8. A kémiai biológia alapfogalmai. Jelzések bevitele, Bioortogonalitás. Stop kodon szupresszió

Átírás

1 8. A kémiai biológia alapfogalmai Jelzések bevitele, Bioortogonalitás. Stop kodon szupresszió

2 8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia N N N N OAc Fluorofórok Kémiai biológia N 3 SO 2 R HOH HO HO H H H OH OH OH Bioortogonalitás Biokémia

3 Kémiai biológia Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)

4 Jelzővegyületek a jelzés Antigén-antitest kölcsönhatás Jelzett antitestek Genetikai bevitel (fúziós fehérjék) Fluoreszcens fehérjék, TAG-ek Szelektív reakció bioortogonális kémia Biomolekula módosítása (metabolizmus, genetikai, kémiai) Jelzővegyület kapcsolása

5 Jelzett antitest sejtalkotók

6 Jelzett antitest tumor diagnózis Bowden, D. J.; Barrett, T. J. Clin. Imaging Sci. 2011, 1, 38

7 Jelzett antitest tumor műtét

8 Protein Tags fusion proteins 8 Peptide (small protein) sequences with unique activity Can be added by recombinant DNA techniques Fluorescent tags (GFPs) Anchoring tags (His6) Labeling tags (Cys4) Enzymatic function for labeling (SNAP, Clip, Halo tags) D. M. Patterson et al. (2014) ACS Chem. Biol. 9, 592

9 Fluoreszcens fehérjék in vivo Fluoreszcens fehérje gén+vizsgált fehérje gén = fúziós gén Fúziós fehérjét termelnek Csak a genomban közvetlenül kódolt molekulákra jó

10 Jelzővegyületek fluoreszcens fehérjék in vivo

11 Jelzővegyületek fluoreszcens fehérjék in vivo Transzgenikus neuronok Fúziós fehérjét termelnek

12 TAG-ek: Snap and Clip tags 12 O-6-Methylguanine-DNA methyltransferase activity A. Juillerat A, et al.(2003). Chem. Biol. 10, 313

13 Halo tag 13

14 Halo tag 14

15 Halo tag 15 G. V. Los et al. (2008) ACS Chem. Biol., 3, 373

16 16 Unnatural sequences of natural functions B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269

17 17 Unnatural sequences of natural functions B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269

18 18 Unnatural sequences of natural functions Nitrilotriacetic acid (NTA) Mainly for affinity chromatography B. A Griffin, et al. (1998). Science, 281, 269

19 Bioortogonális bevitel Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív) Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba nincs keresztreakció, szervezetidegen funkciók Gyors, kvázi kvantitatív ( klikk -reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális ártalmatlan melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus

20 Bioortogonális modulok Célvegyület (biomolekula) Kémiai hírvivő bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia) Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)

21 Jelzés bevitele két lépésben - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)

22 Kémiai hírvivő bevitele 22 D. M. Patterson et al. (2014) ACS Chem. Biol. 9, 592

23 Bioortogonális reakciók Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) Staudinger ligáció (azid + foszfin) Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)

24 Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció Gyors Szelektív Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) UV fény

25 Biokompatibilis Lassú Spontán foszfin oxidáció Staudinger ligáció

26 Staudinger ligáció

27 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Szerves oldószerek, vizes közeg, ph: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás

28 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexál, vagy egyéb adalékok (TBTA) TBTA

29 29 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Glikoproteid jelölés Metabolikus módosítás (Ac 4 ManAz)

30 Cu(I) mentes klikk reakció R 1 R 1 R 1 + R 2 N 3 r.t. N N N R 2 + N N N R 2 1,4 triazol 1,5 triazol -C(sp 3 )-C(sp)- = ~75,3 kj/mol gyűrűfeszültség Nem szükséges Cu(I) Lassabb, bonyolult reagensek

31 31 Ciklooktin reagensek F F R DIFO DIBO R R endo/exo BCN DIFBO F F N R O BARAC CO 2 Me COMBO 0.08 [a] 0.05 [a] 0.14 / 0.11 [b] 0.22 [a] 0.96 [a] 0.24 [a] 0.29 / 0.19 [c] 0.80 [d] c logp = 4,8 c logp = 1,9 [a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v)

32 32 Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO O O COMBO-Flu U937 sejtek, FACS

33 Membrán glikoproteid festés (ManNAz) 12.5 µm COMBO-Flu A-C ManNAz + D-E ManNAz 30 min 45 min 60 min A B C Magfesték (Hoechst 33342) Mosás nélkül!! 30 min 60 min D E

34 Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan Metabolikus Módosított metabolittal (pl. azido-cukor) Glikoziláció követése Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

35 Glikolizáció követése Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

36 Diels-Alder reakció Biokompatibilis Gyors Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)

37 Diels-Alder reakció

38 Bioortogonális funkciók genetikai bevitele - STOP kodon szupresszió Terminációs/nonszenz kodonok Nincs olyan trns, melynek antikodonja komplementer lenne velük nem kötődik hozzá trns leáll a fehérjeszintézis STOP kodont felismerő trns: a genetikai kód kiterjesztése 3 típus: UAG: amber ( különutas baktériumoknál pl. Pyl) UGA: opal UAA: ochre

39 A genetikai kód kiterjesztéséhez szükséges Ortogonális trns-szintáz/trns pár Amber stop kodon a fehérjében Nem természetes aminosav

40 Nem-természetes aminosavak bevitele fehérjékbe ortogonális trns/szintáz pár

41 Ortogonális trns/trns-szintáz kifejlesztése

42 Kémiai hírvivő genetikai beépítése Plass et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3878

43 Inzulin receptor - expresszió követése Nikic et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 2245

44 Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Amfifil fehérjék szintézise baktériumban A kódoló gén bevitele (transzgenikus baktérium) A kifejeződő fehérjék önszerveződése vezikulumokká A szerveződési folyamat valós idejű követése A hidrofil részhez GFP-t is toldanak Egyéb funkcióval való felruházás bizonyítása Nem természetes bioortogonális- aminosav beépítése és jelölése Hatóanyagok direkt szintézise a betegben Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: /NMAT4118

45 Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: /NMAT4118

46 Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: /NMAT4118

47 Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: /NMAT4118

48 Kémiai módosítás Egyedi motívumok reaktivitása (Cys4) -SH, Ar-OH, Trp-indol

49 Tyrosine specific tagging mega-stokes, near infra-red dye HSA HSA labs = 560 nm l em = 700 nm G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

50 Tyr specifikus jelölés HSA HSA G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

51 Cys jelölés HSA HSA G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele Tetrahedron 2014, 70, 5961

52 Fluorogén jelzővegyületek Fluorogén: csak a kapcsolást követően lesz fluoreszcens Minimális háttérfluoreszcencia Jobb jel / zaj arány Herner et al. Org. Biomol. Chem., 2014, 11, 3297 Herner et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370

53 Fluorogén jelzések 1,00 Normalized fluorescence intensity / a.u. 0,75 0,50 0,25 0, l / nm A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2013) Org. Biomol. Chem. 11, 3297.

54 Fluorogén jelzővegyületek A. Herner, G. E. Girona, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2014) Bioconjugate Chem. 25,

55 Vörös, közeli IR, mega-stokes klikk festékek l max /l em 523/630 nm 544/680 nm 588/744 nm

56 Nem citosztatikusak CHO sejtek jelölése: A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel

57 Fluorogén és távoli vörös jelzővegyületek Knorr, G.; Kozma, E.; Herner, A.; Lemke, E. A.; Kele, P., Chem. Eur. J. 2016, 22, 8972

58 Pozitron jelzés (PET) PET Jelzés - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18 F) - Az annihiláció eredménye nagy energiájú foton - Érzékeny, jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros, gyengébb felbontóképesség

59 MRI Jelzés NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd 3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny, gyengébb felbontás

60 Kombinált képalkotás Kombinált jelzések NIR fluorofór + PET Jó kontraszt + érzékeny detektálás Mélyszövetes képalkotás