mellett ELISA readerrel mértük Adhéziós molekulák detektálása sejtes ELISA (celisa) módszerrel Konfluens endotélsejteket használtunk vizsgálatainkhoz, melyeket 0.5% zselatinnal fedett 96 lyukú sejttenyésztő ELISA lemezre tenyésztettünk. Az ICAM-1 (CD54), PECAM-1 (CD31) és VCAM-1 (CD106) expresszióját 24, illetve 48 órás, míg az E-szelektin (CD62E) expresszióját 4 órás CRP, illetve C1q és MBL kezelést követően határoztuk meg. A fixált sejteket egér anti-humán CD54 és CD106 (Dako, Glostrup, Dánia), CD31 (MedSystem Diagnostics GmbH, Bécs, Ausztria) és CD62E (Pharmingen) monoklonális antitestekkel jelöltük. Az antitestek kötődését torma-peroxidázzal konjugált kecske antiegér antitesttel (Dako); o-fenilén diaminnal (Sigma) és szubsztrátként hidrogénperoxiddal mutattuk ki. Az optikai denzitást ELISA Readerrel 492 nm-en mértük 600 nm referencia mellett MCP-1, IL-8 és IL-6 meghatározása HUVEC sejtek felülúszójából Konfluens HUVEC sejteket egy éjszakán át tenyésztettük 2% FCS-vel kiegészített M199 médiumban. Ezt követően a sejteket 48 órát tenyésztettük ncrp, r m CRP és u m CRP, illetve C1q és MBL tartalmú médiumban. Vizsgáltuk a dekorin/biglikán és C1q közti interakció jelentőségét is a C1q-indukálta sejtaktivációban. Ebben az esetben a C1q-t (20 µg/ml) szérummentes AIM-V médiumban előinkubáltuk dekorinnal és biglikánnal (150, 75, 37, 18, 9 µg/ml) szobahőn egy órán keresztül, majd az elegyet HUVEC sejtekhez adtuk. Az IL-8, MCP-1 és IL-6 meghatározását a sejtek felülúszójából szendvics ELISA módszerrel végeztük van den Berg és munkatársai által leírt metodika alapján [28] Áramlási citometriás vizsgálat (FACS) 36

38 A tripszinnel emésztett HUVEC és U937 sejteket minden esetben alacsony ionerejű pufferben (0.5 x PBS, 77 mm glükóz, 1% BSA, 0.1% nátrium-azid) mostuk és az inkubációs lépésekhez is ezt a puffert használtuk. Az inkubáció 30 percen keresztül, jégen történt. A kötődési vizsgálatokhoz a sejteket különböző koncentrációjú C1q-val és MBL-nel inkubáltuk, a detektálást monoklonális antitestekkel végeztük. Vizsgálataink során a következő antitesteket használtuk: egér monoklonális anti-mbl (3E7; Dr. T. Fujita ajándéka, Medical University School of Medicine, Fukushima, Japán), egér monoklonális anti-c1q (mab 2204; Dr. C. E. Hack ajándéka, Sanquin Research, Amszterdam, Hollandia), nyúl poliklonális anti-komplement receptor-1 (Department of Nephrology, Leiden, Hollandia), nyúl poliklonális anti-gc1qr (Dr. Berhane Ghebrehiwet ajándéka, Department of Medicine, State University of New York, Stony Brook, New York, USA), nyúl poliklonális anti-kalretikulin-p-domén (Dr. R. B. Sim és Dr. U. Kishore ajándéka, Oxford, UK) és egér monoklonális anti-cd54 (BD, Pharmingen). A CD91 expressziójának vizsgálatát két különböző monoklonális antitesttel is elvégeztük (BD, Pharmingen, Inc. San Diego, USA; klón: és American Diagnostica Inc., Greenwich, CT; klón: ). Az antitestek vizualizációját fikoeritrin (PE)- konjugált kecske anti-egér (Dako, Glostrup, Dánia) és kecske anti-nyúl (Southern Biotechnology, Birmingham, AL, USA) antitestekkel FACS Calibur (Becton Dickinson) műszerrel végeztük. Az elpusztult sejteket 1 µg/ml propidium-jodiddal (Molecular Probes) vizualizáltuk és a sejttörmelékekhez hasonlóan eredményeink értékelése során az analízisből elektronikusan kizártuk. Az adatok értékelését WinMDI szoftverrel végeztük. Bizonyos kísérletekben az áramlási citomteriás vizsgálatot megelőzően a sejteket 48 órán keresztül Salmonella typhosa LPS-vel (Sigma) (0.1, 1, 10 µg/ml), illetve TNF-αval (0.2, 1, 5 ng/ml) kiegészített sejttenyésztő médiumban tenyésztettük. A C1q kötődését HUVEC és U937 sejteken dekorin és biglikán jelenlétében is elvégeztük. A kísérlet első lépéseként a C1q-t 2.5 µg/ml koncentrációban előinkubáltuk dekorinnal és biglikánnal (10, 1, 0.1 és 0.01 µg/ml) szobahőn egy órán keresztül. A C1q kötődését FACS-val a fentiekben ismertetett módon végeztük Kompetíciós vizsgálat 37

39 A sejteket különböző koncentrációjú MBL-nel és C1q-val 30 percen keresztül jégen előinkubáltuk. Ezt követően - köztes mosási lépés nélkül - dig-konjugált C1q-t (5.5 nm) és MBL-t (3 nm) adtunk a sejtekhez. A molaritás meghatározásához a C1q molekulasúlyát 460 kda-ban, míg a pentamer MBL molekulasúlyát 480 kda-ban állapítottuk meg. A dig-konjugált fehérjéket egér monoklonális anti-dig antitesttel (Prof. Dr. A. M. Deelder ajándéka, Laboratory of Parasitology, Leiden, Hollandia) FACS-val a fentiekben ismertetett módon detektáltuk Statisztikai analízis A CRP proinflammatorikus hatását vizsgáló kísérleteinket legalább háromszor elvégeztük és három párhuzamosban dolgoztunk. Eredményeinket, mint átlagértékeket ± szórás ábrázoltuk. Az adatokat párosítatlan t-teszttel vagy egyutas ANOVA teszttel analizáltuk. A korrelációs vizsgálatot Pearson korrelációs teszttel végeztük. Az LPS és TNF-α kezelt endotél sejtek MBL és C1q kötését nemparaméteres egyutas ANOVA teszttel (Friedman teszt) elemeztük. Minden esetben a p < 0.05 értéket fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak. 38

40 6. EREDMÉNYEK 6.1 NATÍV ÉS MÓDOSÍTOTT C-REAKTÍV FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSA ENDOTÉLSEJTEKKEL Elfogadott és bizonyított tény, hogy a gyulladásos folyamatoknak központi szerepe van az ateroszklerózis kialakulásában [15, ]. Fiziológiás körülmények közt az erek külső falát a vasa vasorum látja el tápanyaggal és oxigénnel, az intima táplálása pedig a lumen felől törtenik. Az aterogenezis során a megvastagodott intima gátolja az oxigén diffúzióját (iszkémia), a hypoxia pedig új erek képződését stimulálja. A leukociták és a plazma proteinek elsősorban az újonnan képződött posztkapilláris venulákon keresztül jutnak a gyulladásos szövetek területére. Ezt bizonyítja, hogy az ICAM-1, a VCAM-1 és az E-szelektin expressziója 2-3-szor magasabb a posztkapilláris vénulákat határoló endotélsejteken, mint az artéria lumenét borító sejteken. A posztkapilláris venulák és a CRP közti interakció in vitro modellezéséhez vénás eredetű, HUVEC sejteket használtunk. A modell megválasztásánál a sejtek vénás fenotípusát, könnyű hozzáférhetőségét, a standardizálható tenyésztést és a gazdag irodalmi hátteret vettük elsősorban figyelembe A C-reaktív fehérje konformációs variánsainak analítikai vizsgálata A CRP endotélsejtekre gyakorolt közvetlen hatását egyre több tudományos munka megkérdőjelezi. Meggyőző, elegáns kísérletekkel bizonyították, hogy a korábban endotélsejteken megfigyelt és CRP-nek tulajdonított hatásokért a preparátumok LPS és/ vagy nátrium-azid tartalma a felelős [ , 202]. Továbbá kimutatták, hogy a CRP hosszú tárolási idő esetén kálcium hiányában spontán képes mcrp-vé alakulni [161]. Kísérleteinkben ezért kiemelkedő fígyelmet szenteltünk a CRP minták tisztaságának és pontos karakterizációjának. Analítikai vizsgálatainkban a CRP molekulák ismert antigenitását és ligand specificitását használtuk [155]. A CRP preparátumok karakterizációja szendvics ELISA módszerrel A CRP izoformákat eltérő epitóp mintázatuk alapján szendvics ELISA-val karakterizáltuk. Mivel a poliklonális CRP antitest alkalmas a CRP mindkét konformációs 39

41 variánsának felismerésére, ezért ezt használtuk az ELISA lemezek fedésére. Kíserleteinkben E. Coli-ban termelt rekombináns és citrakonil-csoporttal kiegészített mcrp-t, valamint urea módosítással előállított mcrp-t használtunk. Mindkét mcrp-t a módosított CRP epitóp specifikus monoklonális, 9C9 antitest ismert fel (7.a ábra), míg a ncrp-t, kizárólag a natív epitóp specifikus, 1D6 monoklonális antitesttel tudtuk detektálni (7.b ábra). A CRP preparátumok homogenitását redukáló körülmények mellett SDS-PAGE-n és Western blottal is ellenőriztük (nem bemutatott ábra). A preparátumok homogenitására és tisztaságára utal, hogy a CRP monomerek molekulatömegével megegyező, azaz 23 kda molekulamarkernél detektáltuk mintáinkat. 7. ábra. A CRP preparátumok analízise szendvics ELISA módszerrel Az ELISA lemezeket poliklonális CRP antitestekkel fedtük. A CRP detektálását 9C9, módosított (A) és 1D6, natív CRP (B) specifikus monoklonális antitestekkel végeztük. A preparátumok karakterizációja eltérő intracelluláris ligand-specificitásuk alapján A ncrp és a mcrp eltérő intracelluláris ligand-specificitást mutat. A ncrp a sejtmagot ismeri fel [ ], míg HEp-2 sejteken a mcrp citoplazmatikus kötődését mutatták ki [155]. A HUVEC sejteket aceton-metanol fixálással permeabilizáltuk, majd ncrp, u m CRP és r m CRP jelenlétében inkubáltuk. Azt találtuk, hogy a ncrp a sejtmaghoz kötődött, míg az u m CRP és a r m CRP a citoplazmát ismerte fel (8. ábra). 40

42 8. ábra. A CRP konformációs variánsainak intracelluláris ligandspecificitása HUVEC sejteken Az endotélsejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd 10 µg/ml ncrpvel (A, B), u m CRP-vel (C, D) és r m CRPvel (E, F) inkubáltuk. A kötődött molekulákat 8D8, natív és 9C9, módosított CRP specifikus monoklonális antitestekkel detektáltuk, amit Alexa 568 fluoreszcens festékkel konjugált kecske anti-egér antitesttel vizualizáltunk (A, C, E). A sejtmagot Hoechst vel jelöltük (B, D, F). Megállapítottuk, hogy a ncrp, az u m CRP és a r m CRP mintáink vizsgált antigenitási és ligandkötő sajátságai az ismert irodami adatokkal megegyezőek [140, 155, ] A ncrp és a r m CRP citotoxicitási vizsgálata endotélsejteken A ncrp citotoxikus hatását több munkacsoport is leírta [206, 207]. Ismertté vált azonban, hogy a LPS és a nátrium-azid is hasonló hatást fejtenek ki endotélsejteken [192, 194]. Taylor és munkatársai írták le először, hogy a korábban CRP-nek tulajdonított antiproliferatív hatásért tulajdonképpen a CRP nátrium-azid, illetve LPS tartalma a felelős [194]. Mivel a CRP toxikus hatása befolyásolhatja más biológiai paraméterek (proliferáció, adhéziós molekulák és citokinek expressziója) mérését is, ezért preparátumaink citotoxikai vizsgálatát is elvégeztük. A sejteket 24 és 48 órát tenyésztettük azidmentes ncrp-t (ncrp), azid-tartalmú CRP-t (a-ncrp), r m CRP-t és u m CRP-t tartalmazó médiumban. 24 óra elteltével nem találtunk szignifikáns különbséget a kezelt és kontroll sejtek között (nem bemutatott ábra). 48 órás kezelést követően, a ncrp, az a-ncrp és az u m CRP 100 µg/ml koncentrációjával kezelt mintáinkban az adherens sejtek száma kis mértékben lecsökkent, melyből a reagensek enyhe toxikus hatására következtettünk (9. ábra). Fontos azonban hangsúlyozni, hogy csak az a-ncrp 41

43 minta tartalmazott nátrium-azidot. Továbbá, hogy a nátrium-azidnak abban a tartományában, mely megegyezett a hígított kereskedelmi CRP nátrium-azid tartalmával nem mertünk toxikus hatást (nem bemutatott ábra). 9. ábra. A CRP citotoxicitásának vizsgálata HUVEC sejteken Az endotélsejteket 48 órát tenyésztettük puffer kontroll, ncrp, a-ncrp, u m CRP és r m CRP jelenlétében. Ezt követően a sejteket fixálással permeabilizáltuk és az adherens sejtek DNS-t SYBR-Green fluoreszcens festékkel jelöltük. A diagramm százalékban ábrázolja a kezelt adherens sejtek számát a kontroll, kezeletlen sejtekhez képest. * p<0.05 a kontroll értékhez viszonyítva A r m CRP, az u m CRP és a ncrp extracelluláris kötődése endotélsejteken A CRP-k extracelluláris kötődését intakt, élő endotélsejteken vizsgáltuk konfokális lézer scanning mikroszkóppal. A sejteket 10 és 100 µg/ml ncrp-vel, r m CRP-vel és u m CRP-vel inkubáltuk, majd a membránhoz kötődött molekulákat fixálással rögzítettük. A r m CRP 10 µg/ml koncentrációban egyértelmű membránkötődést mutatott, míg a ncrp-t és az u m CRP-t nem tudtuk detektálni (10. ábra). Mindkét molekula erős extracelluláris háttér jelölődését fígyeltük meg 100 µg/ml koncentrációban, ami megakadályozta a membránkötődés kiértékelhetőségét. 42

44 10. ábra CRP molekulák extracelluláris kötődése HUVEC sejteken Az endotélsejteket 20 percig inkubáltuk 4 C-on 10 µg/ml ncrp (A, B, C, D), r m CRP (E, F, G, H), és u m CRP (I, J, K, L) jelenlétében. Ezután a sejteket mostuk, fixáltuk, majd mab 9C9, módosított (A, B, E, F, I, J) vagy 8D8, natív CRP specifikus monoklonális antitestekkel jelöltük (C, D, G, H, K, L). A konfokális lézer scanning mikroszkópos vizsgálatok eredményei az A, C, E, G, I, K, míg a fáziskontraszt vizsgálatok eredményei a B, D, F, H, J, L képeken láthatók. Fehér nyilak jelzik a membránkötött r m CRP-t A ncrp és a mcrp biológiai hatása HUVEC sejteken Endotélsejtek proliferációja CRP kezelést követően Az endotélsejtek proliferációjának monitorozására Alamar Blue kolorimetrikus tesztet használtunk, ami a sejtek metabolikus aktivitásának mérésére alkalmas. Proliferáló sejtekre a redukciós állapot a jellemző. Proliferáció esetén megemelkedik a NADPH/NADP, FADH/FAD, FMNH/FMN és NADH/NAD hányados. Ezek a metabolikus termékek az Alamar Blue redukciójára képesek, ami ELISA Readerrel detektálható színváltozást eredményez. Az endotélsejteket 24 órát tenyésztettük ncrp és mcrp jelenlétében. Ezt követően a médiumot 10 v/v % Alamar Blue-val kiegészítettük és mértük a sejtek proliferációját, melynek mértéke ncrp és r m CRP kezelést követően megegyezett a nem kezelt, kontroll sejtek proliferációjával (11. ábra). 43

45 11. ábra. HUVEC sejtek proliferációs vizsgálata CRP kezelést követően Kétezer sejtet raktunk ki 0.5% zselatinnal fedett 96 lyukú sejttenyésztő ELISA lemezre. A sejteket 24 órán keresztül tenyésztettük ncrp-vel, illetve mcrp-vel kiegészített médiumban. Ezt követően a médiumot 10 % v/v Alamar Blue-val egészítettük ki. Az optikai denzitást 550 nm-en, 600 nm referencia mellett mértük. Adhéziós molekulák vizsgálata HUVEC sejteken CRP kezelést követően Az endotélsejtek proinflammatorikus aktiválódásának egyértelmű és elfogadott markere az adhéziós molekulák, például az ICAM-1, a VCAM-1 és az E-szelektin megemelkedett expressziója. Nyugalmi állapotban levő endotélsejtek alacsony vagy nem detektálható mértékben expresszálják membránjukon az ICAM-1 (12.a ábra), a VCAM-1 (12.b ábra) és az E-szelektin (12.c ábra) molekulákat, szemben a konstitútívan nagy mennyiségben expresszálódó vérlemezke-endotélsejt adhéziós molekulával (platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1) (12.d ábra). A LPS stimulálta sejteket, mint pozitív kontrollt használtuk vizsgálatainkban. A sejteket a ncrp, a r m CRP és az u m CRP különböző koncentrációival kezeltük. Az ICAM-1 és a VCAM-1 expresszióját 24 órás kezelést követően, míg az E-szelektin expresszióját 4 órás stimulációt követően mértük. Szignifikáns változást a molekulák expressziójában egyetlen esetben sem detektáltunk. A PECAM-1 expressziója sem a LPS, sem a CRP aktivációt követően nem változott. Az adhéziós molekulák vizsgálatát humán szérummal kiegészített médiumban is elvégeztük. Megfígyeléseink megegyeznek a fent ismertetett, borjú szérumban elvégzett kísérletek eredményeivel (nem bemutatott ábra). 44

46 2. ábra. CRP kezelt HUVEC sejtek ICAM-1, VCAM-1, E-szelektin és PECAM-1 expressziója Az adhéziós molekulák expresszióját konfluens endotélsejteken celisa módszerrel végeztük. Az ICAM-1 (A), a VCAM-1 (B) és a PECAM-1 (D) expresszióját 24 órás kezelést követően mértük, míg az E-szelektin (C) expresszióját 4 órát kezelt sejtek felszínén vizsgáltuk. Az ábrán feltüntetett értékek átlagértékeket ± szórás mutatnak. Endotélsejtek citokin és kemokin expressziója CRP kezelést követően Hasonlóan az ICAM-1, a VCAM-1 és az E-szelektin adhéziós molekulákhoz, az endotélsejtek által termelt IL-8 és MCP-1 is a proinflammatorikus változások érzékeny indikátora. Kísérleteinkben HUVEC sejteket 48 órát kezeltük CRP mintáinkkal, majd a termelt IL-8 és MCP-1 mennyiségét a felülúszóból szendvics ELISA módszerrel meghatároztuk. A kezelést követően, az IL-8 termelésében nem tudtunk kimutatni eltérést a kontroll, kezeletlen sejtekhez képest (13.a ábra). Meglepő módon, a ncrp koncentrációfüggő csekély, de szignifikáns csökkenést okozott a MCP-1 expressziójában (13.b ábra). A LPS (1 µg/ml) kezelés az IL-8 esetében közel 15-szörös, míg az MCP-1 expressziójában 5-szörös növekedést eredményezett. 45

47 13. ábra. HUVEC sejtek IL-8 és MCP-1 expressziója CRP kezelést követően Az endotélsejteket 48 órát tenyésztettük ncrp, r m CRP és LPS (1 µg/ml) jelenlétében. A kezelést követően az IL-8 (A) és a MCP-1 (B) koncentrációját a sejtek felülúszójából, szendvics ELISA módszerrel mértük. Az ábrán feltüntetett értékek átlagértékeket ± szórás mutatnak. A statisztikai elemzését Bonferroni-teszttel kiegészített ANOVA analízissel végeztük. * p<0.05 a kontroll értékhez viszonyítva. 46

48 6.2 A MBL ÉS A C1q INTERAKCIÓJÁNAK ÉS BIOLÓGIAI HATÁSÁNAK ÖSSZEHASONLÍTÁSA ENDOTÉLSEJTEKEN A MBL és a C1q extracelluláris kötődése endotélsejteken A C1q kollagénszerű doménján keresztül kötődik az endotélsejtekhez és azok proinflammatorikus aktiválódását eredményezi [28, 58, 208, 209]. A MBL kötődését ezidáig csak iszkémiás endotélsejteken írták le [ ]. A kálciumfüggő interakció a molekula globuláris doménjének a szerepére utal. Kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy a MBL (14.a ábra) a C1q-hoz (14.b ábra) hasonlóan, a C-terminális doménen keresztül kötődik-e natív, élő endotélsejtekhez. A molekulák kötődését az in vivo körülményeknek megfelelő koncentrációban és kálciummentes pufferben FACS-val vizsgáltuk. Az elpusztult sejteket propidium-jodiddal tettük láthatóvá és a pozitív sejteket, valamint a sejttörmelékeket az analízisből kizártuk. A MBL (14.c ábra) a C1q-hoz hasonlóan (14.d ábra) dózisfüggően és már igen kis koncentrációban is kötődött a sejtekhez. A kísérletet U937 sejteken is elvégeztük. Az irodalmi adatoknak megfelelően a MBL (14.e ábra) és a C1q (14.f ábra) kötődését is kimutattuk [45]. 47

49 14. ábra. A MBL és C1q kötődése endotélsejtekhez A MBL (A, C) és a C1q (B, D) kötődését HUVEC sejteken kálciummentes pufferben FACS-val vizsgáltuk. Mindkét molekula esetében dózisfüggő extracellularis kötődést detektáltunk (C, D). A MBL (E) és a C1q (F) kötődési vizsgálatát U937 sejteken is elvégeztük. Üres diagramm jelzi a monoklonális antitestek kötődését, a C1q és a MBL kötődését (2.5 µg/ml) fekete diagrammok mutatják A MBL és a C1q kötődése LPS és TNF-α aktivált endotélsejtekhez Vizsgáltuk a MBL és a C1q kötődését LPS és TNF-α aktivált sejteken is. A sejteket 48 órán keresztül tenyésztettük LPS (0.1, 1, 10 µg/ml) és TNF-α (0.2, 1, 5 ng/ml) jelenlétében. A kötődési vizsgálatot FACS-val végeztük. LPS aktivációt követően megnövekedett a C1q (p = ) és a MBL (p = , n= 4 független kísérlet) kötődése az endotélsejteken (15.a ábra), míg TNF-α aktivációt követően csak a C1q kötődésének dózisfüggő növekedését mértük (p = 0.033) (15.b ábra), az MBL kötődésében nem detektáltunk változást. A sejtek aktivált állapotát kezelést követően a megemelkedett ICAM-1 expresszió indikálta (15.c, d ábra). 48

50 15. ábra. A C1q és a MBL kötődése endotélsejtekhez LPS és TNF-α aktivációt követően A sejteket 48 órát tenyésztettük LPS (0,1, 1, 10 µg/ml) (A) vagy TNF-α (0,2,1, 5 ng/ml) (B) jelenlétében. A C1q és MBL kötődését 2.5 µg/ml koncentrációban FACS-val mértük. Az ICAM-1 expressziójának növekedése indikálta a sejtek aktivációs állapotát LPS (C) és TNF-α (D) kezelést követően. * p<0.05 a kontroll értékhez viszonyítva Kompetíció a C1q és a MBL között az extracelluláris kötőhelyekért Kompetíciós kísérleteinkben a dig-konjugált C1q (C1q-dig) és MBL (MBL-dig) kötődését detektáltuk. Előkísérleteinkben dig-konjugált C1q-t és MBL-t állítottunk elő, melyek kötődését dig-specifikus monoklonális antitesttel, FACS-val igazoltuk. Az inkubációs és mosási lépésekhez egyaránt kálciummentes puffert használtunk. Mindkét konjugált protein esetében dózisfüggő kötődést kaptunk (nem bemutatott ábra). A kompetíciós kísérlet első lépéseként az endotélsejteket a C1q és a MBL különböző koncentrációjával előinkubáltuk. Ezt követte köztes mosási lépés nélkül a második inkubációs lépés, melyben a dig-konjugált fehérjéket adtuk a sejtekhez. A jelölt és jelöletlen MBL-t ekvimoláris koncentrációban használva, a MBL-dig kötődésének félmaximális gátlását mértük, mely a kötődés specificitására és receptor függésére utal (16.a ábra). Továbbá a C1q gátolta a MBL-dig kötődését (16.a ábra). A C1q-dig sejtfelszíni kötődését is vizsgáltuk C1q, valamint MBL jelenlétében. Mindkét molekula már ekvimoláris koncentrációban erősen gátolta a C1q-dig kötődését (16.b ábra). Ez utal egyrészt a C1q receptormediált kötődésére, valamint arra, hogy a két molekula (részben) azonos struktúrán/ struktúrákon keresztül kötődik az endotélsejtekhez. 49

51 16. ábra Kompetíció a C1q és a MBL között az endotélsejtek extracelluláris kötőhelyeiért A sejteket a MBL és a C1q különböző koncentrációival előinkubáltuk. Ezt követte a második inkubációs lépés MBL-dig (3 nm) (A) és C1q-dig (5.5 nm) (B) jelenlétében. Ezt követően a dig-konjugált fehérjék kötődését vizsgáltuk. A grafikonok százalékban mutatják a dig-konjugált fehérjék kötődésének gátlását C1q és MBL receptorok extracelluláris expressziója HUVEC sejteken Eredményeink arra utalnak, hogy a C1q és a MBL kötődése az endotélsejteken (részben) azonos sejtfelszíni struktúrákon keresztül történik. A gc1qr, a CRT és a CR1 ismertek, mint C1q receptorok [3, 20, 79, 210]. A gc1qr a C1q globuláris doménját köti, míg a CRT és a CR1 a C1q kollagénszerű doménjának felismerése mellett, valószínűleg a MBL kötésében is szerepet játszik [62, 75]. Az endotélsejtek felszínén expresszálódó receptorokat FACS-val vizsgáltuk. Igazoltuk a CRT konstitutív expresszióját (17.a ábra), ugyanakkor a CD91 (17.b ábra), a CRT egyik lehetséges koreceptorának az expresszióját két különböző monoklonális antitesttel se tudtuk kimutatni (egy ábra került bemutatásra). A CR1 (17.c ábra) és a gc1qr (17.d ábra) sejtfelszíni expresszióját nem tudtuk detektálni. Vizsgáltuk a receptorok expresszióját LPS és TNF-α aktiválta sejteken is. Azt találtuk, hogy az aktiváció hatására nem változott a CRT expressziója, a CR1 és a gc1qr expresszióját az aktivációt követően se tudtuk igazolni (17.e ábra). Aktivált sejteken a megnövekedett sejtfelszíni ICAM-1 expresszió a sejtek aktivált állapotát indikálta. 50

52 17. ábra. C1q és MBL receptorok expressziója endotélsejteken Nyugalmi állapotban lévő (A, B, C, D) és aktivált (E) sejtek CRT (A), CD91 (B), CR1 (C) és gc1qr (D) expresszióját FACS-val vizsgáltuk. Az üres hisztogrammok jelzik az antitest kontrollokat, míg a fekete grafikonok utalnak a vizsgált molekulák expressziójára. A CRT, a CR1 és a gc1qr molekulákat nyúl antihumán poliklonális antitesttel detektáltuk, az antitest kontroll nyúl IgG volt. A CD91 és az ICAM-1 expresszióját egér anti-humán monoklonális antitestekkel detektáltuk. Negatív kontrollként a PE-konjugált kecske anti-egér antitest szolgált. 51

53 6.2.5 Endotélsejtek aktivációja MBL és C1q kezelést követően A C1q endotélsejtekre gyakorolt proinflammatorikus hatása már bizonyított [28, 58]. Ismert, hogy fokozza a sejtek citokin és adhéziós molekula expresszióját. Kísérleteinkben vizsgáltuk és összehasonlítottuk a C1q és a MBL endotélsejtekre gyakorolt hatását. Nyugalmi állapotban levő sejteket 48 órán keresztül tenyésztettük MBL-t vagy C1q-t különböző koncentrációban tartalmazó médiumban. A C1q és a MBL koncentrációját a fiziológiás tartománynak megfelelően választottuk. A sejteket 0,01-10 µg/ml MBL-nel és µg/ml C1q-val kezeltük. A termelt IL-6, MCP-1 és IL-8 koncentrációját a sejtek felülúszójából szendvics ELISA módszerrel mértük, az ICAM-1 expressziójának detektálásához celisa-t használtunk. C1q kezelést követően megemelkedett IL-6 (18.e ábra), MCP-1 (18.f ábra), IL-8 (18.g ábra) és ICAM-1 (18.h ábra) expresssziót mértünk. Bár a MBL nagymértékű szerkezeti rokonságot mutat a C1q-val, a MBL-nel kezelt sejtek IL-6 (18.a ábra), MCP-1 (18.b ábra), IL-8 (18.c ábra) és ICAM-1 (18.d ábra) expressziója nem változott a kontroll sejtekhez viszonyítva. 52

54 18. ábra. Endotélsejtek aktivációja C1q és MBL kezelést követően Az endotélsejteket 48 órán keresztül tenyésztettük MBL és C1q jelenlétében. Az IL-6 (A, E), a MCP-1 (B, F) és az IL-8 (C, G) koncentrációját a sejtek felülúszójaból szendvics ELISA módszerrel, az ICAM-1 (D, H) erxpresszióját celisa módszerrel mértük A C1q kötődése endotél- és U937 sejtekhez dekorin és biglikán extracelluláris mátrixfehérjék jelenlétében ELISA rendszerben kimutattuk, hogy az extracelluláris mátrix két proteoglikánja, a dekorin és a biglikán kötődik a C1q globuláris és kollagénszerű doménjához. Funkcionális, hemolítikus tesztben igazoltuk, hogy a kialakult interakció gátolja a klasszikus komplement kaszkád aktiválódását (nem bemutatott ábrák). Mivel a C1q kötődését számos sejten kimutatták és azok receptormediált aktivációját igazolták (lásd 1. táblázat), szerettünk volna választ kapni arra a kérdésre, hogyan befolyásolja a dekorin és a biglikán a C1q kötődését endotél ill. monocita sejtekhez és a C1q endotélsejtekre gyakorolt proinflammatorikus hatását. A kötődési vizsgálat első lépéseként a C1q-t előinkubáltuk különböző koncentrációjú dekorinnal és biglikánnal, majd az elegyet endotél (19.a ábra), illetve U937 sejtekhez adtuk. A C1q kötődését FACS-val vizsgáltuk. Mindkét proteoglikán rendkívül erősen és dózisfüggően gátolta a C1q kötődést a 53

55 sejtekhez. HUVEC sejteken a decorin 0.1 µg/ml koncentrációban (19.b ábra), míg U937 sejteken már µg/ml koncentrációban a C1q kötődés 50%-os (IC 50 ) gátlását eredményezte (19.c ábra). 19. ábra. A C1q kötődése endotél és U937 sejtekhez dekorin és biglikán jelenlétében A C1q-t (2.5 µg/ml) a diagrammokon feltüntetett koncentrációban dekorinnal és biglikánnal előinkubáltuk. A reakciós elegyet ezt követően HUVEC sejtekhez adtuk és a C1q kötődését poliklonális antitestekkel FACS-val detektáltuk (A). A C1q kötődését dekorin jelenlétében HUVEC (B) és U937 (C) sejteken is vizsgáltuk. 54